HIỆU QUẢ của fe EDDHA, AgNO3 và NAA TRÊN sự SINH TRƯỞNG CHỒI và rễ cây tử LA LAN (sinningia speciosa (lodd ) hiern) IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN PHƯƠNG THANH

HIỆU QUẢ CỦA Fe-EDDHA, AgNO3 VÀ NAA TRÊN SỰ
SINH TRƯỞNG CHỒI VÀ RỄ CÂY TỬ LA LAN
(Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) IN VITRO”

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: HOA VIÊN CÂY CẢNH

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: HOA VIÊN CÂY CẢNH

Đề Tài

HIỆU QUẢ CỦA Fe-EDDHA, AgNO3 VÀ NAA TRÊN
SỰ SINH TRƯỞNG CHỒI VÀ RỄ CÂY TỬ LA LAN
(Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) IN VITRO”

Cán bộ hướng dẫn
TS. Lâm Ngọc Phương

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phương Thanh
MSSV: 3073246
Lớp: HVCC K33

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ SINH HÓA

Luận văn tốt nghiệp Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài:

“HIỆU QUẢ CỦA Fe-EDDHA, AgNO3 VÀ NAA TRÊN SỰ
SINH TRƯỞNG CHỒI VÀ RỄ CÂY TỬ LA LAN
(Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) IN VITRO”
Do sinh viên NGUYỄN PHƯƠNG THANH thực hiện kính trình lên hội đồng chấm luận
văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2010
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Lâm Ngọc Phương

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ SINH HÓA

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèm với tên
đề tài:

“HIỆU QUẢ CỦA Fe-EDDHA, AgNO3 VÀ NAA TRÊN SỰ
SINH TRƯỞNG CHỒI VÀ RỄ CÂY TỬ LA LAN
(Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) IN VITRO
Do sinh viên NGUYỄN PHƯƠNG THANH thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận
văn tốt nghiệp và đã được thông qua.
Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ……………
Ý kiến hội đồng: ……………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………...

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2010

Duyệt Khoa

Chủ tịch Hội đồng

Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả được
trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Nguyễn Phương Thanh

iii


LỜI CẢM TẠ
Kính dâng
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Cô cố vấn Lâm Ngọc Phương đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trình
thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Thầy cố vấn Lê Văn Bé cùng với quí thầy cô Khoa Nông Nghiệp và Sinh
Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện em suốt những năm học tại trường Đại Học
Cần Thơ.
Chân thành cảm ơn
Chị Lê Minh Lý và cùng với các anh chị trong phòng thí nghiệm Nuôi Cấy Mô, Bộ Môn
Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ
đã hết lòng giúp đỡ.
Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & cây cảnh K33 đã giúp đỡ động viên tôi trong những năm
tháng trên giảng đường Đại Học.

iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

1. LÝ LỊCH
Họ và Tên:

Nguyễn Phương Thanh

Ngày sinh:

10/12/1989

Nơi sinh:

Thành phố Cần Thơ

Họ và Tên Cha:
Họ và Tên Mẹ:

Giới tính:

Nữ

Nguyễn Trung Hiếu

Năm sinh:

1956

Trần Thị Ngọc Thùy

Năm sinh:

1955

Quê quán:
53/9A đường Cách Mạng Tháng 8, phường An Hòa, quận Ninh Kiều,
thành phố Cần Thơ.
2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1995-2000 :

Trường Tiểu Học Cái Khế 2

2000-2004 :

Trường Trung Học Cơ Sở An Hòa 2

2004-2007 :

Trường Trung Học Phổ Thông Chuyên Lý Tự Trọng

2007-2011 :
Trường Đại Học Cần Thơ, ngành Hoa Viên Cây Cảnh, khóa 33, khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2010

Nguyễn Phương Thanh

v


MỤC LỤC

trang

Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm tạ
Tiểu sử cá nhân
Mục lục
Danh sách bảng
Danh sách hình
Danh sách chữ viết tắt
Tóm lược
MỞ ĐẦU
Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

iii
iv
v
vi
viii
ix
x
xi
1
2

1.1 Đặc điểm thực vật của cây Tử la lan.

2

1.1.1 Đặc tính thực vật

2

1.1.2 Yêu cầu ngoại cảnh cây Tử la lan.

2

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

3

1.2.1 Tầm quan trọng

3

1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật

4

1.3 Vai trò sắt và sắc tố trong quang hợp

8

1.4 Một số nghiên cứu trên cây Tử la lan.

9

1.5 Môt số nghiên cứu của AgNO3

9

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP

10

2.1 Phương tiện

10

2.2 Phương pháp

10

2.2.1 Thí nghiệm 1 Hiệu quả Fe-EDDHA trên sự sinh
trưởng của chồi Tử la lan

vi

11


2.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả AgNO3 và NAA trên sự
sinh trưởng và tạo rễ của chồi Tử la lan.

11

2.3 Xử lý số liệu

12

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

13

3.1 Hiệu quả Fe-EDDHA trên sự sinh trưởng của chồi Tử la
lan

13

3.1.1 Chiều cao gia tăng tương đối (%)

13

3.1.2 Số lá gia tăng tương đối (%)

14

3.1.3 Hàm lượng diệp lục tố (µg/gFW)

15

3.2 Hiệu quả AgNO3 và NAA trên sự sinh trưởng và tạo rễ
của chồi Tử la lan.

16

3.2.1 Chiều cao gia tăng tương đối (%)

16

3.2.2 Số lá gia tăng tương đối (%)

18

3.2.3 Tỷ lệ tạo rễ (%) và trọng lượng tươi (%) gia tăng
tương đối

19

3.2.4 Số rễ (rễ) và chiều dài rễ (cm)

21

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

24

4.1 Kết luận

24

4.2 Đề nghị

24

TÀI LIỆU THAM KHẢO

25

PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3

vii


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tựa bảng

Trang

3.1

Chiều cao gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các nồng
độ sắt khác nhau

13

3.2

Số lá gia tăng tương đối (%) của chồi Tử la lan trên môi trường
có các nồng độ sắt khác nhau

15

3.3

Hàm lượng (/gFW) diệp lục tố trên môi trường có các nồng
độ sắt khác nhau

15

3.4

Chiều cao gia tăng tương đối (%) của chồi Tử la lan trong môi
trường có các nồng độ AgNO3 và NAA khác nhau ở 4 tuần sau
khi cấy.

17

3.5

Số lá gia tăng tương đối (%) của chồi Tử la lan trên môi trường
có các nồng độ AgNO3 và NAA khác nhau ở 4 tuần sau khi
cấy.

18

3.6

Tỷ lệ (%) tạo rễ và trọng lượng tươi (%) gia tăng tương đối
trên môi trường có các nồng độ AgNO3 và NAA khác nhau ở 4
tuần sau khi cấy

20

3.7

Số rễ (rễ) và chiều dài rễ (cm) trong môi trường có các nồng độ

AgNO3 và NAA khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy.

22

viii


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tựa hình

Trang

1.1

Tử la lan Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern

2

1.2

Sinh tổng hợp ethylen và các ảnh hưởng sinh lý

7

2.1

Mẫu vật liệu Tử la lan

10

3.1

Chồi Tử la lan trên các môi trường có bổ sung Fe-EDTA và

14

Fe-EDDHA ở 4 tuần sau khi cấy.
3.2

Hàm lượng diệp lục tố trong môi trường ở 4 tuần sau khi cấy.

16

3.3

Chiều cao gia tăng tương đối ở 4 tuần sau khi cấy

18

3.4

Hình thành mô sẹo ở chồi Tử la lan ở 4 tuần sau khi cấy

21

3.5

Rễ Tử la lan trong môi trường có các nồng độ AgNO3 và NAA
khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy

23

ix


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

MS

Murashige và Skoog, 1962

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EDDHA

Ethylendiaminne-di (o-hydroxylphenyl) acetic acid

NAA

1-Naphthalene acetic acid

ctv.

Cộng tác viên

SAM

S-adenosyl-L-methionine

ACC

1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid

AgNO3

bạc nitrate

MACC

malonyl-ACC

x


NGUYỄN PHƯƠNG THANH. “Hiệu quả của Fe-EDDHA, AgNO3 và NAA trên sự
sinh trưởng chồi và rễ cây Tử la lan (Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) in vitro”. Luận
văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng
Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lâm Ngọc Phương.

TÓM LƯỢC

Đề tài “Hiệu quả của Fe-EDDHA, AgNO3 và NAA trên sự sinh trưởng chồi và rễ cây
Tử la lan (Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) in vitro” nhằm tìm nồng độ Fe-EDDHA,
AgNO3 và NAA thích hợp sinh trưởng chồi và rễ của cây Tử la lan in vitro, đáp ứng nhu
cầu chất lượng cây con cho thuần dưỡng trong qui trình vi nhân giống.

Đề tài được thực hiện gồm 2 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên 1 nhân tố; 4 lần lặp lại; mỗi lần lặp lại 1-2 keo; mỗi keo cấy 4 mẫu.
Kết quả thí nghiệm cho thấy a) môi trường sử dụng Fe-EDDHA 25 mg/l giúp gia tăng
hàm lượng diệp lục tố trong lá; b) môi trường MS có bổ sung bổ sung NAA 0,2 mg/l
thích hợp việc phát triển rễ và AgNO3 1 mg/l cho sự sinh trưởng, phát triển về chiều cao,
số lá tốt sau 4 tuần nuôi cấy của chồi Tử la lan.

xi


MỞ ĐẦU
Hoa tượng trưng cho cái đẹp, giải tỏa nỗi buồn, đem lại cảm giác vui vẻ cho con
người, đồng thời hoa được dùng trong các dịp kỷ niệm, lễ, Tết, ...nên hoa chiếm một vị trí
quan trọng trong cuộc sống con người. Cùng với sự phát triển không ngừng của đi sống
xã hội, việc thưởng thức hoa ngày càng trở nên phổ biến; nghề trồng hoa và kinh doanh
hoa cũng phát triển rất mạnh mẽ, đặc biệt là về qui mô, chất lượng cũng như chủng loại.
Hiện nay, Tử la lan Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern, là một trong những loại hoa nhập
nội, hấp dẫn vì vẻ đẹp về màu sắc và hình dáng cũng như độ bền của hoa. Hoa dạng hình
chuông đa dạng về màu sắc và hình dáng, nhiều hoa nở cùng lúc và mỗi đợt hoa nở kéo
dài đến 20 ngày nên phù hợp và đáp ứng được nhiều đối tượng. Tuy nhiên do đây là
giống hoa mới được nhập nội nên giống hoa rất ít, chưa đáp ứng được nhu cầu của người
chơi hoa (Nguyễn Quang Thạch, 2004).
Cây Tử la lan được nhân giống bằng nhiều phương pháp như nhân giống bằng hạt,
cuống lá, thân củ, trong đó phương pháp tốt nhất là nhân giống bằng hạt (Saledo,1980).
Việc nhân giống bằng các phương pháp cổ truyền tuy chiếm nhiều ưu thế nhưng không
làm cây sạch bệnh và hệ số nhân thấp (Dương Công Kiên, 2007). Hiện nay, để đáp
ứng xu hướng ưa thích các loài hoa lạ của người dân nhưng các loại hoa nhập nội này có
giá thành cao, nguồn cung cấp không ổn định, độ bền giảm ..., việc nghiên cứu và chọn
tạo những giống hoa bền, đẹp để đáp ứng thị trường ngày càng được chú trọng. Nhân
giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô đang được nhiều người ưa chuộng và được xem là cách

có thể chọn để thay thế phương pháp cổ truyền trong nhân giống cây trồng (Khosravi và
ctv., 2007). Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004) sự thành công của công việc vi nhân giống
tùy thuộc vào các giai đoạn a) chuẩn bị của cây mẹ; b) vô trùng mẫu cấy; c) nhân chồi; d)
vươn cao chồi, tạo rễ, tiền thuần dưỡng và e) thuần dưỡng. Trong giai đoạn nhân chồi,
những năm gần đây, AgNO3 là chất ức chế hoạt động ethylen đã được sử dụng có vai trò
trì hoãn lão hóa đưa đến kết quả tốt trong tăng trưởng của chồi khi được sử dụng ở nồng
độ thấp (Beyer, 1976). Ngoài ra, việc sử dụng sắt dạng Fe-EDDHA cũng được đưa vào
trong môi trường nuôi cấy (Rashid và Street, 1973).
Đề tài “Hiệu quả của Fe-EDDHA, AgNO3 và NAA trên sự sinh trưởng chồi và rễ cây
Tử la lan (Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern) in vitro” nhằm tìm nồng độ Fe-EDDHA,
AgNO3 và NAA thích hợp sinh trưởng chồi và rễ của cây Tử la lan in vitro, đáp ứng nhu
cầu chất lượng cây con cho thuần dưỡng trong qui trình vi nhân giống.

1


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật của cây Tử la lan.
1.1.1 Đặc tính thực vật
Tên thương mại: Gloxinia
Tên khoa học: Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern, thuộc họ Gesneriaceae, bộ
Lamiales. Một số khác quan trọng như Aeschynanthus radicans Jack. (cây son môi,
Lipstick Plant), Nematanthus sp. (cá vàng, Goldfish Plant), Episcia cupreata Hanst
(Ấm kiếm), Saintpaulia ionantha Wendl. (Tử linh lan, African Violet) (John và Harold,
2005).
Nguồn gốc: nhiệt đới từ Brazil.
Màu sắc: bao gồm màu trắng, hồng, đỏ và tím. Các hoa cũng có thể có hai màu với
các trung tâm màu trắng hoặc vành trắng (Steven, 2007).
Đặc điểm: cây phát triển với lóng, cuống lá ngắn, phiến lá hình trứng thuôn, có lông

và xanh đậm. Đài hoa dạng thùy, hình trứng và hợp nhất thành vành hoa dạng chuông
hình ống, cuống nhỏ 10 cm hoặc dài hơn để giúp hoa đứng vững. Cụm hoa xuất hiện
trong nách lá (John và Harold, 2005).
Nhân giống: bằng hạt, cuống lá giâm cành, hoặc củ, tuy nhiên phương pháp nhân
giống thường dùng là bằng hạt. Chu kỳ nở hoa có thể kéo dài 2-4 tuần, và số hoa còn lại
có thể kéo dài nếu chăm sóc đúng (Steven, 2007).

Hình 1.1: Tử la lan Sinningia speciosa (Lodd.) Hiern

1.1.2 Yêu cầu ngoại cảnh cây Tử la lan.
Ánh sáng: không để cây dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp.
Nước: khi tưới, tránh tưới trên bề mặt lá. Không bao giờ cho phép để cây Tử la lan
khô, thậm chí là hơi khô (Steven, 2007).
2


Nhiệt độ: là cây nhạy cảm, tốt nhất với ban đêm ở nhiệt độ 650F (18,30C) hoặc cao
hơn và ban ngày ở nhiệt độ 750F (23,90C). Cây phát triển chậm ở 600F (160C) và sự
chết xuất hiện ở 500F (100C) (Stromme, 1985).
Độ ẩm: yêu cầu với ẩm độ cao. Cây bị tổn thương ở 100C hoặc dưới mức đó.
Côn trùng: rệp, nhện, bọ trĩ, sâu đục lá, luôn là vấn đề (Saledo, 1980; Love, 1985).
1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật
Nhà thực vật học người Đức Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương
pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Nuôi cấy
mô thực vật đã nhanh chóng hoàn thiện và phát triển cho đến ngày nay và có nhiều
đóng góp quan trọng trong nông nghiệp, lâm nghiệp và nhiều lĩnh vực khác (Nguyễn
Đức Thành, 2000).
1.2.1 Tầm quan trọng
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy thực vật trong ống nghiệm, khác
với nuôi cấy in vivo là quá trình nuôi cấy thực vật trong tự nhiên (Nguyễn Xuân Linh,

1998). Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen được
tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Ưu điểm
 Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí hiếm làm vật liệu cho công tác tạo giống.
 Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau,
cây hoa và các cây trồng khác.
 Nhân nhanh các loại cây trồng khó nhân giống bằng các phương pháp thông
thường khác. Làm sạch virut và bảo quản nguồn gen cây trồng trong ngân hàng gen
 Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh (Lâm Ngọc
Phương, 2005).
 Làm hạ giá thành vận chuyển, bảo quản cây giống cũng thuận tiện (Nguyễn Đức
Thành, 2000).
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Gần đây hằng năm trên thế
giới sản xuát khoảng 50 triệu cây. Một vấn đề hiện nay là giá cây giống nhân bằng
phương pháp vi nhân còn cao (2500-3000đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến qui trình nhân
để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống
cây thật quí hiếm và có giá trị kinh tế cao.

3


1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật
* Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong cấy mô
thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất
hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Các nguyên tố khoáng đa lượng
Theo Lê Văn Hòa và ctv. (2004) khoáng đa lượng rất cần cho cây có ảnh hưởng rất
tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên tố đa lượng cần
cung cấp là: Nitrogen (N), Phospho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium

(Ca) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Các nguyên tố khoáng đa lượng
được sử dụng trong môi trường nuôi cấy thường ở nồng độ trên 30 mg/l (Lê Trần Bình
và ctv., 1997).
* Các nguyên tố khoáng vi lượng
Đây là những nguyên tố mà cây trồng chỉ cần rất ít nhưng không thể thiếu cho sự
sinh trưởng và phát triển bình thường. Hầu hết các nguyên tố khoáng vi lượng cần thiết
cho cây đối với mô nuôi cấy đều được cung cấp vào trong môi trường nhân tạo. Các vi
lượng thường thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng
(Cu), Molybden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường
thấp hơn 30 mg/l. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các
enzyme (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
*

Nguồn cacbonhydrate

Hầu hết các mẫu vật nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp chất hữu cơ.
Nguồn carbonhydrate giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế
bào phân chia, tăng sinh khối. Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro
là glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Tùy theo mục đích nuôi cấy, hàm lượng
sucrose được sử dụng từ 20-40 g/l (Nguyễn Đức Thành, 2000). Khi sử dụng đường
sucrose trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy phân hoàn toàn hoặc một phần thành
monosaccharide: glucose và fructose (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
*

Vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng
hợp được hầu hết các loại vitamin nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ
sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các nhóm vitamin thuộc nhóm B (Lê Trần Bình

và ctv., 1997). Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và
cofactor của nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Các vitamin thường
được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin (B1 ), acid nicotinic (PP),
pyridoxine (B6) và myo-inositol. Trong đó thiamin là một vitamin căn bản cần thiết
4


cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,
2002). Trong đó, myo-inositol có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào và thường
được dùng với hàm lượng lớn từ 50-100 mg/l (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
* Agar
Agar là một polysaccharide làm từ rong biển. Agar tan ở 1000C và đông đặc ở 450C.
(Nguyễn Đức Thành, 2000). Agar được sử dụng làm chất đông cứng môi trường để làm
giá thể cho môi trường nuôi cấy. Vì có nguồn gốc từ thực vật tự nhiên, agar không tạo
độc tố cho mẫu vật, không phản ứng với chất trong môi trường nuôi cấy và không bị
thủy phân bởi enzyme thực vật nên được sử dụng rộng rãi (Nguyễn Đức Lượng và Lê
Thị Thủy Tiên, 2002). Nồng độ agar thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô
thực vật là 6-8g (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004) nồng độ
agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến: thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ
cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như
sự thừa nước, sự hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar.
*

Nước dừa

Nước dừa được bổ sung vào môi trường nhằm tăng sự sinh trưởng và phát triển mô.
Thành phần của nước dừa khá phong phú, có chứa myo-inosytol, các chất thuộc nhóm
cytokynin (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006), và một số amino acid khác (Nguyễn Đức Lượng
và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Đối với đa số mẫu vật nuôi cấy, lượng nước dừa phù hợp
nhất là từ 15 đến 20% theo thể tích môi trường (Vũ Văn Vụ, 1999).

* pH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Giá trị pH ảnh hưởng đến khả năng
hòa tan của các ion trong môi trường khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng
tế bào. Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. Ngoài
ra sự bền vững và hấp thụ một số chất phụ thuộc vào pH của môi trường, đặc biệt mẫn
cảm với pH là NAA, gibbrellin và vitamin. Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc
vào pH. Murashige và Skoog (1962) nhận thấy rằng nồng độ pH = 5,7-5,8 thích hợp
duy trì sự hòa tan các chất khoáng trong môi trường MS.
* Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi
cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro (Vũ
Văn Vụ và ctv., 2006). Đây là chất có hoạt tính sinh học rất cao nên với một hàm lượng
rất nhỏ (10-9) có thể kích thích, ức chế hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý nào
trong thực vật. Tuỳ theo giống, loài thực vật mà nhu cầu về dạng và nồng độ của nhóm
chất này khác nhau. Hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng thực vật được dùng nhiều nhất
là auxin và cytokinin (Nguyễn Xuân Linh, 1998).

5


 Auxin
Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) và auxin
tổng hợp là indole-3-butyric acid (IBA), 1-alpha-naphthaleneacetic acid (NAA) và
2,4-dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D) (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Trong lĩnh vực
nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh
trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất,
kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Tùy theo
loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là
kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành mô sẹo. Nồng
độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1-2,0 mg/l vì chúng có

hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
* Sắt (Fe)
Theo Lê Văn Bé (2007), sắt có vai trò đối với cây trồng: Fe hiện diện trong các
cytochrome (gọi chung là Hemoprotein) các protein này có trong lục lạp và ty thể, làm
nhiệm vụ chuyển vận điện Tử giữa hệ thống quang (quang hợp) và vận chuyển điện Tử của
hydro (hô hấp). Fe trải qua sự oxit hóa và khử luân phiên giữa trạng thái Fe 2+ và Fe 3+ có vai
trò như chất vận chuyển điện tử. Khi thiếu sắt, sự hình thành diệp lục tố bị ức chế, là do
sự tổng hợp protein bị giảm vì số lượng ribosome giảm nghiêm trọng (Lin và Stocking,
1978). Triệu chứng thiếu sắt ở lá là lục lạp không phát triển, còn ở rễ thì có sự thay đổi
về hình thái (Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2003). Khi thiếu sắt, tế bào mất đi khả năng phân
chia. Theo Nguyễn Đức Thành (2000) thì sự hiện diện của nguyên tố sắt đặc biệt quan
trọng cho quá trình tạo chồi và rễ bất định. Theo Dunlap và Robacker (1988) sắt là một
trong những thành phần vi lượng cơ bản được sử dụng trong vi nhân giống, vì nó là
nguyên tố cần thiết trong nhiều quá trình giống như tổng hợp chất diệp lục và ADN
Mặt khác, sự thay thế của Fe-EDTA với hình thức Fe-EDDHA đã tác động tích cực
đến vi nhân giống các loài khác nhau (Rashid và Street, 1973). Sắt được dùng phổ biến
trong nuôi cấy mô ở dạng: Fe-EDTA (ethylenediamine tetraacetate) và Fe-EDDHA
(ethylenediamine di-o-hydroxyphenyl acetate). Marta và Teresa (2006) khi thêm FeEDDHA vào môi trường nhân chồi mâm xôi (raspberry) thì giảm bệnh vàng lá, tăng
hàm lượng diệp lục tố. Theo Christensen và ctv. (2008) khi thay thế Fe-EDTA bởi FeEDDHA thì hàm lượng diệp lục tố và diện tích lá cây dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis
L.) tăng gấp 3 lần ở các mức độ 98 μM, 197 μM, 295 μM Fe-EDDHA.
* Bạc (AgNO3)
Trong nhân giống vô tính, ở giai đoạn tạo mô sẹo và cây non, ethylen ảnh hưởng
đến sự phát triển và cành nhánh khác thường (Turhan, 2004). Tiền thân của ethylen là
1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). Sinh tổng hợp của ethylen bắt đầu với
chuyển đổi của các acid amin methionine để hình thành SAM (S-adenosyl-Lmethionine). SAM có thể đi theo hai con đường, biến đổi thành S-adenosylmethyl thio
propylamin bởi enzym SAM decarboxylate và đi vào sự sinh tổng hợp polyamine. Con
6


đường khác là thành 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) theo con đường

của enzym ACC synthase (ACS). Ở ACC, nó có thể được biến đổi thành ethylen do
ACC oxidase hoặc thành malonyl-ACC theo con đường của enzym ACC N-malonyltransferase (Nguyễn Minh Chơn, 2005). ACC ức chế sự thành lập rễ bằng cách trì hoãn
sự xuất hiện rễ và gia tăng hình thành callus ở chồi và ngược lại chất ức chế ethylen thúc
đẩy hình thành rễ (Vinod Kumar, 2009). Các chất ức chế ethylen ảnh hưởng đến mức độ
SAM tạo thành ACC, do đó ảnh hưởng đến mức độ ethylen (Gong và ctv., 2005).
Trong những năm gần đây, AgNO3 đã được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô
đóng vai trò là chất ức chế hoạt động ethylen, trong đó Ion bạc làm giảm khả năng thụ
cảm của ethylen. Bạc được phát hiện có ích trong sự phục hồi và nhân giống một vài
cây có giá trị kinh tế như đậu (Pestanaetal, 1999), dưa hấu (Lim và Song, 1993), dưa
leo (Mohiuddin et al., 1997), khoai mì (Zang et al., 2001)… Bạc thích hợp sử dụng để
đẩy mạnh tạo rễ cây táo, rau diếp và Decalepsis hamiltonii (Ma et al., 1998; Bais et al.,
2000). Ion bạc trong AgNO3 có vai trò chủ yếu trong ảnh hưởng thành lập chồi, phôi
soma, giảm số lượng mô sẹo trong vi nhân giống (Tsao, 2002).

Mô sẹo
MACC
Kích thích
Ion cobal

Methionin

Chín trái
Rụng lá

Ức chế sinh
tổng hợp

Lão suy hoa
Tạo rễ

ACC

Sinh trưởng chồi
ACC synthase

Ức chế

Ethylen
Hoạt động
ức chế

Tạo cơ quan
Tạo phôi

Kích thích

SAM

Tái sinh
Ra hoa

Ion bạc

Hình 1.2 Sinh tổng hợp ethylen và các ảnh hưởng sinh lý (Kumar, 2009).

7


1.3 Vai trò sắt và sắc tố trong quang hợp
Theo Lê Văn Hòa và ctv. (2004) tất cả các sắc tố hoạt động trong quang hợp được

tìm thấy trong lục lạp. Hệ sắc tố quang hợp có:
* Chlorophylls (diệp lục)
Diệp lục a: C55H72O5N4Mg
Diệp lục b: C55H70O6N4Mg
Công thức cấu tạo, chia ra hai phần: nhân diệp lục và đuôi diệp lục. Nhân diệp lục là
phần quan trọng nhất, gồm 1 nguyên tử Mg ở trung tâm liên kết với 4 nguyên tử N của
4 vòng pyrol tạo nên vòng Mg-pocphirin rất linh hoạt. Đuôi phân tử diệp lục rất dài
gồm gốc rượu phitol có 20 nguyên tử cacbon. Đuôi diệp lục có tính ưa lipit.
Chlorophylls không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (este, axeton, rượu,
benzen…), tác dụng với axit; có thể phát huỳnh quang, truyền năng lượng và quang
hóa học.
* Carotenoit
Là nhóm sắc tố từ màu vàng tới cam. Có 2 loại: carotenes (C40H56 ) và xanthophylls
(C40H56O2 ) có chứa oxygen. Xanthophylls là nhóm sắc tố màu vàng da cam. Carotenoit
là sắc tố thu nhận ánh sáng để đóng góp cho quang hợp và bảo vệ chlorophylls (chống
lại sự phá hủy oxit hóa khi mức độ chiếu sáng cao).
Sắt là nguyên tố cần thiết bởi vì nó đóng vai trò then chốt của các hệ thống enzyme. Ở lá,
khoảng 80% Fe định vị trong lục lạp. Sắt được dự trữ trong tế bào cây, dưới dạng
phytoferritin (ở stroma của plastid) (Nguyễn Bảo Vệ và ctv., 2003). Fe không phải là
thành phần của diệp lục tố nhưng rất cần thiết cho sự sinh tổng hợp của diệp lục tố (Nguyễn
Bảo Toàn, 2004).
Diệp lục hấp thu năng lượng ánh sáng mặt trời . Năng lượng được dự trữ trong các
phân tử sắc tố dưới dạng năng lượng kích thích và tiếp theo là sự di trú năng lượng vào
trong trung tâm phản ứng, là một phân tử diệp lục đặc biệt. Phân tử diệp lục ở trung tâm
phản ứng này, sau khi nhận năng lượng sẽ trở nên bị kích thích và trở thành chất cho
điện tử, nhường điện tử cho chất nhận electron đầu tiên tham gia vào quá trình quang
phosphoryl hóa. Tuy nhiên, tùy theo diệp lục ở trung tâm phản ứng khác nhau mà quá
trình vận chuyển điện tử có thể đi theo con đường quang phosphoryl hóa vòng hay
không vòng. Có 2 hệ thống quang: hệ thống quang 1 PSI chứa đựng chla, lượng nhỏ
chlb, 1 ít caroten. P700 là trung tâm phản ứng PSI và tất cả chla ,caroten bao xung

quanh và chuyển năng lượng. Sự hiện diện ít nhất 2 protein chứa sắt tương tự với
ferredoxin (Fd), mà một trong 4 nguyên tử sắt trong mỗi protein liên kết vào 2 nguyên
tử lưu huỳnh-protein Fe-S là chất nhận điện tử chủ yếu PS I. Ferredoxin truyền các điện
tử từ protein Fe-S của PSI đến trực tiếp cho NADP+, hoàn tất xuyên suốt quá trình
truyền điện tử do ánh sáng tác động. Hệ thống quang 2 PS II chứa chla, caroten, một ít
8


chlb. Trung tâm phản ứng là P 680. Dãy phức hợp thu nhận ánh sáng chứa chla, chlb
xanthophyll nhưng rất ít caroten, các sắc tố này liên kết với protein.
1.4 Một số nghiên cứu trên cây tử la lan.
Hồ Bảo Thùy Quyên và ctv. (2004) đã nghiên cứu trên lá biệt hóa thành chồi trên
môi trường MS bổ sung BA (0,5-1,0 mg/l) và IAA (0,5-1,0 mg/l), sau đó chuyển sang
môi trường MS có NAA 0,2 mg/l để tạo rễ.
Khi có sự kết hợp giữa BA và NAA 1 mg/l số chồi thu được tăng lên rõ rệt. Với
IAA và NAA 3 mg/l với số lượng rễ thấp và rễ khá nhỏ theo Wuttisit và
Kanchanapoom (1996).
Nguyễn Quang Thạch sử dụng môi trường tối ưu cho hệ số nhân là: MS + BA 0,5
mg/l + NAA 0,2 mg/l. Môi trường MS có lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa cho
khả năng tạo cây có rễ đầy đủ và sinh trưởng mạnh.
Theo Phạm Thanh Thoảng (2009) bổ sung BA 1 mg/l + NAA 0,1 mg/l tạo mô sẹo
từ lá cao nhất đạt 97,5%, và BA 2 mg/l + NAA 0,1 mg/l cho tỷ lệ tái sinh chồi từ mẫu lá
đạt 57,5%, mẫu thân đạt 25%.
1.5 Môt số nghiên cứu của AgNO3
Theo Harsh và ctv. (2000) với AgNO38 mg/l cải thiện và kéo dài rễ Decalepis
hamiltonii..
Giridhar và ctv. (2001) số lượng chồi tối đa và độ dài của chồi cao nhất thu được khi
thêm AgNO3 4 mg/l. AgNO3 không chỉ ảnh hưởng đến nhân chồi mà còn ảnh hưởng
đến quá trình tạo rễ của vanilla, các cây trồng khi thêm vào AgNO3 8 mg/l đạt tỉ lệ
100% cây sống.

Sunakumari và ctv. (2004) AgNO3 cũng giúp tạo rễ và hoa trong ống nghiệm những
loài thực vật quý hiếm, Rotula aquatica Lour. Ở môi trường 1/2 MS sử dụng NAA (2,69
μM) và bạc (11,7 μM) là giải pháp cải thiện rễ hiệu quả.
Turhan (2004) nồng độ AgNO3 1-2 mg/l làm tăng số lượng rễ, chồi giảm thủy tinh
thể và tính biến dị của chồi ở khoai tây.
Gek-Lan Chi (1990) có hiệu quả trong việc thúc đẩy hình thành chồi, sử dụng nồng
độ AgNO3 1mg/l cho việc thành lập chồi nhiều, và việc phát triển rễ rất tốt trong các
môi trường có AgNO3.
Fuentes et al. (2000) ở nồng độ thấp, AgNO3 được tìm thấy đã làm chậm lão hóa và
cải thiện tăng trưởng của các chồi phát triển mạnh ở cà phê

9


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện
2.1.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: thí nghiệm được thực hiện từ tháng 09/2010-12/2010.
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng cấy mô, Bộ môn Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Điều kiện phòng thí
nghiệm: phòng nuôi cấy có nhiệt độ là 26  20C, cường độ chiếu sáng 1000-2000 lux,
thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu Tử la lan in vitro 3 tuần tuổi, có từ 6-8 lá, chiều
cao 2-3 cm. (Hình 2.1)

Hình 2.1 Mẫu vật liệu Từ la lan

2.1.3 Phương tiện thí nghiệm

Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ sấy giấy, nồi thanh trùng (autoclave), máy đo pH, cân
điện tử, tủ lạnh,…
Hóa chất: Khoáng đa lượng, vi lượng, đường, agar, nước cất, nước dừa, các loại
vitamine, Myo-inositol.
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 6-benzyl adenine (BA), 1- naphthaleneacetic
acid (NAA), AgNO3 và Fe-EDDHA
2.2 Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường: Môi trường nuôi cấy cơ bản gồm môi trường dinh dưỡng MS
(Murashige và Skoog, 1962) (Phụ lục 1) có bổ sung nước dừa (80 ml/l), đường (30
g/l), agar (7 g/l), myo-inositol (100 mg/l), nicotinic acid (1 mg/l), pyridoxin (1 mg/l),
thiamin (1 mg/l). Ngoài ra tùy theo thí nghiệm có bổ sung thêm vào môi trường nuôi
cấy các chất điều hòa sinh trưởng: 6-benzyl adenine (BA), 1-naphthalene acetic acid
(NAA), AgNO3, hoặc thay thế Fe-EDTA bằng Fe-EDDHA.
10


Điều chỉnh pH môi trường về 5,7-5,8 trước khi nấu môi trường. Mỗi keo rót 40 ml
môi trường và chuyển vào nồi hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 atm, trong 20 phút.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Hiệu quả của Fe-EDDHA trên sự sinh trưởng chồi Tử la lan.
* Mục tiêu: tìm nồng độ Fe-EDDHA thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển chồi
Tử la lan.
* Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một
nhân tố, bao gồm 4 nghiệm thức (NT), mỗi nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại
tương ứng 1 keo, mỗi keo có 4 mẫu chồi.
Thí nghiệm được bố trí như sau: Thời gian lấy chỉ tiêu: 1, 2, 3, và 4 tuần sau khi cấy
NT1: Fe-EDTA (MS)
NT2: MS + Fe-EDDHA 25 mg/l (3,36 mg Fe)
NT3: MS + Fe-EDDHA 50 mg/l (6,7 mg Fe)

NT4: MS + Fe-EDDHA 100 mg/l (13,4 mg Fe)
* Cách tiến hành: chọn những chồi ngọn in vitro có chiều cao 2-3 cm, có 6-8 lá để bố
trí thí nghiệm.
* Chỉ tiêu theo dõi:
 Chiều cao chồi (tính từ gốc chồi đến đỉnh lá cao nhất (cm))
 Số lá
 Hàm lượng diệp lục tố (Phụ lục 2)
Thí nghiệm 2: Hiệu quả AgNO3 và NAA trên sự sinh trưởng và tạo rễ của chồi Tử
la lan.
* Mục tiêu: tìm nồng độ NAA và AgNO3 thích hợp cho sự tạo rễ của chồi Tử la lan.
* Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một
nhân tố với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại tương ứng 2
keo, mỗi keo có 4 chồi.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
NT1 NAA 0,0 mg/l
NT2: NAA 0,2 mg/l
NT3: NAA 0,5 mg/l
NT4: AgNO3 1 mg/l
NT5 : AgNO3 2mg/l
NT6: NAA 0,2 mg/l + AgNO3 1 mg/l
11


NT7: NAA 0,5 mg/l + AgNO3 1 mg/l
NT8: NAA 0,2 mg/l + AgNO3 2 mg/l
NT9: NAA 0,5 mg/l + AgNO3 2 mg/l
* Cách tiến hành: chọn những chồi ngọn có chiều cao 2-3 cm, có 6-8 lá để bố trí thí
nghiệm.
* Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian lấy chỉ tiêu: 0, 1, 2, 3 và 4 tuần sau khi cấy
 Tỉ lệ tạo rễ (%)

 Số rễ (đếm rễ chính)
 Chiều dài rễ tính ở rễ dài nhất (cm)
 Chiều cao chồi (tính từ gốc chồi đến đỉnh lá cao nhất (cm) )
 Số lá
 Trọng lượng tươi (ghi nhận ở thời điểm 0 và 4 tuần sau khi cấy)
2.3 Xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng chương trình Microsoft Excel và phân tích thống kê bằng chương
trình MSTATC, kiểm định LSD, Duncan ở mức ý nghĩa 5% hay 1%.
Các số liệu chiều cao, số lá và số chồi gia tăng tương đối được tính như sau:
 Giá trị gia tăng tương đối= (giá trị sau – giá trị đầu)/giá trị đầu*100
 Tỉ lệ tạo rễ (%)= (số cây ra rễ/tổng số cây trong mẫu)*100

12