HIỆU QUẢ các LOẠI CARBOHYDRAT TRÊN sự SINH TRƯỞNG và PHÁT TRIỂN của LAN CATTLEYA IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

TRIỆU XUÂN THƯƠNG

HIỆU QUẢ CÁC LOẠI CARBOHYDRAT TRÊN SỰ
SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN
CATTLEYA IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

CẦN THƠ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NÔNG HỌC

HIỆU QUẢ CÁC LOẠI CARBOHYDRAT TRÊN SỰ
SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA LAN
CATTLEYA IN VITRO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGs.Ts Nguyễn Bảo Toàn

Triệu Xuân Thương

Ths. Ngô Thảo Trân

MSSV: 3087706
Lớp: Nông học K34

CẦN THƠ, 2012


LỜI CẢM TẠ


Kính dâng
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con
Chân thành biết ơn
Thầy Nguyễn Bảo Toàn và chị Ngô Thảo Trân đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ
em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Thầy Phạm Ngọc Du cùng qúy thầy cô đã tận tình dìu dắt em trong suốt những
năm Đại Học.
Chị Phạm Thị Tố Lan, anh Phúc, chị Ái, anh Tú, chị Trình, các bạn cùng thực
hiện luận văn trong trại Nghiên Cứu và Thực Nghiệm Nông Nghiệp và toàn thể các
bạn lớp Nông Học Khóa 34 đã giúp đỡ tận tình trong quá trình hoàn thành luận văn.
Thân ái gửi về
Toàn thể các bạn sinh viên Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng trường
Đại Học Cần Thơ lời chúc sức khỏe và thành đạt.

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2012

ii


QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

1. LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Họ và tên: Triệu Xuân Thương
Sinh ngày: 08/12/1990
Nơi sinh: Hòa Tú 1 – Mỹ Xuyên – Sóc Trăng
Chổ ở và địa chỉ liên lạc: ấp Hòa Phước xã Hòa Tú 1 huyện Mỹ Xuyên tỉnh Sóc
Trăng
2. THỜI GIAN HỌC PHỔ THÔNG
2.1 Tiểu học
Thời gian học từ năm 1996 đến năm 2001
Trường: tiểu học Hòa Tú 1A
Địa chỉ: xã Hòa Tú 1 huyện Mỹ Xuyên tỉnh Sóc Trăng
2.2 Trung học cơ sở và trung học phổ thông
Thời gian học từ năm 2001 đến năm 2008
Trường: THPT Văn Ngọc Chính
Địa chỉ: xã Thạnh Phú huyện Mỹ Xuyên tỉnh Sóc Trăng
3. THỜI GIAN HỌC ĐẠI HỌC
Thời gian học từ 2008 – 2012
Trường Đại Học Cần Thơ, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng
Ngành: Nông Học, Khóa 34
Cần thơ, ngày…tháng…năm 2012

iii


LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Cần thơ, ngày… tháng… năm 2012

iv


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG ỤNG

Luận văn tốt nghiệp Kỹ Sư ngành Nông Học với đề tài:

HIỆU QUẢ CÁC LOẠI CARBOHYDRAT TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN CỦA LAN CATTLEYA IN VITRO

Sinh viên thực hiện: Triệu Xuân Thương
Ý kiến cán bộ hướng dẫn: ...............................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012
Cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Bảo Toàn

v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG ỤNG

Sự chấp nhận của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp với đề tài:

HIỆU QUẢ CÁC LOẠI CARBOHYDRAT TRÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN CỦA LAN CATTLEYA IN VITRO

Do sinh viên Triệu Xuân Thương thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn.
Luận văn tốt nghiệp đã được hồi đồng đánh giá ở mức: ..................................................
Ý kiến hội đồng: .............................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2012

CHỦ NHIỆM KHOA

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

vi


MỤC LỤC

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... ix
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................... x
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... xi
TÓM LƯỢC ................................................................................................................... xii
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................ 2
1.1 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI .......................................................................... 2
1.2 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT ....................................................................................... 3
1.3 SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ ....................................................... 4
1.3.1 Giới thiệu ...................................................................................................... 4
1.3.2 Các giai đoạn trong vi nhân giống ................................................................. 5
1.3.3 Môi trường nuôi cấy ...................................................................................... 6
1.3.3.1 Một số môi trường nuôi cấy phổ biến..................................................... 6
1.3.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy ........................................................... 6
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 10
2.1 PHƯƠNG TIỆN................................................................................................... 10
2.1.1 Thời gian thực hiện thí nghiệm ..................................................................... 10
2.1.2 Điều kiện thí nghiệm .................................................................................... 10
2.1.3 Các trang thiết bị và hóa chất thí nghiệm ...................................................... 10
2.2 PHƯƠNG PHÁP.................................................................................................. 11
2.2.1 Chuẩn bị môi trường thí nghiệm ................................................................... 11
2.2.2 Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 12
2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 15
vii


CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 16
3.1 Hiệu quả của gạo lứt trên sự sinh trưởng và phát triển của lan Cattleya in vitro.... 16
3.1.1 Chiều cao gia tăng tương đối ........................................................................ 16
3.1.2 Số lá gia tăng tương đối ................................................................................ 17

3.1.3 Số chồi gia tăng tương đối ............................................................................ 17
3.2 Hiệu quả của khoai lang trên sự sinh trưởng và phát triển của lan Cattleya in
vitro ................................................................................................................................ 19
3.2.1 Chiều cao gia tăng tương đối ........................................................................ 19
3.2.2 Số lá gia tăng tương đối ................................................................................ 19
3.2.3 Số chồi gia tăng tương đối ............................................................................ 20
3.3 Hiệu quả từ việc bổ sung thêm đường và gạo lứt trên sự sinh trưởng và phát
triển của lan Cattleya in vitro .......................................................................................... 22
3.3.1 Chiều cao gia tăng tương đối ........................................................................ 22
3.3.2 Số lá gia tăng tương đối ................................................................................ 22
3.3.3 Số chồi gia tăng tương đối ............................................................................ 23
3.3 Hiệu quả từ việc bổ sung thêm đường và khoai lang trên sự sinh trưởng và phát
triển của lan Cattleya in vitro .......................................................................................... 24
3.4.1 Chiều cao gia tăng tương đối ........................................................................ 24
3.4.2 Số lá gia tăng tương đối ................................................................................ 25
3.4.3 Số chồi gia tăng tương đối ............................................................................ 26
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 28
4.1 KẾT LUẬN.......................................................................................................... 28
4.2 ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 29
PHỤ CHƯƠNG ................................................................................................................

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

MS: Murashige and Skoog (1962)
ctv: Cộng tác viên
CAM: Crassulacean Acid Metabolism

CCL: Giống lan Cattleya Chea Lin
LSD: Least Significant Difference

ix


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tựa hình

Trang

1.1

Hoa lan Cattleya

3

3.1

Hiệu quả của sự bổ sung gạo lứt vào môi trường nuôi cấy mô trên sự 18
sinh trưởng của lan con Cattleya in vitro.

3.2

Hiệu quả của sự bổ sung khoai lang vào môi trường nuôi cấy mô trên 21
sự sinh trưởng của lan con Cattleya in vitro.

3.3

Hiệu quả của sự bổ sung đường sucrose và gạo lứt vào môi trường 24
nuôi cấy mô trên sự sinh trưởng của lan con Cattleya in vitro.

3.4

Hiệu quả của sự bổ sung đường sucrose và khoai lang vào môi 27
trường nuôi cấy mô trên sự sinh trưởng của lan con Cattleya in vitro.

x


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tựa bảng

Trang

3.1

Hiệu quả bổ sung gạo lứt vào môi trường ½ MS lên chiều cao gia tăng

16

tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.
3.2

Hiệu quả bổ sung gạo lứt vào môi trường ½ MS lên số lá gia tăng tương
đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

17

3.3

Hiệu quả bổ sung gạo lứt vào môi trường ½ MS lên số chồi gia tăng
tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

18

3.4

Hiệu quả bổ sung khoai lang vào môi trường ½ MS lên chiều cao gia
tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

19

3.5

Hiệu quả bổ sung khoai lang vào môi trường ½ MS lên số lá gia tăng
tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

20

3.6

Hiệu quả bổ sung khoai lang vào môi trường ½ MS lên số chồi gia tăng
tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

21

3.7

Hiệu quả bổ sung đường sucrose và gạo lứt vào môi trường ½ MS lên
chiều cao gia tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

22

3.8

Hiệu quả bổ sung đường sucrose và gạo lứt vào môi trường ½ MS lên số
lá gia tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

23

3.9

Hiệu quả bổ sung đường sucrose và gạo lứt vào môi trường ½ MS lên số
chồi gia tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

23

3.10

Hiệu quả bổ sung đường sucrose và khoai lang vào môi trường ½ MS lên
chiều cao gia tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

25

3.11

Hiệu quả bổ sung đường sucrose và khoai lang vào môi trường ½ MS lên
số lá gia tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

26

3.12

Hiệu quả bổ sung đường sucrose và khoai lang vào môi trường ½ MS lên
số chồi gia tăng tương đối (%) theo thời gian của lan Cattleya in vitro.

26

xi


TRIỆU XUÂN THƯƠNG, 2012. “Hiệu quả các loại Carbohydrat trên sự sinh trưởng và
phát triển của lan Cattleya in vitro.”, Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng trường Đại Học Cần Thơ.
Người hướng dẫn khoa học: PGs.Ts. NGUYỄN BẢO TOÀN.

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Hiệu quả các loại Carbohydrat trên sự sinh trưởng và phát triển
của lan Cattleya in vitro.” Nhằm xác định hiệu quả của các loại carbohydrat trên sự
sinh trưởng và phát triển của cây lan con nuôi cấy mô giống lan Cattleya., góp phần
hoàn thiện quy trình nhân giống hoa lan in vitro phục vụ nhu cầu sản xuất. Đề tài gồm
4 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

một nhân tố với 5 lần lặp lại mỗi lần một chai, mỗi chai cấy 4 cây. Chồi lan Cattleya
Chea lin có màu đỏ tím được ký hiệu CCl và được tách ra từng cây riêng lẻ với chiều
cao 1 – 2.5cm. Thời gian ghi nhận thí nghiệm 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 ngày về
chiều cao gia tăng tương đối, số lá gia tăng tương đối và số chồi gia tăng tương đối.
Kết quả cho thấy môi trường ½ MS bổ sung gạo lứt hoặc khoai lang không thích hợp
cho sự phát triển của lan Cattleya in vitro. Môi trường ½ MS có bổ sung 10g sucrose
và 20g khoai lang thích thợp cho sự sinh trưởng của lan Cattleya in vitro về chiều cao,
số lá và số chồi gia tăng.

xii


MỞ ĐẦU
Hoa Lan rất đa dạng về chủng loại với vẻ đẹp phong phú, trong số đó có một loài
Lan được gọi là “Hoàng Hậu các loài hoa” chính là Lan Cattleya với vẻ đẹp cao quý được
nhiều người yêu thích (Huỳnh Văn Thới, 1996). Vì vậy việc nhanh chóng cung cấp một số
lượng lớn cây giống sạch bệnh là một yêu cầu tất yếu của thực tiển.

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), phương pháp nhân giống in vitro là phương pháp
có thể tạo ra hàng loạt cây giống đồng nhất trong cùng một lúc với khoảng thời gian ngắn.
Việc nhân giống không bị ảnh hưởng bởi thời tiết và các yếu tố ngoại cảnh (Bùi Bá Bổng,
1995). Quá trình nhân giống in vitro được thực hiện qua bốn giai đoạn (Debergh và
Zimmermann, 1991), trong đó giai đoạn 3 là giai đoạn cây con được hình thành hoàn chỉnh,
do đó việc xác định môi trường thích hợp để cây phát triển tốt là rất quan trọng để có thể
chuyển sang giai đoạn thuần dưỡng (giai đoạn 4). Nguồn năng lượng chính giúp cây phát
triển trong môi trường in vitro thường là sucrose (Bùi Bá Bổng, 1995). Tuy nhiên nếu hàm
lượng sucrose cao thì mô nuôi cấy khó hút được nước, nếu hàm lượng quá thấp lại là một
trong những nguyên nhân gây hiện tượng mọng nước ở mẫu cây (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
Vì vậy, việc bổ sung các nguồn carbonhydrat khác nhằm khắc phục hiện trượng trên, đồng
thời giúp cây phát triển hoàn thiện và nâng cao tỷ lệ sống khi chuyển sang thuần dưỡng. Đa

số các chất hữu cơ được đưa vào môi trường nuôi cấy còn có tác dụng làm tăng sự sinh
trưởng của cây và giảm giá thành sản xuất. Thành phần của khoai lang và gạo lứt có chứa
nhiều carbonhydrat và vitamin, được biết đến như là nguồn thực phẩm năng lượng với giá
thành thấp. Tuy nhiên, chưa thấy nghiên cứu trên môi trường nuôi cấy lan Cattleya.

Đề tài “ Hiệu quả các loại carbohydrat trên sự sinh trưởng và phát triển của lan
Cattleya in vitro ” được thực hiện nhằm xác định hiệu quả của việc bổ sung khoai lang hoặc
gạo lứt kết hợp và không kết hợp với đường sucrose vào môi trường nuôi cấy lan Cattleya
trong giai đoạn tiền thuần dưỡng, góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro, cải
thiện hiệu quả sản xuất.

1


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1

NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI

Ngành : Angiospermae
Lớp: Monocotyledonae
Bộ : Orchidales
Họ : Orchidaceae
Giống: Cattleya sp. Thuộc họ Orchidaceae

Nhóm Cattleya là một nhóm lan lớn. Về mặt thực vật học, nó thuộc về tông
Laelineae, gồm các giống Cattleya, Laelia, Sophronitis, Brassavola, Encyclia, Epidendrum
và nhiều giống khác (Trung Tâm Biên Soạn Dịch Thuật Sách Sài Gòn, 2006). Tuy nhiên

các loại lai từ nhiều giống trên với Cattleya cũng điều gọi chung là Cattleya như
Laeliocattleya, Brassocattleya, Sophrocattleya,… (Huỳnh Văn Thới, 1996).

Nơi sống tự nhiên của chúng là khắp vùng nhiệt đới Nam Mỹ và tận đến Bắc
Mexico. Một số loài có xuất xứ từ miền Tây Ấn Độ. Những cây to và rực rỡ nhất đến từ
vùng núi duyên hải Brazil. Chúng từng có ảnh hưởng rất lớn trong việc lai giống, tạo ra một
lượng khổng lồ những hoa lan mới. Hoa to nhất có kích thước bằng cái đĩa, với nhiều màu
sắc và tươi lâu cả tuần (Trung Tâm Biên Soạn Dịch Thuật Sách Sài Gòn, 2006). Phân bố
chủ yếu ở Thụy Điển, Alaska và ở đảo cực nam Austraylia (Trần Văn Bảo, 1999).

Lan Cattleya được tìm thấy tại Trung Mỹ bởi các nhà thám hiểm vào năm 1818, sau
khi mang về nước Anh, Cattleya được đặt tên bởi nhà thực vật học nổi tiếng, tiến sĩ Lindley
để vinh danh William Cattley, một nhà tự nhiên học người Anh (Sheehan, 1950).

2


Cattleya là một giống Lan đẹp nhất trong họ Orchidaceae, mặt dù Bentham và
Hooker chỉ chấp nhận có 20 loài, nhưng con số hiện nay tăng lên rất nhiều khoảng 65 loài,
chưa kể vô số cây lai được biết. Lan Cattleya là một giống lan có nhiều cây lai nhất trong họ
Lan. Kích thước hoa rất lớn với bề rộng 15 - 20cm và hoa có màu sắc cực kỳ phong phú
(Nguyễn Công Nghiệp, 2006).

Hình 1. Hoa lan Cattleya
(Nguồn: www.orchidboard.com)

1.2

ĐẶC TÍNH THỰC VẬT

Lan Cattleya được phân ra hai nhóm:
 Nhóm 1 lá: giả hành chỉ có một lá, có rất nhiều biến dạng, có củ giả nạc, cụm
hoa có một đến vài hoa lớn kích thước từ 12 - 15cm (Monofoliata). Đa số lan
đẹp đều thuộc nhóm này.
 Nhóm 2 lá: mỗi giả hành có hai lá, hoa nhỏ hơn loại một lá nhưng chùm nhiều
hoa hơn (Bifoliate) (Trần Hợp, 1998).

Khuyết điểm của lan Cattleya là hoa mau tàn, chỉ nở khoảng một đến hai tuần lễ là
tàn, tuy nhiên có loại cho hoa có mùi hương rất thơm (Huỳnh Văn Thới, 1996).

3


Cũng như Dendrobium, Cattleya cũng là loài đa thân nhưng giả hành mập và lùn
hơn, phát triển theo chiều ngang, lúc còn non có bẹ màu xanh bọc lại, lúc lớn các bẹ khô lại
và rụng đi.

Thường trên đỉnh giả hành có một hoặc hai lá to, chính giữa có một lưỡi mèo bao bọc
lấy phát hoa, phát hoa vượt lên và xuyên qua lưỡi mèo để trổ hoa. Mỗi hoa có ba lá đài hình
thuôn, hai cánh ở hai bên, to hơn đài. Cánh thứ ba biến thành môi xòe rộng màu sắc rất đẹp,
có khi nhăn nheo, giữa có trụ nhụy khá cao với bốn phấn khối hình dĩa màu vàng. Trung
bình một năm, một cây lan có thể ra ba giả hành mới và ra ba vòi hoa (Huỳnh Văn Thới,
1996).

Rễ lan thường được hình thành từ căn hành, hình trụ, có thể có nhánh bật 1, bật 2, bật
3 hoặc không có và thường là rất dài. Rễ trên không của các loại lan phụ sinh có một trụ
chính bao quanh bởi mô không chặt giống như bọt biển bao quanh gọi là mạc (velamen).
Mạc này do sự phân cắt các tế bào của căn bì cho ra tế bào mà vách được nông to ra nhờ
những sợi tấm mộc tố cứng, mạc ấy có thể hấp thụ hơi nước và sương đọng, do che phủ nhẹ
nhàng với biểu bì mỏng của nó, làm cho rễ hút ẩm nhanh và giữ ẩm trong thời gian đáng kể

(Nguyễn Công Nghiệp, 1998).

Ẩm độ lý tưởng là từ 40% - 70%. Giả hành Cattleya mập, khả năng giữ nước tốt, do
đó nếu tưới nước ẩm quá sẽ làm thối đọt non (Huỳnh Văn Thới, 1996). Cattleya thuộc nhóm
cây CAM tuy nhiên nếu sống trong môi trường chiếu sáng trực tiếp trong thời gian dài sẽ
ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây (Giulio và ctv, 2002) vì vậy có thể nói đây là
loại cây sống thích nghi với điều kiện che mát (Winter và ctv, 1983).

1.3

SƠ LƯỢC VỀ KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

1.3.1

Giới thiệu

Dựa vào tính toàn năng của thực vật (totipotency) kỹ thuật nuôi cấy mô đã được
Schleiden và Schwann đưa ra vào năm 1839. Đây là phương pháp nuôi cấy vô trùng các cơ
4


quan, mô, tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc nuôi cấy được
duy trì dưới điều kiện được kiểm soát (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Cho đến nay không có
phương pháp nhân giống vô trính nào có hệ số nhân giống cao hơn và đã có trên 300 loại
cây có thể nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô (Nguyễn Xuân Linh, 1998).

Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô có nhiều ưu điểm như: tạo được hàng
loạt cá thể đồng nhất, giữ nguyên được tính trạng của cây mẹ, tái sinh, phục chế được các
giống cây quý bị nhiễm virus, bị thoái hóa, tạo được giống sạch bệnh có phẩm chất như
mong muốn,… (Nguyễn Như Khanh, 2006).

1.3.2

Các giai đoạn trong vi nhân giống

Quá trình vi nhân giống được chia thành 4 giai đoạn khác nhau và chỉ thành công khi
hoàn thành 4 giai đoạn này. Sự thất bại của bất cứ giai đoạn nào cũng sẽ ảnh hưởng đến kết
quả của quá trình vi nhân giống (Debergh và Zimmerman, 1991). Trong đó, giai đoạn 3
được chia làm 2 giai đoạn phụ:

+ Giai đoạn 3a: kéo dài

+ Giai đoạn 3b: kích thích rễ và tiền thuần dưỡng

Đây là giai đoạn rất quan trọng vì trong giai đoạn này cây con sẽ được hình thành
tương đối hoàn chỉnh do đó việc xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp sẽ giúp cây
con phát triển tốt, kích thích cho cây con gia tăng chiều cao và tạo rễ đầy đủ, sẵn sàng cho
giai đoạn thuần dưỡng. Thường khi chồi đạt chiều cao 2cm có thể chuyển sang môi trường
kích thích ra rễ (Bùi Bá Bổng, 1995). Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ là chất điều
hòa sinh trưởng trực vật, khoáng đa lượng, vi lượng, các hợp chất hữu cơ,… (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

5


1.3.3

Môi trường nuôi cấy

1.3.3.1

Một số môi trường nuôi cấy phổ biến

Hiện nay có nhiều loại môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô như: môi trường
White (1953), môi trường Murashige và Skoog (MS) (1962), môi trường Nitsch (1969), môi
trường Gamborg (1968),... (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Theo Nguyễn Văn Uyển (1993), môi trường MS là môi trường giàu và cân bằng về
chất dinh dưỡng, thích hợp cho nhiều loại cây nên được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên vì lan
là thực vật nhạy cảm với muối nên môi trường MS giàu khoáng cần giảm nồng độ đi ¼ hoặc
½ thì sẽ thu được kết quả tốt hơn (Phạm Văn Duệ, 2005).

1.3.3.2

Thành phần môi trường nuôi cấy

Các thành phần cơ bản trong môi trường nuôi cấy thường bao gồm các thành phần
sau: các muối khoáng đa lượng và vi lượng, nguồn carbon, than hoạt tính, agar,…
 Các nguyên tố khoáng

Các nguyên tố khoáng được chia làm hai nhóm: nguyên tố khoáng đa lượng và
nguyên tố khoáng vi lượng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).

Nhóm nguyên tố khoáng đa lượng rất cần thiết cho cây trồng (Lê Văn Hòa và
Nguyễn Bảo Toàn, 2004) thường được sử dụng với nồng độ trên 30mg/l (30ppm) (Lê Trần
Bình và ctv, 1997) bao gồm các nguyên tố: Nitrogen (N) (dạng ammonium và nitrat), lân
(P), Potassium (K), Magiesium (Mg), Calcium (Ca), lưu huỳnh (S), Sodium (Na) và Cloride
(Cl).

Các nguyên tố khoáng vi lượng chủ yếu là Mn, B, Cu, Zn, I, Co, Al,… Chúng có vai
trò quan trọng trong đời sống thực vật, tham gia vào các quá trình sinh hóa trong tế bào,

tăng tính chống chịu của thực vật trong điều kiện bất lợi. Mặc dù các nguyên tố khoáng vi
6


lượng hiện diện trong cây với hàm lượng rất thấp nhưng rất cần thiết cho sự sinh trưởng và
phát triển của cây trồng (Lê Văn Bé, 2007). Vì vậy, nồng độ sử dụng các nguyên tố này
trong môi trường nuôi cấy thường rất thấp (Nguyễn Văn Uyễn và ctv, 1993).
 Nguồn carbon

Mô cây trong môi trường không có khả năng tự dưỡng (autotrophic) do không tiến
hành được quang hợp đầy đủ trong điều kiện không thuận lợi. Vì vậy, nguồn carbon được
cung cấp cho môi trường là từ các loại đường (Bùi Bá Bổng, 1995).

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng hai loại đường là glucose và sucrose, nhưng hiện
nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn với nồng độ thường ở mức 2 – 3% (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thị Thủy Tiên, 2002). Tuy nhiên, tùy vào từng loại tế bào, loại mô và các
mục đích của việc nuôi cấy còn có thể dùng các loại đường khác như: fructose, maltose,…
(Nguyễn Xuân Linh, 1998).
 Than hoạt tính

Than hoạt tính có khả năng hấp thụ một số chất không có lợi cho sự phát triển của
cây như các chất được sản sinh trong quá trình khử trùng môi trường nuôi cấy như các chất
màu, hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006). Đôi lúc
than hoạt tính cũng đóng vai trò như chất điều tiết sinh trưởng (George và Sherrington,
1984).
 Vitamin

Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1),
acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo – inositol có vai trò xúc tác các quá trình biến
dưỡng khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).

7


 Chất điều hòa sinh trưởng

Theo Bùi Bá Bổng (1995), chất điều hòa sinh trưởng được chia làm ba nhóm: auxins,
cytokinins và gibberellins. Chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình
phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào nồng độ
sử dụng , mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Các chất hữu cơ bổ sung

Trong môi trường nuôi cấy được bổ sung nhiều chất hữu cơ khác nhau thường mang
lại kết quả thuận lợi cho sự tăng trưởng của mô, một vài chất hữu cơ khi bổ sung có tác
dụng như là chất kích thích ra rễ. Lượng sử dụng thường từ 0,05 – 1% (Nguyễn Đức Lượng,
2002).

Trong thành phần các chất hữu cơ có chứa đường, một số loại vitamin (thiamin, acid
nicotinic, pyridoxine,…), các acid amin (glysin, lysine, arginine, casein hydrolysate,…) và
một số chất điều hòa sinh trưởng (George, 1993).

+ Gạo lứt

Gạo lứt chứa nhiều vitamin B, protein, tinh bột và nhiều nguyên tố vi lượng. Trong
gạo lứt có chứa 74,46% Glucid, 8,1% protein, 2,02% lipide, 1,18% Tro, 1,18% Vitamin B1
(Trần Văn Chương, 2006). Trong đó, Thiamine (Vitamin B1) là một vitamin cơ bản cần cho
sự trao đổi carbonhydrate và sinh tổng hợp một số amino acid cần thiết cho sự tăng trưởng
của tấc cả các tế bào, có chức năng như là một coenzyme hỗ trợ cho chu trình acid hữu cơ
(chu trình Kreb) (Lydiane Kyte, 1996).

+ Khoai lang trắng
Khoai lang tươi chứa nhiều vitamin và muối khoáng (34mg Canxi; 49,4g Photpho;
1mg sắt; 0,3mg carotene; 0,05mg vitamin B1vitamin B2; 0,6mg vitamin PP; 23mg vitamin
C,…) (Nguyễn Thị Hương Liên, 1999). Ngoài ra khoai lang còn chứa nhiều protein, tinh
8


bột, chất nhựa và hơn 10 loại nguyên tố vi lượng (Ahmad và ctv, 2006). Đồng thời trong
khoai lang còn chứa nhiều acid amin (lysine, methionine, threonine, tryptophane,…)
(Dương Minh, 1999). Trong đó, tryptophane là acid amin có mạch bên chứa nhân thơm, là
tiền chất để tổng hợp vitamine PP – thành phần không thể thiếu của NAD+ và NADP+ là
những coenzyme của các enzyme dehydrogenase yếm khí làm nhiệm vụ vận chuyển H và
enzyme trong các phản ứng oxy hóa khử của quá trình hô hấp. Bên cạnh đó, đây cũng là
tiền chất để tổng hợp IAA – một loại auxin nội sinh của thực vật (Ngô Xuân Mạnh và ctv,
2006).

9


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN

2.1.1 Thời gian thực hiện thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện tại Trại Nghiên cứu và Thực Nghiệm Nông Nghiệp,
Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ từ ngày 08/2011 đến
ngày 12/2011 với mẫu Lan được dùng làm thí nghiệm là giống lan Cattleya lấy từ phòng
nuôi cấy mô của Trại Nghiên Cứu và Thực Nghiệm Nông Nghiệp thuộc Khoa Nông Nghiệp

và Sinh Học Ứng Dụng.

2.1.2 Điều kiện thí nghiệm
 Cường độ chiếu sáng: 1.000lux
 Nhiệt độ 28 ± 30C
 Thời gian chiếu sáng 12 h/ngày

2.1.3 Các trang thiết bị và hóa chất thí nghiệm

Các trang thiết bị trong phòng nuôi cấy: Tủ cấy vô trùng, máy đo pH, đèn huỳnh
quang, tủ lạnh, cân, đèn cồn, nồi hấp khử trùng (autoclave), bếp điện, cốc thủy tinh, đũa
thủy tinh, máy xoay sinh tố, cồn…..
 Dụng cụ cấy: kẹp cấy, kéo, dao mổ…
 Hóa chất: khoáng đa lượng, vi lượng, agar, các vitamin….
10


 Các nguyên liệu trong thí nghiệm: gạo lứt, khoai lang, đường sucrose.

2.2

PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Chuẩn bị môi trường thí nghiệm

Môi trường nuôi cấy là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có nồng độ
giảm đi ½, được ký hiệu ½ MS.
 Thành phần đa lượng trong môi trường MS: giảm đi một nửa

+ NH4NO3 825mg/l

+ KNO3 950mg/l
+

MgSO4 7H2O 185mg/l

+ CaCl2 165mg/l
+

KH2PO4 85mg/l

 Thành phần vi lượng trong môi trường MS:

+ H3BO3 6,2mg/l
+

MnSO4 22,3mg/l

+ ZnSO4 7H2O 11,5mg/l
+

Na2MoO4 2H2O 0,25mg/l
11


+

CuSO4 5H2O 0,025mg/l

+

KI 0,83mg/l

+

CoCl2 0.025mg/l

+ FeEDTA

FeSO4 7H2O 27,8mg/l
EDTA 37,3mg/l

Vitamin: Thiamin 1mg/l, Pyridoxin 1mg/l, Nicotinic acid 1mg/l

Các thành phần trong môi trường thí nghiệm: khoai lang trắng xay nhuyễn, gạo lứt
xay nhuyễn, đường sucrose.

Các thành phần trong thí nghiệm được bổ sung tùy mục tiêu thí nghiệm cùng với môi
trường ½ MS, vitamin, agar 7,5g/l. Nồng độ pH của môi trường được chuẩn về 5,8 trước khi
hấp khử trùng ở 121oC trong 120 phút, mỗi nghiệm thức được đưa vào hệ thống nuôi cấy
bằng chai thủy tinh. Mỗi chai cấy chứa 50ml môi trường.

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện cho giai đoạn cấy cây lớn, cấy lần cuối để đưa ra vườn
ươm. Cây lan Cattleya có kích thước từ 1- 2.5 cm được tách thành từng cây riêng lẻ và được
cấy vào môi trường từng thí nghiệm.

12