Xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập từ lươn đồng bệnh xuất huyết

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, đặc biệt là Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy
Sản đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và dẫn dắt tôi trong
suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tất cả thầy cô trong Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giúp đ ỡ tôi trong
quá trình thực hiện đề tài.
Các anh chị cán bộ trong Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn gia đình và tập thể lớp Bệnh học Thủy Sản khóa 34 luôn ở bên cạnh,
hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.

i


TÓM TẮT
Đề tài “Xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập từ lươn đồng bệnh
xuất huyết” được thực hiện nhằm tìm ra nguyên nhân gây bệnh, xác định được
một số chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh và biết được
những dấu hiệu bệnh lý xuất hiện trên lươn đồng khi có vi khuẩn xâm nhập.
Lươn bị bệnh thường có dấu hiệu xuất huyết toàn thân, có một vài hoặc nhiều
vết loét trên thân. Kết quả kính phết mẫu tươi ở cơ quan thận cho thấy có rất
nhiều vi khuẩn tấn công vào tế bào thận làm vỡ các tế bào. Kết quả phân lập từ
38 mẫu lươn (trong đó có 21 mẫu lươn ở giai đoạn nuôi thương phẩm và 17
mẫu lươn ở giai đoạn giống) qua 4 đợt thu mua mẫu, bằng phương pháp phân
lập vi khuẩn và định danh bằng bộ kít API 20E đã xác đ ịnh được tác nhân gây
bệnh đó là vi khuẩn Aeromonas hydrophila (chiếm 85,71% trong tổng số các
chủng định danh). Sáu chủng định danh cho kết quả A. hydrophila là
LT2T2(2), LT2T(3), LT4T(4), LT5T(4), LT6T(4), LG2T(4), các chủng vi
khuẩn đều có hình que ngắn, Gram âm, di động, dương tính với Oxidase và

Catalase, âm tính với O/129, đều có khả năng tan huyết dạng beta.

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................................... i
TÓM TẮT .............................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG............................................................................................................ v
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ vi
CHƯƠNG 1........................................................................................................................... 1
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1
1.1

Giới thiệu ................................................................................................................. 1

1.2

Mục tiêu của đề tài ................................................................................................... 1

1.3

Nội dung của đề tài .................................................................................................. 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................................... 2
2.1

Tổng quan tình hình nuôi thủy sản ........................................................................... 2

2.1.1 Trên thế giới ......................................................................................................... 2

2.1.2 Ở Việt Nam .......................................................................................................... 3
2.2

Tổng quan về lươn đồng ( Monopterus albus Zuiew, 1793) .................................... 4

2.2.1 Đặc điểm sinh học................................................................................................ 4
2.2.2 Tình hình nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long ..................................................... 6
2.2.3 Một số trở ngại trong nghề nuôi lươn .................................................................. 7
2.2.4 Một số nghiên cứu trước đây ............................................................................... 8
2.3

Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra..................................................... 9

2.4

Khả năng tan huyết của vi khuẩn ........................................................................... 12

CHƯƠNG 3......................................................................................................................... 13
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 13
3.1

Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................................... 13

3.2

Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................ 13

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 13
3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu .................................................................... 13
3.3

Hóa chất ................................................................................................................. 13

3.3.1 Hóa chất dùng làm tiêu bản kính phết................................................................ 13
3.3.2 Hóa chất dùng trong phân lập vi khuẩn.............................................................. 13
3.3.3 Hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn......................................... 14
3.3.4 Hóa chất dùng trong PCR................................................................................... 14
iii


3.4

Phương pháp nghiên cứu........................................................................................ 14

3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển ..................................................................... 14
3.4.2 Phân lập vi khuẩn ............................................................................................... 14
3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản kính phết .................................................................. 15
3.4.4 Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn ................................... 15
3.4.5 Phương pháp định danh vi khuẩn ....................................................................... 16
3.4.6 Phương pháp PCR .............................................................................................. 18
Chương 4 ............................................................................................................................. 21
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................................. 21
4.1

Thông tin chung về mẫu nghiên cứu...................................................................... 21

4.2

Mô kính phết .......................................................................................................... 21

4.3

Phân lập vi khuẩn ................................................................................................... 22

4.4

Khả năng tan huyết của vi khuẩn thuộc các chủng Aeromonas spp. ..................... 25

4.5

Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E (BioMérieux) ....................................... 26

4.6

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR......................................................... 29

CHƯƠNG 5......................................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................................................ 31
5.1

Kết luận .................................................................................................................. 31

5.2

Đề xuất ................................................................................................................... 31

iv


DANH SÁCH BẢNG

Trang
Bảng 2.1: Sản lượng nuôi thủy sản của thế giới 2004-2006.......................... 2
Bảng 3.1: Thành phần các chỉ tiêu trong bộ kít API 20E ............................ 17
Bảng 3.2: Thành phần hóa chất qui trình PCR phát hiện A. hydrophila ..... 19
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu cơ bản của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp. ...... 23
Bảng 4.2: Các chỉ tiêu cơ bản của chủng vi khuẩn Vibrio sp. ..................... 24
Bảng 4.3: Kết quả định danh vi khuẩn Aeromonas spp. bằng API 20E...... 27
Bảng 4.4: Kết quả định danh chủng vi khuẩn Vibrio spp.
bằng bộ kít API 20E ................................................................... 28

v


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 4.1: Lươ n không có dấu hiệu bệnh lý ................................................. 21
Hình 4.2a: Lươn bị xuất huyết và lở loét..................................................... 21
Hình 4.2b: Lươn bị xuất huyết và lở loét..................................................... 21
Hình 4.3: Lươn bị lở loét nặng .................................................................... 21
Hình 4.4 : Vi khuẩn trong các cơ quan của lươn đồng (Giemsa) ................ 22
Hình 4.5: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila LT6T(4)
phân lập trên lươn đồng nuôi thương phẩm................................. 24
Hình 4.6: Hình dạng vi khuẩn của chủng Vibrio spp. LT2T1(2) ................ 24
Hình 4.7: Một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của A. hydrophila ..................... 25
Hình 4.8: Khuẩn lạc trên môi trường Aeromonas agar ............................... 25
Hình 4.9: Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu của chủng LT2T2(2) ....... 26
Hình 4.10: Kết quả API 20E của 2 chủng vi khuẩn. Chủng Aeromonas
hydrophila LT5T(4). Chủng Vibrio mimicus LT2T1(2) ........... 29
Hình 4.11: Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng ADN chiết tách từ 6 mẫu
thận lươn đồng................................................................................ 3

vi


CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, riêng năm
2010 kim ngạch xuất khẩu của ngành thủy sản đạt gần 5 tỷ USD, vượt xa con
số dự kiến là 4,5 tỷ USD. Với sự đóng góp to lớn trên, ngành thủy sản được
đánh giá là một trong những ngành kinh tế quan trọng ở nước ta. Do đó Viện
Kinh tế Quy hoạch Thủy sản (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn), quy
hoạch đến năm 2015, diện tích nuôi thủy sản tại Đồng Bằng Sông Cửu Long
(ĐBSCL) đạt 830.000 ha, sản lượng đạt 2,97 triệu tấn, giải quyết việc làm cho
2,1 triệu lao động trực tiếp. Vì vậy, việc mở rộng diện tích nuôi cũng như đa
dạng đối tượng nuôi là điều cần thiết.
Thời gian gần đây, lươn đồng là một đối tượng nuôi đang được chú ý
để phát triển nhằm góp phần đa dạng hóa đối tượng nuôi ở ĐBSCL nói riêng
và Việt Nam nói chung. Lươn là một đối tượng dễ nuôi, ăn nhiều loại thức ăn
khác nhau, có thể tận dụng những ao mương nhỏ và cạn để nuôi. Nuôi lươn ở
quy mô hộ gia đình ngoà i vấn đề tận dụng nguồn lao động nhàn rỗi; thức ăn
thừa của gia đình, c ủa chăn nuôi mà còn có th ể tăng thêm thu nhập góp phần
cải thiện đời sống gia đình. Hơn n ữa, giá trị dinh dưỡng của lươn khá cao
được xác định trong 100 g thịt có chứa hơn 18,8 g đạm, 0,9 g béo, 150 mg lân,
39 mg canxi, 1,6 mg sắt, nhiều vitamin B1, B2 và các yếu tố vi lượng khác.
Chính những lợi ích trên cùng với điều kiện khí hậu phù hợp cho sự sinh sản
và phát triển của lươn, nên phong trào nuôi lươn đang phát triển rầm rộ ở
ĐBSCL. Hiện nay, mặc dù đã có nhiều mô hình, nhiều cách nuôi lươn thành
công, nhưng trên thực tế quy trình kỹ thuật nuôi vẫn chưa hoàn chỉnh cũng
như những nghiên cứu về sức khỏe, quản lý dịch bệnh vẫn còn rất hạn chế. Vì

vậy, đề tài “Xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập từ lươn đồng
bệnh xuất huyết” cần được thực hiện để giải quyết phần nào khó khăn cho
nghề nuôi lươn.
1.2 Mục tiêu của đề tài
Xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập từ lươn đồng.
1.3 Nội dung của đề tài
- Thu mẫu, phân lập vi khuẩn từ lươn bệnh và làm tiêu bản kính phết.
- Định danh bằng phương pháp sinh hóa và PCR.
1


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Tổng quan tình hình nuôi thủy sản

2.1.1 Trên thế giới
Sản lượng nuôi trồng thủy sản trên thế giới hiện nay đã đáp ứng với
nhu cầu tiêu thụ của người dân (~17 kg/người). Theo thống kê của Tổ chức
Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO) năm 2006 đánh bắt và
nuôi trồng thủy sản cung cấp khoảng 110 triệu tấn sản phẩm thủy sản, trong đó
nuôi trồng thủy sản chiếm 47% (51,7 triệu tấn) (FAO, 2009).
Nuôi trồng thủy sản trên thế giới đã phát triển không ngừng trong
những năm qua. Từ sản xuất với sản lượng nhỏ hơn 1 triệu tấn vào những năm
70, đến năm 1995 đạt (24,6 triệu tấn) (FAO, 2006), đến 2002 sản lượng tăng
lên 51,7 triệu tấn, điều này cho thấy sự phát triển vượt bậc của nuôi trồng thủy
sản trong những năm qua. Mặc dù, khi sản xuất thủy sản ngừng phát triển
trong những năm 80 nhưng ngành thủy sản vẫn duy trì tốc độ tăng trưởng
trung bình hàng năm là 8,7% (FAO, 2009).

Bảng 2.1: Sản lượng nuôi thủy sản của thế giới 2004-2006 (tấn) (FAO, 2009)
Quốc gia
Trung Quốc
Ấn Độ
Việt Nam
Thái Lan
Indonesia
Bănglađét
Nhật Bản
Chile
Na Uy
Philiphin

Năm 2004
30.614.968
2.472.335
1.198.617
1.172.866
1.045.051
914.752
776.421
674.979
637.993
512.220

Năm 2006
34.429.122
3.123.135
1.657.727
1.385.801

1.292.899
892.049
802.410
733.891
708.780
623.369

Tăng (%)
6,05
5,71
17,6
4,87
11,23
-1,25
9,81
-2,78
5,5
10,32

Theo số liệu thông kê của FAO ở bảng trên cho biết trong giai đoạn 20042006, Trung Quốc vẫn là nước có sản lượng nuôi trồng thủy sản cao nhất, kế
đến là Ấn Độ, Việt Nam,… Tuy nhiên, do điều kiện địa lí nên mỗi quốc gia
chỉ sản xuất vài loài chính như: Trung Quốc sản xuất chủ yếu cá chép (chiếm
77% sản lượng nuôi cá chép của Thế Giới), Na Uy (33%) và Chile (31%) sản
xuất cá hồi của Thế Giới. Trong đó Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam,
Indonesia và Ấn Độ là 5 nước có sản lượng tôm cao nhất (chiếm 81%).
2


2.1.2 Ở Việt Nam
Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam cũng phát triển song song với

ngành nuôi trồng thủy sản trên Thế Giới. Từ đầu những năm 90, Việt Nam
thường xuyên nằm trong 10 nước có tổng sản lượng sản phẩm thủy sản trên
Thế Giới (Bộ Thủy Sản, 2007).
Tình hình phát triển thủy sản Việt Nam trãi qua nhiều giai đoạn, ngày
càng phát triển sau mỗi năm. Diện tích nuôi trồng thủy sản tăng đều đặn theo
từng năm suốt từ 1981 tới nay, từ 230 nghìn ha năm 1981 lên 384,6 nghìn ha
năm 1986. Năm 1981, tổng sản lượng thủy sản chỉ đạt 596.356 tấn (trong đó
khai thác đạt 416.356 tấn, nuôi trồng đạt 180.000 tấn), giá trị kim ngạch xuất
khẩu đạt 11,2 triệu USD. Năm 1986, tổng sản lượng đạt 840.906 tấn (khai thác
đạt 598.040 tấn, nuôi trồng đạt 242.866 tấn), kim ngạch xuất khẩu thủy sản
100 triệu USD. Năm 1991, diện tích nuôi trồng thủy sản mới đạt 520.000 ha,
sản lượng đạt 335.910 tấn. Đến năm 1996 diện tích nuôi trồng thủy sản là
585.000 ha, sản lượng nuôi trồng đạt 411.000 tấn. Năm 2000, diện tích nuôi là
652.000 ha, sản lượng đạt 723.110 tấn thì đến năm 2003, tổng sản lượng thủy
sản đã đ ạt 1.110.138 tấn (Trích Trần Nguyễn Diễm Tú, 2011). Giai đoạn
2004-2008, sản lượng thủy sản phát triển chậm lại nhưng vẫn duy trì tốc độ
tăng trưởng trung bình hàng năm là 8,94%. Tuy nhiên đến năm 2009, do diện
tích nuôi thủy sản giảm (1.052.600 ha – năm 2008 giảm xuống còn 1.044.700
ha – năm 2009) nên tốc độ tăng trưởng giảm đi rất nhiều 2,1% (sản lượng nuôi
trồng thủy sản năm 2008 là 2.465.600 tấn trong khi đó năm 2009 chỉ tăng lên
2.569.900 tấn). Sản lượng nuôi trồng thủy sản năm 2010 đạt 2.706.800 tấn,
tăng 4,5% so với năm 2009, tổng sản lượng thu hoạch năm nay tăng 4,9% so
với năm trước do các địa phương thực hiện chuyển đổi và mở rộng diện tích
nuôi theo hướng đa canh, đa con kết hợp, hướng vào thị trường nội địa. Đáng
chú ý là nuôi thủy sản nước mặn bằng hình thức lồng, bè phát triển khá mạnh
tại một số địa phương.
Nhiều năm qua, ngành thủy sản là thế mạnh kinh tế đặc biệt ở khu vực
ĐBSCL, biến nơi đây thành một vùng trọng điểm về nuôi trồng thủy sản cho
tiêu dùng và xuất khẩu của cả nước. Tuy nhiên, sự phát triển nuôi trồng thủy
sản mạnh mẽ lại kéo theo các tác động môi trường diễn ra ở quy mô ngày càng

lớn và hết sức đa dạng. Bảo vệ môi trường trong nuôi trồng thủy sản ở
ĐBSCL đang trở thành vấn đề bức xúc, cần được tập trung giải quyết để bảo
đảm sự phát triển bền vững. Diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản ở khu vực
ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây. Năm 2000 là 445.300 ha với
tổng sản lượng nuôi trồng là 365.141 tấn, năm 2002 là 570.300 ha, sản lượng
3


518.743 tấn, năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng 773.294 tấn, năm 2005 là
685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn (Trích Trần Nguyễn Diễm Tú,
2011). Năm 2009, diện tích nuôi trồng thủy sản toàn vùng ĐBSCL đạt gần
824.000 ha, sản lượng đạt trên 1,9 triệu tấn, chiếm 89% diện tích và 93% sản
lượng ở các tỉnh phía Nam. ĐBSCL hiện có hơn 400.000 ha mặt nước nuôi
thủy sản, tổng sản lượng hằng năm lên tới hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn 70%
sản lượng thủy sản nuôi của cả nước. Ngoài diện tích nuôi thủy sản nước mặn,
tập trung ở ven biển, diện tích nuôi thủy sản nước ngọt cũng khá lớn với trên
500.000 ha, chủ yếu ở các tỉnh Tiền Giang, Long An, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc
Trăng,…
Nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh, đem lại nhiều lợi ích cho kinh tế xã hội. Tuy nhiên, quá trình phát triển đã bộc lộ những vấn đề bất cập cần sớm
được giải quyết. Trong đó, bảo vệ môi trường là vấn đề hết sức quan trọng để
có thể phát triển nghề nuôi trồng thủy sản bền vững ở Đồng Bằng Sông Cửu
Long.
2.2

Tổng quan về lươn đồng ( Monopterus albus Zuiew, 1793)

2.2.1 Đặc điểm sinh học
Theo khóa phân loại: (www.fishbase.org)
Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii

Bộ: Synbranchiformes
Họ: Synbranchidae
Họ phụ: Neoterygii
Chi: Monopterus
Loài: Monopterus albus (Zuiew, 1793)
Fluta alba (i.e Smith, 1945)
Tên địa phương: Lươn đồng
Tên tiếng Anh là Asian Swamp Eel (Rice Eel), là loài có nhiều tên khoa học
nhất, được gọi với nhiều tên là Gymnotus albus, Muraena alba, Fluta alba,
Monopterus javanensis, Unibranchapertura laevis, Symbranchus grammicus,
Pneumabranchus
cinereus,
Ophicardia
phayriana,
Synbranchus
xanthognathus, Monopterus helvolus, Monopterus marmoratus, Apterigia
immaculata, Apterigia nigromaculata, Apterigia saccogularis.
Phân bố: lươn phân bố rộng khắp các thủy vực của Việt Nam, chúng sống và
phát triển từ các vùng thượng lưu sông Hồng đến vùng rừng núi cao nguyên
4


Trường Sơn, miền Đông Nam Bộ và ĐBSCL. Sống ở các ao, hồ, mương rãnh,
ruộng lúa và dọc ven bờ sông; sống chui rúc ở dưới bùn và đào hang trong đất
nhưng ở độ sâu không quá 3 m.
Đặc điểm hình thái: có hình dạng gần giống hình trụ thon dài, đuôi bị ép lại
mảnh kéo dài thành một chấm nhưng ngắn hơn phần thân. Lươn không có vảy;
mũi hình tròn l ộ ra ngoài; mắt nhỏ được bao phủ bởi một lớp da; vây lưng, vây
đuôi và vây hậu môn sẽ tiêu biến mất ở những con trưởng thành; mang mở ra
có dạng hình chữ V đặt ở mặt dưới của đầu (còn được gọi là bọng hầu). Thân

có màu nâu ở trên, trắng đến nâu xám ở dưới; bụng có màu vàng hoặc xám
nhạt tùy vùng sinh sống. Lươn đực lớn hơn lươn cái. Lươn có cơ quan hô hấp
phụ là da và màng nhầy xoang miệng hầu.
Tập tính sinh sống: thường sống trong hang; hoạt động mạnh mẽ vào mùa
mưa ẩm ướt. Ban ngày sống trong hang, ban đêm ra ngoài săn mồi kiếm ăn.
Lươn phát triển tốt ở nhiệt độ 24-28oC.
Tập tính ăn: lươn là loài ăn tạp thiên về động vật, đặc biệt là thức ăn có mùi
tanh như tôm, cá, nòng nọc,… Ngoài ra, lươn cũng có thể sử dụng các loại
thức ăn khác như phụ phẩm của lò mổ, đồ phế thải của nhà bếp, kể cả thức ăn
viên dành cho gia cầm. Lươn có tính ăn rất khó chịu, có thể nhịn đói dài ngày,
có thể nhịn ăn cho đến chết nếu mồi ăn thay đổi đột ngột; không ăn thức ăn
ươn hư thối.
Sinh sản:
- Lươn đẻ vào đầu mùa mưa thời tiết mát mẻ, mùa đẻ chính là vào tháng
5-6 và có thể tái thành thục đẻ vào mùa phụ là khoảng tháng 8-9; ở
ĐBSCL lươn thường đẻ trong suốt mùa mưa.
- Là loài cá có hiện tượng sinh sản lưỡng tính, trong tuyến sinh dục có cả
tinh sào và buồng trứng xen kẽ lẫn nhau, khi tuyến sinh dục bên trái phát
triển thì tuyến sinh dục bên phải thoái hóa teo lại và hình thành giới tính
đực hay cái. Hiện tượng lưỡng tính này thường chỉ rơi vào lươn cái.
Lươn cái khi thành thục lần đầu tiên hình thành noãn sào cho đến khi
trứng chín là lươn cái, sau khi đẻ trứng, noãn sào teo đi, tinh sào phát
triển và trở thành lươn đực. Lươn một năm tuổi là có thể thành thục.
Lươn đực có đuôi dài hơn đuôi lươn cái, đầu thon mõm nhọn và hoạt
động năng động hơn lươn cái, khi kích thước cỡ 40-50 cm hầu hết là
lươn đực.
- Lươn đực dài 40-60 cm, nặng 200-350 g/con, dùng tay ấn nhẹ thấy tinh
dịch trong suốt chảy ra; lươn cái dài 30-40 cm, nặng 200-300 g/con, có
5

bụng trương to hai bên hông da mỏng, ấn thấy mềm, lỗ sinh dục đỏ hồng.
Lươn làm tổ đẻ nơi đất sét pha thịt thường là ven bờ ruộng, ven bờ kênh
mương, bờ ao, bưng trũng. Lươn đ ực có nhiệm vụ đào khoét hang làm
tổ, hang thường có hình chữ “U”, cao hơn mặt nước khoảng 5-10 cm và
có 3 ngách: ngách chính nằm sâu dưới bùn, lươn sinh sống và sinh sản
tại đây; ngách phụ từ trên bờ vòng xuống tạo thành hình chữ “U”, ngách
phụ thứ 2 để thông không khí cho lươn thở.
- Lươn cái đến đẻ trứng trên đám bọt mà lươn đực đã phun sẵn từ trước.
Lươn đực và lươn cái đều bảo vệ trứng và con nhỏ. Số lượng trứng trong
một tổ khoảng 80-1.000 trứng.
Sinh trưởng: Có khả năng tồn tại khi nhiệt độ dưới 0oC, độ mặn
6‰. Lươn con một năm tuổi chỉ lớn nhanh về chiều dài, còn năm th ứ hai và
thứ ba chiều dài phát triển chậm lại chủ yếu là tăng trọng lượng. Lươn một
tuổi có thể dài 40-60 cm, nặng khoảng 150-250 g/con.
2.2.2 Tình hình nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long
Từ lâu lươn đóng vai trò là mặt hàng xuất khẩu đặc biệt như lươn đông lạnh,
lươn tẩm dầu hun khối, lươn tươi sống,… nhưng nguồn lươn có được chủ yếu
là do thu bắt từ tự nhiên: Bạc Liêu 1.000 tấn/năm, Châu Đốc 2.000 tấn/năm
(thời điểm ở miền Nam trước ngày giải phóng) (Ngô Trọng Lư, 2008). Do
chính việc khai thác không giới hạn của người dân như hiện nay đã làm cho
nguồn lươn trong tự nhiên ngày càng khan hiếm, cùng với một số nguyên nhân
khác như: qui hoạch phát triển nông thôn, thủy lợi, sử dụng thuốc trừ sâu diệt
cỏ,… làm cho diện tích sinh sản tự nhiên của lươn ngày càng bị thu hẹp.
Nhưng với giá trị dinh dưỡng của lươn mang lại và nhu cầu thị trường ngày
nay, nghề nuôi lươn cần được mở rộng phát triển.
Ở ĐBSCL mô hình nuôi cũng khá đa dạng. Một số tỉnh như Hậu Giang, Vĩnh
Long có mô hình nuôi trong bể không có đất, giá thể là dây nylon cho hiệu quả
kinh tế cao (Nguyễn Chung, 2007).
Theo Dương Nhựt Long (2003) nuôi lươn gồm có các mô hình:

- Mô hình nuôi trong hồ cement hoặc chuồng nuôi heo cải tạo lại. Diện
tích hồ nuôi có thể từ 4-6 m2 hoặc 10 m2.
- Mô hình nuôi trong ao mương, có th ể sử dụng các ao mương nhỏ.
- Mô hình nuôi trong hồ đất đắp có lót cao su, thông thường hồ có diện
tích 10-12 m2.

6


Theo cục thống kê An Giang (2007) thì diện tích nuôi lươn là 65.014 m2 (chủ
yếu là tận dụng đất thổ cư quanh nhà), tập trung nhiều nhất ở huyện Châu
Thành là 34.519 m2 (chiếm 53,1% tổng diện tích nuôi toàn tỉnh), kế đến là
huyện Thoại Sơn là 9.261 m2 (chiếm 14,3%) và Long Xuyên là 7.501 m2
(chiếm 11,5%). Nghề nuôi lươn đã mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người
nuôi nên diện tích nuôi ngày càng được mở rộng, điều này được thể hiện rõ ở
diện tích nuôi năm 2009 lên đến 145.000 m2, tăng gấp đôi năm 2007 (Cục
thống kê An Giang, 2009). Bên cạnh đó sản lượng nuôi cũng tăng rất nhanh,
năm 2008 đạt 185 tấn, đến năm 2009 tăng vọt lên 370 tấn gấp đôi năm 2008
(Cục thống kê An Giang, 2008; Cục thống kê An Giang, 2009) (trích dẫn bởi
Nguyễn Tường Duy, 2010).
2.2.3 Một số trở ngại trong nghề nuôi lươn
Trong quá trình nuôi sự thay đổi của thời tiết, môi trường nước, thức ăn, chỗ
trú ngụ,… cũng là nguyên nhân làm suy giảm sức khỏe của lươn tạo điều kiện
cho kí sinh trùng, vi khuẩn tấn công và gây bệnh. Hiện nay, đa phần lươn nuôi
thường mắc bệnh do kí sinh trùng gây ra: bệnh lở loét, nấm thủy mi, bệnh
tuyến trùng, bệnh đỉa,…
- Bệnh lở loét (còn được gọi là bệnh đóng dấu): bệnh xảy ra khi lươn bị
xây xát, khi đó kí sinh trùng và vi khuẩn cơ hội sẽ tấn công gây nên
những vết lở loét. Trên thân lươn xuất hiện những vết hình tròn hoặc
hình bầu dục màu đỏ xen lẫn với vùng da bị dập nát. Bệnh nặng, đuôi

lươn bị rụng, bơi lội khó khăn, đầu lươn thường ngóc lên khỏi mặt nước
để thở, lươn mệt mỏi, yếu dần rồi chết.
- Bệnh tuyến trùng do kí sinh trùng đường ruột gây ra: tuyến trùng có màu
trắng dài khoảng 1 cm, đầu bám vào niêm mạc phá hoại mô, hình thành
các bào nang gây viêm ruột sưng đỏ. Bệnh nặng hậu môn sưng, kém hoạt
động dẫn đến kiệt sức rồi chết.
- Bệnh nấm thủy mi (còn được gọi là bệnh nấm nước): bệnh do nấm kí
sinh gây ra, những sợi nấm bám chặt trên da hút hết chất dinh dưỡng,
làm lươn mất máu, yếu dần rồi chết. Bệnh thường xảy ra vào mùa mưa.
- Bệnh đỉa: do đỉa bám vào phần đầu lươn, phá hoại mô bì, hút máu gây ra
những vết thương trên cơ thể tạo điều kiện cho vi trùng xâm nhập gây
viêm nhiễm, làm lươn yếu đi hoạt động chậm chạp gây ảnh hưởng đến
sinh trưởng và có thể chết.
Ngoài ra, lươn còn mắc một số bệnh do lỗi kĩ thu ật như ăn phải mồi trộn thuốc
nên nội tạng bị hư; ăn thức ăn tươi sống (bệnh nhiễm kí sinh trùng); thả nuôi
7


với mật độ dày trong điều kiện nước nhiều chất thải và thức ăn thừa gây thiếu
oxy nghiêm trọng, mức nước trong bể thấp hoặc bể nuôi không được làm mát
khiến nhiệt độ nước tăng cao (bệnh sốt nóng),...
- Bệnh sốt nóng: do nuôi với mật độ dày, lươn quấn vào nhau, lượng dịch
nhầy tiết vào trong nước nhiều bị lên men, độ nhớt tăng lên làm nhiệt độ
nước tăng, hàm lượng oxy giảm, lươn ở trong tình trạng ngạt thở phải
luôn luôn sử dụng bọng hầu ở cổ để thở, da bọng hầu căng phồng liên
tục, lươn bị yếu sức, chỗ bọng hầu ửng đỏ. Đầu sưng phồng to, chết hàng
loạt. Bệnh này thường gặp ở mô hình nuôi trong ống nhựa hoặc dây
nylon.
- Bệnh nhiễm kí sinh trùng: do lươn ăn thức ăn tươi sống.
2.2.4 Một số nghiên cứu trước đây

Nghiên cứu về lươn trên thế giới đã đư ợc chú ý từ lâu, nhưng các nghiên cứu
về đặc điểm sinh học, sinh sản nhân tạo, dinh dưỡng và nuôi thương phẩm của
lươn vẫn chưa nhiều.
Một nghiên cứu đặc điểm sinh học dinh dưỡng và sinh sản của lươn đồng
được thực hiện bởi Lý Văn Khánh và ctv. (2008) trong thời gian một năm tại
thành phố Cần Thơ và tỉnh An Giang. Mẫu lươn được chuyển về phòng thí
nghiệm của khoa Thủy sản để phân tích. Sau khi quan sát một số chỉ tiêu về
hình thái, lươn được giải phẫu lấy tuyến sinh dục và tiến hành cắt mô xác định
giới tính, các giai đoạn thành thục, mùa vụ sinh sản và đường kính trứng. Kết
quả nghiên cứu này cho thấy lươn có chiều dài <30 cm là lươn cái, chiều dài
>50 cm là lươn đực, lươn lưỡng tính có chiều dài nằm trong khoảng 30-50 cm.
Kết quả mô bệnh học tuyến sinh dục lưỡng tính cho thấy có sự tồn tại của tinh
nguyên bào, tinh tử và trứng ở các giai đoạn 1, 2 và 3. Sự chuyển giới tính từ
cái sang lưỡng tính rồi thành đực chỉ xảy ra trên cùng một tuyến sinh dục của
lươn. Mùa vụ sinh sản tập trung vào tháng 3 và 9 trong năm. Sức sinh sản
tuyệt đối đạt 143 - 6.813 trứng/lươn cái và sức sinh sản tương đối từ 4.828 65.771 trứng/kg lươn cái. Đường kính trứng trung bình ở giai đoạn 4 là 0,5
mm, giai đoạn 5 là 1,48 mm. Lươn cái có khả năng sinh sản tốt ở chiều dài 4050 cm.
Đỗ Thị Thanh Hương và ctv. (2008) đã thành công ở bước đầu về sản xuất
giống nhân tạo lươn đồng. Nghiên cứu sử dụng hai loại kích dục tố HCG và
LH-RHa để kích thích lươn đẻ. Liều sử dụng cho HCG là 1.000 UI/kg; 1.500
UI/kg; 2.000 UI/kg; và với liều 50 µg/kg; 100 µg/kg; 150 µg/kg cho LH-RHa.
Kết quả thu được: nhóm lươn được chích kích dục tố LH -RHa liều 150 µg/kg
8


có tỉ lệ tham gia đẻ cao nhấ t là 75%; tỉ lệ thụ tinh cao nhất 86% là nhóm trứng
của lươn bố mẹ được tiêm kích dục tố HCG liều 2.000 UI/kg.
Sự chuyển giới tính tự nhiên của lươn, ảnh hưởng của hormone mLH
(mammalian Luteineizing Hormone) của động vật có vú đến sự chuyển giới
tính của lươn; methyltestosterone, testosterone và 11-ketotestosterone không

ảnh hưởng đến sự chuyển giới tính này (Tang, et al., 1974a, 1974b).
Chất tương tự kích dục tố cá hồi (Salmon Gonadotropin-releasing Hormone
Analog, sGnRH-A), sử dụng riêng biệt hoặc sử dụng kết hợp với chất thụ thể
DOM) đều đã kích thích làm tăng hàm lư ợng testosterone và đã làm giảm hàm
lượng 17 β estradiol trong huyết tương của lươn. Não thùy cá chép không có
tham gia vào quá trình chuyển đổi giới tính của lươn, tuy nhiên chúng đã kích
thích sự phát triển của buồng trứng rất tốt trong thí nghiệm này (Tao et al.,
1993).
Song song với các nghiên cứu về chuyển đổi giới tính của lươn, có một vài
nghiên cứu về ảnh hưởng của hormone đến sự phát triển buồng trứng của
lươn, oLH của cừu (ovine Lute inizing Hormone) và chất tương đương LH
(LH-RHa) được dùng trong thí nghiệm để kích thích sự phát triển của buồng
trứng sau khi đẻ và giai đoạn sớm trước khi đẻ. oLH được tiêm hàng ngày
trong vòng 4 tuần và LH -RHa, nhóm đối chứng được tiêm nước muối sinh l ý.
Kết quả buồng trứng nhóm lươn (có tuyến sinh dục sau khi đẻ) đã xuất hiện
những tế bào kĩ và tinh sào. Buồng trứng lươn nhóm LH -RHa gia tăng khối
lượng và kích thích có ý nghĩa so với buồng trứng ban đầu (Yeung et al.,
1993).
Theo Nhan Trung Nghĩa (2010), nghiên cứu tuổi thành thục và thử nghiệm
sinh sản lươn đồng. Kết quả cho thấy lươn đồng thành thục ở giai đoạn 10
tháng tuổi. Hàm lượng vitellines tăng nhanh trong giai đoạn lươn đồng 9 -10
tháng tuổi từ 1,67 µgALP/mg protein lên 2,72 µgALP/mg protein. Ở lươn
đồng 10 tháng tuổi có tỉ lệ thành thục là 18,2% và hệ số thành thục cao nhất là
1,04%. Thí nghiệm được bố trí với 3 nghiệm thức: nhóm đối chứng, nhóm
tiêm HCG, nhóm tiêm LH-RHa. Kết quả tỉ lệ sinh sản cao nhất ở nhóm tiêm
LH-RHa (50%); nhóm đối chứng và nhóm tiêm HCG đều ở mức 33,3%.
2.3

Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra

Otte (1963) cho rằng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas gây bệnh xuất huyết ở
cá phổ biến ở châu Âu từ thời Trung Cổ. Bệnh xuất huyết là do vi khuẩn A.
hydrophila gây ra. A. hydrophila có nhiều trong môi trường thủy sản nước

9


ngọt (Klyver et al., 1936). Ngoài ra, người ta còn phát hiện loài vi khuẩn này
cũng gây bệnh cho người (Cascon et al., 1996).
Trong vài năm gần đây, bệnh xuất huyết ở cá nước ngọt đã phát tri ển
rộng rãi, gây nhiều thiệt hại và trở thành mối nguy hiểm cho người nuôi cá ở
khu vực châu Á – Thái Bình Dương. Theo thống kê, khi phân lập vi khuẩn ở
các loài cá hồi (Salmo gairdneri) bệnh ở sông Porma (tỉnh Leon, Tây Ban
Nha) thì thu được ba loài vi khuẩn: A. hydrophila, A. sorbia và A. caviae trong
đó A. hydrophila chiếm 72,02% (Paniagua et al., 1990). Theo Chowdhury
(1998), điều tra các ao nuôi và trại nuôi ở Bangladesh thì 50-60% bệnh do vi
khuẩn A. hydrophila. Theo thống kê nhiều loài cá bệnh ở Trung Quốc thì vi
khuẩn A. hydrophila chiếm 40% (Nielsen et al., 2001).
Ở Việt Nam, bệnh xuất huyết xuất hiện hầu hết các loài cá như: trắm
cỏ, chép, rô phi, mè, trê. Một trong những tác nhân gây bệnh là vi khuẩn A.
hydrophila, ngoài ra còn có các loài vi khuẩn khác (A. sorbia, Pseudomonas
flouresens,…) (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005).
A. hydrophila thuộc giống Aeromonas, họ Aeromonadaceae, bộ
Aeromonadales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria (Barrow và
Feltham, 1993), di động bằng tiên mao (Macinnes, 1979). A. hydrophila là tác
nhân gây bệnh cơ hội, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn (Colwell et
al., 1986), kích thước 0,5 x 1,0-1,5 µm, hai đầu hơi tròn. Mỗi tế bào vi khuẩn
có một tiên mao, nhờ đó mà có thể di động, có phản ứng Cytochrom oxidase
dương tính, có khả năng khử nitrate, không mẩn cảm với VP (Voges
Proskauer), sinh H2S từ Cysteine (Bùi Quang Tề, 2004).

Điều kiện gây bệnh của A. hydrophila rất đa dạng. Tùy thuộc vào các
yếu tố như: mật độ nuôi, tình trạng sức khỏe của vật nuôi và khả năng kháng
bệnh của các loài cá khác nhau. Lallier (1981) nghiên cứu so sánh về độc lực
của A. hydrophila và A. sorbia ở cá hồi vân (Oncorhyncus mykiss) đã chỉ ra
rằng vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá bệnh và cá khỏe đều nguy hiểm
hơn dòng vi khu ẩn A. sorbia.
A. hydrophila cũng dễ dàng bị lây nhiễm khi cá nuôi ở mật độ cao.
Ventura & Grizzle (1987) nghiên cứu cá nheo Mỹ (Ictarlurus punctatus) và vi
khuẩn A. hydrophila cho rằng: khi cho cá tiếp xúc với vi khuẩn ở mật độ nuôi
cao (13,1 g cá/L) thì khi kiểm tra cơ quan nội tạng cá thì bệnh xuất hiện còn ở
mật độ nuôi thấp hơn (5,2 g cá/L) thì b ệnh không xuất hiện.
Dấu hiệu bệnh lý
-

Aeromonas hydrophila (bệnh xuất huyết)
10


-

Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn. Cá bệnh bị sẫm màu từng vùng ở bụng,
xuất huyết từng mảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuôi, xuất hiện có vết thương
trên lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vẩy dễ rơi rụng. Mắt lồi, mờ đục
phù ra, xoang bụng chứa dịch. Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng ở miền
Nam bệnh thường xuất hiện vào đầu mùa mưa.
Aeromonas sobria (bệnh lở loét)
Bệnh xảy ra quanh năm nhưng tập trung vào tháng 3-7 hàng năm. Những
dấu hiệu đầu tiên là cá ít ăn hoặc bỏ ăn, hoạt động lờ đờ, bơi nhô đầu lên
mặt nước, da cá sẫm lại, có vết mòn màu xám hoặc các đốm đỏ phát triển ở
đầu, thân, các vây và đuôi. Những vết loét dần dần lan rộng, vẩy rụng, xuất

huyết và viêm. Những con bệnh nặng vết loét lõm sâu tới xương, cơ bị thối
rửa, đôi khi ăn cụt cả phần đuôi và cuối cùng cá chết (Từ Thanh Dung,
1994). Theo Đỗ Hồng Tuấn (2002), khảo sát bệnh trên cá rô đồng cũng đã
ghi nhận được với những vết loét rộng, vẩy rụng, xuất huyết.

Phân bố và lan truyền
Kết quả nghiên cứu của Austin và Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là tác
nhân của một vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và
thường liên kết với mầm bệnh khác như A. salmonisida. Bệnh đốm đỏ là biểu
hiện sự có mặt của những vết thương trên da, đặc biệt xuất huyết ở mang và
hậu môn, loét, ung mủ, lồi mắt, phình bụng. Bên trong xoang bụng tích tụ dịch
loãng, gây thiếu máu và tổn thương các cơ quan như gan, thận. Ventura và
Grizzle (1987) cho rằng vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu
trên cá nheo (Ictalurus punctatus) và A. hydrophila làm cho cơ quang nội tạng
và da bị xuất huyết trong điều kiện nuôi ở mật độ cao và nhiệt độ là 24oC. Cá
cũng gây bệnh lở loét cho các trại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết cao lên đến
80-90% (Angka, 1990). Ở châu Âu, bệnh do A. hydrophila trên cá chình
(Anguilla australis) thường xuất hiện vào mùa xuân – hè, nhiệt độ nước
khoảng 17-22oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt độ thích
hợp thường gặp là A. hydrophila, A. sobria và A. caviae, được phát hiện đầu
tiên trên cá chình trong báo cáo bùng phát bệnh của Sanarelli (1891) (Trích
dẫn của Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997). Bên cạnh đó thì Aeromonas sp. di
động gây bệnh trên nhiều loài thủy sản nước ngọt. Ở Việt Nam, các loài cá
nuôi lồng, bè và ao nước ngọt thường gặp bệnh đốm đỏ như cá lóc, cá trắm cỏ,
cá trôi, cá chép, cá basa,…bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh (Bùi
Quang Tề, 2006). Theo kết quả nghiên cứu của Lư Trí Tài (2010) cho thấy vi
khuẩn xuất huyết chiếm tỉ lệ cao nhất (38,3%) trong tổng số 81 chủng vi
khuẩn phân lập được, còn lại là nhóm vi khuẩn khác như Pseudomonas,
Edwardsiella, Streptococcus. Một nghiên cứu khác về bệnh trên tôm càng của
11

Nguyễn Tấn Đạt (2002) ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ cũng
cho kết quả có 18 chủng được định danh là vi khuẩn A. hydrophila.
Phương pháp phát hiện A. hydrophila hiện nay thường được sử dụng phổ biến
là sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kít API 20E
(BioMerieux). Tuy nhiên, phát hiện A. hydrophila bằng phương pháp thông
thường mất nhiều thời gian. Để phát hiện chính xác và tiết kiệm thời gian
thường sử dụng phương pháp PCR để phát hiện A. hydrophila bằng cách
khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của A. hydrophila (trích Trần Nguyễn Diễm Tú,
2011).
2.4

Khả năng tan huyết của vi khuẩn

Môi trường thạch máu là một môi trường giàu dinh dưỡng có chứa các tế bào
máu đỏ. Môi trường được sử dụng để phát hiện ra những vi khuẩn có sản sinh
enzyme phá vỡ tế bào máu. Quá trình này đươc gọi là tan huyết. Tan huyết là
sự phá vỡ màng tế bào của các tế bào máu đỏ bởi một protein của vi khuẩn
được gọi là hemolysin. Hoạt động chủ yếu của protein này là xâm nhập vào
màng tế bào máu, phá vỡ cấu trúc của màng tế bào máu (Lerner et al., 2003).
Môi trường thạch máu là nguồn thức ăn phong phú cho vi khuẩn. Vì vậy, nó
có thể được sử dụng làm môi trường nuôi chính, nhưng thực tế nó chỉ được sử
dụng với mục đích xác định đặc tính tan huyết của vi khuẩn vì chi phí của môi
trường này tốn kém hơn nhiều so với những môi trường thông thường khác.
Máu được sử dụng trong môi trường máu đã được loại bỏ fibrin (chất đông
máu) để bảo đảm rằng không có xảy ra hiện tượng đông máu trong môi trường
thạch. Việc xác định đặc tính tan huyết rất hữu ích cho việc xác định loài của
vi khuẩn. Theo Jackie et al. (2011), có 3 loại tan huyết là alpha, beta và
gamma:

- Tan huyết dạng alpha (α-hemolysis): trên môi trường thạch có một màu
xanh xuất hiện bao quanh khuẩn lạc của vi khuẩn. Đây còn được gọi là
tan huyết một phần.
- Tan huyết dạng beta (β-hemolysis) là dạng tan huyết toàn phần tạo một
quầng sáng xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn.
- Tan huyết dạng gamma (γ-hemolysis) cơ bản không có sự thay đổi màu
sắc của môi trường.

12


CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
- Thu mua mẫu lươn từ các chợ Trung Tâm Cái Khế, chợ Hưng Lợi, chợ
Tân An thuộc địa bàn thành phố Cần Thơ và ở Vĩnh Thành - Châu Thành
- An Giang.
- Phân tích mẫu tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy
sản – Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01/2012 đến tháng 05/2012.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Lươn không có dấu hiệu hoặc có dấu hiệu bất thường tại các chợ ở Cần Thơ
và ở Châu Thành – An Giang.
3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
-

Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa.

Pipette, ống nghiệm, ống đong.
Lame, lamella, đĩa Petri, giấy nhôm.
Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi.
Chai nấu môi trường, bình tam giác, cốc thủy tinh.
Đầu cone, ống hút, ống eppendorf, que nghiền, găng tay.
Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh.
Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.
Cân điện từ, lò viba, máy ly tâm, máy chụp hình UV.
Các vật liệu khác.

3.3 Hóa chất
3.3.1 Hóa chất dùng làm tiêu bản kính phết
- Methanol
- Bộ hóa chất nhuộm Giemsa
3.3.2 Hóa chất dùng trong phân lập vi khuẩn
13


- Cồn tuyệt đối.
- Tryptone Soya Agar (TSA), Nutrient Agar (NA).
3.3.3 Hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn
-

Bộ hóa chất nhuộm Gram
Dung dịch H2O2
Que thử Oxidase
Môi trường O/F
Nước cất, nước muối sinh lý
Các loại hóa chất khác

3.3.4 Hóa chất dùng trong PCR
-

Chloroform
Dung dịch chạy điện di TAE
Ethidium bromide
Taq polymerase
Các loại hóa chất khác

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển
- Thu mua mẫu lươn có và không có dấu hiệu bệnh lý với tổng số con là
38 qua 4 đợt.
- Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm và được phân tích ngay. Chỉ
sử dụng những mẫu còn sống.
3.4.2 Phân lập vi khuẩn
- Mẫu lươn còn sống.
- Trước khi giải phẫu phải đặt lươn trên khay sạch. Quan sát lươn bằng
mắt thường, ghi nhận tất cả những dấu hiệu bên ngoài: vết thương, điểm
xuất huyết, mùi và các triệu chứng bất thường khác.
- Khử trùng mặt ngoài cơ thể lươn bằng cồn 70o và lau sạch.
- Dùng kim tiêm tiệt trùng hút một ít máu lươn cho vào đĩa TSA, sau đó
dùng que cấy tiệt trùng cấy trên đĩa TSA.

14


- Tiến hành mổ lươn bằng dao mổ, kéo tiệt trùng (tiệt trùng dụng cụ bằng
cách nhúng vào cồn 95o và đốt trên ngọn lửa đèn cồn). Lưu ý: trong quá
trình mổ tránh làm vỡ các nội quan.

- Quan sát và ghi nhận tất cả dấu hiệu của các cơ quan nội tạng của lươn.
- Khử trùng mặt ngoài của cơ quan nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) bằng cồn
70o.
- Dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên thận hay vết thương. Đặt
que cấy vào nơi vừa rạch, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên
đĩa môi trư ờng TSA. Lưu ý: que cấy phải được tiệt trùng trước khi sử
dụng bằng cách hơ que cấy trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ và để
nguội.
- Ủ các đĩa này trong t ủ ấm ở nhiệt độ 28oC sau 24 giờ. Quan sát ghi nhận
màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc.
- Tiến hành tách ròng cho đến khi có được đĩa c ấy thuần.
Chú ý: các thao tác trên phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
3.4.3 Phương pháp làm tiêu bản kính phết
- Dùng kim tiêm lấy máu, nhỏ một giọt máu ở đầu lame, kế tiếp dùng một
lame sạch khác đặt vào ngay giọt máu hợp một gốc 45o để máu lan ra sau
đó kéo về phía cuối lame.
- Dùng nhíp tiệt trùng lấy một ít cơ quan từ gan, thận, tỳ tạng phết đều lên
lame sạch.
- Để khô nhiệt độ phòng.
- Cố định trong methanol trong thời gian 1 phút.
- Để ở ngăn mát (nếu chưa nhuộm liền).
- Nhuộm mẫu theo phương pháp Humason, 1979 trích dẫn bởi Rowley, 1990
+ Cho lame vào dung dịch Wright trong 3-5 phút.
+ Chuyển mẫu sang dung dịch pH 6,2-6,8 từ 5-6 phút.
+ Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút.
+ Cho mẫu vào dung dịch pH từ 15-30 phút.
Cách pha các dung dịch được trình bày ở phụ lục 1
- Đọc kết quả dưới kính hiển vi vật kính 100X có giọt dầu.
3.4.4 Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn
15

- Cấy các chủng vi khuẩn sau khi tách ròng trên đĩa môi trư ờng TSA đã
thuần và được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm Gram lên môi trường
thạch máu.
- Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 35oC thời gian 24-48 giờ và đọc kết quả.
- Phương pháp đổ môi trường thạch máu được trình bày ở phụ lục 2.
3.4.5 Phương pháp định danh vi khuẩn
Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
- Nhuộm Gram để kiểm tra vi khuẩn đã thuần, quan sát hình dạng và biết
được vi khuẩn thuộc Gram âm hay dương. Phương pháp nhuộm được trình
bày ở phụ lục 2. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu.
- Tiến hành test các chỉ tiêu sinh hóa theo phương pháp truyền thống
+ Kiểm tra tính di động
+ Phản ứng Oxidase
+ Phản ứng Catalase
+ Khả năng lên men và oxy hóa đường Glucose (O/F).
+ Phản ứng O/129
Phương pháp thực hiện và thành phần môi trường được trình bày ở phụ lục 2.
Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API
- Định danh theo nhà sản xuất (BioMérieux).
- Tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu nhuộm Gram, di động, Oxidase, Catalase,
phản ứng O/F.
- Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kít API 20E

16


Bảng 3.1: Thành phần các chỉ tiêu trong bộ kít API 20E (BioMérieux).
Chỉ tiêu

Chất nền

Phản ứng/ enzyme

Âm tính

Dương tính

ONPG

Ortho-nitrophenyl galactosidase

Beta-galactosidase

Không màu

Vàng

ADH

Arginine

Arginine dihydrolase

Vàng

Đỏ/cam

LDC

Lysine

Lysine decarboxylase

Vàng

Cam

ODC

Ornithine

Ornithine decarboxylase

Vàng

Đỏ

CIT

Sodium citrate

Citrate utilisation

Vàng

Xanh/xanh lá

H2S

Sodium Thiosulphate

H2S production

Không màu

Đen

URE

Urea

Urease

Vàng

Đỏ/cam

TDA

Tryptophane

Tryptophane deaminase

Vàng

Nâu sậm

IND

Tryptophane

Indole production

Vàng

Đỏ (2 phút)

VP

Sodium Pyruvate

Acetoin production

Không màu

Hồng/đỏ (10 giây)

GEL

Gelatin

Gelatinase

Kết tủa đen

Màu đen hòa tan

GLU

Glucose

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

MAN

Mannitol

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

INO

Inositol

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

SOR

Sorbitol

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

RHA

Rhamnose

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

SAC

Sucrose

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

MEL

Melibiose

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

AMY

Amygdalin

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

ARA

Arabinose

Fermentation/oxidation

Xanh/xanh lá

Vàng

Phương pháp thực hiện

- Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý
hoặc nước cất tiệt trùng, lắc đều.
- Cho một ít nước vào khuôn nhựa của bộ kít để giữ ẩm trong suốt quá trình ủ
trong tủ ấm.
- Đặt bộ kít API 20E vào khuôn nhựa
- Dùng pipette với đầu cone tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô
của bộ kít
+ Cho vi khuẩn vào đầy các ô CIT, VP và GEL.
+ Cho vi khuẩn vào ½ các ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE, kế tiếp cho
dầu paraffin tiệt trùng vào đầy ô.
+ Cho vi khuẩn vào ½ các ô còn lại.
- Đậy nắp khuôn nhựa và ủ trong tủ ấm ở 28oC.
- Đọc kết quả sau 24 giờ
17


Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử
- TDA: nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu nâu sậm xuất hiện thì kết
quả phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì k ết quả phản ứng là âm
tính (-).
- IND: nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện
là phản ứng dương tính (+), màu vàng là phản ứng âm tính (-).
- VP: lần lượt cho 1 giọt thuốc thử VP1 và 1 giọt thuốc thử VP2. Đợi ít nhất
10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+), nếu
màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10-12 phút là phản ứng âm tính (-).
3.4.6 Phương pháp PCR
Quy trình PCR phát hiện A. hydrophila theo Panangala et al. (2007) (có điều
chỉnh theo Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010).
Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thận của lươn được trữ trong ethanol.
Quy trình thực hiện

- Tách chiết ADN từ mô thận lươn
+ Thận lươn trữ trong ống eppendorf 1,5 mL, loại bỏ ethanol sau đó nghiền
nát mẫu trong 600 µL dung dịch Lysis buffer (0,5M NaCl; 0,001 EDTA;
1% SDS; 0,8% Triton; 0,1M Tris-HCl), 40 µL SDS 10% và 2,5 µL
Protein K (40 mg/mL). Chuyển động đảo lộn ống 25 lần. Ủ mẫu 15 phút
ở nhiệt độ 37oC.
+ Cho vào 2,5 µL RNase (2 mg/mL). Chuyển động đảo ngược ống 25 lần.
Ủ dung dịch ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút.
+ Cho vào 600 µL Chloroform – Isoamyl (24:1) đảo và ly tâm 13.000 vòng
trong 15 phút ỏ nhiệt độ 4oC. Protein sẽ lắng xuống thành 1 lớp nhỏ giữa
2 pha. Cẩn thận hút dung dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1,5 mL
khác.
+ Cho vào 600 µL Phenol – Chloroform – Isoamyl (25:24:1) và đảo ngược
ống để rửa ADN. Ly tâm 13.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ 4oC. Cẩn
thận hút dung dịch phía trên cho vào ống eppendorf khác.
+ Cho vào 600 µL Isopropanol lạnh. Ly tâm 13.000 vòng trong thời gian 10
phút ở nhiệt độ 4oC. ADN lắng đáy ống eppendorf, nhẹ nhàng loại bỏ
dung dịch phía trên.

18


+ Cho vào 600 µL cồn 70% lạnh. Dùng tay đánh nhẹ để rửa ADN. Nhẹ
nhàng loại bỏ cồn phía trên.
+ Lặp lại bước trên thêm một lần nữa. Dùng micropipette loại bỏ cồn thật
kỹ.
+ Lật ngược và phơi ống trong vài giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Cho thêm 50 µL TE buffer (10 mM Tris, 10 M EDTA, có pH=7) vào ống
eppendorf chứa ADN, bảo quản thời gian ngắn ở 4oC và bảo quản lâu ở 20oC.
Đo hàm lượng ADN bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 260 nm.

+ Đầu tiên sử dụng 500 µL TE để tạo mẫu blank. Đo mẫu TE 3 lần rồi mới
đo mẫu ADN.
+ Mẫu ADN đã đư ợc pha loãng 100 lần (1 µL ADN + 99 µL nước cất), với
thể tích đo là 500 µL.
+ Hàm lượng được tính bằng công thức
Hàm lượngADN (µg/mL) = OD260 nm x 50 x độ pha loãng
- Quy trình khuếch đại
Thành phần phản ứng
Bảng 3.2: Thành p hần hóa chất qui trình PCR phát hiện A. hydrophila
Thể tích ( µL)
Hóa chất/dung dịch
Nồng độ
Nước cất
17
PCR Buffer
1X
2,5
MgCl2
1,5 mM
1,5
dNTPs
0,2 mM
0,5
Taq DNA polymerase
2,5 UI
0,5
Đoạn mồi (AeroFd)
0,4 µM
1
Đoạn mồi (AeroRs)

0,4 µM
1
ADN
100 ng
1
Thể tích phản ứng
25
Chu kỳ nhiệt
o
95 C trong 4 phút
95oC trong 30 giây
60oC trong 45 giây
30 chu kỳ
o
72 C trong 30 giây
72oC trong 10 phút
- Chạy điện di
19