HIỆU QUẢ của môi TRƯỜNG NUÔI cấy TRÊN sự NHÂN CHỒI và tạo rễ cây HOA dã yên THẢO (petuniasp ) IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ NHI

HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN
SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY HOA
DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.) IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: HOA VIÊN CÂY CẢNH

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: HOA VIÊN CÂY CẢNH

Tên đề tài:

HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN
SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY HOA
DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.) IN VITRO

Cán bộ hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. Lâm Ngọc Phương

Nguyễn Thị Nhi
MSSV: 3073242
Lớp: Hoa Viên Cây Cảnh k33

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG



Luận văn tốt nghiệp ngành Hoa viên & Cây cảnh với đề tài: “HIỆU QUẢ CỦA
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY HOA
DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.) IN VITRO” do sinh viên Nguyễn Thị Nhi thực
hiện.
Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2010
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Lâm Ngọc Phương

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG



Hội đồng chấm luận văn đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Hoa viên
& Cây cảnh với đề tài: “HIỆU QUẢ CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TRÊN
SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia sp.) IN
VITRO”, do sinh viên Nguyễn Thị Nhi thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm
luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua.

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ....................................
Ý kiến hội đồng: ......................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................

Duyệt Khoa

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2010

Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Chủ tịch Hội đồng

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn
(ký tên)

Nguyễn Thị Nhi

iii


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
Họ và tên: Nguyễn Thị Nhi
Ngày sinh: 01/06/1989
Nơi sinh: Cần Thơ
Họ và tên cha: Nguyễn Thanh Phong
Họ và tên mẹ: Nguyễn Thị Lệ
Quê quán: Xã Mỹ Khánh, huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ.
Quá trình học tập:
1995 – 1997: Trường Tiểu Học Mỹ Khánh 3
1997 – 2000: Trường Tiểu Học Mỹ Khánh 1
2000 – 2004: Trường Trung học cơ sở Mỹ Khánh
2004 – 2007: Trường Phổ Thông Trung Học Phan Văn Trị
2007 – 2010: Trường Đại Học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, Ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, khóa 33.

iv


LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn!

Cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình
thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cám ơn cô đã có những lời khuyên bổ ích và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho em nghiên cứu, hoàn thành tốt luận văn này.
Quý thầy cô, chị Lê Minh Lý và các anh chị phòng Nuôi cấy mô, Bộ môn Sinh
lý – Sinh hóa, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng đã quan tâm, giúp đỡ em
trong quá trình thực hiện đề tài.
Thầy Lê Văn Bé – cố vấn học tập lớp Hoa viên & Cây cảnh khóa 33 cùng tất cả
quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập.
Kính dâng!
Cha mẹ đã sinh ra và nuôi dạy, suốt đời tận tụy vì con.
Thân gửi về!
Cô Lâm Ngọc Phương, thầy Lê Văn Bé, chị Lê Minh Lý và các bạn lớp Hoa
Viên & Cây Cảnh khóa 33 những lời chúc tốt đẹp nhất.

Nguyễn Thị Nhi

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

iii

Tiểu sử cá nhân

iv

Lời cảm tạ

v

Mục lục

vi

Danh sách bảng

ix

Danh sách hình

xi

Danh sách chữ viết tắt

xii

Tóm lược

xiii

MỞ ĐẦU

1

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2

1.1 Đặc điểm thực vật của cây hoa dã yên thảo

2

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố

2

1.1.2 Đặc điểm thực vật

2

1.1.3 Kỹ thuật trồng

2

1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

2

1.2.1 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam

2

1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật

3

1.3 Một số kết quả nuôi cấy mô cây hoa dã yên thảo đã
được công bố

8

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

9

2.1 Phương tiện nghiên cứu

9

2.2.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm

9

2.2.2 Thiết bị và hóa chất

9

2.2.3 Điều kiện thí nghiệm

9

2.2.4 2.1.4 Vật liệu

9

vi


2.2 Phương pháp nghiên cứu

10

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

10

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

10

2.3 Xử lý số liệu

14

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

15

3.1 Ghi nhận tổng quát về giai đọan vô trùng mẫu chồi dã
yên thảo

15

3.2 Hiệu quả của BA và NAA trên sự nhân chồi dã yên thảo

15

3.2.1 Số chồi gia tăng

15

3.2.2 Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%)

18

3.2.3 Chiều cao gia tăng tương đối (%)

19

3.2.4 Số lá gia tăng tương đối (%)

22

3.3 Hiệu quả của NAA và AgNO3 trên sự sinh trưởng và
phát triển của chồi dã yên thảo

24

3.3.1 Chiều cao gia tăng tương đối (%)

24

3.3.2 Số lá gia tăng tương đối (%)

28

3.3.3 Trọng lượng gia tăng tương đối (%)

31

3.4 Hiệu quả của Fe-EDDHA trên sự sinh trưởng và phát
triển của chồi dã yên thảo

32

3.4.1 Hàm lượng diệp lục tố

32

3.4.2 Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%)

33

3.4.3 Chiều cao gia tăng tương đối (%)

33

3.4.4 Số lá gia tăng tương đối (%)

34

3.4.5 Số chồi gia tăng

34

3.5 Hiệu quả của IBA và nồng độ khoáng đa lượng trên sự
tạo rễ của chồi dã yên thảo

35

3.5.1 Tỉ lệ chồi tạo rễ (%)

35

3.5.2 Số rễ

37

3.5.3 Chiều dài rễ

38

vii


3.5.4 Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%)

39

3.5.5 Số lá gia tăng tương đối (%)

41

3.5.6 Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%)

43

3.5.7 Số chồi gia tăng

43

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

47

4.1 Kết luận

47

4.2 Đề nghị

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

48

PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3

viii


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tựa bảng

Trang

2.1

Các nghiệm thức của thí nghiệm 1

10

2.2

Các nghiệm thức của thí nghiệm 2

11

2.3

Các nghiệm thức của thí nghiệm 4

13

3.1

Số chồi gia tăng trên môi trường có các nồng độ BA và NAA
khác nhau ở 1 tuần sau khi cấy

15

3.2

Số chồi gia tăng trên môi trường có các nồng độ BA và NAA
khác nhau ở 2 tuần sau khi cấy

16

3.3

Số chồi gia tăng trên môi trường có các nồng độ BA và NAA
khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

17

3.4

Số chồi gia tăng trên môi trường có các nồng độ BA và NAA
khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy

17

3.5

Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có
các nồng độ BA và NAA khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy

19

3.6

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các
nồng độ BA và NAA khác nhau ở 1 và 2 tuần sau khi cấy

20

3.7

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các
nồng độ BA và NAA khác nhau ở 3 và 4 tuần sau khi cấy

21

3.8

Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các nồng độ
BA và NAA khác nhau ở 1 và 2 tuần sau khi cấy

22

3.9

Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các nồng độ
BA và NAA khác nhau ở 3 và 4 tuần sau khi cấy

24

3.10

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các

nồng độ AgNO3 và NAA khác nhau ở 1 và 2 tuần sau khi cấy

25

3.11

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các
nồng độ AgNO3 và NAA khác nhau ở 3 và 4 tuần sau khi cấy

27

3.12

Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các nồng độ
AgNO3 và NAA khác nhau ở 1 và 2 tuần sau khi cấy

29

3.13

Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các nồng độ
AgNO3 và NAA khác nhau ở 3 và 4 tuần sau khi cấy

30

3.14

Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có

31

ix


các nồng độ AgNO3 và NAA khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy
3.15

Hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotenoid trên môi
trường có các hàm lượng Fe-EDTA và Fe-EDDHA khác nhau
ở 4 tuần sau khi cấy

32

3.16

Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có
các hàm lượng Fe-EDTA và Fe-EDDHA khác nhau ở 4 tuần
sau khi cấy

33

3.17

Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các
hàm lượng Fe-EDTA và Fe-EDDHA khác nhau
Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các hàm lượng
Fe-EDTA và Fe-EDDHA khác nhau

33

3.19

Số chồi gia tăng trên môi trường có các hàm lượng Fe-EDTA
và Fe-EDDHA khác nhau 4 tuần sau khi cấy

34

3.20

Tỉ lệ chồi dã yên thảo ra rễ trên môi trường có IBA và nồng độ
khoáng đa lượng khác nhau ở 2 tuần sau khi cấy

35

3.21

Tỉ lệ chồi dã yên thảo ra rễ trên môi trường có IBA và nồng độ
khoáng đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

37

3.22

Số rễ dã yên thảo trên môi trường có IBA và nồng độ khoáng
đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

38

3.23

Chiều dài rễ dã yên thảo (cm) trên môi trường có IBA và nồng
độ khoáng đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy
Chiều cao chồi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có IBA
và nồng độ khoáng đa lượng khác nhau 1-3 tuần sau khi cấy

39

3.25

Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có IBA và nồng
độ khoáng đa lượng khác nhau 1-3 tuần sau khi cấy

42

3.26

Trọng lượng tươi gia tăng tương đối (%) trên môi trường có
IBA và nồng độ khoáng đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi
cấy

43

3.27

Số chồi dã yên thảo gia tăng trên môi trường có IBA và nồng
độ khoáng đa lượng khác nhau ở 1 tuần sau khi cấy

44

3.28

Số chồi dã yên thảo gia tăng trên môi trường có IBA và nồng
độ khoáng đa lượng khác nhau ở 2 tuần sau khi cấy

45

3.29

Số chồi dã yên thảo gia tăng trên môi trường có IBA và nồng
độ khoáng đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

45

3.18

3.24

x

34

40


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tựa hình

Trang

1.1

Con đường sinh tổng hợp ethylen

6

2.1

Hoa dã yên thảo

9

3.1

Chồi dã yên thảo trên môi trường có các nồng độ BA và NAA
khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy

18

3.2

Chiều cao chồi dã yên thảo trên môi trường có các nồng độ
AgNO3 và NAA khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy

28

3.3

Hàm lượng diệp lục tố trên môi trường có các hàm lượng FeEDTA và Fe-EDDHA khác nhau ở 4 tuần sau khi cấy

32

3.4

Rễ dã yên thảo trên môi trường có IBA và nồng độ khoáng đa
lượng khác nhau ở 2 tuần sau khi cấy

36

3.5

Rễ dã yên thảo trên môi trường có IBA và nồng độ khoáng đa
lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

37

3.6

Cây dã yên thảo trên môi trường có IBA và các nồng độ
khoáng đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

39

3.7

Chồi dã yên thảo trên môi trường có IBA và nồng độ khoáng
đa lượng khác nhau ở 3 tuần sau khi cấy

41

xi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

HgCl2

Thủy ngân clorua

MS

Murashige và Skoog, 1962

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EDDHA

Ethylendiaminne-di (o-hydroxylphenyl) acetic acid

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

NAA

1-Naphthalene acetic acid

BA

Benzyl adenine

IBA

Indole-3-butyric acid

Kinetin

6-Furfurylaminopurine

TDZ

Thidiazuron (1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl))

ctv.

Cộng tác viên

SAM

S-adenosyl-L-methionine

ACC

1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid

AgNO3

bạc nitrate

xii


NGUYỄN THỊ NHI. “Hiệu quả của môi trường nuôi cấy trên sự nhân chồi và tạo
rễ cây hoa dã yên thảo (Petunia sp.) in vitro”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành
Hoa Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại
Học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lâm Ngọc Phương.

TÓM LƯỢC

Đề tài “Hiệu quả của môi trường nuôi cấy trên sự nhân chồi và tạo rễ cây hoa dã
yên thảo (Petunia sp.) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra môi trường thích hợp để
nhân chồi và tạo rễ in vitro đáp ứng nhu cầu chất lượng cây con trong qui trình vi
nhân giống cây hoa này.
Đề tài được thực hiện gồm 4 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn
ngẫu nhiên 1-2 nhân tố; 3-5 lần lặp lại; mỗi lần lặp lại 2 keo; mỗi keo cấy 4-5 mẫu.
Kết quả thí nghiệm cho thấy a) môi trường MS có bổ sung BA 0,5 mg/l+NAA
0,05 mg/l cho kết quả tốt nhất với số chồi gia tăng 5,6 chồi; b) môi trường MS có
bổ sung AgNO3 1,0 mg/l+NAA 0,2 mg/l cho hiệu quả chiều cao gia tăng và xanh
đậm sau 4 tuần nuôi cấy chồi c) sử dụng Fe-EDDHA 50 mg/l giúp gia tăng hàm
lượng diệp lục tố trong lá; d) sử dụng IBA 0,5 mg/l cùng nồng độ khoáng ½ MS cho
hiệu quả tạo rễ cao (100%) với số rễ và chiều dài rễ tốt nhất trong tạo rễ dã yên
thảo.

xiii


MỞ ĐẦU

Hiện nay dã yên thảo (Petunia sp.) có nhiều loài lai tạo cho ra nhiều chủng loại,
hoa có màu sắc phong phú, khá bền và phù hợp với nhiều mục đích sử dụng. Hoa có
đơn hoặc đa lớp, dạng gợn sóng, có thể có sọc, đốm hoặc viền quanh cánh với các
màu đỏ tía, hoa cà, màu oải hương, hồng, đỏ, trắng hay vàng. Dã yên thảo thường
được trồng thành luống, trong bồn hoặc chậu treo trang trí.
Hoa dã yên thảo được du nhập vào nước ta những năm gần đây chủ yếu được
nhân giống từ hạt. Tuy nhiên theo Verdonk (2005) cây hoa dã yên thảo có hạt nhỏ
và rất chậm để xử lý nhân giống bằng hạt. Đối với nhân giống bằng phương pháp
giâm cành thì hệ số nhân thấp, không đồng đều nên chưa thể đáp ứng nhu cầu khi
cần trồng cây với số lượng lớn, đồng loạt. Trong khi đó nuôi cấy mô là một phương
pháp hiệu quả trong nhân giống. Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004) sự thành công của
công việc vi nhân giống tùy thuộc vào các giai đoạn a) chuẩn bị của cây mẹ; b) tiệt
trùng mẫu cấy; c) nhân chồi; d) vươn cao chồi, tạo rễ, tiền thuần dưỡng và e) thuần
dưỡng. Trong giai đoạn nhân chồi, có nhiều nghiên cứu cho thấyAgNO3 là chất ức
chế hoạt động ethylen đã được sử dụng vì có vai trò trì hoãn lão hóa đưa đến kết
quả tốt trong tăng trưởng của chồi khi được sử dụng ở nồng độ thấp (Beyer, 1976).
Ngoài ra, việc sử dụng sắt dạng Fe-EDDHA cũng được đưa vào trong môi trường
nuôi cấy (Rashid và Street, 1973).
Đề tài “Hiệu quả của môi trường nuôi cấy trên sự nhân chồi và tạo rễ cây hoa dã
yên thảo (Petunia sp.) in vitro” được thực hiện nhằm tìm ra môi trường thích hợp để
nhân chồi và tạo rễ in vitro đáp ứng nhu cầu chất lượng cây con trong qui trình vi
nhân giống cây hoa này.

1


Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật của cây hoa dã yên thảo
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố
Cây hoa dã yên thảo thuộc họ cà (Solanaceae). Cây có nhiều tên gọi khác nhau,

theo Phạm Hoàng Hộ (2000) cây có tên là dã yên, theo Trần Hợp (2000) có tên là
cây hoa cà.
Cây dã yên thảo có nguồn gốc từ các nước miền Nam châu Mỹ, hiện nay được
gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, vườn hoa khắp nước ta. Ở miền bắc, hoa nở vào dịp
hè thu, còn ở miền nam, hoa nở vào dịp tết (Trần Hợp, 2000).
Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có từ nhiều loài khác của chi petunia, ví như
P. axillaris BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng, hoặc
P.violacea Lindl (Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím.
Ngày nay, các nhà vườn từ loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa
xèo ngón rất đẹp (Trần Hợp, 2000).
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Dã yên thảo là cây thân cỏ, sống hàng năm, mềm, phủ đầy lông dính, phân ít
cành nhánh. Lá mọc cách, hình trái xoan, thuôn đều, mép răn reo, mềm, màu xanh
bóng. Hoa lớn, thường đơn độc ở các nách lá. Một thân có thể có nhiều hoa nở cùng
lúc, và có nhiều màu khác nhau, từ trắng, hồng đến tím, đỏ hay loang lổ các màu
trên cùng một hoa. Cánh đài hợp ở gốc thường còn lại ở quả, cánh tràng hợp thành
ống, leo rộng ra ở đỉnh, dạng loa kèn, mềm, nổi rõ các gân thùy. Quả nang 2 mảnh,
nhiều hạt (Trần Hợp, 2000).
1.1.3 Kỹ thuật trồng
Theo Trần Hợp (2000) cây dã yên thảo có thể trồng bằng hạt hay giâm cành
ngọn. Trước khi gieo hạt cần làm đất kỹ và đủ nắng, hạt gieo 4-6 ngày sẽ cho cây
con và có thể đem trồng ở vườn ươm sau 20 ngày. Sau 20-25 ngày nữa thì đem
trồng ở vườn hoa, đất trồng cần đủ phân. Còn cành giâm, sau 20 ngày đã có rễ và
sau 1 tháng bứng trồng ở nơi cố định. Cây chóng cho hoa, nhưng nở rộ và chóng
tàn, quả cần thu hoạch kịp thời (1g hạt có 10.000-12.000 hạt).
1.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật
1.2.1 Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm
1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay có rất nhiều phòng

2


thí nghiệm nuôi cấy mô ở các Trường Đại học, các Viện nghiên cứu, các Sở khoa
học và Công nghệ ở các Tỉnh, Thành phố. Đà Lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô của tư nhân phục vụ cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ
(Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển Hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Theo Vũ Văn Vụ và ctv. (2006) thì thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và
mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Đối
với cùng một loại mô, bộ phận nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi
trường sử dụng cũng khác nhau khá cơ bản, môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo
giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cây.
Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại
môi trường nuôi cấy đều bao gồm các thành phần: các nguyên tố khoáng đa vi
lượng, nguồn cacbon, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, agar (đối
với môi trường rắn) (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định
(amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa,
dịch chiết nấm men…
* Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong
nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử
dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Các nguyên tố khoáng đa lượng
Theo Lê Văn Hòa và ctv. (1999), khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh
hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Nhu cầu khoáng

đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên. Các
nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium
(K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Lưu huỳnh (S), Sodium (Na+), Chloride (Cl-).
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng như Mg2+ là thành
phần của phân tử diệp lục, Ca2+ là thành phần của màng tế bào, N là thành phần
quan trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic.

3


* Các nguyên tố vi lượng
Các nguyên tố vi lượng thường được sử dụng với lượng nhỏ, nhưng đây là thành
phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy. Các vi lượng thường thêm vào môi
trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molybden (Mo),
Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấp hơn 30 mg/l.
Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzym (Nguyễn
Xuân Linh, 1998).
* Nguồn cacbonhydrat
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang hợp
rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2. Ngoài ra, nguồn carbon còn có tác dụng
điều hòa áp suất thẩm thấu của môi trường (Vũ Văn Vụ, 1999). Vì vậy phải đưa
thêm hợp chất cacbonhydrat vào thành phần môi trường nuôi cấy. Hai loại đường
mono và disaccharide đã được thí nghiệm. Đường sucrose thường được sử dụng
trong khoảng 2-5% (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học rất lớn,
được tạo ra một lượng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

 Auxin

Trên cơ sở các hoạt tính sinh học của auxin, công nghiệp hóa chất đã tổng hợp
được các hóa chất hóa học có tác dụng giống IAA. Chúng được sử dụng trong nông
nghiệp có tác dụng như chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Mặc dù cấu trúc hóa học
khác nhau, nhưng chúng được cấu tạo bởi các nhân: Napthalene, Phenoxy, Indole.
Các chất thường được sử dụng là Napthatelene acetic acid (NAA), 2,4Dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D), Indole bytyric acid (IBA) (Lê Văn Hòa và
Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Vài ảnh hưởng quan trọng
của auxin điều hoà các quá trình sinh lý của thực vật có thể kể đến như sự vươn dài
tế bào, quang hướng động, địa hướng động, ưu thế chồi ngọn, sự tượng rễ, sự sản
sinh ethylen, sự phát triển trái... (Nguyễn Minh Chơn, 2004). Đặc biệt là alphanaphthalene acetic acid (NAA) có tác dụng phân chia tế bào, tạo rễ, làm tăng khả
năng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh
đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi
trường (Nguyễn Đức Thành, 2000). Auxin thường được sử dụng kết hợp với
cytokinin (Pierick, 1987). Theo Nguyễn Văn Uyển (1993), nhóm auxin thường

4


được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1-5,0 mg/l, tùy theo nhu cầu và mục
đích thí nghiệm.
 Cytokinin
Vị trí sinh tổng hợp cytokinin thường ở trong các mô có hoạt động phân sinh
mạnh, như tượng tầng mô gỗ, đỉnh sinh trưởng dinh dưỡng và lá non. Người ta cũng
phát hiện nồng cytokinin cao xuất hiện vào mùa xuân trong nhựa cây. Đỉnh rễ là vị
trí chính yếu của sự tạo hormone ở những cây con (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo
Toàn, 2004).
Các cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy mô là kinetin (6furfurylaminopurin), BA (Benzyl adenine). Ngoài ra, một số cytokinin tổng hợp
như DPU (Diphenylurea), CPPU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-phenylurea), TDZ
(Thidiazuron) cũng được dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toàn,
2004).

Chức năng chính của cytokinin là kích thích sự phân bào. Ngoài ra, cytokinin
còn kích thích pha dãn dài lẫn pha chuyên hóa. Khi có tác dụng của auxin ở các
mức khác nhau, đối với các tế bào tách rời (nuôi cấy mô) sự cân đối giữa auxin và
cytokinin sẽ kích thích sự thành lập mô sẹo, rễ và chồi. Cytokinin còn có tác dụng
làm lá trẻ hóa (trì hoãn sự già cỗi) (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Sắt
Sắt (Fe) là nguyên tố cần thiết bởi vì nó đóng vai trò then chốt của các hệ thống
enzym. Các enzym này bao gồm catalase, peroxidase và một số cytochrome.
Cytochrome hoạt động cơ nguyên hô hấp của các tế bào sống. Một số enzym kiểm
soát phản ứng oxy hóa-khử trong quang hợp. Nó trải qua sự oxy hóa và sự khử luân
phiên giữa trạng thái Fe2+ và Fe3+ khi nó đóng vai trò như một chất mang điện tử
trong các protein. Sắt không phải là thành phần của diệp lục tố, nhưng rất cần cho
sự sinh tổng hợp của diệp lục tố (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Ngoài
ra, theo Nguyễn Bảo Vệ và nguyễn Huy Tài (2003), ở nhóm protein nonheme, Fe
liên kết với nhóm thiol của cysteine hoặc liên kết với S vô cơ, nó hoạt động như là
tác nhân truyền điện tử trong nhiều tiến trình biến dưỡng theo nguyên lý sau:

5


Theo Dunlap và Robacker (1988) sắt là một trong những thành phần vi lượng cơ
bản được sử dụng trong vi nhân giống, vì nó là nguyên tố cần thiết trong nhiều quá
trình giống như tổng hợp chất diệp lục và ADN. Sắt được sử dụng phổ biến trong
nuôi cấy mô gồm: Fe-EDTA (sắt ethylendiamine tetraacetate) và Fe-EDDHA (sắt
ethylendiamine di-o-hydroxyphenyl acetate).
Theo Singh và Krikorian (1980) nồng độ của Na2EDTA (37,3 mg/l) là vượt quá
mức cần thiết để kết hợp với Fe2+ (27,8 mg/l FeSO4.7H2O). Số lượng dư thừa có thể
ảnh hưởng đến các vi lượng quan trọng khác. Hơn nữa, sự phức hợp của Fe-EDTA
không ổn định và 45% Fe ban đầu chưa được kết hợp ở pH 5,8 hoặc ít hơn tính toán
(Dalton và ctv., 1983). Hangarter và Stasinopoulos (1991) cũng báo cáo sự hình

thành độc tố formaldehyde sau khi EDTA giảm. Mặt khác, sự thay thế của FeEDTA với hình thức Fe-EDDHA đã tác động tích cực đến vi nhân giống các loài
khác nhau (Rashid và Street, 1973). Theo Christensen và ctv. (2008) khi thay thế
Fe-EDTA bởi Fe-EDDHA thì hàm lượng diệp lục tố và diện tích lá cây dâm bụt
tăng gấp 3 lần ở các mức độ Fe-EDDHA 98 μM, 197 μM, 295 μM.
* AgNO3
Ethylen được tổng hợp từ Methyonine, Methyonine được biến đổi thành Sadenosylmethionine (SAM) theo con đường của enzym SAM synthetase. SAM có
thể đi theo con đường biến đổi thành S-adenosylmethyl thio propylamin bởi enzym
SAM decarboxylate và đi vào sự sinh tổng hợp polyamine. Con đường khác là
thành 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) theo con đường của enzym
ACC synthase, nó có thể được biến đổi thành ethylen do ACC oxidase hoặc thành
malonyl-ACC theo con đường của enzym ACC N-malonyl-transferase (Nguyễn
Minh Chơn, 2004). Hoạt động ethylen trong thực vật có thể bị ức chế bởi chất ức
chế như CO2 và chất ức chế mạnh mẽ như các hợp chất bạc. Điều này là có thể do
quá trình oxy hóa của ethylen bởi một hệ thống enzym-ion kim loại (Abeles, 1973).
Trong đó, AgNO3 có thể ức chế hoạt động ethylen bởi các ion bạc bằng cách ngăn
cản các quá trình phản ứng tạo ethylen (Yang, 1985) (Hình 1.1). Miyazaki và Yang
(1987) báo cáo ảnh hưởng của putrescine và AgNO3 về việc sử dụng cạnh tranh của
SAM. Các chất ức chế ethylen ảnh hưởng đến mức độ SAM tạo thành ACC, do đó
ảnh hưởng đến mức độ ethylen (Gong và ctv., 2005).

AgNO3
SAM synthetase

Methionine

SAM

ACC

ACC oxidase

ACC synthase

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp ethylen (Gong và ctv., 2005)

6

Ethylen


Các ion bạc ở dạng nitrat như AgNO3, đóng một vai trò quan trọng trong ảnh
hưởng đến phát sinh phôi soma, hình thành chồi và là điều kiện tiên quyết để
chuyển đổi gen thành công (Bais và ctv., 2001). Trong những năm gần đây, AgNO3
đã được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô đóng vai trò là chất ức chế hoạt
động ethylen, trì hoãn lão hóa kết quả tốt trong tăng trưởng của chồi khi được sử
dụng ở nồng độ thấp, nồng độ cao có thể gây hại (Beyer, 1976). Theo Giridhar và
ctv. (2001) các tác động của AgNO3 đến số lượng chồi và độ dài của chồi cao nhất
khi thêm 20 μM AgNO3 trên Vanilla planifolia.
* Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào
và mô được nuôi cấy thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn của chúng
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Vitamin thường được sử dụng
nhất là Nicotinic acid, Pyridoxine (B6), Thiamin (B1), Myo inositol và vitamin C
thường được sử dụng như là chất chống oxy hóa (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* Nước dừa
Nước dừa là thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm tăng sinh
trưởng và phát triển của mô. Các loại khoáng, acid amin, myo-inositol, chất béo và
các chất điều hòa sinh trưởng như cytokinin đã được chứng minh có trong nước dừa
(Vũ Văn Vụ, 1999). Các thành phần này có hàm lượng thay đổi khác nhau giữa quả
non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả cùng độ tuổi (Vũ Văn Vụ và ctv.,

2006).
* Agar
Agar là một loại polysaccharide của tảo biển được sử dụng làm chất đệm cho
môi trường dinh dưỡng đông cứng lại (tạo môi trường đặc hay môi trường bán đặc)
(Lê Trần Bình và ctv., 1997), làm giá thể cho mô tế bào thực vật nuôi cấy (Nguyễn
Xuân Linh, 1998). Nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưỡng đến thế năng nước
trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy,
các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước, sự hoạt động của cytokinin trong
môi trường có agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
* pH
pH của môi trường là một trong những yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến khả
năng hòa tan của các ion khoáng, khả năng đông tụ agar và sự tăng trưởng của tế
bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ một số chất phụ thuộc vào pH môi trường,
đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibbrellin và các vitamin. Sự hấp thụ chất sắt
cũng phụ thuộc vào pH (Nguyễn Đức Thành, 2002). Theo Murashige và Skoog

7


(1962) nhận thấy rằng độ pH = 5,7-5,8 thích hợp duy trì sự hòa tan các chất khoáng
trong môi trường MS.
1.3 Một số kết quả nuôi cấy mô cây hoa dã yên thảo đã được công bố
Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Minh Tâm (2005) cho thấy môi trường tốt
nhất để nhân giống dã yên thảo gồm có: chất hữu cơ là nước cá, nồng độ đường 50
g/l và auxin được chọn là NAA. Điều kiện thuần dưỡng có tỉ lệ sống cao nhất là
trùm bọc nilon kín trong vòng 1 tuần.
Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv. cho thấy các đoạn thân và lá
của chồi non đang tăng trưởng trong điều kiện in vitro được nuôi cấy trên môi
trường MS có BA hoặc BA và NAA. Kết quả được ghi nhận trên giống hoa kép và
hoa đơn sau 10 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ % thành lập chồi cao nhất từ mẫu cấy lá được

ghi nhận trên môi trường MS có 0,5 µM BA đối với giống hoa kép và 2 µM BA đối
với hoa đơn. Chồi được tái tạo từ lóng thân của cả hai giống trên môi trường MS bổ
sung 0,5 µM BA và 0,05 µM NAA. Việc bổ sung nước dừa 5% kích thích cho sự
kéo dài chồi non. Cây con có bộ rễ khỏe mạnh được trồng thủy canh trong ½ MS
trong 7-10 ngày trước khi ra vườn ươm.
Theo kết quả nghiên cứu của Hassan và ctv. (2010) trong thí nghiệm nhân chồi
thì số chồi dã yên thảo trung bình cao nhất với môi trường bổ sung BA 0,8 mg/l và
NAA 0,1 mg/l. Đối với thí nghiệm tái sinh chồi từ mẫu cấy lá thì số chồi cao nhất
được tái sinh (45%) đã được quan sát trong môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l.

8


Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý-Sinh
hóa, khoa Nông nghiệp & Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thí nghiệm: Đề tài được thực hiện từ tháng 09/2010 đến 12/2010.
2.1.2 Thiết bị và hóa chất
Thiết bị: tủ lạnh, tủ sấy, máy khử trùng nhiệt ướt, máy đo pH, máy khuấy từ,
buồng cấy vô trùng, cân phân tích, lò vi sóng, bếp điện…
Dụng cụ: keo thủy tinh (13 x 7 cm) có nắp nhựa và các dụng cụ phòng cấy mô.
Hóa chất: Khoáng đa, vi lượng theo công thức MS, vitamin (thiamine HCl
(B1), pyridoxine HCl (B6), nicotinic acid (niacine)), đường sucrose, myoInositol, agar, nước dừa tươi, chất điều hòa sinh trưởng thực vật (benzyl adenine
(BA), α-napthaleneacetic acid (NAA), Indole bytyric acid (IBA)), chất khử trùng
(HgCl2 0,1%, cồn 70o), Fe-EDDHA và silver nitrate (AgNO3).
2.1.3 Điều kiện thí nghiệm
Điều kiện phòng thí nghiệm: phòng nuôi cấy mô được trang bị máy điều hoà
nhiệt độ, đèn neon, có nhiệt độ 26oC ± 2, cường độ chiếu sáng 1000–2000 lux, thời

gian chiếu sáng 16 giờ/ngày.
2.1.4 Vật liệu
Thí nghiệm được tiến hành trên giống hoa dã
yên thảo màu tím (Hình 2.1). Thí nghiệm sử dụng
nguồn mẫu từ cây mẹ khỏe mạnh, mập mạp,
không sâu bệnh được trồng tại nhà lưới bộ môn
Sinh lý-Sinh hóa khoa Nông nghiệp và Sinh học
ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
* Khử trùng mẫu cấy

Hình 2.1 Hoa dã yên thảo

Chọn những đoạn chồi không quá non cũng không quá già để tiến hành khử mẫu
và nuôi cấy. Sau khi cắt những chồi từ cây mẹ thì đem rửa dưới vòi nước máy 10
phút, sau đó cho thêm 2 giọt xà phòng và thêm nước vào đầy keo đựng mẫu lắc nhẹ
10 phút, xong đem rửa lại với vòi nước 10 phút, cắt bớt lá và tiếp tục mang vào tủ
cấy tiến hành khử trùng mẫu. Mẫu được khử trùng 2 lần:

9


- Lần 1: khử trùng mẩu với 0,5‰ HgCl2 với lượng vừa đủ ngập mẫu trong keo + 1
giọt xà phòng, lắc nhẹ trong 10 phút. Rửa lại nước cất đã được khử trùng 3 lần.
- Lần 2: khử trùng mẩu với 0,75‰ HgCl2 với lượng vừa đủ ngập mẫu trong keo, lắc
nhẹ trong 8 phút. Rửa lại nước cất đã được khử trùng 3 lần.
Cuối cùng cấy mẫu vào keo có môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng và có bổ sung BA 0,5 mg/l.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Chuẩn bị môi trường: môi trường nuôi cấy cơ bản gồm môi trường dinh dưỡng

MS (phụ lục 1) và các chất bổ sung nước dừa (80 ml/l), đường (30 g/l), agar (7 g/l),
myo-inositol (100 mg/l), nicotinic acid (1 mg/l), pyridoxine (1 mg/l), thiamine (1
mg/l). Tùy theo từng thí nghiệm mà thêm các chất điều hòa sinh trưởng: BA, NAA,
AgNO3, IBA, thay thế Fe-EDTA bằng Fe-EDDHA hoặc nồng độ khoáng MS hay ½
MS.
Điều chỉnh pH môi trường về khoảng 5,7-5,8 trước khi nấu môi trường. Thể tích
môi trường trong keo là 40 ml. Môi trường được khử trùng ở 121 oC, áp suất 1 atm.
trong 20 phút.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Hiệu quả của BA và NAA trên sự nhân chồi dã yên thảo
Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ thích hợp của BA và NAA trên sự nhân
chồi dã yên thảo.
Bố trí thí nghiệm: theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố gồm 3 nồng độ
BA và 3 nồng độ NAA với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp lại, mỗi lần
lặp lại là 2 keo, 1 keo cấy 4 mẫu (Bảng 2.1).
Bảng 2.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1

Hàm lượng NAA (mg/l)

Hàm lượng BA
(mg/l)

0,0

0,05

0,1

0,0

NT1

NT2

NT3

0,1

NT4

NT5

NT6

0,5

NT7

NT8

NT9

10