ẢNH HƯỞNG của môi TRƯỜNG NUÔI cấy TRÊN sự SINH TRƯỞNG cây cẩm CHƯỚNG NHUNG (dianthus barbatus l ) IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PHAN DƯƠNG PHƯƠNG THẢO

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ SINH
TRƯỞNG CÂY CẨM CHƯỚNG NHUNG (Dianthus barbatus L.)
IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH HOA VIÊN & CÂY CẢNH

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: HOA VIÊN & CÂY CẢNH

Tên đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ
SINH TRƯỞNG CÂY CẨM CHƯỚNG NHUNG (Dianthus
barbatus L.) IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn:
TS. Lâm Ngọc Phương

Sinh viên thực hiện:

Phan Dương Phương Thảo
MSSV: 3077413
Lớp: Hoa Viên & Cây Cảnh

Cần Thơ, 2011


LỜI CẢM TẠ


Xin kính dâng lời tạ ơn chân thành và sâu sắc đến cha mẹ cùng với những người
thân trong gia đình đã quan tâm, yêu thương, động viên và giúp đỡ con rất nhiều
trên con đường học tập, đã cho con có được ngày hôm nay.
Vô cùng biết ơn cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá
trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn cô vì những lời khuyên sáng suốt và bổ ích,
những lần giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu để em có thể hoàn thành tốt luận
văn này.
Xin chân thành cảm ơn thầy Lê Văn Bé và cô Lê Hồng Giang cố vấn học tập đã
quan tâm giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập.
Chân thành cảm tạ và biết ơn các thầy cô đã tận tình truyền đạt kiến thức, những
kinh nghiệm nghề nghiệp và xin cảm ơn thầy cô đã tận tình dìu dắt em trong suốt
quá trình học tập tại trường trong những năm tháng Đại Học vừa qua.
Xin cảm ơn chị Lê Minh Lý và các anh chị trên phòng thí nghiệm Cấy Mô, bộ môn
Sinh Lý – Sinh Hóa đã tận tình hướng dẫn, đưa ra nhiều lời khuyên đúng đắn và
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện việc nghiên, giúp em có nhiều kinh
nghiệm đáng quý. Cùng các bạn học trong lớp Hoa Viên & Cây Cảnh k33 đã sát
cánh ủng hộ, giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian qua.

Xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày.... tháng.... năm 2011

Phan Dương Phương Thảo

v


LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Phan Dương Phương Thảo

vi


THỜI GIAN HỌC TẬP


I.
LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Họ và tên: Phan Dương Phương Thảo
Giới tính: Nữ
Ngày sinh: 02/11/1989
Nơi sinh: Thị Trấn Phú Lộc - Huyện Thạnh Trị – Tỉnh Sóc Trăng
II.

THỜI GIAN HỌC PHỔ THÔNG

1. Tiểu học:
Thời gian: 1995 – 2000
Trường: Tiểu học Phú Lộc 1
Địa chỉ: Thị Trấn Phú Lộc - Huyện Thạnh Trị – Tỉnh Sóc Trăng
2. Trung học cơ sở:
Thời gian: 2000 – 2004
Trường: Trung học cơ sở Phú Lộc
Địa chỉ: Thị Trấn Phú Lộc - Huyện Thạnh Trị – Tỉnh Sóc Trăng
3. Trung học phổ thông:
Thời gian: 2004 – 2007
Trường: Trung học phổ thông Trần Văn Bảy
Địa chỉ: Thị Trấn Phú Lộc - Huyện Thạnh Trị – Tỉnh Sóc Trăng

vii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT


MS: Murashige and Skoog (1962)
ctv.: Cộng tác viên
2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
NAA: alpha-naphthalene acetic acid
IBA: Indole-3-butyric acid
BA: Benzyl adenine
BAP: Benzylaminopurine
HgCl2 : Thủy ngân clorua.

LSD: Least Significant Difference
TSKC: Tuần sau khi cấy

viii


DANH SÁCH BẢNG

Bảng
3.1

3.2

3.3

3.4

3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
3.11

Tựa bảng
Trang
Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) của cây cẩm chướng nhung trên môi
13
trường bổ sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau giai đoạn

2 TSKC
Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) của cây cẩm chướng nhung trên môi
14
trường bổ sung BA và 2,4- D ở các nồng độ khác nhau giai
đoạn 4 TSKC
Kích thước mô sẹo (cm) của cây cẩm chướng nhung trên môi
15
trường bổ sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau giai đoạn
2 TSKC
Kích thước mô sẹo (cm) cây cẩm chướng nhung trên môi trường
16
bổ sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4
TSKC
Tỉ lệ tạo chồi (%) cây cẩm chướng nhung trên môi trường bổ
17
sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC
Số chồi cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung
18
BA và đường ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 2 TSKC
Số chồi cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung
19
BA và đường ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC
Số lá cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung BA
20
và đường ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 2 TSKC
Số lá cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung BA
21
và đường ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC
Chiều cao (cm) cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ
22

sung BA và đường ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 2 TSKC
23
Chiều cao (cm) cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ
sung BA và đường ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC

3.12

3.13

Tỉ lệ (%) mẫu ra rễ trên môi trường bổ sung NAA và IBA ở các
nồng độ khác nhau của cây cẩm chướng nhung in vitro ở giai
đoạn 4 TSKC
Số rễ cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung NAA
và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC

ix

24

25


3.14
3.15
3.16
3.17
3.18
3.19

3.20

Số chồi cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung
NAA và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 2 TSKC
Số chồi cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung
NAA và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC
Số lá cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung NAA
và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 2 TSKC
Số lá cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ sung NAA
và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 4 TSKC
Chiều cao (cm) cẩm chướng nhung gia tăng trên môi trường bổ
sung NAA và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn 2 TSKC
Chiều cao gia tăng trên môi trường có bổ sung có NAA và IBA
ở các nồng độ khác nhau của cây cẩm chướng nhung in vitro ở
giai đoạn 4 TSKC
Trọng lượng tươi (g) cẩm chướng nhung gia tăng trên môi
trường bổ sung NAA và IBA ở các nồng độ khác nhau giai đoạn
4 TSKC

x

27
27
28
29
30
30

32

DANH SÁCH HÌNH
Hình
1.1
2.1
3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

Tựa hình

Trang
2

Cây cẩm chướng nhung
Chồi cẩm chướng nhung 2-3 tuần tuổi
Kích thước mô sẹo cẩm chướng nhung sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trường có bổ sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác
nhau A: BA 2,0 mg/l; B: 2,4-D 1,0 mg/l.
Tỉ lệ tạo chồi cẩm chướng nhung sau 4 tuần nuôi cấy trong
môi trường có bổ sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác nhau
A: BA 4,0 mg/l; B: 2,4-D 1,0 mg/l.
Sự tăng trưởng của cây cẩm chướng nhung khi vừa cấy xong
và sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trường có bổ sung BA và
đường ở các nồng độ khác nhau A: Khi vừa cấy xong ; B: MS

không bổ sung BA và 2,4-D; C: đường 20 g/l.
Số rễ gia tăng của cẩm chướng nhung sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trường có bổ sung BA và đường ở các nồng độ
khác nhau A: MS không bổ sung BA và 2,4-D; B: IBA 1,0
mg/l; C: IBA 2,0 mg/l; D: NAA 1,0 mg/l; E: NAA 1,0 mg/l
+ IBA 1,0 mg/l; F: NAA 1,0 mg/l + IBA 2,0 mg/l; G: NAA
2,0 mg/l; H: NAA 2,0 mg/l + IBA 1,0 mg/l; I: NAA 2,0 mg/l
+ IBA2,0 mg/l.
Chiều cao gia tăng của cẩm chướng nhung sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trường có bổ sung BA và 2,4-D ở các nồng độ khác
nhau A: Lúc bắt đầu cấy vào môi trường; B: MS không bổ
sung NAA và IBA; C: NAA 1,0 mg/l + IBA 1,0 mg/l

xi

9
16

17

23

26

31


PHAN DƯƠNG PHƯƠNG THẢO, 2011. “Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
trên sự sinh trưởng cây cẩm chướng nhung (Dianthus barbatus L.) in vtro. Luận văn tốt
nghiệp Đại Học, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng Trường Đại Học Cần Thơ.

Người hướng dẫn khoa học: TS.LÂM NGỌC PHƯƠNG.

TÓM LƯỢC
Đề tài: “Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trên sự sinh trưởng cây cẩm chướng
nhung (Dianthus barbatus L.) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra môi trường và các
nồng độ thích hợp, để nâng cao hệ số nhân chồi, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản
xuất.
Đề tài gồm 3 thí nghiệm, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố, 6 lần lặp lại, mỗi
lần lặp lại 1 keo, mỗi keo cấy 5-7 mẫu.
Kết quả thí nghiệm cho thấy a) Môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1,0 mg/l cho hiệu quả tạo
mô sẹo và tạo chồi cao nhất b) Môi trường MS bổ sung đường 20 g/l có hiệu quả nhất
trong sự sinh trưởng chồi c) Môi trường MS có bổ sung NAA 2,0 mg/l và IBA 1,0 mg/l cho
hiệu quả tạo rễ cao nhất (11,0 rễ).
Từ khóa: Cẩm chướng nhung, in vitro, đường, 2,4-D.

xii


PHẦN ĐẦU
Cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống của con người ngày càng được
nâng cao, thị hiếu yêu cầu và thẩm mỹ của con người cũng không ngừng phát triển.
Trong nông nghiệp cùng với những yêu cầu ngày càng cao về lương thực, thực
phẩm thì cây hoa cũng đã trở thành một nhu cầu không thể thiếu trong đời sống con
người. Cẩm chướng là một trong các loại hoa cắt cành phổ biến cho năng suất và
giá trị kinh tế cao. Hoa cẩm chướng ngày càng được nhiều người biết đến bởi sự đa
dạng về màu sắc, là loại hoa bền, giữ được lâu, thuận lợi cho bảo quản và vận
chuyển đi xa.
Người trồng hoa Đà Lạt vốn quen với những bông cẩm chướng đa màu đa
sắc đã trồng từ gần trăm năm nay. Nhưng hiện nay, người trồng hoa Đà Lạt đang
tiếp cận với một loài cẩm chướng mới, cẩm chướng nhung - có người gọi là cẩm

chướng Nhật, một loài hoa mang lại lợi nhuận kinh tế cao, đồng thời an toàn cho
môi trường và người trồng hoa (Nguyễn Diệp Quỳnh, 2008).
Tuy nhiên, các giống cẩm chướng ở nước ta hiện nay chủ yếu là giống nhập
từ Hà Lan hay Trung Quốc. Điều này gây khó khăn trong sự chủ động nguồn giống,
chi phí lớn cho việc nhập khẩu dẫn tới giá thành hoa cắt cao. Mặt khác, để thích
nghi với điều kiện Việt Nam, các giống nhập nội này yêu cầu quy trình trồng và
chăm sóc nghiêm ngặt. Vì vậy một đòi hỏi thực tế là việc tạo ra những giống hoa
cẩm chướng mới và cải tạo các giống đã nhập nội, đáp ứng nhu cầu thị trường, góp
phần khẳng định thương hiệu hoa Việt Nam.
Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp nhân giống vô
tính cho hệ số nhân cao, cây giống được tạo ra đồng nhất về mặt di truyền, cây sạch
bệnh, có sức sống tốt, phát triển mạnh, ít bị biến dị (Nguyễn Đức Thành, 2000). Vì
thế đã có nhiều đề tài nghiên cứu về nhân giống cây cẩm chướng in vitro như
Archana Katntia (2002) trên Dianthus caryophyllus, Ali và ctv. (2008) trên
Dianthus caryophyllus, và Arpakna và ctv. (2004) trên Dianthus barbatus.
Do đó đề tài “Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trên sự sinh trưởng
cây cẩm chướng nhung (Dianthus barbatus L.) in vitro” được thực hiện nhằm
tìm ra môi trường và các nồng độ thích hợp, để nâng cao hệ số nhân chồi, rút ngắn
thời gian đưa giống vào sản xuất.


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ SINH HÓA

Luận văn Tốt nghiệp Kỹ Sư Ngành Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ SINH
TRƯỞNG CÂY CẨM CHƯỚNG NHUNG (Dianthus barbatus L.)
IN VITRO

Sinh viên thực hiện Phan Dương Phương Thảo
Ý kiến cán bộ hướng dẫn............................................................................
...................................................................................................................
...................................................................................................................
...................................................................................................................
...................................................................................................................

Cần Thơ, ngày ... tháng ... năm 2011
Cán bộ hướng dẫn

Lâm Ngọc Phương

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ – SINH HÓA

Sự chấp thuận của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ SINH
TRƯỞNG CÂY CẨM CHƯỚNG NHUNG (Dianthus barbatus L.)
IN VITRO

Do sinh viên Phan Dương Phương Thảo thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm
luận văn.
Luận văn tốt nghiệp đã được hội đồng đánh giá ở mức:..................................
.......................................................................................................................

.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2011

CHỦ NHIỆM KHOA

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ii


MỤC LỤC
TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRANG CHẤP NHẬN LUẬN VĂN CỦA HỘI ĐỒNG
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ
LỜI CAM ĐOAN
THỜI GIAN HỌC TẬP
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
TÓM LƯỢC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật của cây cẩm chướng nhung

1.1.1 Phân loại thực vật
1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố
1.1.3 Đặc tính thực vật
1.2 Sơ lược về nôi cấy mô
1.2.1 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô
1.2.2 Phương pháp nhân giống in vitro
1.2.3 Môi trường nuôi cấy
1.2.4 Tạo và nuôi cấy mô sẹo
1.3 Một số kết quả nghiên cứu trên Dianthus sp.
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1
Phương tiện thí nghiệm
2.1.1 Vật liệu thí nghiệm
2.1.2 Phương tiện thí nghiệm
2.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
2.1.4 Điều kiện thí nghiệm
2.2
Phương pháp thí nghiệm
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
2.2.3 Xử lý số liệu

iii

i
ii
iii
v
vi
vii

viii
ix
xi
xii
2
2
2
2
2
3
3
4
4
6
7
9
9
9
9
9
10
10
10
10
12


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1
Ảnh hưởng của BA và 2,4-D trên sự tạo mô sẹo và tạo chồi

cẩm chướng nhung in vitro
3.1.1 Tỉ lệ tạo mô sẹo (%)
3.1.2 Kích thước mô sẹo (cm)
3.1.3 Tỉ lệ tạo chồi (%)
3.2
Ảnh hưởng của BA và đường trên sự sinh trưởng chồi cẩm
chướng nhung in vitro
3.2.1 Số chồi gia tăng (chồi)
3.2.2 Số lá gia tăng (lá)
3.3.3 Chiều cao gia tăng (cm)
3.3
Ảnh hưởng của NAA và IBA trên sự tạo rễ cẩm chướng
nhung in vitro
3.3.1 Tỉ lệ mẫu ra rễ (%)
3.3.2 Số rễ gia tăng(rễ)
3.3.3 Số chồi gia tăng (chồi)
3.3.4 Số lá gia tăng (cm)
3.3.5 Chiều cao gia tăng (cm)
3.3.6 Trọng lượng tươi gia tăng (g)
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
4.2 Đề nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

iv

13
13

13
15
17
18
18
19
21
24
24
24
26
28
29
31
33
33
33
34


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm thực vật của cây cẩm chướng nhung
1.1.1 Phân loại thực vật
Cẩm chướng nhung có tên thường gọi là Sweet William. Tên khoa học là
Dianthus barbatus L, thuộc chi Dianthus, họ Caryophyllaceae.
1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố
Cây cẩm chướng nhung có nguồn gốc từ vùng Trung Cận Đông, hoa cẩm
chướng được trồng cách đây 2000 năm. Cây được gây trồng rộng rãi ở châu Âu và

sau đó phát triển rộng ra các nước châu Á và châu Mỹ. Cây được trồng đầu tiên ở
miền Bắc châu Âu vào thế kỷ XVI, rồi sau đó được gây trồng rộng rãi đến miền Bắc
nước Mỹ và nhiều nơi khác.
Phân bố chủ yếu ở vùng núi phía Nam châu Âu từ phía Đông Pyrenees đến
Carpathians và Balkans, với các giống cây đa dạng ở phía Đông Bắc Trung Quốc,
Hàn Quốc và ở hầu hết phía Đông Bắc của nước Nga (Gender, 1994).

Hình 1.1 Cây cẩm chướng nhung
1.1.3 Đặc tính thực vật
Loài cây hằng niên hay nhị niên, thân thảo, nhẵn, có 4 cạnh, đơn hay phân
nhánh ở đỉnh. Cây cao 30 – 75 cm, lá có màu xanh thuôn dài, hẹp, thon nhọn, dài 410 cm, rộng 1-2 cm, lá không có cuống, có bẹ ngắn ôm thân, mọc đối làm thành u
lồi ở thân (Trần Hợp, 2000).
Hoa nhỏ, màu sắc thay đổi từ màu trắng, hồng, đỏ, tím và một số màu khác
và có dạng hoa có đốm hay viền nhiều màu. Cánh hoa đơn hay kép tùy thuộc vào
các dạng lai khác nhau. Mỗi cây có 4 đến 5 lứa hoa . Mỗi hoa có đường kính 2-3

2


cm. Mỗi hoa có 5 cánh và cánh hoa có rìa hình răng cưa. Những cây hoang dại có
hoa màu đỏ với nền màu trắng. Hoa nở thành những chùm dày đặc có thể lên đến 30
hoa ở ngọn thân. Hoa có vị và mùi thơm giống như hoa tử đinh hương (Lê Quang
Long và ctv., 2008).
Cây trồng bằng hạt. Mỗi cây cho 4-5 lứa hoa, cần bón phân và chăm sóc kỹ
thì chùm hoa mới có nhiều hoa (Trần Hợp, 2000).
1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật
Theo Haberlandt (1902) mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện
thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh (Nguyễn
Đức Thành, 2002). Sự thành công của vi nhân giống phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, giống, nhiệt độ,
ánh sáng, chọn mẫu vật (Dương Công Kiên, 2007) và tất cả các giai đoạn nuôi cấy
(Debergh và Zimmerman, 1991).
Theo Lâm Ngọc Phương (2009), nuôi cấy mô in vitro là một từ rất tổng quát
để chỉ việc nuôi cấy tế bào hay mô để chúng phát triển trong môi trường dinh dưỡng
vô trùng trong một thời gian vô hạn.
Cây cẩm chướng nhung được nhân giống chủ yếu bằng hạt (Lê Quang Long
và ctv., 2008), để nhân giống đạt được hiệu quả thì việc tạo ra chủng loại tốt, hiệu
quả cao và nhân nhanh với số lượng nhiều là điều rất quan trọng. Trong các phương
pháp nhân giống thì phương pháp nhân giống in vitro là mang lại hiệu quả cao nổi
trội trong việc sản xuất giống cây trồng.
1.2.1 Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô
Theo Nguyễn Đức Thành (2000), phương pháp nuôi cấy mô có nhiều ưu
điểm sau:
+ Nhân một số lượng cây con lớn với diện tích nhỏ.
+ Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
+ Có thể tạo được một số loài thực vật mà không thể tiến hành invitro.
+ Không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh.
Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy mô phải được thực hiên với một quy trình
nghiêm túc và tỉ mĩ, điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, các mẫu vật phát triển trên
một môi trường vô trùng.
1.2.2 Phương pháp nhân giống in vitro
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) quá trình nhân giống
thường được chia thành các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: chuẩn bị cây mẹ. Cây mẹ phải sạch bệnh và đang ở trong giai
đoạn tăng trưởng mạnh nhất .

3

Giai đoạn 2: khử trùng mẫu cấy. Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng
sẽ được chuyển sang giai đoạn 3.
Giai đoạn 3: tăng nhanh số lượng. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh
số lượng cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định.
Các chồi tăng trưởng mạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang giai đoạn
ra rễ in vitro.
Giai đoạn 4: ra rễ in vitro. Những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ được
chuyển sang môi trường kích thích ra rễ. Trong môi trường này cần phải bổ sung
Auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm so với môi trường tăng sinh.
Giai đoạn 5: giai đoạn ra rễ in vivo. Với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ
được chuyển ra vườn ươm để phát rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
1.2.3 Môi trường nuôi cấy
Trải qua nhiều thử nghiệm người ta nhận thấy nên sử dụng môi trường
chuyên dụng cho từng loài hay từng loại mô cấy chuyên biệt (Lê Văn Hòa và ctv,
2009).
Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: muối khoáng (đa
lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng, agar (đối
với môi trường rắn). Ngoài ra, có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành
phần xác định như amino acid, Fe-EDTA, … và một số chất có thành phần không
xác định như dịch chiết nấm men, dịch trích khoai tây, chuối, nước dừa, dịch trích
trái cây,...
Thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm:
 Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong
nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử
dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
 Các nguyên tố khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của
mô cấy và chúng không gây độc Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là
Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potasium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu

huỳnh (S)… (Lê Văn Hòa và ctv.,1999).
Các nguyên tố khoáng đa lượng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy
thường ở nồng độ 30 mg/l (Lê Trần Bình và ctv., 1997).
 Các nguyên tố khoáng vi lượng
Các nguyên tố vi lượng thường được sử dụng với liều lượng nhỏ, nhưng
đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của enzyme. Bao gồm sắt (Fe), Bo (B),
Mangan (Mn), Iodine (I), Molybden (M), Đồng (Cu), Cobalt (Co)... (Nguyễn Xuân
Linh, 1998).

4


 Nguồn cacbohydrate
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng nên việc đưa đường vào môi trường vào môi trường nuôi cấy là điều bắt
buộc. Nó không chỉ điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường mà còn là nguồn
hydrat cacbon tốt nhất cung cấp cho mô và tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu
cơ, phân chia, tăng sinh khối (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Nhưng khi hàm lượng chất hữu cơ quá cao sẽ hạn chế hiệu quả hấp thu nước của
mô cây. Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro là glucose và
sucrose, trong đó sucrose được sử dụng phổ biến hơn (Lê Trần Bình và ctv., 1997).
 Agar
Là chất được sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán đặc để nuôi
cấy mô thực vật, nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến: thế năng nước, độ
cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, sự hoạt động của cytokinin trong
môi trường có agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2005).
Theo Lâm Ngọc Phương (2009), agar được sử dụng làm chất đông cứng môi
trường để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy tế bào thực vật tách rời. Agar là
phức hợp polisaccharit tự nhiên được trích từ loài tảo đỏ (Gelidium amansii) sống ở
biển, thuộc ngành Rhodophyta (George, 1993).

 Các vitamin
Vitamin có vai trò xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào.
Các vitamin thường được sử dụng bao gồm thiamin (B1), pyridoxin (B6), nicotinic
acid (B3), myo – inositol (Bùi Bá Bổng, 1995).
 Nước dừa
Nước dừa được bổ sung vào môi trường nhằm tăng sự sinh trưởng và phát
triển mô. Trong nước dừa có các loại khoáng, acid amin, nino-inositol, đường, chất
béo và chất điều hòa sinh trưởng như cytokinin. Đối với nhiều loại mẫu cấy, lượng
nước dừa phù hợp là 15-20% thể tích (Vũ Văn Vụ, 1999).
 pH
pH thường được chỉnh giữa 5,5 – 6 trước khi hấp khử trùng. pH quyết định
sự hòa tan của khoáng, ảnh hưởng sự hấp thu khoáng trong môi trường, ảnh hưởng
đến sự tạo gel khi hấp thử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). pH dưới 5,5 làm cho
agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng (Vũ Văn
Vụ và ctv., 2006).
 Chất điều hòa sinh trưởng
Hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được dung nhiều nhất là Auxin và
Cytokinin (Nguyễn Xuân Linh, 1998).

5


o Auxin
Các hợp chất Auxin kích thích sự giản nở tế bào, sự hình thành mô sẹo và sự
xuất hiện rễ bất định (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
Auxin tự nhiên thường tìm thấy ở thực vật là indole – 3 – acetic acid
(IAA).Auxin tổng hợp là những chất có hoạt tính tương tự IAA. Auxin được chia
thành các nhóm: Indole-3-acetic (IAA), indole-3-butyric acid (IBA); 2,3,6
trichlorobenzoic acid và 2-methoxy-3-6dichorobenzoic acid (Dicamba); 2,4,5
trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5- T) và 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D)…

(Nguyễn Minh Chơn, 2005).
Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984, chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin
gồm 2,4-D, NAA, IBA, IAA thường sử dụng trong nuôi cấy mô với nồng độ từ 0.1
đến 5mg/l. NAA và IBA thường được sử dụng cho sự tạo rễ. Sự hình thành rễ hoàn
toàn phụ thuộc vào loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
NAA (Alpha-naphthalene acetic acid): có tác dụng phân chia tế bào, tạo rễ,
làm tăng khả năng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh
hưởng mạnh đến trao đổi chát của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường
trong môi trường (Nguyễn Đức Thành, 2000)
o Cytokinin
Cytokinin có vai trò chính trong sự phân cắt tế bào, đóng vai trò chính trong
sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cây mô (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Theo
Nguyễn Minh Chơn (2005), cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt là
vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn. Ngoài ra, cytokinin còn kích thích sự biến
đổi của những lạp còn non thành lục lạp; giúp chồi bên tránh bớt được sự ức chế
của chồi ngọn, làm chậm sự lão hóa, đặc biệt là đối với lá. Cytokinin được tạo ra từ
trong ngọn rễ và trong hột đang phát triển và cytokinin được vận chuyển qua mô gỗ
từ rễ lên thân (Trần Phước Đường, 2010).
Các cytokinin thường dùng: BA (Benzyel adenin), 2- iP (2-iso Pentyladenin)
(Bùi Bá Đổng, 1995). Theo Nguyễn Minh Chơn (2005) trong cytokinin còn có
Thidiazuron (TDZ) cũng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô.
1.2.4 Tạo và nuôi cấy mô sẹo
 Định nghĩa mô sẹo
Mô sẹo là một khối tế bào không tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan
đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Theo
Nguyễn Bảo Toàn (2005) thì mô sẹo bao gồm một khối vô định hình của các tế bào
nhu mô có vách mỏng được sắp xếp lỏng lẻo.

6

 Tầm quan trọng của việc tạo mô sẹo
Theo Nguyễn Đức Thành (2000), nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng
trong nuôi cấy mô tế bào. Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan
trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, protolast, sản xuất các
chất hoạt tính sinh học… Còn theo Vũ Văn Vụ (1999) thì việc nuôi cấy mô sẹo
được ứng dụng trong nhiều trường hợp như:
 Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nuôi cấy
nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc không thực hiện.
 Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt
tính sinh học…
 Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng chịu mặn…
 Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan…
 Tạo và nuôi cấy mô sẹo
Nguyên liệu để tạo mô sẹo là phần non của cây, được đưa vào môi trường
nuôi cấy trên các môi trường MS, Gamborg… và cần thiết phải cần thiết thêm các
chất thuộc nhóm Auxin. Loại và nồng độ auxin sử dụng phụ thuộc vào loại mô nuôi
cấy (Ycoman và Macleod, 1997).
Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra tạo bướu ở các mô và cơ
quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây
ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma, từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Khi
nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ
không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo (Torres, 1989). Theo Nguyễn
Văn Uyển và ctv., (1993), sử dụng môi trường có 2,4-D (1,0-2,0 mg/l) kích thích
tạo mô sẹo từ chồi đỉnh của cây củ kiệu F1.
1.3 Một số kết quả nghiên cứu trên Dianthus. sp
Theo Arpakna và ctv. (2004) đã tiến hành nhân giống in vitro cây cẩm
chướng nhung (Dianthus barbatus) cùng với 2 loài khác: cẩm chướng (Dianthus
caryophyllus) và cẩm chướng gấm (Dianthus chinensis) từ chồi ngọn và chồi thân

trên môi trường MS với BA và NAA. Kết quả cho thấy môi trường MS + 1,0 mg/l
BA + 0,5 mg/l NAA là môi trường tốt nhất để nhân chồi (10-15 chồi được hình
thành sau 4 tuần nuôi cấy cả chồi ngọn và chồi thân ở cả 3 loài cẩm chướng).
Ali và ctv. (2008) tiến hành vi nhân giống cây cẩm chướng (Dianthus
caryophyllus). Kết quả cho thấy môi trường nhân chồi tốt nhất là MS + BA 1,0
mg/l, môi trường tạo rễ tốt nhất là MS + 1,0 mg/l NAA (rễ xuất hiện sau 9 ngày
nuôi cấy).
Archana Katntia (2002) tiến hành tái sinh từ lá trên cây cẩm chướng
(Dianthus caryophyllus) đã nhận định rằng môi trường tốt nhất để tái sinh từ lá cây
cẩm chướng là MS + BAP 0,5 mg/l + 2,4-D 1,0 mg/l.

7


Nguyễn Phạm Trang Nguyên (2010) tiến hành nhân giống cây cẩm chướng
nhung (Dianthus barbatus). Kết quả cho thấy môi trường tốt nhất để nhân chồi là
MS + BA 1,0 mg/l (3,8 chồi sau 4 tuần nuôi cấy), và môi trường MS + IBA 1,0
mg/l cho hiệu quả cao nhất trong việc tạo rễ cây cẩm chướng nhung in vitro (cho tỉ
lệ ra rễ là 87,5% với số rễ là 4,3 rễ).

8


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện thí nghiệm
2.1.1 Vật liệu thí nghiệm
Vật liệu thí nghiệm là lá và chồi cây cẩm chướng nhung in vitro 2-3 tuần tuổi
được cấy trong môi trường cơ bản MS.

Hình 2.1 Chồi cẩm chướng nhung 2-3 tuần tuổi

2.1.2 Phương tiện thí nghiệm
- Trang thiết bị phòng thí nghiệm:
+ Tủ cấy vô trùng, tủ sấy.
+ Máy đo pH, cân điện tử, cân phân tích.
+ Nồi hấp khử trùng (autoclave), máy khuấy từ, máy lắc.
+ Tủ lạnh, bếp điện, nồi nấu agar...
- Dụng cụ: keo thủy tinh 13x7 cm được đậy nắp lỗ, micropipette, ống đong,
kẹp, giấy cấy, beaker ...
- Hóa chất:
+ Đường, agar, nước cất, nước dừa.
+ Khoáng đa lượng.
+ Vi lượng.
+ Vitamin: Thiamin, Pyridoxin, Nicotinic acid, Myo – inosytol.
+ Chất điều hòa sinh trưởng: Benzyl Adenin (BA), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), alpha-naphthaleneacetic acid (NAA), Indol
butyric acid (IBA).
2.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh
lý – Sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần
Thơ. Thời gian tiến hành thí nghiệm từ 12/2010 đến 05/2011.

9


2.1.4 Điều kiện thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm cấy mô (nhiệt độ 26 +
0
2 C, cường độ ánh sáng 1.500 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày).
2.2 Phương pháp thí nghiệm

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường dinh dưỡng MS
(Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, myo-inosytol
0,1 g/l, 7g/l agar, 80 ml/l nước dừa. Các thí nghiệm bổ sung đường với nồng độ
khác nhau và sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BA, 2,4-D, NAA và IBA.
Môi trường nuôi cấy có pH là 5,8.
Môi trường được chứa trong các keo thủy tinh (13x7 cm) với thể tích 40 ml
môi trường trong keo và được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210C, áp suất 1 atm
trong 20 phút.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA và 2,4-D trên sự tạo mô sẹo và tạo chồi cẩm
chướng nhung in vitro.
Mục tiêu: Tìm ra nồng độ BA và 2,4-D thích hợp cho sự tạo mô sẹo và tạo
chồi cẩm chướng nhung.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố
gồm 9 nghiệm thức (NT). Mỗi nghiệm thức lặp lại 6 lần, mỗi lần lặp lại có 1 keo,
mỗi keo cấy 7 mẫu.
Bảng 2.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1
Nồng độ 2,4-D (mg/l)
0,0
0,5
1,0

Nồng độ BA (mg/l)
2,0
4,0
NT4
NT7
NT5
NT8

NT6
NT9

0,0
NT1
NT2
NT3

Phương pháp: Lá cẩm chướng nhung 3 tuần tuổi được tuyển chọn từ bình
chồi mẹ được cấy vào môi trường MS có sử dụng chất điều hòa sinh trưởng BA và
2,4-D với các nồng độ khác nhau.
Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỉ lệ lá tạo mô sẹo (%).
+ Kích thước mô sẹo (cm).
+ Số chồi (nếu có).
+ Tỉ lệ lá tạo chồi (%).
Các chỉ tiêu được ghi nhận 2 và 4 tuần sau khi cấy.
10


Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của BA và đường trên sự sinh trưởng chồi cẩm chướng
nhung in vitro.
Mục tiêu: Xác định được nồng độ BA và đường thích hợp cho việc sinh
trưởng chồi cây cẩm chướng nhung in vitro.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên hai nhân tố
gồm 9 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại 6 lần, mỗi lần lặp lại 1 keo, mỗi keo
cấy 5 mẫu.
Bảng 2.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2
Nồng độ đường
(g/l)

0
20
40

Nồng độ BA (mg/l)
2,0
NT4
NT7
NT5
NT8
NT6
NT9

0,0
NT1
NT2
NT3

4,0

Phương pháp: Chồi cẩm chướng nhung 3 tuần tuổi có chiều cao 1cm và có 4
lá đầu tiên trên chồi ngọn được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA và đường
riêng rẻ và kết hợp theo những nồng độ khác nhau theo như trên Bảng 2.2.
Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Chiều cao (cm) (đo từ gốc đến đỉnh sinh trưởng).
+ Số lá (lá) (tính các lá đã bung ra).
+ Số chồi (chồi).
+ Trọng lượng tươi (g) ghi nhận lúc bố trí thí nghiệm và lần lấy chỉ tiêu
cuối cùng.
Các chỉ tiêu được ghi nhận 2 và 4 tuần sau khi cấy.

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của NAA và IBA trên sự tạo rễ cẩm chướng nhung in
vitro.
Mục tiêu: Tìm ra được nồng độ của NAA và IBA thích hợp nhất cho sự ra rễ
cho chồi cây cẩm chướng nhung in vitro.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố
gồm 9 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại 6 lần, mỗi lần lặp lại có 1 keo, mỗi keo
cấy 5 mẫu.
Bảng 2.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 3
Nồng độ IBA (mg/l)
0,0
1,0
2,0

Nồng độ NAA (mg/l)
1,0
2,0
NT4
NT7
NT5
NT8
NT6
NT9

0,0
NT1
NT2
NT3
11