SO SÁNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN của lá BÀNG (terminalia catappa l) được LY TRÍCH BẰNG ETHANOL 90 o và ETHANOL 70 o

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

NGUYỄN HOÀN MINH

SO SÁNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA LÁ
BÀNG (Terminalia catappa L) ĐƯỢC LY TRÍCH
BẰNG ETHANOL 90O VÀ ETHANOL 70O

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

12/ 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

SO SÁNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA LÁ
BÀNG (Terminalia catappa L.) ĐƯỢC LY TRÍCH
BẰNG ETHANOL 90O VÀ ETHANOL 70O

Cán bộ hướng dẫn:
ThS. BÙI THỊ LÊ MINH

Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN HOÀN MINH
MSSV : LT10522

Lớp : CN1067L1

Cần Thơ, 12/2012

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
Đề tài “So sánh hoạt tính kháng khuẩn của lá Bàng (Terminalia catappa L.)
được ly trích bằng Ethanol 90 o và Ethanol 70o" do sinh viên Nguyễn Hoàn
Minh thực hiện tại phòng Dược lý thú y, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ từ 08/2012 đến 11/2012.

Cần thơ, ngày tháng năm 2013
Duyệt Của Bộ Môn
(Ký tên)

Cần thơ, ngày tháng năm 2013
Giáo Viên Hướng Dẫn
(Ký tên)

Cần thơ, ngày tháng năm 2013
Duyệt Của Khoa NN & SHƯD
(Ký tên)

ii

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin cảm ơn gia đình và người thân đã hết lòng quan tâm, động viên,
khích lệ tinh thần và chia sẽ cùng tôi những khó khăn trong suốt quá trình học tập
tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong Bộ môn Thú Y và thầy cố vấn học
tập đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báo để giúp tôi học tập, làm
việc tốt hơn.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Lê Minh đã nhiệt tình chỉ dẫn và
tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp Thú Y Liên Thông khóa 36 và các
bạn Thú Y trong nhóm đã quan tâm, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
qua.
Xin chân thành cảm ơn!

iii


MỤC LỤC
TRANG TỰA .............................................................................................................................. i
TRANG DUYỆT........................................................................................................................ii
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ................................................................................................................................iv
DANH MỤC VIẾT TẮT........................................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG.................................................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................. vii
TÓM LƯỢC.......................................................................................................................... viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .........................................................................................1
CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ...................................................................................2
2.1.1 Phân loại.................................................................................................................2

2.1.2 Đặc điểm ................................................................................................................2
2.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến .................................................................................3
2.1.4 Thành phần hóa học và dưỡng chất......................................................................3
2.1.5 Tác dụng sinh học và biệt dược .................................................................................. 3
2.21 Staphylococcus aureus (S.aureus).........................................................................4
2.2.2 Streptococcus faecalis (S. faecalis)......................................................................4
2.2.3 Escherichia coli (E.coli) ......................................................................................5
2.2.4 Pseudomonas aeruginosa (P.aeruginosa) ..........................................................6
2.2.5 Salmonella spp. (Sal.spp.)....................................................................................7
2.2.6 Aeromonas (A.hydrophila)...................................................................................8
2.2.7 Edwardsiella ictaluri (E.ictaluri) ........................................................................8
2.2.8 Edwardsiella tarda (E.tarda)................................................................................9
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................10
3.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm.......................................................................10
3.1.2 Hóa chất và thiết bị......................................................................................................10
3.1.3 Vi khuẩn dùng trong nghiên cứu .......................................................................10
3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu ................................................................................10
3.2.2 Chiết xuất cao Bàng ............................................................................................11
3.3.4.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ......................................................13
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .....................................................................17
4.1 Hiệu suất điều chế cao thô .....................................................................................17
4.2 Kết quả ẩm độ cao thô............................................................................................17
4.3 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao thô của Bàng ..................18
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................20
5.1 Kết luận ............................................................................................................................20
5.2 Đề nghị .............................................................................................................................20
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................21
PHỤ LỤC

iv

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT
DMSO
MIC
MHA
NA
TSA

Dimethyl Sulfoxide
Minimum Inhibitory Concentration
Mueller Hinton Agar
Nutrient Agar
Trypticase Soy Agar

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Hiệu suất chiết xuất của 2 mẫu lá Bàng .....................................................17
Bảng 2. Vật chất khô và ẩm độ của cao lá Bàng từ Ethanol 90o và Ethanol 70 o ...17
Bảng 3. Nồng độ ức chế tối thiểu của hai loại cao ở trạng thái ướt ........................18
Bảng 4. Nồng độ ức chế tối thiểu của hai loại cao ở trạng thái khô hoàn toàn ......19

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Thân, hoa và quả Bàng....................................................................................2
Hình 2. Quy trình chiết xuất mẫu...............................................................................11

Hình 3. Quy trình chuẩn độ vi khuẩn .......................................................................14
Hình 4. Quy trình xác định MIC cao chiết thô .........................................................15

vii


TÓM LƯỢC
Để so sánh hoạt tính kháng khuẩn của là Bàng (Terminalia catappa L.) được ly
trích bằng Ethanol 90o và Ethanol 70o, chúng tôi tiến hành phân tích mẫu nghiệm
từ tháng 08 đến tháng 11 năm 2012 tại phòng thí nghiệm Dược lý thú y - Bộ môn
Thú y - Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng - Khu II trường Đại học Cần
Thơ với kết quả thu được như sau:
- Hiệu suất chiết xuất của cao lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 90o là 7,64% và
hiệu suất chiết xuất từ cao lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 70 o là 10,41%.
- Ẩm độ của cao lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 90o là 19,54% và ẩm độ của
cao lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 70o là 18,13%.
- Nồng độ ức chế tối thiểu của hai mẫu cao lá Bàng đối các chủng vi khuẩn S.
aureus và E. coli là tương đương nhau với MIC là 1024 µg/ml, tương tự đối với
Sal. spp và A. hydrophila có MIC là 2048 µg/ml, riêng đối với E. ictaluri và E.
tarda có MIC thấp nhất là 256 µg/ml. Ngược lại, nồng độ ức chế tối thiểu của cao
lá Bàng được ly trích từ Ethanol 70o đối với các chủng S. faecalis (MIC là 1024
µg/ml)và P. aeruginosa (MIC là 128 µg/ml) thì thấp hơn phân nửa so với nồng độ
ức chế tối thiểu của cao lá Bàng được ly trích từ Ethanol 90o.
Tóm lại, cao lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 90o có hoạt tính kháng khuẩn
thấp hơn so với lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 70 o và chủng vi khuẩn
Pseudomona aeryginosa nhạy cảm nhất với hai loại cao lá Bàng.
Từ khóa: lá Bàng, khả năng kháng khuẩn.

viii

CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Những năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta khá phát triển do áp dụng các thành
tựu khoa học kỹ thuật trong chăn nuôi và đang từng bước chuyển đổi từ hình thức
chăn nuôi nhỏ lẻ sang hình thức chăn nuôi tập trung công nghiệp hoặc bán công
nghiệp. Tuy có một số thuận lợi, nhưng tình hình dịch bệnh vẫn còn diễn ra khá
phức tạp đã ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe đàn vật nuôi nói chung và kinh tế
người chăn nuôi nói riêng. Hiện nay, có rất nhiều công trình nghiên cứu về các
phương thức điều trị bệnh trong chăn nuôi có hiệu quả, nhưng tình trạng tồn trữ
thuốc kháng sinh trong cơ thể đàn vật nuôi vẫn còn cao, làm ảnh hưởng trực tiếp
đến sức khỏe người tiêu dùng. Chính vì thế, một hướng đi mới cho các bác sỹ, dược
sỹ thú y đó là nguồn dược liệu thiên nhiên có chứa một số hoạt chất kháng sinh thực
vật có thể điều trị được bệnh cho đàn vật nuôi và phù hợp với nhu cầu tiêu thụ sản
phẩm sạch hiện nay.
Ở nước ta việc sử dụng các loại cây cỏ trong điều trị bệnh cho người và vật nuôi đã
được áp dụng từ rất lâu đời. Trong kho tàn dược liệu thiên nhiên, nhân dân ta đã
biết sử dụng các loai cây như: cây Sả, cây Nghệ, cây Tỏi… để điều trị bệnh. Bên
cạnh chúng, cây Bàng là vị thuốc quí mà con người đã áp dụng điều trị bệnh như:
vỏ Bàng sắc uống chữa lỵ, tiêu chảy và rửa các vết thương, vết loét; lá Bàng còn
dùng sắc uống chữa cảm sốt; hạt Bàng dùng chữa tiêu ra máu (Đỗ tất lợi, 2003).
Bên cạnh đó, ethanol là dung môi được dùng phổ biến để chiết xuất dược liệu, tuy
nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về nồng độ ethanol sử dụng trong chiết xuất
dược liệu để đạt được hiệu quả chiết xuất cao nhất.
Để tìm hiểu thêm về những đặc tính hữu ích trên, trong điều kiện cho phép chúng
tôi xin tiến hành thực hiện đề tài: “So sánh hoạt tính kháng khuẩn của lá Bàng
(Terminalia catappa L.) được ly trích bằng Ethanol 90o và Ethanol 70o” với mục
tiêu so sánh hoạt tính kháng khuẩn của cao lá Bàng được ly trích bằng Ethanol 90o
và Ethanol 70o.

1


CHƯƠNG 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY BÀNG
2.1.1 Phân loại
Cây Bàng có tên khoa học là Terminalia catappa L. thuộc bộ Myrteles, họ Trâm
Bầu (Combretaceae), chi Terminalia, loài Terminalia catappa L. (Thomson Lex A.
J. and Evans B. (2006)).
Tên gọi ở các nước khác: Indian almond – tree (Ấn Độ), Tropical almond (Anh),
Badamier (Pháp) (Gilman E.F. and Watson2 Dennis G., 1994).
Bàng còn gọi là Quang Lang, ChamBok parang parcang prang (Campuchia),
Badamier (Pháp) (Đỗ Tất lợi, 2003).
2.1.2 Đặc điểm hình thái
Bàng là một cây to, có thể cao đến 25m cành mộc vòng làm cho tán cây xòe ra như
cái lộng. Lá to hình thìa, đầu tròn, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông hung nhạt, phiến
lá dài 20 - 30cm rộng 10 - 13cm. Hoa nhiều mộc thành bông dài 15 – 20cm, trên
cáng bông hoa có lông. Quả hình bầu dục, nhẵn dẹp với 2 bên rìa hẹp, đầu hơi nhọn,
dài 4cm, rộng 3cm, dày 15cm, hạt có nhân trắng chứa nhiều dầu. Mùa quả: tháng 8
đến tháng 10 (Đỗ Tất lợi, 2003).

Hình 1. Thân, hoa và quả Bàng

Cây dễ mắc bệnh đốm lá và bọ trĩ tấn công. Đây là một trong những vấn đề đáng
lưu tâm khi chăm sóc cây (Gilman E.F. and Watson2 Dennis G., 1994).
Thông thường 1 - 5 quả của cây phát triển trên một phần của các cành hoa. Quả
không cuống, hẹp theo bề ngang, hình trứng, da trơn, có hột cứng. Trong quá trình
trưởng thành, nó thay đổi màu sắc từ xanh qua vàng, màu đỏ tươi hoặc đỏ tía tới lúc
trưởng thành hoàn toàn (Thomson Lex A. J. and Evans B., 2006).

2


2.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến
Cây bàng được trồng khắp nơi làm cây bóng mát. Người ta cho rằng cây bàng vốn
không có ở nước ta, mà di thực từ đảo Moluques vào. Người ta thường dùng lá, vỏ
và hạt. Về mặt nguyên liệu cho dầu thì năng suất bàng thấp vì việc tách nhân bàng
rất vất vả. Từ 100g hạch khô chỉ tách được 23g nhân (Đỗ Tất Lợi, 2003).
Thường sống ở vùng nhiệt đới và ven biển. Nó phân bố trải dài từ Seychelles đến
Ấn Độ, Andamans và các đảo lân cận, và khắp khu vực Đông Nam Á (Myanmar,
Thái Lan, bán đảo Mã Lai, Việt Nam, Philippines, Indonesia), Papua New Guinea
và Bắc Australia phía Nam. Loài này được tìm thấy trên khắp khu vực Nam Thái
Bình Dương, bao gồm cả quần đảo Solomon, Vanuatu và Fiji. Nó hiện diện gần như
tất cả các quần đảo Polynesia và Micronesia. Loài này chịu được gió mạnh, độ mặn,
và sống được ở đất cát, có vai trò quan trọng bảo vệ bờ biển. Cây khoảng 3 năm
tuổi có thể thu hoạch trái và sử dụng. Có thể dễ dàng trồng và nhân giống cây bằng
hạt (Thomson Lex A. J. and Evans B., 2006).
2.1.4 Thành phần hóa học
Lá và vỏ cây chứa tanin: vỏ thân chứa từ 25 – 35% tanin pyrogalic và tanin
catechic. Vỏ cành chứa 11% tanin. Nhân hạt chứa 50% dầu béo màu vàng nhạt hay
lục nhạt, vị dễ chịu, giống như dầu hạnh nhân, ăn được. Tuy nhiên, nhân chỉ chứa
10% toàn quả cho nên cuối cùng quả chỉ chứa 5% dầu béo, việc tách nhân lại đòi
hỏi nhiều công sức, chưa cơ giới hóa được cho nên đến nay việc khai thác dầu hạt
Bàng chưa được đặt ra. Một số tính chất của dầu hạt Bàng đã được nghiên cứu kết
quả như sau: tỷ trọng (0,917), chỉ số khúc xạ ở 35oC là (1,4660), độ đông đặc ở 1oC,
chỉ số axit là (2,94), chỉ số xà phòng là (197,8), chỉ số iod là (60,72), phần không xà
phòng hóa (0,38), axit toàn phần tách được ở dạng đặc, màu vàng nhạt hay trắng
phần axit đặc chiếm tới 36%.
Do chỉ số iod thấp và không cho phản ứng hexabromua nên người ta có thể kết luận

dầu Bàng không có glyxerit linoleic và thuộc loại dầu không khô (Đỗ Tất Lợi,
2003).
2.1.5 Tác dụng sinh học và biệt dược
Lá, vỏ cây, và da trái cây được sử dụng trong y học. Lá sử dụng làm thuốc trị khó
tiêu và chống bệnh lỵ. Ở Việt Nam lá non được sử dụng để chữa bệnh nhức đầu và
đau bụng. Vỏ cây được sử dụng như một chất làm se trong bệnh lỵ và bệnh tưa
miệng (Đỗ Tất Lợi, 2003).

3


Tại Đài Loan, cây Bàng được sử dụng như một loại thuốc thảo dược trong điều trị
các bệnh liên quan đến gan. Lá có chứa chất dùng làm hóa trị phòng ngừa ung thư.
Có tiềm năng chứa chất anticarciogenic. Có đặc tính chống oxy hóa. Có tác dụng
kích dục, nó có thể được sử dụng trong điều trị một số bệnh về giới tính (xuất tinh
sớm). Cây Bàng cũng được sử dụng bởi các nhà lai tạo cá hồ, cá nhiệt đới để giữ
cho chúng khỏe mạnh (các loại cá betta, cá da trơn và tetras). Nó có tính chất kháng
khuẩn cao. Trà làm từ lá cây Bàng được sử dụng chống lại bệnh lỵ và tiêu chảy
(TropillabRinc expoerter & Wholesaler of madicinal plants herbs & Tropicalseeds,
2011).
Theo Wee Yeow Chin (1992), lá, vỏ cây và hoa quả điều trị bệnh lỵ (Đông Nam Á).
Lá sử dụng loại bỏ ký sinh trùng đường ruột (Philippines), cầm máu (Mexico), lá
già được sử dụng để điều trị bệnh gan (Đài Loan), lá non trị đau bụng (Nam Mỹ).
Nước ép của lá dùng trị ghẻ, bệnh ngoài da (Ấn Độ, Pakistan), Vỏ cây điều trị rối
loạn dạ dày và tiêu chảy (Samoa), sốt, kiết lỵ (Brazil).
2.2 VI KHUẨN
2.2.1 Staphylococcus aureus (S. aureus)
Trong các loài vật, ngựa dễ cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, lợn, cừu. Gà vịt có sức
đề kháng rất cao đối với S. aureus (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Đặc điểm hình thái: Đường kính 0,5 – 1,5 m , gồm nhiều cầu khuẩn gắn liền nhau

tạo thành hình giống như chùm nho, bắt màu gram dương, không có lông, không có
nha bào, thường không có vỏ nhày (Asperger, 1994).
Đặc điểm nuôi cấy: Dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 – 40oC, thích hợp
điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. Nhiệt độ thích hợp 30 – 37 oC, pH tốt nhất là 7,0 –
7,5 (Asperger, 1994).
Tính kháng thuốc: Sự kháng kháng sinh của S. aureus là một đặc điểm rất đáng chú
ý. Đa số S. aureus kháng Penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men
Penicillinase. Một số còn kháng lại được Methicillin gọi là Methicillin Resistant S.
aureus (MRSA), do nó tạo ra các protein gắn vào các vị trí tác động của kháng sinh
(Lê Huy Chính, 2007). Theo Nguyễn Ngọc Thanh Hà (2004), S. aureus nhạy cảm
với Ciprofloxacin (95,00%), Getamycin (95,00%), Neomycin(100,00%),
Streptomycin (80,00%). Theo nghiên cứu của trường đại học Akdeniz (2005), S.
aureus nhạy cảm với kháng sinh như Penicillin G (37,50%), Ampicillin (44,10%),
Amoxicillin (52,90%), Methicillin (77,20%), Cloxacollin (77,90%), Cefuroxime
(91,90%), Neomycin (69,10%), Lincomycin (84,60%), Enrofloxacin (97,10%),
Gentamycin (67, 60%) (htt://www.piwet.pulawy.pl).

4


2.2.2 Streptococcus faecalis (S. faecalis)
Theo Mark Huycke thì S. faecalis thuộc họ Enterococceace. S. faecalis sống chủ
yếu trong ruột của con người, vật nuôi (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Ở động vật liên
cầu thường gây những chứng nung mủ , những bệnh biến chứng hay cục bộ, ví dụ
bệnh viêm vú.
Đặc điểm hình thái: Theo Nguyễn Như Thanh và ctv (1997), S. faecalis là những
cầu khuẩn xếp thành chuỗi, uốn khúc dài ngắn khác nhau S. faecalis có thể được tìm
thấy trong ruột già của người, là một trong nhiều họ Enterococci. Vi khuẩn hình cầu
hay hình bầu dục, đường kính trung bình 1 m , bắt màu gram dương. Sở dĩ S.
faecalis xếp thành chuỗi vì nó phân chia trong 1 mặt phẳng thẳng góc với trục của

chuỗi. Chiều dài của chuỗi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường.
Đặc điểm nuôi cấy: S. faecalis là những vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện,
mọc tốt ở tất cả các môi trường và phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37oC. Môi trường
thạch thường: khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám. Khi làm tiêu bản, S.
faecalis không xếp thành chuỗi dài mà thường hình thành chuỗi ngắn (Nguyễn Vĩnh
Phước, 1977).
Tính kháng thuốc: S. faecalis đề kháng hoàn toàn với Gentamycin và Streptomycin
ở nống độ thấp. S. faecalis còn đề kháng với kháng sinh ampicillin (70%)
(http:www.thongnhathospital.org.vn/nckh/2005_60_HNKH.pdf). Phần lớn các
chủng Enterococcus faecalis (trước đây gọi là S. faecalis ) đề kháng với cefaclor và
các loại cephalosporin khác (http: www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc/thuocgoc92.aspx).
2.2.3 Escherichia coli (E. coli)
E. coli thuộc họ Enterobacteriaeceae được mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 do
Theo Escherich người Đức, được xem là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở người
và động vật. (Levine, 1987).
Đặc điểm hình thái: E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2 x 0,6-3 x
0,6 m .Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi
ngắn. Phần lớn E. coli có khả năng di động do có lông xung quanh thân. Vi khuẩn
không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu
đều hay sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy
để nhuộm có thể thấy giáp mô, còn khi soi tươi không thấy được (Nguyễn Như
Thanh và ctv, 1997).

5


Đặc điểm nuôi cấy: E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, nhiệt độ
thích hợp là 37oC, có thể sống ở 10 – 46oC. Mọc dễ dàng trên môi trường Mac
Conkey (MC), Eosin Methylene Blue agar (EMB), Nutrient Borth (NB). Một số hoá
chất ức chế sự phát triển của E. coli như chlorine và dẫn xuất của nó, muối mật

(Nguyễn Thanh Bảo, 2005). Trên thạch thường, sau 24 giờ hình thành những khuẩn
lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3mm.
Nuôi lâu khuẩn lạc hình như nâu nhạt và mọc rộng ra (Nguyễn Như Thanh và ctv,
1997).
Tính kháng thuốc: Theo Bùi Thị Tho (2003), kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của
vi khuẩn phân lập từ heo con bệnh phân trắng của bộ môn Nội Chẩn Dược Độc chất
học trường Đại học Nông nghiệp I (Hà Nội) từ năm 1976 đến nay cho thấy tỷ lệ
kháng thuốc của E. coli đối với Chloramphenicol là 25,78%, với Chlortetracycline
là 23,21% , với Streptomycin và Sulphonamide lần lượt là 77,07% và 89,97%. Theo
Đỗ Ngọc Thuý và ctv (2002), thử tính kháng kháng sinh của 106 chủng E. coli ,
chọn ra từ 323 gốc phân lập được từ heo tiêu chảy ở 4 trại heo miền Bắc, dùng E.
coli ATCC 25922 làm đối chứng, nhận thấy các chủng đề kháng mạnh với các
kháng sinh thông thường vẫn sử dụng điều trị bệnh: Amoxicillin (76,42%),
Chloramphenicol (79,25%), Trimethoprim, Sulfamethoxazole (80,19%),
Streptomycin (88,68%) và Tetracycline (97,17%) và phổ biến là đa kháng với trên 3
loại kháng sinh (90,57%), cá biệt có ba chủng (2,83%) đề kháng với 13 trong số 14
loại kháng sinh được kiểm tra. Đáng quan tâm là đối với Enrofloxacin, một loại
kháng sinh mới thuộc nhóm Quinolone mới được sử dụng trong nhân y và thú y từ
những năm 90, đã có đến 44,34% chủng kháng thuốc.
2.2.4 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)
Trực khuẩn mủ xanh P.aeruginosa còn có tên là Pseudomonas pyocyaneus,
Bacterium pyocyaneum, Pseudomonas Aeruginosa là vi sinh vật có độc lực thấp,
thường tìm thấy trong quá trình nung mủ ở bò, heo và trong các vết thương nhiễm
trùng của người. Trong tự nhiên vi khuẩn có trong đất, nước, không khí, sống hoại
sinh ở da và niêm mạc, phân người và gia cầm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Đặc điểm hình thái: P. aeruginosa có dạng hình que mỏng, gram âm, kích thước
1,5 x 3, hai đầu tròn, đứng riêng từng đơn vị hoặc từng đôi, từng chuỗi ngắn và đôi
khi còn tồn tại dạng hình sợi, hình dấu phẩy, hình cầu. P. aeruginosa chuyển động
bằng tiêm mao, không sinh bào tử và không có vỏ nhầy (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977).

6


Đặc điểm nuôi cấy: P. aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí không bắt buộc,
mọc ở nhiệt độ từ 30 – 37oC, giới hạn nhiệt độ phát triển 5 – 42oC, pH thích hợp là
6,6 – 7,0. Trên môi trường thạch dinh dưỡng như TSA (Trypticase Soy Agar), NA
(Nutrient Agar) khuẩn lạc hơi tròn, rìa không phẳng, trong óng ánh, môi trường
xung quanh khuẩn lạc màu xanh, mùi trái cây (Carter G.R, 1978).
Tính kháng thuốc: P. aeruginosa có được tính kháng thuốc cao là do cấu tạo của
màng tế bào làm giảm khả năng thấm của kháng sinh vào bên trong tế bào của vi
khuẩn, một yếu tố khác là do P. aeruginosa có mang plasmid – R có khả năng
truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid. Theo Bonfiglio et al (1998), P.
aeruginosa kháng một số kháng sinh: Meropenem 9,1%, Ceftazidime 13,4%,
Carbenicillin 27,3%, Ticarcillin/clavulanic acid 22,8%, Amikacin 10,6% và
Ciprofloxacin 31,9%. Theo Hoàng Kim Tuyến và ctv, (2005), P. aeruginosa kháng
mạnh cefoperazone và nhóm aminoglycoside (65 – 70%). Kháng sinh thông dụng
như Ceftazidime cũng chỉ còn nhạy cảm khoảng 50%.
2.2.5 Salmonella spp. (Sal. spp.)
Vi khuẩn Salmonella thuộc bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae.
Salmonella là trực trùng gram âm hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý có khả năng di động,
không tạo bào tử, lên men saccharose và lactose, không sinh indole không phân giải
ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều
sinh H2S (Trần Linh Thước, 2006). Sal. spp. gây bệnh đường ruột, bệnh thương hàn
cho người, gia súc, gia cầm (Koupal, 1997).
Đặc điểm hình thái: Sal. spp. có kích thước 0,4 – 0,6 m x 1 - 3 m , là vi khuẩn
gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, không sinh nha bào, không hình thành giáp
mô, có khả năng di động mạnh do trên thân có lông (7-12 lông chung quanh thân)
trừ Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum. Vi khuẩn dễ nhuộm với các
thuốc nhuộm, khi nhuộm bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu (Nguyễn

Vĩnh Phước, 1977).
Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn Sal. spp. vừa hiếu khí, vừa yếm khí, dễ nuôi, nhiệt độ
thích hợp là 37oC, pH từ 7,2 – 7,6, Sal. spp. của gia súc sinh trưởng trong điều kiện
hiếu khí kém hơn trong điều kiện yếm khí, phát triển tốt trong cơ thể, trong môi
trường trung tính hay kiềm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Môi trường nước thịt: cấy
vi khuẩn vài giờ đã đục nhẹ, sau 18 giờ đã đục đều, nuôi cấy lâu thì đáy ống nghiệm
có cặn, trên bề mặt môi trường có màng mỏng (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).
Môi trường thạch: xuất hiện những khuẩn lạc tròn, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, có

7


màu đỏ nhạt trên môi trường BGA (Brilliant Green Agar), đường kính khuẩn lạc từ
2 - 3 mm (Black Burn et al, 1991).
Tính kháng thuốc: Theo Nguyễn Thị Nguyệt và ctv (2006), Sal. spp có tỷ lệ kháng
thuốc thấp hơn E. coli nhưng kháng cũng khá cao với 6 loại kháng sinh:
Tetracycline và Nalidixic acid (82,4%), Amoxicillin (76,5%), Sulfonamide (64,7%),
Chloramphenicol (58,8%) và Cotrimoxazole/Bactrim (52,9%), Salmonella spp. có
tỷ lệ kháng thấp với Cefoxitine (5,9%), Gentamycin và Cephalothin (23,5%).
2.2.6 Aeromonas (A.hydrophila)
Aeromonas spp. là nhóm vi khuẩn chủ yếu gây bệnh đốm đỏ trên cá tra: A.
hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas sobria. Vi khuẩn có mặt bình thường
trong nước, nhất là trong nước có nhiều chất hữu cơ. Cá con dễ mẫn cảm hơn cả cá
trưởng thành, có thể gây chết đến 80%.
A. hydrophila thuộc nhóm Aeromonas di động, giống Aeromonas, họ
Aeromonasaceae, bộ Aeromonasles, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria (Bùi Quang tề và ctv, 2004).
Đặc điểm hình thái: A. hydrophila là trực khuẩn gram âm, hình que ngắn, hai đầu
tròn, kích thước 0.5 x 1 – 1.5 m , đầu có một tiên mao, là vi khuẩn không sinh nha
bào, di động (Bùi Quang tề, 2006).

Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28 – 30oC. Sinh trưởng
trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1 – 7,2. Trên môi trường thạch, khuẩn lạc
tròn, có rìa đều hơi lồi, nhẵn bòng, màu vàng rất nhạt (Từ thanh Dung và ctv, 2005).
2.2.7 Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri)
E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá da trơn, một bệnh gây thiệt hại nghiêm
trọng cho các hộ nuôi cá tra, basa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tỷ lệ xuất hiện
bệnh này trên cá tra khoảng 61%. Tỷ lệ chết cao nhất (60 - 80%) làm giảm năng
suất đáng kể cho các hộ nuôi (Crumlish và Từ Thanh Dung, 2003).
Đặc điểm hình thái: E. ictaluri có dạng hình que mảnh, không sinh bào tử, gram âm,
có kích thước khoảng 0,75 x 2,5 m , di động ở 26oC là nhờ lông rung (Plum and
Vinitnantharat, 1989).
Đặc điểm nuôi cấy: Vi khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 30oC. Nuôi cấy trên môi
trường TSA hoặc BHI (Bian heart Infusion) sau 48 giờ ủ nhiệt độ 25 – 30oC, khuẩn
lạc phát triển tròn bóng và có kích thước khoảng 2 mm, khuẩn lạc có màu trắng đục
(Francis & Floyd, 1987).

8


Tính kháng thuốc: Tất cả các E. ictaluri đều kháng oxytetracycline, oxilinic acid và
sulfonamide ( Vi
khuẩn E. ictaluri trên cá tra hay cá basa kháng một số loại kháng sinh
Oxytetracycline, Oxolinic acid, Sulfonamide (Từ Thanh Dung và ctv, 2003). Theo
Truong Thy Ho, E. ictaluri kháng với Oxytetracycline (36,2%), Florfenicol (25%),
Ampicillin (15,5%) và Enrofloxacin (12,1%) ( />Drawers/Article/Data007/00007643.PDF).
2.2.8 Edwardsiella tarda (E. tarda)
E.tarda thường gây viêm dạ dày dạng cấp tính, tiêu chảy dạng phân lỏng, kiết lỵ
cũng thường xảy ra. E. tarda là tác nhân gây nhiễm trùng máu ở cá. E. tarda gây
bệnh trên cá tra, cá basa, cá trê, cá điêu hồng, cá rô phi, cá bóng tượng, cá chép, cá
tai tượng (Từ Thanh Dung và ctv, 2003).

Đặc điểm hình thái: Tương tự như E. ictaluri, E. tarda cũng có dạng hình que
mảnh, gram âm, kích thước 1 x 2 - 3  m, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành
tiêm mao, kỵ khí (Bùi Quang Tề và ctv, 2004).
Đặc điểm nuôi cấy: Nuôi cấy E. tarda trên môi trường TSA ở nhiệt độ 30oC thì
khuẩn lạc thường nhỏ phát triển sau 24 – 48 giờ. Tăng trưởng chậm trên môi trường
nuôi cấy và vi khuẩn tăng trưởng rất chậm hoặc không tăng trưởng khi ủ ở 37oC
(Bùi Quang Tề và ctv, 2004).
Tính kháng thuốc: E. tarda kháng tự nhiên với nhóm kháng sinh: Ampicillin,
Antifolate, Chloramphenicol, Ciprofloxacin, Kanamycin, hầu hết các
  Lactamim, và Nitrofurantoin. Tuy nhiên, chúng cũng kháng lại một số loại
kháng sinh: Colistin, Glycopeptides, Lincosamide, Streptogramins và Rifampin. So
với các loài khác trong giống Edwardsiella thì E. tarda còn kháng được Oxacillin và
Benzylpenicillin (Stock and Wiedernann, 2001).

9


CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.1.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
Thời gian: từ 08/2012 đến 11/2012.
Địa điểm thu mẫu: khu II trường Đại học Cần Thơ.
Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Dược lý thú y - Bộ môn Thú y - Khoa
Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ.
Đối tượng nghiên cứu: lá Bàng.
3.1.2 Hóa chất và thiết bị
Hóa chất: Dung môi DMSO, môi tường MHA (Muller Hinton agar), NA, Ethanol
90o và Ethanol 70o dùng để ly trích mẫu Bàng, BaCl2.2H2O, H2SO4, cồn dùng để sát
trùng tay và dụng cụ.

Dụng cụ: Cân điện tử, tủ lạnh, kéo, giấy bạc, cóc thủy tinh, và một số dụng cụ khác,
tủ sấy dụng cụ thủy tinh (Classware Drying Oven), tủ ấm, máy lọc chân không,
Autoclave, máy cô quay chân không.
3.1.3 Vi khuẩn dùng trong nghiên cứu
Chủng Edwardsiella tarda 280208.
Chủng Aeromonas hydrophila 011004.
Chủng Staphylococcus aureus 081008.
Chủng Streptococcus faecalis 010408.
Chủng Escherichia coli 101008.
Chủng Pseudomonas aeruginosa 111008.
Chủng Salmonella spp. 291003.
Chủng Edwardsiella ictaluri CFA 258 – An Giang, 200.
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu
Các mẫu lá Bàng được thu hái vào buổi sáng từ 8 – 10 giờ, hái lá trưởng thành
khoảng 2kg, rửa loại sạch đất, những lá bị sâu, nấm ký sinh và loại bỏ những tạp

10


chất, để ráo nước, sau đó cắt nhỏ cân thành hai phần bằng nhau, mỗi phần 200g, sấy
khô ở nhiệt độ 50oC cho đến khi dòn.
3.2.2 Chiết xuất cao Bàng
Quy trình chiết xuất cao thô được tóm lược qua hình 2.
Mẫu
tươi
Sấy 50oC
Nghiền mịn
Chiết với Methanol
(lần 1)

Dịch chiết
(lần 1, trữ)

Mẫu đã lấy dịch
chiết
Ngâm Methanol
(24 giờ)

Dịch chiết
(lần 2, trữ)

Mẫu đã lấy dịch
chiết
Ngâm Methanol
(24 giờ)

Dịch chiết
(lần 3, trữ)
Cô quay
(40oC)

Mẫu đã lấy dịch
chiết

Loại bỏ

Cao thô

Hình 2. Quy trình chiết xuất mẫu

11


Sau khi lá Bàng được sấy khô lần lượt ngâm riêng hai phần lá Bàng trong Ethanol
90o và Ethanol 70o, 3 ngày sau đó chiết lấy dịch chiết và tiếp tục ngâm và chiết với
Ethanol 90o và Ethanol 70o, 2 ngày nữa mỗi ngày chiết một lần (24 giờ/lần). Loại bỏ
dung môi trong các dịch chiết và cô đặc các dịch chiết đó bằng máy cô quay chân
không ở nhiệt độ 40oC cho đến khi cắn. Cao này sẽ được dùng trong thí nghiệm xác
định nồng độ ức chế tối thiểu trên tám chủng vi khuẩn.
+ Tính ẩm độ các loại cao
Chén dùng để đựng mẫu cao được sấy ở nhiệt độ 105oC cho đến khi trọng lượng
không đổi (sai số cho phép là 0.1%), được khối lượng chén sau sấy.
Cân 1g mẫu cao cho vào chén và đem sấy ở nhiệt độ 105oC đến khi có trọng lượng
không đổi (sai số cho phép là 0,3%), được khối lượng chén và mẫu sau sấy (Lưu
Hữu Mãnh và Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 1997).
Ẩm độ cao được tính theo công thức:
H = 100% - DM
msau sấy – mchén
Với DM =

x 100%
mmẫu

Trong đó:
H: phần trăm độ ẩm của cao (%)
DM: vật chất khô của mẫu (%)
msau sấy : trọng lượng mẫu và chén sau sấy (g)
mchén : trọng lượng chén sau sấy (g)
mmẫu : trọng lượng mẫu trước sấy (g)

Từ độ ẩm sẽ quy ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ở trạng thái khô hoàn toàn theo
công thức:
MIC100%DM = DM x MIC
Trong đó:
MIC100%DM: nồng độ ức chế tối thiểu ở trạng thái khô hoàn toàn (µg/ml)
MIC: nồng độ ức chế tối thiểu ở ẩm độ của cao (µg/ml)
+ Tính hiệu suất chiết xuất cao
Cao Bàng sau khi cô quay được tính hiệu suất theo công thức sau:

12


mcao
HS =

x 100%
mmẫu tươi

Trong đó:
HS: hiệu suất chiết xuất (%)
mcao: trọng lượng cao sau cô quay (g)
mmẫu tươi: trọng lượng mẫu tươi (g)
3.2.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Bàng
+ Chuẩn độ đục
Sử dụng thang độ đục Mac Farland 0,5 được pha chế như sau: thêm 0,05ml BaCl2
0,048M (1,175% BaCl2.2H2O) vào 9,95ml H2SO4), sau đó khuấy liên tục để tạo
huyền dịch. Điều chỉnh độ đục của huyền dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước
sóng 625 nm nằm trong khoảng 0,08 – 0,10.
Chọn ống nghiệm có cùng kích thước với các ống nghiệm dùng chuẩn độ vi khuẩn,
cho vào ống nghiệm đó 4 – 6ml huyền dịch, đậy nút chặt.

Chuẩn độ đục được bảo quản ở nhiệt độ phòng và để trong bóng tối, trước khi sử
dụng phải lắc mạnh để huyễn dịch phân tán đều trở lại. Nếu thấy lợn cợn phải loại
bỏ. Hàng tháng phải kiểm tra lại độ hấp thu.
+ Chuẩn độ vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn gốc được nuôi cấy tăng sinh riêng trên môi trường NA. Môi
trường NA được pha, hấp vô trùng ướt và cho 15ml vào mỗi đĩa petri đã được vô
trùng 180o, sau đó:
- Ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC trong 24 – 48 giờ đối với chủng vi khuẩn E. ictakuri và E.
tarda. Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ đối với chủng vi khuẩn: S. aureus, S. faecalis,
E. coli, P. aeruginosa, Sal. spp. và A. hyrophila.
Dùng que cấy đã được tiệt trùng lấy riêng một ít khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn
trên và cho chúng vào các ống nghiệm chứa dung dịch NaCl 0,9% (đã hấp tiệt trùng
ở 121oC trong 15 phút), sau đó khuấy đều các ống này để vi khuẩn phân bố đều
trong dung dịch. Điều chỉnh độ đục của các ống nghiệm dùng chuẩn độ vi khuẩn
sao cho bằng với độ đục ống Mac Farland 0,5 (có mật độ vi khuẩn tương đương 108
CFU/ml), huyền dịch vi khuẩn trên được pha loãng 100 lần để có mật độ vi khuẩn
đạt 106 CFU/ml (Nguyễn Hữu Bảy và ctv,1986).
Các ống chuẩn độ vi khuẩn này được dùng để xác định MIC của các loại cao thử
nghiệm. Vi khuẩn sau khi điều chỉnh độ đục được sử dụng trong vòng 15 phút, và

13


được lắc lên trước khi sử dụng. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng theo
phương pháp pha loãng trong thạch.
Quy trình chuẩn độ vi khuẩn được tóm lược qua hình 3.
Ghi chú:

Vi khuẩn

NA: Nutrient Agar
VK: vi khuẩn

Cấy chuyển
Môi trường NA
Ủ 28-37oC
24-48 giờ
Chuẩn độ VK so với Mac Farland 0,5
Mật độ vi khuẩn 108CFU/ml
Mật độ vi khuẩn 106CFU/ml

Hình 3. Quy trình chuẩn độ vi khuẩn

+ Chuẩn bị nồng độ chất thử
Lần lượt cân 800mg mỗi loại cao cho vào 10ml dung môi DMSO đã được tiệt trùng,
được dung dịch gốc có nồng độ 80000 g / ml , khi sử dụng phải pha loãng dung dịch
gốc này tạo thành các dãy nồng độ khác nhau trong môi trường thử nghiệm (có
nồng độ sau bằng ½ nồng độ trước) như sau: 4096 g / ml , 2048 g / ml ,
1024 g / ml , 512 g / ml , 256 g / ml ,... 64 g / ml . Khoảng nồng độ cần pha tùy
thuộc vào MIC dự đoán của chất thử.
Lần lượt trộn riêng các cao thử nghiệm này vào môi trường thạch MHA đã hấp vô
trùng ở 121oC trong 15 phút và để nguội đến 45- 50oC, sau đó lắc để trộn đều chất
thử trong môi trường thạch, đổ thạch vào đĩa petri và để cho thạch đông lại.
+ Tiến hành cấy vi khuẩn
Dùng micropipette cấy lần lượt 1 l huyền dịch các vi khuẩn đã chuẩn độ đục lên bề
mặt môi trường thạch có chứa chất thử nghiệm.

14

Quy trình xác định MIC được tóm lược qua hình 4.
Nước cất (ml) + MHA
-

Hấp 121oC, 15’
40-50oC
Cho dung dịch gốc vào

Dung dịch gốc (80000 g / ml )
- Đổ đĩa

4096 g / ml

2048 g / ml

64 g / ml

Cấy

Để yên 15 phút
Ủ 28 – 37oC
Sau 24 – 48 giờ

Đọc kết quả

Hình 4. Quy trình xác định MIC cao chiết thô

Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất. Mỗi chủng vi khuẩn được cấy thành 1 chấm (thí
nghiệm được tiến hành trên 8 chủng vi khuẩn). Ở mỗi nồng độ cấy 2 chủng E.
ictakuri và E. tarda trên 1 đĩa và 6 chủng vi khuẩn còn lại trên 1 đĩa, khi thay đổi

15


chủng vi khuẩn thì thay đổi đầu cấy, thay đổi môi trường đầu cấy cũng được thay
bằng đầu khác. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Bên cạnh đó, ta cũng tiến hành cấy trên đĩa đối chứng, đĩa đối chứng không chứa
cao thử nhưng có chứa dung môi pha loãng (DMSO).
Để yên 15 phút cho vết chấm khô. Lật ngược hộp thạch đã cấy, sau đó đem ủ ở
nhiệt độ 28-30oC trong 24 – 48 giờ đối với chủng vi khuẩn E. ictakuri và E. tarda, ủ
ở 37oC trong 24 giờ đối với chủng vi khuẩn S. aureus, S. faecalis, E. coli, P.
aeruginosa, Sal. spp. và A. hyrophila.
Đọc kết quả dựa vào sự quan sát sự không mọc của các khuẩn lạc trên môi trường
chứa chất thử nghiệm ở nồng độ thấp nhất để xác định MIC.

16