khảo sát khả năng sinh trưởng của một số chủng nấm men và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới tính chất bề mặt của tế bào nấm men

i

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến:
Các Thầy Cô giáo trong viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường cũng như
toàn thể các Thầy Cô đã dạy em trong suốt thời gian học tập tại trường và đặc biệt
là TS. Tạ Thị Minh Ngọc, người đã tận tình hướng dẫn để em có thể hoàn thành
một cách tốt nhất đồ án tốt nghiệp này.
Các Thầy Cô giáo, anh chị đang công tác tại Trung tâm thí nghiệm thực hành,
Trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong thời gian làm nghiên cứu.
Cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn bên cạnh cổ vũ động viên em
trong suốt bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Nha Trang.
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1 Tổng quan về nấm men 2
1.1.1. Đặc điểm phân bố 2

1.1.2. Đặc điểm về hình dạng và kích thước của nấm men 2
1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm men 2
1.1.3.1. Nguồn cacbon 2
1.1.3.2. Nguồn nitơ 3
1.1.3.3. Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ 3
1.2. Màng tế bào 4
1.2.1. Đặc điểm, cấu trúc của màng 4
1.2.1.1.Lipid màng 5
1.2.1.2. Protein màng 6
1.2.1.3. Glucide 6
1.2.2. Phương thức vận chuyển chất qua màng 7
1.2.2.1. Vận chuyển thụ động (passive transport) 7
1.2.2.2.Vận chuyển chủ động (active transport) 8
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men 11
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 11
1.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 11
1.3.3. Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng 12
1.3.4. Ảnh hưởng của oxy 12

iii

1.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ 12
1.3.6. Ảnh hưởng của pH môi trường 13
1.4. Giới thiệu về các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và Yarrowia
lipolytica 13
1.4.1. Saccharomyces cerevisiae 13
1.4.1.1. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của S. cerevisiae 13
1.4.2. Yarrowia lipolytica 14
1.4.2.1. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Y. lipolytica 14
1.4.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của Y.

lipolytica 15
1.5. β-carotene 16
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Đối tượng – vật liệu 18
2.1.1. Đối tượng 18
2.1.2. Vật liệu 18
2.1.2.1. Thiết bị 18
2.1.2.2. Hóa chất 18
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 19
2.1.3.1. Môi trường hoạt hóa, giữ giống 19
2.1.3.2. Môi trường quan sát đặc điểm khuẩn lạc ở các nhiệt độ nuôi cấy
khác nhau 19
2.1.3.3. Môi trường nuôi cấy khảo sát đường cong sinh trưởng của nấm men
21
2.2. Các phương pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Phương pháp giữ giống, cấy chuyền 21
2.2.2. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm men 21
2.2.2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 21
2.2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống 21

iv

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc trên các điều kiện nuôi cấy
khác nhau 22
2.2.4. Xây dựng đường cong sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 22
2.2.5. Phương pháp xác định lượng sterol trong màng tế bào 22
2.2.6. Phương pháp xác định tính thấm của màng tế bào nấm men đối với chất
kỵ nước β-carotene trên các điều kiện nuôi cấy được lựa chọn 23
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. Kết quả nghiên cứu: 24

3.1.1. Quan sát đặc điểm hình thái của chủng nấm men 24
3.1.1.1. Chủng nấm men Y. lipolytica 24
3.1.1.2. Chủng nấm men S. cerevisiae 27
3.1.2. Khảo sát khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 28
3.1.2.1. Chủng Y. lipolytica W29 28
3.1.2.2. Chủng S. cerevisiae 29
3.1.3. Xây dựng đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica và S. cerevisiae trên
các môi trường nuôi cấy khác nhau 36
3.1.3.1. Y. lipolytica 36
3.1.3.2. S. cerevisiae 37
3.1.4. Khả năng thấm β-carotene qua màng tế bào 38
3.1.5. Xác định lượng sterol trong màng tế bào được nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau 40
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
KẾT LUẬN 42
KIẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần môi trường hoạt hóa, giữ giống 19
Bảng 2.2: Thành phân môi trường quan sát đặc điểm khuẩn lạc ở các nhiệt độ nuôi
cấy khác nhau 20
Bảng 3.1: Khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên các môi trường khác
nhau ở các nhiệt độ khác nhau 30
Bảng 3.2: Khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica 0544 trên các môi trường khác
nhau ở các nhiệt độ khác nhau 32
Bảng 3.3: Khả năng sinh trưởng và phát triển của S. cerevisiae TNS.c trên các môi

trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau 34

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của màng sinh chất 5
Hình 1.2: Hiện tượng nhập bào 10
Hình 1.3: Hiện tượng xuất bào 10
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của β-carotene 16
Hình 1.5: Quang phổ hấp thụ của β-carotene 17
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của Y. lipolytica W29 trên môi trường YPDA ở 27
o
C 24
Hình 3.2: Hình thái tế bào Y. lipolytica W29 khi nuôi trên YPDA ở 27
o
C 25
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y. lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27
o
C 26
Hình 3.4: Hình thái tế bào Y. lipolytica 0544 khi nuôi trên môi trường YPDA ở 27
o
C 26
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27
o
C 27
Hình 3.6: Hình thái tế bào của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27
o
C 28
Hình 3.7: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên một số môi trường 36

Hình 3.8: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica 0544 trên một số môi trường 37
Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae TNS.c trên một số môi trường 38
Hình 3.10: Đường cong sinh trưởng của S. cerevisiae HNS.c trên môi trường YPD 38
Hình 3.11: Hàm lượng β-carotene trên 1g sinh khối nấm men của 4 chủng 39
Hình 3.12: Hàm lượng sterol trên các môi trường khác nhau (Y. lipolytica W29) 40


vii

KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT

Y. lipolytica: Yarrowia lipolytica
S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae
RDA: rice dextrose agar
PDA: potato dextrose agar
YNBA: yeast nitrogen base
YPOA: yeast pepton oleate agar
YPDA: yeast pepton dextrose agar
YNBOA: yeast nitrogen base oleate agar
YNBDA: yeast nitrogen base dextrose agar
YPA: yeast pepton agar
NXB: nhà xuất bản

1

LỜI MỞ ĐẦU

Khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm men chịu ảnh hưởng của nhiều
yếu tố như nhiệt độ, oxy, đặc biệt là môi trường nuôi cấy. Các chủng nấm men khác
nhau có khả năng sinh trưởng trong môi trường có các nguồn dinh dưỡng khác

nhau. Các nguồn dinh dưỡng chính đối với sinh trưởng của nấm men gồm nguồn
cacbon (đường, tinh bột, các chất kỵ nước như ankan, lipid, các acid béo ) và
nguồn nitơ (cao nấm men + pepton, các acid amin cơ bản ). Các nguồn dinh dưỡng
này tác động mạnh đến sinh trưởng nấm men cũng ảnh hưởng đến các bộ phận
trong tế bào, đặc biệt là bề mặt tế bào. Để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát
triển cũng như ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng này ảnh hưởng như thế nào
đến tính chất bề mặt của màng tế bào nấm men nên chúng tôi thực hiện đề tài:
“Khảo sát khả năng sinh trưởng của một số chủng nấm men và ảnh hưởng của
môi trường nuôi cấy tới tính chất bề mặt của tế bào nấm men” gồm các bước
thực hiện sau:
- Xây dựng đường cong sinh trưởng của một số chủng nấm men trên các điều
kiện nuôi cấy khác nhau.
- Khảo sát tính chất bề mặt của màng tế bào nấm men trên một số điều kiện
nuôi cấy lựa chọn.
Vì đây là lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu, với kinh nghiệm thực
tế và kiến thức bản thân còn hạn chế, thời gian thực hiện có hạn nên trong quá trình
thực hiện đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, sai lầm. Rất mong nhận được sự
đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.

2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về nấm men
1.1.1. Đặc điểm phân bố
Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi
trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật
mía, rỉ đường, mật ong, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu
mỏ
Trong các sản phẩm như sữa, sữa chua, bánh mì cũng chứa một lượng lớn
các loài nấm men như Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus,

Debaromuces hanseni, Torulopsis lactis condense
1.1.2. Đặc điểm về hình dạng và kích thước của nấm men
Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật (eukaryote). Tùy
loài nấm men mà tế bào có thể hình tròn (Torulopsis utilis), hình trứng, hình
ovan (Saccharomyces cerevisiae), hình quả chanh, hình elip, hình trụ…
Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, ở dạng đơn bào
kích thước của chúng là 2,5-10µm x 4,1-21µm. Kích thước và hình thể của nấm
men còn phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, thành phần môi
trường, oxy và tuổi của tế bào nấm men. Ví dụ như S. cerevisiae có hình bầu dục
nếu nuôi trong môi trường giàu chất dinh dưỡng. Trong điều kiện yếm khí thì nó
có hình tròn và ngược lại trong điều kiện hiếu khí thì tế bào có dạng kéo dài hơn.
Một số tế bào nấm men có hình dài nối tiếp nhau thành dạng sợi gọi là lá
khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium), thường gặp ở các
giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon. Nhiều nấm men chỉ sinh khuẩn ty
giả khi không được cung cấp đầy đủ oxy.
1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm men
1.1.3.1. Nguồn cacbon
Nguồn dinh dưỡng cacbon của nấm men là các loại đường và dẫn xuất,
các rượu, acid hữu cơ, acid amin…

3

Hầu hết các loài nấm men không có enzyme polyhydrolase, trong đó
không có amylase và cellulase cho nên không sử dụng trực tiếp được tinh bột,
cellulose, hemicellulose. Đường hexose được tất cả các loài nấm men sử dụng.
Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dưỡng thì
nguồn cacbon nào cung cấp cho nấm men sinh trưởng sẽ được sử dụng trước.
Trong họ hàng men rượu Saccharomyces với các chủng khác nhau cần có các
nguồn cacbon khác nhau, là các đường khác nhau lên men cũng khác nhau. Lên
men rượu etylic cần hoặc vật liệu lý tưởng cho lên men là đường glucose, lên

men bia là đường maltose, lên men rượu vang là đường fructose sau là glucose.
Đối với những disaccharide trước khi được nấm men sử dụng phải trải qua quá
trình thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men.
Các acid béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào từng
chủng loại nấm men, nồng độ axit, chiều dài mạch cacbon trong phân tử acid và
mức độ điện ly. Mạch từ C
2
- C
4
làm nguồn cơ chất khá tốt ở nồng độ tương đối
thấp.
Ngoài ra có thể sử dụng nguồn cacbon từ dầu mỏ và khí đốt nhưng vẫn
còn nhiều e ngại nếu ứng dụng sinh khối nấm men vào các sản phẩm như thức
ăn chăn nuôi do có thể tồn dư các chất nào đó hoặc rất ít, không thể xác định
được chúng có ảnh hưởng đến sức khỏe của người và động vật hay không.
1.1.3.2. Nguồn nitơ
Là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường.
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotide
purin, protein, pirimidin và một số vitamin. Nấm men có khả năng tổng hợp
được tất cả các acid amin, đa số nấm men không đồng hóa được nitrate.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid
vô cơ cũng như hữu cơ: amoni phosphate, muối acetat, lactat, malat…
1.1.3.3. Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ
Được quan tâm trước hết là phospho, sau đó đến kali, magie, lưu huỳnh…

4

Khi không đủ P trong môi trường, sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi
đáng kể liên quan đến sự phá vỡ nhu cầu và sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu
cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10-13mg P.

Trong phòng thí nghiệm người ta thường dùng muối KH
2
PO
4
và K
2
HPO
4
làm
nguồn P và K.
Lưu huỳnh có trong thành phần của một số axit amin trong phân tử
protein và nhóm phụ của một số enzyme CoA. Những chất chứa lưu huỳnh như:
cystein, methionin, thiamin, biotin. Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường
dùng (NH
4
)
2
SO
4
. Hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men.
Nếu lượng lưu huỳnh cao thì sẽ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và có thể
không tổng hợp được protein.
Ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphate hoặc sunphat, còn
Mg
2+
và Ca
2+
thường dùng có trong nước sinh hoạt.
Các nguyên tố vi lượng như Mn, Cu, Zn, Fe….cũng được bổ sung vào để
quá trình sinh lý trong tế bào nấm men được xảy ra bình thường.

1.1.3.4. Dinh dưỡng các chất sinh trưởng
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin,
pyrimidin. Các acid amin cũng đóng vai trò là chất kích thích sinh trưởng cho
một số chủng nấm men. Nhu cầu riêng biệt này rất nhỏ.
1.2. Màng tế bào
1.2.1. Đặc điểm, cấu trúc của màng
Màng tế bào được tạo thành từ lớp lipid kép dày khoảng 7.5nm, chúng
hình thành mặt phân cách giữa tế bào và môi trường tế bào. Vì vậy, nó ngăn
chặn các phân tử nội bào đi ra ngoài và các phân tử tự do bên ngoài đi vào trong
tế bào. Màng tế bào có tính thấm chọn lọc, cho phép một số chất đi qua dễ dàng
hơn các chất khác, thường thì chúng chỉ cho các phân tử có kích thước nhỏ hơn
600 Da thấm qua. Màng còn là nơi chứa các enzyme truyền tín hiệu, enzyme
sinh tổng hợp năng lượng, là nơi đến đầu tiên của các phần tử mang thông tin
như hoocmon, các phân tử truyền nơron…

5

Màng tế bào gồm 3 thành phần cơ bản của sự sống: protein, lipid và
glucide. Ba thành phần này kết hợp lại tạo thành một màng lỏng, tách biệt với
môi trường bên trong tế bào và cho phép nó tương tác với các bộ phận khác của
tế bào.

Hình 1.1: Cấu trúc của màng sinh chất (trích Giáo trình sinh học tế bào,
Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục, 2006)
1.2.1.1.Lipid màng
Lipid màng sinh chất rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ, có vai trò
quan trọng trong hoạt động của các protein màng tế bào. Các lipid màng là phân
tử lưỡng cực, gồm một đầu kỵ nước và một đầu ưa nước. Đầu ưa nước quay ra
ngoài tế bào hoặc vào trong tế bào chất để tiếp xúc với nước của môi trường
hoặc của tế bào chất, đầu kỵ nước thì quay vào giữa, nơi tiếp giáp của hai lớp
lipid. Tính chất dấu đầu kỵ nước này đã làm cho màng có xu hướng kết dính các
phân tử lipid với nhau để đầu kỵ nước khỏi tiếp xúc với nước, lớp phân tử lipid
còn khép kín lại tạo thành một túi kín.
Lipid màng gồm có 2 loại: phospholipid và sterol.
Các phospholipid tạo thành lớp lipid chủ yếu của tế bào bao gồm:
phosphatidyletanolamine, phosphstidylglyglycerol, phosphatidylserine,
phosphatidylcholine.

6

Các sterol cần thiết để hình thành màng tế bào. Chúng được xem như là
phần tử quan trọng để duy trì trạng thái của màng, đảm bảo tính lỏng của màng.
Trong khi phần lớn sterol ở động vật có xương sống là cholesterol, sterol chính
của nấm men là ergosterol. Các sterol được giấu kỹ trong lớp kép lipid, nhóm
OH của sterol đối diện với nhóm COOH của mạch phospholipid. Khi lượng
sterol trong lớp kép giảm tạo điều kiện dễ dàng cho sự xâm nhập của các phân tử
nước, tương tác giữa sterol và mạch acyl không bão hòa làm tăng khả năng kỵ
nước của trung tâm lớp kép và làm giảm tính bán thấm của màng tế bào
(Subczynski et al., 1994). Chúng được biết như thiết bị điều hòa tính lỏng của
màng tế bào. Thêm sterol sẽ làm cứng lại màng khi màng ở trạng thái lỏng và
ngược lại, nếu màng lỏng sẽ cứng hơn (Aora et al., 2004; Dufourc, 2008).

1.2.1.2. Protein màng
Căn cứ vào cách liên kết với màng lipid, người ta chia protein màng ra
làm 2 loại: protein xuyên màng và protein ngoại vi.
Protein xuyên màng: các protein này trôi nổi trong tầng lipid kép như
những cái phao trên hồ, tạo ra các kênh đi qua màng tế bào, nhờ đó mà các phân
tử và thông tin đi qua lại được tế bào. Protein xuyên màng có hình sợi, có thể
xuyên qua màng một lần nhưng cũng có loại lộn vào lộn ra để xuyên qua màng
nhiều lần, có khi tới 6-7 lần. Chúng không cố định một chỗ mà di chuyển qua lại
và chiếm khoảng 70% protein màng tế bào.
Protein ngoại vi: chiếm khoảng 30% thành phần protein màng, gặp ở mặt
ngoài hay mặt trong màng tế bào.
1.2.1.3. Glucide
Glucide màng là những đoạn dextrin ngắn, thường liên kết với
phospholipid tạo thành glycolipid hoặc protein tạo thành glycoprotein phân bố ở
mặt ngoài màng tạo nên tính bất đối xứng của màng, tham gia tạo nên khối chất
nền ngoại bào giữa các tế bào trong mô của cơ thể đa bào. Chất nền ngoại bào
không chỉ có chức năng dính kết các tế bào trong mô mà còn có chức năng
truyền đạt thông tin giữa các tế bào.

7

1.2.2. Phương thức vận chuyển chất qua màng
Có 3 cách để vận chuyển các chất qua màng
1.2.2.1. Vận chuyển thụ động (passive transport)
Đây là hình thức vận chuyển nước và các chất theo gradient nồng độ và
không tiêu tốn ATP của tế bào.
 Hiện tượng thẩm thấu và khuếch tán qua màng tế bào
Tùy thuộc vào điều kiện môi trường và nồng độ các chất bên trong, nước
và các chất hòa tan trong nước có thể vào hoặc ra khỏi tế bào cho đến khi đạt
mức độ cân bằng về áp suất và nồng độ. Hiện tượng nước đi từ nơi có nồng độ

cao đến nơi có nồng độ thấp gọi là hiện tượng khuếch tán (diffusion). Hiện
tượng nước đi từ nơi có áp suất thẩm thấu cao đến nơi có áp suất thẩm thấu thấp
gọi là hiện tượng thẩm thấu (osmosis).
Ta có thể chia ra làm 3 loại môi trường dựa vào áp suất thẩm thấu của
dung dịch xung quanh tế bào: đẳng trương, ưu trương và nhược trương.
Đẳng trương: môi trường dịch xung quanh tế bào có áp suất thẩm thấu
bằng áp suất thẩm thấu của dịch tế bào. Trong môi trường đẳng trương, số lượng
phân tử nước đi vào tế bào bằng số lượng phân tử nước đi ra khỏi tế bào, tế bào
không thay đổi về hình dạng và kích thước.
Ưu trương: môi trường dịch bao quanh tế bào có áp suất thẩm thấu cao
hơn so với dịch tế bào. Trong môi trường ưu trương, các phân tử nước đi ra khỏi
tế bào, làm cho tế bào co lại, biến dạng tế bào.
Nhược trương: dịch xung quanh tế bào có áp suất thẩm thấu thấp hơn so
với dịch trong tế bào. Các phân tử nước từ môi trường ngoài đi vào trong tế bào,
làm cho tế bào phồng to lên, đến một mức độ nhất định có thể gây vỡ tế bào.
 Vận chuyển các chất đơn giản trực tiếp qua lớp kép phospholipid
Các chất có kích thước nhỏ, không phân cực, không tích điện (CO
2
,
O
2
…), một số chất hòa tan trong lipid (alcol, aldehyt…) dễ dàng qua lớp
phospholipid kép vào trong tế bào hoặc ra khỏi tế bào theo gradient nồng độ (từ
nơi có nồng độ thấp đến nơi có nồng độ cao).

8

 Vận chuyển các chất qua màng tế bào chất nhờ protein mang
Các ion mang điện tích, các chất có kích thước nhỏ phân cực (glucose,
acid amin, H

2
O…) không được vận chuyển trực tiếp qua màng phospholipid kép
mà được vận chuyển nhờ các protein mang đặc hiệu trên màng (carrier protein).
Những chất này được vận chuyển qua màng theo gradient nồng độ, không tiêu
tốn ATP của tế bào.
Các protein mang này có thể vận chuyển một chất (kênh vận chuyển đơn)
hoặc nhiều chất (kênh vận chuyển kép) ra hoặc vào trong tế bào.
1.2.2.2.Vận chuyển chủ động (active transport)
Là hình thức vận chuyển ion và các chất qua màng tế bào chất ngược
chiều gradient nồng độ và tiêu tốn ATP của tế bào.
 Bơm Na-K
Bơm Na-K là phức hợp enzyme Na
+
-K
+
adenosine triphosphatase (Na
+
-
K
+
ATPaes) trên màng tế bào, giúp điều hòa nồng độ các ion Na
+
và ion K
+

trong và ngoài tế bào. Cơ chế hoạt động gồm 4 bước:
Bước 1: ba phân tử Na
+
liên kết vào đầu cuối bên trong của hai dưới đơn
vị dẫn đến làm thay đổi hình thể của phức hệ protein xuyên màng.

Bước 2: hình thể mới của phức hệ sẽ liên kết với một phân tử ATP phân
cắt nó thành ADP + P. ADP thì được giải phóng, còn gốc phosphate cũ thì được
gắn vào phức.
Bước 3: việc gắn phosphate vào phức sẽ làm cho phức hệ thay đổi cấu
hình lần thứ hai. Kết quả của sự thay đổi này là vận chuyển được ba ion Na
+
qua
màng và định vị ở vị trí ngoài màng. Với hình thể mới này làm cho phức có ái
lực với ion Na
+
thấp, nên ion Na
+
được tách ra và khuếch tán đi ngay, cấu hình
mới có ái lực cao với ion K
+
nên lập tức kết hợp với hai ion K
+
ngay sau khi giải
phóng ion Na
+
.
Bước 4: sự kết hợp với các ion K
+
lại dẫn đến sự thay đổi khác trong cấu
hình của phức hệ protein xuyên màng, làm cho nhóm phosphate được giải phóng
và phức hệ protein trở về hình dạng ban đầu với hai ion K
+
nằm phía trong

9

màng. Cấu hình mới có ái lực với ion K
+
nên nó được tách ra và khuếch tán ngay
trong tế bào. Với hình thể ban đầu nó lại có ái lực cao với các ion Na
+
. Khi các
ion này kết hợp vào, chu kỳ bơm khác lại bắt đầu.
Đặc tính duy nhất của bơm Na-K là quá trình vận chuyển tích cực các ion
Na
+
, K
+
từ vùng có nồng độ thấp đến vùng có nồng độ cao. Sự vận chuyển này
xảy ra được là nhờ sự tiêu phí năng lượng trao đổi chất dưới dạng ATP.
 Bơm proton
Là phức hợp protein đặc hiệu trên màng tế bào, thực hiện chức năng vận
chuyển các ion H
+
ngược chiều gradient nồng độ nhờ năng lượng ATP do tế bào
cung cấp. Bơm proton hoạt động, luôn đưa các ion H
+
ra khỏi tế bào, làm cho
nồng độ ion H
+
trong tế bào luôn thấp hơn bên ngoài tế bào, tạo sự chênh lệch
điện thế màng cần thiết cho hoạt động của tế bào. Điều này có thể làm cạn kiệt
ion H
+
bên trong tế bào. Để đảm bảo lượng ion H

+
trong tế bào, các ion H
+
sẽ
được đưa vào tế bào đồng thời với sự vận chuyển các chất khác nhờ protein
mang trên tế bào.
 Vận chuyển các chất qua tế bào chất theo cơ chế nhập bào và xuất bào
 Nhập bào (endocytosis)
Là hình thức vận chuyển các chất rắn hoặc dịch lỏng vào hoặc ra khỏi tế
bào qua màng tế bào. Gồm 3 hình thức: thực bào, ẩm bào và nhập bào - thụ thể
Thực bào (phagocytosis): là hình thức màng tế bào lõm vào, bao lấy các
thể rắn đưa vào trong tế bào. Các enzyme sẽ phân giải các vật thể rắn này thành
những chất đơn giản, giúp tế bào hấp thu các chất dinh dưỡng các chất dinh
dưỡng cần thiết.
Ẩm bào (pinocytosis): là hình thức biến đổi của màng tế bào, màng tế
bào chất lõm vào bao lấy các giọt dịch lỏng, đưa vào trong tế bào.
Nhập bào - thụ thể: là hình thức các vật thể, chất rắn, hoặc dịch thể tiếp
xúc với màng tế bào chất tại các điểm thụ thể đặc hiệu. Tại vị trí các thụ thể,
màng tế bào chất lõm vào bao lấy các vật thể hoặc giọt dịch đưa vào trong tế

10

bào. Đây là hình thức đặc biệt của vận chuyển chủ động, quá trình này cần tiêu
tốn nhiều ATP để phục hồi trạng thái bình thường của màng tế bào chất.

Hình 1.2: Hiện tượng nhập bào
(trích Giáo trình sinh học tế bào, Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục,
2006)
 Xuất bào (exocytosis)
Là hiện tượng các túi xuất bào chứa các chất tiết như enzyme,

hoocmon… từ lưới nội chất và phức hệ golgi được đưa đến màng tế bào chất,
được màng tế bào đưa ra khỏi tế bào.
Nhập bào và xuất bào là hình thức vận chuyển các chất đặc biệt của tế
bào liên quan đến sự biến đổi cấu trúc màng tế bào chất để đưa các chất vào
hoặc ra khỏi tế bào.

Hình 1.3: Hiện tượng xuất bào

11

(trích Giáo trình sinh học tế bào, Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục,
2006)
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng. Nấm men có hệ
thống enzyme phong phú và khả năng chuyển hóa nhanh những nguồn cacbon
khác nhau trong môi trường nuôi cấy qua các con đường trao đổi chất. Phổ
cacbon của nấm men rất rộng, chúng có khả năng sử dụng những hợp chất
cacbon khác nhau như: các loại đường đơn, đường đôi, các acid hữu cơ…cho
quá trình sinh trưởng. Một số nấm men Candida phân lập từ nước biển có khả
năng sử dụng nguồn cacbon là ethanol cho quá trình sinh trưởng.
Một số chủng nấm men nếu sử dụng nguồn cacbon khác nhau thì tính
chất bề mặt sẽ khác nhau: loài Candida tropicalis khi nuôi cấy trong môi trường
có ankan thì bề mặt sẽ trơn nhẵn hơn trong môi trường có glucose (Osumi et al.,
1975), bề mặt Yarrowia sẽ xuất hiện các chỗ lồi (Fickers et al., 2005), bề mặt tế
bào có nhiều hạt lipid bám vào, đồng thời màng tế bào sẽ linh động hơn.
1.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Trong quá trình sinh trưởng, nấm men chịu ảnh hưởng của nguồn nitơ có
trong môi trường nuôi cấy. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với tế bào nấm men

là NH
4
+
. Muối nitrat là nguồn nitơ thích hợp nhất đối với nhiều loại tảo, nấm sợi
và xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với nhiều loại nấm men. Nấm men có khả
năng sử dụng tốt nguồn nitơ có trong các chất hữu cơ. Các chất hữu cơ này vừa
là nguồn cacbon vừa là nguồn nitơ cung cấp cho vi sinh vật nói chung và nấm
men nói riêng. Nấm men được nuôi trong môi trường có chứa nguồn nitơ hữu
cơ, thành phần lipid của màng sẽ cao hơn nuôi trong môi trường có nguồn nitơ là
muối NH
4
+
(Blinc và Hocevar, 1953; Woodbine, 1959). Nguồn nitơ hữu cơ
thường được sử dụng để nuôi cấy nấm men là pepton – loại chế phẩm thủy phân
không triệt để của một nguồn protein nào đấy. Chúng khác nhau về lượng chất

12

chứa các loại polypeptide và loại chứa acid amin tự do. Sự đa dạng và thành
phần của nguồn nitơ trong môi trường ảnh hưởng đến việc tích lũy ergosterol
của màng tế bào nấm men. Nấm men tăng trưởng trên môi trường giàu nitơ như
muối amoni có thể thu hoạch được nhiều sinh khối nấm men hơn, nhưng số
lượng ergosterol ở màng tế bào lại thấp. Điều này làm cho tính linh động của
màng cũng thay đổi.
1.3.3. Ảnh hưởng của nguyên tố khoáng
Khi sử dụng các môi trường tự nhiên để nuôi cấy nấm men, người ta
thường không cần thiết phải bổ sung các nguyên tố khoáng. Trong nguyên liệu
tự nhiên dùng làm môi trường thường đã chứa đủ các nguyên tố khoáng cần thiết
đối với nấm men. Nguợc lại, với các môi trường tổng hợp bắt buộc phải bổ sung
đủ các nguyên tố khoáng cần thiết để cho nấm men sinh trưởng tốt. Các nguyên

tố khoáng thường được bổ sung vào môi trường là P, Mg, K…
1.3.4. Ảnh hưởng của oxy
Mặc dù nấm men mọc được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí nhưng oxy
và độ thoáng khí rất cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men. Đồng thời nó còn
ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất của nấm men như quá trình lên men.
Nấm men hấp thụ oxy một cách nhanh chóng và sử dụng oxy cho quá trình sinh
tổng hợp các acid béo không no và sterol cho màng tế bào. Do đó, oxy có vai trò
hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng của nấm men để đem lại hiệu quả
cao nhất. Ví dụ như chủng nấm men lên men bia, một số enzyme của nấm men
chỉ phản ứng với oxy mà không gây phản ứng với bất kỳ một chất nhận hydro
nào khác, điển hình như enzyme oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
các acid béo không no và các sterol. Do đó, nếu lượng oxy đầy đủ thì lượng
sterol trên màng tế bào ổn định nếu thiếu oxy có thể làm cho màng lỏng hơn.
1.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Một nhân tố khác ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và trao đổi chất
của nấm men là nhiệt độ. Hoạt động trao đổi chất của nấm men có thể coi là kết
quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào

13

nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế
bào. Tế bào thu được nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài và một phần cũng
do cơ thể thải ra từ kết quả hoạt động trao đổi chất. Tùy theo quá trình sinh lý
khác nhau mà đòi hỏi những nhiệt độ tối thích khác nhau. Biên độ nhiệt độ cho
quá trình sinh trưởng của nấm men rất rộng nhưng nhìn chung nấm men sinh
trưởng tốt ở 28-30
o
C. Ở nhiệt độ 4
o
C, nấm men vẫn có thể sinh trưởng được

nhưng rất chậm. Trên 38
o
C hầu hết nấm men sinh trưởng rất yếu và có thể bị
chết nếu nhiệt độ vượt quá 40
o
C. Nhiệt độ cũng làm thay đổi tính linh động của
màng, ở nhiệt độ cao màng linh động hơn so với nhiệt độ thấp.
1.3.6. Ảnh hưởng của pH môi trường
pH môi trường có ảnh hưởng đối với sinh trưởng của nấm men. Các ion
H
+
và OH
-
là 2 ion hoạt động lớn nhất trong các ion. Những biến đổi dù nhỏ
trong nồng độ các ion này cũng có thể có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh
trưởng của nấm men. Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và việc duy
trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của nấm men rất quan trọng. pH môi
trường không những ảnh hưởng đến sinh trưởng mà còn tác động sâu sắc đến
quá trình trao đổi chất. Trong lên men rượu vang, pH có ảnh hưởng đến khả
năng sống và tăng trưởng của nấm men (Fleet và Heard, 1993). Với quá trình
kiểm soát pH ban đầu của dịch lên men là 4,5 thì sau quá trình lên men, pH của
rượu vang là 3,5-3,8. Giá trị pH này có thể cải thiện được độ ổn định của rượu,
ức chế sự phát triển của vi khuẩn và tạo điều kiện tốt cho quá trình lên men
đường. Tuy nhiên, nếu điều chỉnh dịch lên men ban đầu cao hơn 4,5 thì pH của
rượu vang sau lên men khá cao (4,2-4,5). Ở pH này sẽ tạo điều kiện cho vi
khuẩn phát triển nhanh chóng và dẫn đến quá trình lên men không mong muốn,
rượu vang có chất lượng xấu, màu sắc kém (Kurtzman và Fell, 1998; Ribereau-
Gayon et al., 2006). Nhìn chung nấm men ưa pH acid (pH= 4-6).
1.4. Giới thiệu về các chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiae và Yarrowia lipolytica

1.4.1. Saccharomyces cerevisiae
1.4.1.1. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của S. cerevisiae
Phân loại:
Bộ: Saccharomycetales

14

Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces thuộc nhóm vi sinh vật rất phổ biến trong tự nhiên. Đây là
loài nấm men được sử dụng lâu đời trong lên men cồn và sản xuất bánh mì.
Chúng có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5- 14µm, khuẩn
lạc của chúng dạng bột nhão, màu trắng.
S. cerevisiae lên men hầu hết các loại đường trừ lactose và cellobiose.
Tuy nhiên, khả năng tăng trưởng của S. cerevisiae trên các loại đường khác nhau
là khác nhau (Chen, 2009). S. cerevisiae sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi
nhưng cũng có thể sinh sản hữu tính. S. cerevisiae là loài có thể phát triển trong
điều kiện hiếu khí hay kỵ khí, ở điều kiện hiếu khí sinh trưởng tăng sinh khối
nhanh, điều kiện yếm khí chủ yếu lên men tạo cồn; pH phát triển trong khoảng 4
– 6,8, tối ưu ở pH 5,8; nhiệt độ phát triển trong khoảng 27 – 35
o
C, tối ưu ở 32
o
C.
Nguồn dinh dưỡng carbohydrate chính là các loại đường, thích hợp nhất là
đường fructose, có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ lẫn hữu cơ.
1.4.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của
S. cerevisiae
Điều kiên nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của S.

cerevisiae. Tùy theo mục đích nuôi cấy mà đảm bảo các yếu tố về oxy, pH, nhiệt
độ…Phổ nhiệt độ tăng trưởng tương đối rộng, ở nhiệt độ cao 37
o
C chúng vẫn
mọc được. Là loài hiếu khí tùy tiện nên S. cerevisiae không yêu cầu khắt khe về
khí oxy, phát triển tốt trên môi trường có đường, tuy nhiên lại không có khả
năng tăng trưởng trong môi trường có bổ sung lipid. Vì thế nếu trong môi trường
có bổ sung lipid thì S. cerevisiae không tăng trưởng được (Freeze et al., 1973;
Hunkova và Fencl, 1977; Lafon – Lafourcade et al., 1984; Viegas et al., 1989).
1.4.2. Yarrowia lipolytica
1.4.2.1. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Y. lipolytica
Phân loại:

15

Bộ: Saccharomycetales
Họ: Dipodascaceae
Giống: Yarrowia
Loài: Yarrowia lipolytica
Y. lipolytica là một loài nấm lưỡng hình, có thành tế bào, dạng sợi dài,
vách khuẩn ty phụ thuộc vào chủng và điều kiện tăng trưởng như thành phần
môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy… (Dominguez et al., 2000). Khuẩn lạc
của Y. lipolytica có nhiều hình dạng khác nhau như nhẵn và lấp lánh, cuộn xoắn
và sần sùi. Hầu hết các chủng không thể tăng trưởng được ở nhiệt độ quá 32
o
C
và là loài hiếu khí nghiêm ngặt, nó được xem như không gây bệnh (GRAS –
General Recognised as Safe) (Holzschu et al., 1979).
Y. lipolytica thường được tìm thấy ở môi trường có protein hoặc các cơ
chất kỵ nước như ankan, lipid (Sinigaglia et al., 1994; Barth và Gaillardin, 1997;

Fickers et al., 2005). Nấm men này có thể được phân lập từ bơ sữa hay các sản
phẩm từ sữa bị hư hỏng như bơ, sữa chua, xúc xích. Ngoài ra chúng cũng có thể
được phân lập từ đất, nước thải và môi trường bị ô nhiễm dầu.
Các chủng phân lập từ tự nhiên thường là thể đơn bội, một số ít là thể
lưỡng bội. Cả 2 thể đơn bội và lưỡng bội đều bền vững dưới điều kiện phòng thí
nghiệm. Bào tử hình thành trong điều kiện tăng trưởng cụ thể và tạo ra 4 bào tử
có hình lưỡi liềm có thể được tách ra bằng máy vi xử lý (Barth và Gaillardin,
1996).
Y. lipolytica có thể tăng trưởng trong môi trường có bổ sung lipid như
ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng hợp thành lacton do hoạt động
của enzyme lipase và esterase (Ficker et al., 2005)
1.4.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của
Y. lipolytica
Y. lipolytica là loài nấm men hiếu khí cho nên yêu cầu phải có đầy đủ
lượng oxy để sinh trưởng và phát triển, do đó tốc độ lắc cũng ảnh hưởng đến khả

16

năng phát triển của nó. Đồng thời cũng đảm bảo yếu tố nhiệt độ và một số yếu tố
khác.
Ngoài ra, chúng có khả năng tăng trưởng trong môi trường có bổ sung các
hợp chất kỵ nước (Peters và Nelson, 1948; Klug và Markovetz, 1967). Sử dụng
các chất kỵ nước này như nguồn cacbon để sinh trưởng và phát triển, chuyển hóa
thành một số hợp chất thơm như α-,γ-decalactone…Tuy nhiên, nếu những hợp
chất này tích lũy cao trong tế bào có thể gây độc và ức chế hoạt động của nấm
men (Feron et al., 1996).
1.5. β-carotene
β-carotene là một loại carotenoid phổ biến được tìm thấy nhiều trong một
số trái cây và rau quả có màu đỏ như: gấc, khoai lang đỏ, cà rốt…Là tiền thân
chủ yếu của vitamin A (cơ thể có thể chuyển β-carotene thành vitamin A).

Công thức hóa học của β-carotene là C
40
H
56
, khối lượng phân tử là
536,88.

Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của β-carotene
(nguồn: internet)
Β-carotene tự nhiên có khả năng chữa các bệnh nan y và được coi như
liều thuốc làm tăng tuổi thọ của con người, có khả năng ngăn ngừa được bệnh
ung thư, bảo vệ sắc tố da chống lại hiệu ứng của các tia tử ngoại, giúp phát triển
thị giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng.
Tính chất vật lý: β-carotene hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ và
bị hấp thụ bởi ánh sáng, bền hơn ở nhiệt độ ổn định. Hấp thụ bước sóng cực đại
vào khoảng 450nm.

17


Hình 1.5: Quang phổ hấp thụ của β-carotene
Tính chất hóa học:
Β-carotene là dẫn xuất của isopren chưa bão hòa, có dạng hình kim, màu
nâu đỏ, bền trong môi trường kiềm và không bền trong môi trường acid, tan tốt
trong dầu, ete, hexan và các dung môi hữu cơ như aceton, methanol…không tan
trong nước. Có hệ thống nối đôi liên hợp dài nên β-carotene có ái lực mạnh với
oxy đơn bội, dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng,
nhiệt độ cao. Vì vậy, β-carotene phải được bảo quản ở bao bì kín với nitro hoặc
argon, tránh ánh sáng, nhiệt độ cao khi sử dụng lâu dài.

18

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng – vật liệu
2.1.1. Đối tượng
Chủng Y. lipolytica W29 được cung cấp bởi trường AgroSup Dijon, Pháp. Chủng
Y. lipolytica 0544 và S. cerevisiae HNS.c được cung cấp bởi Viện Công nghiệp
Thực phẩm, Hà Nội.
Chủng S. cerevisiae TNS.c được cung cấp bởi trường Đại học Khoa Học
Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.2. Vật liệu
2.1.2.1. Thiết bị
- Cân điện tử - Máy đo OD
- Kính hiển vi quang học - Tủ lạnh
- Tủ ấm- Bếp nung
- Tủ sấy- Bể ổn nhiệt
- Nồi hấp thanh trùng - Máy ly tâm
- Máy lắc - Các dụng cụ khác: pipet, đầu
típ, nồi, đĩa petri, ống nghiệm,
bình tam giác, lam kính…
2.1.2.2. Hóa chất
- NaCl
- Glucose
- Cao nấm men
- Pepton
- Acid amin cơ bản
- Tween 80
- Cồn tuyệt đối
- Glycerol

- Cồn 96
o

- KOH
- Dầu thầu dầu
- Dầu đậu nành
- Agar
- Gạo
- Khoai tây
- Cồn tuyệt đối
- BHT 10%
- n- hexane
- Đệm phosphate
-β-carotene