MÔI TRƯỜNG NHÂN NHANH CHỒI cây HOA cúc “FARM tím” (chrysanthemumsp ) BẰNG PHUƠNG PHÁP NUÔI cấy mô

TR
NG
I H C C N TH
KHOA NÔNG NGHI P & SINH H C NG D NG

NGUY N M NG THÚY

MÔI TR
NG NHÂN NHANH CH I CÂY HOA
CÚC “FARM TÍM” (Chrysanthemum sp.) B NG
PH
NG PHÁP NUÔI C Y MÔ

Lu n v n t t nghi p
Ngành: HOA VIÊN VÀ CÂY C NH

n Th , 2009


TR
NG
I H C C N TH
KHOA NÔNG NGHI P & SINH H C NG D NG

Lu n v n t t nghi p
Ngành: HOA VIÊN VÀ CÂY C NH

Tên

tài:

MÔI TR
NG NHÂN NHANH CH I CÂY HOA
CÚC “FARM TÍM” (Chrysanthemum sp.) B NG
PH
NG PHÁP NUÔI C Y MÔ

Giáo viên h ng d n
Th.S. Nguy n Th Mai Anh

Sinh viên th c hi n
Nguy n M ng Thúy
MSSV: 3053385
p: HVCC K31

n Th , 2009

2


Lu n v n t t nghi p ngành Hoa Viên và Cây C nh v i

MÔI TR

tài:

NG NHÂN NHANH CH I CÂY HOA CÚC “FARM TÍM”

(Chrysanthemum sp.) B NG PH

NG PHÁP NUÔI C Y MÔ

Do sinh viên Nguy n M ng Thúy th c hi n

Kính trình lên h i

ng ch m lu n v n t t nghi p

C n th , ngày
Ng

ih

tháng

n m 2009

ng d n khoa h c

Nguy n Th Mai Anh


TR

NG

I H C C N TH

KHOA NÔNG NGHI P VÀ SINH H C
B

H i

NG D NG

MÔN SINH LÝ SINH HÓA

ng ch m lu n v n t t nghi p ã ch p nh n lu n v n t t nghi p ngành Hoa

Viên và Cây C nh v i

MÔI TR

tài:

NG NHÂN NHANH CH I CÂY HOA CÚC “FARM TÍM”

(Chrysanthemum sp.) B NG PH

NG PHÁP NUÔI C Y MÔ

Do sinh viên Nguy n M ng Thúy th c hi n và b o v tr
Ý ki n c a H i

cH i

ng

ng ch m lu n v n t t nghi p ………………………………….

………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
Lu n v n t t nghi p

cH i

ng ánh giá

m c: ………………………………

DUY T KHOA
Tr

ng khoa Nông Nghi p & SH D

C n th , ngày tháng n m 2009

ii


L I CAM OAN

Tôi xin cam oan ây là công trình nghiên c u c a b n thân. Các s li u, k t qu
trình bày trong lu n v n là trung th c và ch a
nào tr

c ai công b trong b t k lu n v n

c ây.

Tác gi lu n v n

Nguy n M ng Thúy

iii


L IC M

Xin t lòng bi t n sâu s c

N

n:

Th y Nguy n B o Toàn B môn Sinh lý Sinh hoá, khoa Nông Nghi p và Sinh H c
ng D ng, tr

ng

i H c C n Th

ã t n tình h

ng d n, g i ý và cho nh ng l i

khuyên h t s c b ích trong su t th i gian th c hi n lu n v n này.
Cô Nguy n Th Mai Anh B môn Sinh lý Sinh hoá, khoa Nông Nghi p và Sinh H c
ng D ng, tr

ng

i H c C n Th

ã h t lòng h

ng d n, t o m i i u ki n cho

vi c nghiên c u và hoàn thành lu n v n này.
Xin chân thành c m n:
Th y Nguy n V n Ây, ch Lê H ng Giang và các th y cô, các anh ch phòng thí
nghi m B môn Sinh lý sinh hoá ã t o i u ki n và giúp

tôi hoàn thành lu n

v n.
Quí Th y Cô c a khoa Nông Nghi p và Sinh H c
h c C n Th nói chung ã truy n
su t th i gian ào t o t i tr
Thân ái g i

ng D ng nói riêng, tr

ng

t nh ng ki n th c, kinh nghi m cho em trong

ng.

n các b n t p th l p Hoa viên và Cây c nh K31 l i chúc t t

nh t.
Kính dâng
Cha m

i

ã sinh ra và nuôi d y con khôn l n nên ng

i.

C n th , ngày tháng n m 2009

Nguy n M ng Thúy

iv

p


S

L

C CÁ NHÂN

H và tên: Nguy n M ng Thúy
Sinh ngày: 19/01/1987
N i sinh: B n Tre
a ch : 250, Tân Hoà, Tân Bình, M Cày B c, B n Tre.

i n tho i: 0753.846227
Email:
Quá trình h c t p:
1993-1998: h c t i tr

ng ti u h c Nhu n Phú Tân A, Nhu n Phú Tân, M Cày,

B n Tre.
1998-2002: h c t i tr

ng trung h c c s Nhu n Phú Tân, Nhu n Phú Tân, M

Cày, B n Tre.
2002-2005: h c t i tr

ng trung h c ph thông Cheguevara, th tr n M Cày, M

Cày, B n Tre.
2005-2009: h c t i tr

ng

i h c C n Th , khoa Nông Nghi p & Sinh H c

D ng, ngành Hoa Viên và Cây C nh K31.

v

ng

M CL C

L I CAM OAN

iii

L I CÁM N

iv

S L

v

C CÁ NHÂN

M CL C

vi

DANH SÁCH B NG

ix

DANH SÁCH HÌNH

x

DANH SÁCH CÁC CH

TÓM L
M
CH

VI T T T

xi

C

xii

U

1

NG 1. L

C KH O TÀI LI U

1.1 Ngu n g c và

2

c i m th c v t c a cây hoa cúc

2

1.1.1 Ngu n g c

2

1.1.2

2

c i m th c v t

1.1.2.1 Thân

2

1.1.2.2 R

3

1.1.2.3 Lá

3

1.1.2.4 Hoa

3

1.1.2.5 Qu

3

1.2 Thành ph n môi tr

ng nuôi c y mô t bào th c v t

3

1.2.1 Khoáng a l

ng

4

1.2.2 Khoáng vi l

ng

4

1.2.3 Ngu n cacbon

5

1.2.4 Vitamin

5

1.2.5 N

5

cd a

1.2.6 Ch t i u hòa sinh tr

ng th c v t

6

1.2.6.1 Auxin

6

1.2.6.2 Cytokinin

7

1.2.7 Agar

7

vi


1.2.8 pH

8

1.3

8

ng d ng c a k thu t nuôi c y mô trong vi nhân gi ng

CH

NG 2. PH

2.1 Ph

NG TI N VÀ PH

NG PHÁP THÍ NGHI M

ng ti n thí nghi m

12
12

2.1.1 V t li u thí nghi m

12

2.1.2 Ph

12

2.1.3
2.2 Ph

ng ti n thí nghi m

a i m và th i gian thí nghi m

12

ng pháp thí nghi m

2.2.1 Thí nghi m 1:

13

nh h

ng c a môi tr

ng nuôi c y mô

n s nhân ch i c a

cây hoa cúc

13

2.2.2 Thí nghi m 2: Hi u qu c a ch t i u hoà sinh tr

ng th c v t BA và NAA

ên s nhân ch i c a cây hoa cúc

14

2.3 Phân tích s li u

14

CH

16

NG 3. K T QU VÀ TH O LU N

3.1 Thí nghi m 1:

nh h

ng c a môi tr

ng nuôi c y mô

n s nhân ch i c a

cây hoa cúc

16

3.1.1 S ch i trung bình thu

c sau 4 tu n nuôi c y

16

3.1.2 T l ph n tr m ch i m i hình thành sau 1 tu n nuôi c y

17

3.1.3 Chi u cao ch i

17

3.1.4 S lá trên ch i

19

3.2 Thí nghi m 2: Hi u qu c a ch t i u hoà sinh tr

ng th c v t BA và NAA

s nhân ch i c a cây hoa cúc
3.2.1 S ch i trung bình thu
3.2.2 T l ph n tr m ch i m i

n
21

c sau 8 tu n nuôi c y trên cây hoa cúc
c t o thành sau 1 tu n nuôi c y

21
22

3.2.3 Chi u cao ch i

22

3.2.4 S lá trên ch i

23

3.2.5 S ch i m i hình thành sau 4 tu n nuôi c y trên cây hoa cúc

24

3.2.6 T l ph n tr m s ch i m i hình thành sau 4 tu n nuôi c y

26

3.2.7 Chi u cao ch i trung bình gia t ng t

i trên ch i

28

i trên ch i trên ch i

29

3.2.8 S lá trung bình gia t ng t
K T LU N VÀ

ng

NGH

ng

31

vii


TÀI LI U THAM KH O

32

PH L C

34

THÀNH PH N CÁC MÔI TR

NG NUÔI C Y

viii

40


DANH SÁCH B NG

B ng T a b ng
3.1

S ch i trung bình thu

3.2

T l

Trang
c sau 28 ngày nuôi c y trên cây hoa cúc

16

ph n tr m ch i m i hình thành trên cây hoa cúc sau 7 ngày 17

nuôi c y
3.3

nh h

ng c a môi tr

ng nuôi c y lên chi u cao (cm) c a cây hoa 18

cúc sau 28 ngày
3.4

nh h

ng c a môi tr

ng nuôi c y lên s lá c a cây hoa cúc sau 28 20

ngày nuôi c y
3.5

S ch i trung bình thu

3.6

T l ph n tr m ch i m i

c sau 56 ngày nuôi c y trên cây hoa cúc

21

c t o thành c a cây hoa cúc sau 7 ngày 22

nuôi c y
3.7

Hi u qu c a BA và NAA

n chi u cao ch i c a cây cúc sau 28 23

ngày nuôi c y
3.8

Hi u qu c a BA và NAA

n s lá trên ch i c a cây hoa cúc sau 28 24

ngày nuôi c y
3.9

Hi u qu c a BA và NAA

n s ch i 28 ngày sau khi c y

25

3.10

T l ph n tr m s ch i m i hình thành trên cây hoa cúc 28 ngày sau 27
khi c y

3.11

Chi u cao ch i trung bình gia t ng t

3.12

S lá trung bình gia t ng t ong

ng

i

28 ngày sau khi c y

28

i trên ch i hoa cúc sau 28 ngày 30

nuôi c y

ix


DANH SÁCH HÌNH

Hình T a hình

Trang

3.1

Trình bày s khác bi t v chi u cao ch i

19

3.2

S lá trên ch i c a hoa cúc

20

3.3

Hi u qu c a BA

3.4

S sinh tr

28 ngày sau khi nuôi c y

n s t o thành c m ch i c a cây hoa cúc

26

ng ch i c a hoa cúc c a nghi m th c BA 1.0 mg/l +

NAA 0.2 mg/l.trong môi tr

ng

27

i ch ng

3.5

Chi u cao ch i trung bình gia t ng t

3.6

Hình thái lá c a hoa cúc sau 28 ngày nuôi c y
ch ng

x

ng

i

môi tr

ng

môi tr

i ch ng 29
ng

i 30


DANH SÁCH CÁC CH

MS: Murashige & Skoog (1962)
NAA: alpha-naphthalenacetic acid
BA: Benzyl adenin

xi

VI T T T


NGUY N M NG THÚY, 2009. “Môi tr

ng nhân nhanh ch i cây hoa cúc

”Farm tím” (Chrysanthemum sp.) b ng ph

ng pháp nuôi c y mô”. Lu n v n

t t nghi p

i h c, Khoa Nông Nghi p và Sinh H c

ng D ng, Tr

ng

iH c

C n Th .
Cán b h

ng d n : ThS. Nguy n Th Mai Anh

TÓM L
tài “Môi tr
ph

ng nhân nhanh ch i cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) b ng

ng pháp nuôi c y mô”

h p v i n ng

C

c th c hi n nh m tìm ra môi tr

ch t i u hoà sinh tr

ng nuôi c y k t

ng th c v t (BA và NAA) thích h p cho s

nhân ch i, nâng cao h s nhân ch i, làm c s cho vi c rút ng n th i gian

a

gi ng vào s n xu t.
tài bao g m 2 thí nghi m

c b trí theo th th c hoàn toàn ng u nhiên t 1

n 2 nhân t , v i 5 l n l p l i, m i l n l p l i là 1 keo, m i keo c y 5 m u ch i.
Thí nghi m c a
Môi tr

tài ã thu

c các k t qu nh sau:

ng nuôi c y 1/2MS có b sung 10% n ng

h p cho s nhân ch i trên hoa cúc. K t qu

n

c d a là môi tr

thí nghi m 1 thu

c

ng thích

h s nhân

ch i cao nh t trên cây hoa cúc v i 8,2 ch i/m u c y sau 4 tu n nuôi c y.
K t qu
n

thí nghi m 2 trong môi tr

ng nuôi c y 1/2MS có b sung 10% n ng

c d a có s k t h p v i ch t i u hoà sinh tr

ng th c v t nhóm cytokinin BA

(1mg/l) và nhóm auxin NAA (0.2mg/l) cho h s nhân ch i cao nh t trên cây hoa
cúc v i 133,3 ch i/m u c y sau 8 tu n nuôi c y.

xii

U
Hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là m t trong ba loài hoa c t cành

c a chu ng

nh t trên th gi i (Lê H u Cân và Nguy n Th H i Hà, 2004). Trong các danh hoa,
hoa cúc c ng là loài hoa
a, hoa cúc

c x p h ng. Trong b t quí c a ng

i ch i hoa

i

c x p vào b t quí (mai, lan, trúc, cúc). Hoa cúc ã tôn vinh v

p cho mùa thu, làm s ng d y s luy n l u c a mùa hè, g i c m v m t th i xa
a trong lòng ng
s c(

i. Hoa cúc là m t loài hoa a d ng v ch ng lo i, a h

ng V n ông và inh Th L c, 2003).

Vi t Nam hoa cúc
H i Phòng.

c tr ng nhi u

ng V n

ông và

ng pháp nhân gi ng hoa cúc: ph

tính. Ph

Hà N i, Thành Ph H Chí Minh,

n nay Vi t Nam có kho ng 70 gi ng hoa cúc

ích c t cành (
ph

ng, a

à L t,

c tr ng v i m c

inh Th L c, 2003). Hi n nay, có r t nhi u
ng pháp nhân gi ng vô tính, nhân gi ng h u

ng pháp nhân gi ng h u tính g p nhi u khó kh n do a s cúc th

ng

không có h t. Ph n l n các lo i hoa cúc m c t h t ch s ng m t n m nên th

ng

ch

c s d ng

t o gi ng m i (Nguy n Xuân Linh, 2004).

Nhân gi ng b ng ph

ng pháp nuôi c y mô là m t ph

tính cho h s nhân cao, cây gi ng

c t o ra

ng pháp nhân gi ng vô

ng nh t v m t di truy n, cây s ch

b nh, có s c s ng t t, phát tri n m nh, ít b bi n d (Nguy n

c Thành, 2000);

(Bùi Bá B ng, 1995).
Do ó,

tài kh o sát “Môi tr

(Chrysanthemum sp.) b ng ph
môi tr
th c v t,

ng nhân nhanh ch i cây hoa cúc “Farm tím”

ng pháp nuôi c y mô”

c th c hi n nh m tìm ra

ng nuôi c y mô thích h p v i s k t h p c a các ch t
nâng cao h s nhân ch i, rút ng n th i gian

1

u hòa sinh tr

a gi ng vào s n xu t.

ng


CH
1.1 NGU N G C VÀ

NG 1. L

C KH O TÀI LI U

C I M TH C V T CÂY HOA CÚC

1.1.1 Ngu n g c
Cây hoa cúc có tên khoa h c là Chrysanthemum sp., thu c h Asteraceae, phân h
Asteroideae, chi Chrysanthemum. Hoa Cúc có ngu n g c t Trung Qu c, Nh t B n,
m ts n

c Châu Âu và

c nh p vào Vi t Nam t lâu

i (Nguy n Xuân Linh,

1998).

1.1.2

c

m th c v t

Trên th gi i cây hoa cúc có h n 200 loài,

Vi t Nam có 5 loài ch y u thu c hoa

c nh hi n

p c a hoa. Hoa cúc không ch

c a chu ng ph bi n vì v

còn th m và r t lâu tàn,

c bi t khi héo cánh không r i cành nên quan ni m Á

ông cho r ng cúc có tính trung thành c a ng
hay tr ng ch u, vì dáng v cây c ng r t
a khí h u mát m , nhi t
100C, m

p mà

i quân t . Hoa cúc có th c t bông

p. Hoa cúc còn là v thu c quý. Hoa cúc

trung bình không cao quá 35 0C c ng không th p quá

không quá 80% (

ng Ph

ng Trâm, 2005).

a s hoa cúc là cây

ng n ngày.

1.1.2.1 Thân
Hoa cúc thu c nhóm cây thân th o, kh n ng phân nhánh m nh, có nhi u
d g y, cây càng l n thân s càng c ng. Chi u cao c a cây, chi u dài c a

phân cành m nh, y u ph thu c vào

c tính c a t ng gi ng. Nhìn chung

t giòn,
t, s
u

ki n Vi t Nam hoa cúc có th cao t 30-80cm. Trong i u ki n ngày dài hoa cúc có
th cao

n 1.5-2m (Nguy n Xuân Linh, 1998).

2


1.1.2.2 R

Cây hoa cúc thu c lo i r chùm, r cây ít n sâu mà phát tri n theo chi u ngang.
Kh i l

ng b r l n do sinh nhi u r ph và lông hút, nên kh n ng hút n

dinh d

ng m nh (Nguy n Xuân Linh, 1998).

c và

1.1.2.3 Lá

Lá cúc x thùy có m t r ng c a, th

ng là lá

n m c so le nhau, m t d

ph m t l p lông t , trên m t nh n, phân hình m ng l
hay m ng, màu s c xanh

i lá bao

i. Phi n lá to hay nh , dày

m, xanh vàng hay xanh nh t còn ph thu c vào

c i m

c a t ng gi ng (Nguy n Xuân Linh, 1998).

1.1.2.4 Hoa
Hoa l

ng tính ho c

xanh).

n tính có nhi u màu s c khác nhau (tr ng, vàng,

ng kính hoa t 1,5-12cm. Hoa kép nhi u hoa

n và th

, tím,

ng m c nhi u

hoa trên m t cành phát sinh t các nách lá. Tràng hoa dính vào b u nh hình cái
ng, trên ng ó phát sinh cánh hoa. Cánh có nhi u hình d ng khác nhau cong ho c
th ng, có lo i cánh ng n

u, có lo i dài, cu n ra ngoài hay cu n vào trong (Nguy n

Xuân Linh, 1998).

1.1.2.5 Qu
Qu là m t qu b khô ch ch a m t h t. H t có phôi th ng và không có n i nh
(Nguy n Xuân Linh, 1998).

1.2 THÀNH PH N MÔI TR

NG NUÔI C Y MÔ T BÀO TH C V T

Trong i u ki n in vitro, mô c y khi tách r i kh i c th m s ph thu c vào nh ng
i u ki n môi tr

ng nuôi c y cung c p. Môi tr

ng dinh d

ng c b n c a nuôi

c y mô hi n nay r t a d ng do nh ng tác gi khác nhau v i các m c ích khác
3


nhau. Tr i qua nhi u th nghi m ng

i ta nh n th y ph i s

d ng môi tr

ng

chuyên d ng cho t ng loài hay t ng lo i mô c y chuyên bi t (Lê V n Hòa & ctv.,
2001).
Thành ph n môi tr

1.2.1 Khoáng a l
Trong môi tr

ng nuôi c y bao g m:

ng

ng MS (Murashige & Skoog,1962), 1/2MS và White’s (1963) g m

các nguyên t N, P, K, Mg, S, Ca, Na. Các nguyên t
n ng

al

ng

c s d ng v i

30mg/l (Lê Tr n Bình và ctv., 1997).

Theo Lê V n Hòa và ctv. (1999) khoáng a l

ng r t c n cho cây nh h

cho s h p thu mô c y và chúng không gây

c. Trong nuôi c y mô in vitro ngu n

nit th

ng

nit còn th

c s d ng d
ng

i d ng nitrate (NO3-), ammonium (NH4+), ngoài ra

c s d ng d

i d ng nit h u c nh acid amin. Tuy nhiên n u

ch dùng acid amin làm ngu n cung c p nit thì mô r t y u, s có m t
ngu n nit vô c và h u c

ng r t t t

hàm l

ng thích h p s thúc

ng th i c a

y t bào sinh tr

ng

m nh (V V n V , 1999).

1.2.2 Khoáng vi l
Trong môi tr
khoáng vi l

ng

ng MS (Murashige & Skoog,1962), 1/2MS và White’s (1963),
ng bao g m các nguyên t Fe, B, Mn, I, Cu, Mo, Cl, Zn, Co, Ni. Các

nguyên t khoáng vi l

ng là các nguyên t

c s d ng

n ng

th p h n

30mg/l (Nguy n Xuân Linh, 1998)
Khoáng vi l

ng óng vai trò quan tr ng trong ho t

ng c a enzyme, tuy chi m t

l nh nh ng nó mang l i là thành ph n không th thi u (Nguy n V n Uy n và ctv.,
1984). Thi u s t t bào m t kh n ng phân chia. Theo Nguy n V n Uy n và ctv.
(1984) trong nuôi c y mô th

ng s d ng s t vi l

d ng này, s t không b k t t a nên s cung c p
tr

ng nuôi c y.

4

ng d ng chelate (Fe-EDTA).
li u l

ng theo nhu c u c a môi

1.2.3 Ngu n cacbon
Theo Nguy n V n Uy n và ctv. (1984) mô th c v t trong môi tr
không có kh n ng t d

ng, ph i s ng theo ph

ng th c d d

ng nuôi c y

ng nên b sung

ngu n cacbon là c n thi t vì nó óng vai trò là ngu n cung c p n ng l

ng ch y u

cho mô nh m t ng h p nên các ch t h u c giúp t bào phân chia, t ng sinh kh i.
Ngoài ra nó còn có tác d ng i u hòa áp su t th m th u c a môi tr
V , 1999). Ngu n cacbon th

ng dùng trong nuôi c y mô là

ng (V V n

ng saccharose (2 –

3%) (Bùi Bá B ng, 1995).

1.2.4 Vitamin
Vitamin c ng r t c n thi t trong thành ph n môi tr
in vitro a s mô c y ch a có c u trúc
s h tr t môi tr

ng nuôi c y vì trong i u ki n

t t ng h p

l

ng c n thi t nên c n có

ng bên ngoài (Lê V n Hòa & ctv., 2001). Các vitamin th

ng

s d ng trong nuôi c y mô là Thiamin (B1), Acid Nicotinic (B3), Pyridoxine (B6)
và myo-inositol. Trong ó Thiamin
tr

c coi là vitamin thi t y u

i v i s sinh

ng c a t bào th c v t (Bùi Bá B ng, 1995). Theo Nguy n Xuân Linh (1998)

myo-inositol có tác d ng c i thi n s sinh tr
hàm l

ng c a mô c y và

ng 10-100 mg/l. Các vitamin có tác d ng kích thích s sinh tr

c s d ng
ng c a mô

c y.

1.2.5

cd a

Theo Lê Tr n Bình và ctv. (1997), n
c y t n m 1941
tích n

cd a ã

c s d ng trong môi tr

ng nuôi

nuôi phôi Datura và n m 1949 nuôi mô Daucus. K t qu phân

c d a c a trái có

tu i t non

n già cho th y s xu t hi n trong n

d a có các thành ph n sau:
-Amino acid t do có n ng
trùng

nhi t

t 190,5-685 mg/l. Tùy theo

cao amino acid còn kho ng 70 mg/l.

-Amino acid d ng liên k t có trong protein và peptid.
-

ng

-ARN và AND

5

tu i, khi h p kh

c


Ngoài ra trong n

c d a còn ch a các h p ch t quan tr ng

i v i t bào nuôi phân

l p nh myo-inositol, các h p ch t có tính auxin, các cytokinin d ng glucoside.
v i nhi u m u nuôi c y, l

ng n

i

c d a phù h p t 15-20% th tích môi tr

ng

(V V n V , 1999).
1.2.6 Ch t

u hoà sinh tr

Ch t i u hoà sinh tr

ng

ng là y u t quan tr ng nh t trong quá trình i u khi n s

phát sinh hình thành và tái sinh cây nguyên v n t t bào và mô th c v t trong nuôi
c y in vitro. Hai nhóm ch t i u hoà sinh tr

ng

c dùng nhi u nh t là auxin và

cytokinin (Nguy n Xuân Linh, 1998).

1.2.6.1 Auxin

Các h p ch t auxin kích thích s dãn n t bào, s hình thành mô s o và s xu t
hi n r b t

nh (Nguy n Xuân Linh, 1998).

Auxin t nhiên th
di n

n ng

cao

ng tìm th y

th c v t là indole-3-acetic acid (IAA). Nó hi n

vùng phân sinh mô c a th c v t và liên quan

n nhi u áp

ng sinh lý. Trong l nh v c nuôi c y mô, hi u qu chính c a nó là s phân chia t
bào và quá trình gián phân. M t trong nh ng áp d ng chính c a auxin là kích thích
quá trình t o r .
Auxin t ng h p là nh mg h p ch t có ho t tính t

ng t nh IAA. Auxins có th

c chia thành 6 nhóm: nh ng d n xu t c a indole: Indole-3-acetic (IAA) và
indole-3-butyric acid (IBA); nh ng d n xu t benzoic acid: 2,3,6-trichlorobenzoic
acid và 2-methoxy-3-6-dichorobenzoic acid (Dicamba); nh ng chlorophenoxyacetic
acid: 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
(2,4-D);

Picolinic

acid:

4-amino-3,5,6-trichloropiconic

acid

(Tordon

hay

Pichloram); nh ng naphthalene acid: alpha và beta naphthalenacetic acid; nh ng
naphthoxyacetic acid: alpha và beta naphthoxyacetic (Nguy n Minh Ch n, 2005)
Theo Nguy n V n Uy n và ctv.(1984), ch t i u hoà sinh tr
2,4-D; NAA; IBA; IAA th
trong kho ng t 0.1

ng s d ng trong môi tr

n 5 mg/l.
6

ng nhóm auxin g m

ng nuôi c y mô v i n ng


1.2.6.2 Cytokinin
Theo Nguy n Minh Ch n (2005) cytokinin có kh n ng kích thích ch i bên,
bi t là c ch

nh h

c

ng u th c a ch i ng n.

Các h p ch t cytokinin kích thích s phân chia t bào và s phân hoá ch i b t
(Nguy n Xuân Linh, 1998). Zeatin là cytokinin t nhiên
m m (Nguy n Minh Ch n, 2005). Các cytokinin th

nh

c trích t h t b p n y

ng dùng là kinetin (6-Fufuryl

aminopurin), BA (Benzyl adenin), 2-iP (2-iso Pentyladenin) (Bùi Bá B ng, 1995).
Theo Nguy n Minh Ch n (2005) trong nhóm cytokinin còn có Thidiazuron (TDZ)
c ng

c s d ng r ng rãi trong nuôi c y mô.

Theo

ng Ph

ng Trâm (1997) m t dù trong th c v t có nhi u nhóm ch t i u hòa

sinh tr

ng th c v t nh ng ch y u ki m soát sinh tr

thu c nhóm auxin và cytokinin. Vi c s d ng hàm l
trong môi tr

ng nuôi c y mô quy t

ng phát tri n là các ch t
ng và t l auxin/cytokinin

nh s phân chia c a t bào theo h

ng t o

mô s o, t o ch i, t o r hay t o phôi sôma (Nguy n Xuân Linh,1998). Nhìn chung
t l cytokinin/auxin cao kích thích s thành l p ch i, ng
auxin/cytokinin cao kích thích s hình thành r , n u
cho s phát tri n mô s o (Nguy n
nh t

cl it l

m c

c Thành, 2000). Môi tr

i v i cúc xanh, cúc mai vàng và cúc

i óa tr ng l n l

cân b ng thì thu n l i
ng cho nhi u ch i
t là MS b sung

1mg/l BA và 0,2mg/l NAA, MS b sung 1mg/l BA và 0,4mg/l NAA (

H ng Liên

& ctv.,2002).

1.2.7 Agar
Agar là m t lo i polysaccharic c a t o bi n
tr

ng dinh d

c s d ng làm ch t

m cho môi

ng ông c ng l i (Lê Tr n Bình và ctv., 1997), làm giá th cho nuôi

c y mô t bào th c vât (Nguy n Xuân Linh, 1998). Hàm l
cho nuôi c y in vitro t 0.5

n 1%. N ng

c ng, s khuy ch tán các ch t dinh d

agar cao môi tr

ng agar th

ng dùng

ng s tr nên ông

ng c ng nh s h p th c a mô s o g p khó

kh n (Bùi Bá B ng, 1995).

7


1.2.8 pH
pH th

ng

c i u ch nh t 5.5 - 6 tr

tan c a khoáng, nh h

c khi h p kh trùng. pH quy t

ng s h p thu khoáng trong môi tr

ng, nh h

nh s hoà
ng

ns

t o gel c a agar khi h p kh trùng (Nguy n B o Toàn, 2005).

1.3

NG D NG C A K
GI NG

THU T NUÔI C Y MÔ TRONG VI NHÂN

Nuôi c y mô t bào th c v t (nuôi c y in vitro) là m t ngành k thu t còn non tr
c phát tri n m nh và

c hoàn thi n t nh ng n m 60 c a th k XX và em

l i nhi u ng d ng (Nguy n Nh Hi n và Nguy n Nh

t, 2001). Theo Nguy n

V n Uy n (1999) thì kh n ng ng d ng nuôi c y mô th c v t thành công nh t là
trong l nh v c nhân gi ng và ph c tráng gi ng.

Nhân gi ng vô tính in vitro (vi nhân gi ng)
i v i hoa cúc, ph
ph

ng pháp nhân gi ng vô tính th

ng là ph

ng pháp nhân gi ng h u tính g p nhi u khó kh n do

i a s hoa cúc th

không có h t. Ph n l n các lo i hoa cúc m c t h t ch sinh tr
m nên ph

ng pháp này ch

ng pháp chính, do
ng

ng trong vòng m t

c áp d ng trong t o gi ng m i (Nguy n Xuân

Linh, 1998).

Khái ni m
Nhân gi ng vô tính in vitro hay vi nhân gi ng là vi c nhân úng ki u cây (true-totype) c a m t ki u gen
ph

c tuy n ch n b ng cách s d ng k thu t in vitro là

ng pháp nhân nhanh gi m giá thành (George, 1993).

Vi nhân gi ng b t d u t vi c tách
sau ó

a vào môi tr

ng thích h p, ch i

c tách ra và chuy n sang môi tr
tr

ng h p r

ch i

nh ch i hay mô phân sinh ti n hành kh trùng

ng m i và qui trình c l p l i. Trong m t s

c t o ra ngay trên môi tr

c chuy n sang môi tr

c nhân lên sau 3-4 tu n. các ch i

ng nhân ch i. M t s tr

ng kích thích

Th Th y Tiên, 2000).

8

t o r (Nguy n

ng h p khác
cL

ng và Lê


M c ích c a vi nhân gi ng
Nhân gi ng vô tính in vitro
cây c a m t ki u gen ã

c s d ng vào vi c nhân nhanh và nhân úng ki u
c tuy n ch n (Nguy n B o Toàn, 2005).

Nhân gi ng vô tính trong in vivo nh giâm cành, ghép cành, chi t cành…th
cho s l

ng cây con th p trong th i gian dài vì m i cây m ch chi t

nhánh, n u chi t nhi u s làm h n ch s sinh tr

cm ts

ng c a cây m và có th mang

theo m m b nh (virus, mycoplasma, vi khu n) t cây m chuy n sang cây con
th i cây con mau già cõi và d

ngã (Tr n Th

ng

ng

ng Tu n và ctv., 1994). M t khác,

nhân gi ng vô tính in vivo cho h s nhân th p h n nhân gi ng vô tính in vitro (Lê
Tr n Bình và ctv., 1997).
Theo Bùi Bá B ng (1995) nhân gi ng vô tính in vitro có nhi u u i m
-T o ra cây con

ng nh t và gi

c

-H s nhân cao có th nhân m t s l

c tính di truy n c a cây m
ng cây con r t l n t m t cá th ban

u

trong th i gian ng n
-M t gi ng quý có th nhân nhanh

a vào s n xu t

-Có th t o ra cây con s ch b nh do có s ch n l c các
khi

a vào môi tr

it

ng s ch b nh tr

ng nuôi c y

Nhìn chung, nhân gi ng vô tính in vitro

c ng d ng thành công và d dàng trên

cây hai lá m m, c ng nh trên các cây thân th o h n trên cây thân g (Nguy n
L

c

c

ng, 2002).

Qui trình nhân gi ng in vitro
Nhân gi ng in vitro

c Debergh và Zimmerman (1991) chia thành n m giai o n:

-Giai o n 0: L a ch n và chu n b cây m
Kh i

u c a qui trình vi nhân gi ng c n ph i có s l a ch n cây m c n th n,

chúng

c tr ng cho gi ng loài và không có bi u hi n m m b nh do ó làm gi m và

lo i tr m m b nh là c n thi t.
-Giai o n 1: B t

u ti t trùng và t o m u c y vô trùng

ây là giai o n mà m u v t t bên ngoài
trùng.

c

thành công trong giai o n này c n ph i

9

a vào i u ki n nuôi c y vô
m b o các yêu c u sau: t l


nhi m th p, t l s ng cao, t c

sinh tr

ng nhanh (Lê Tr n Bình và ctv., 1997).

Nh v y, c n ph i tho hai y u t sau:
+Cách l y m u: H u h t các mô c a th c v t
nuôi c y, quan tr ng nh t là

nh sinh tr

u có th s d ng

làm m u v t

ng, ch i nách, sau ó là hoa, o n thân,

m nh lá và r (Lê Tr n Bình và ctv., 1997).
+Ch n ph

ng pháp kh trùng: m u v t s

thích h p s cho t c

sinh tr

t t l s ng cao, môi tr

ng nhanh.

-Giai o n 2: Nhân nhanh s l

ng

M c ích c a giai o n này là t o

cs l

trình kích thích các mô phân sinh nh :
(Nguy n B o Toàn, 2005). Có hai ki u
+Ph

ng pháp c y m t: thân

ng cây theo ý mu n thông qua quá

nh sinh tr
t ng t c

ng, ch i chính, ch i bên

nhân trong giai o n này là:

c c t ra thành t ng o n ch a m t m t hay nhi u

m t lo i b lá. Ch i m i s phát tri n t m m ngang
pháp này t

ng nuôi c y

ra có hi u qu

nách lá. Tuy nhiên ph

ng

nhóm cây hai lá m m và nh ng cây s ch b nh

(George, 1993).
+Ph

ng pháp khác

t ng s ch i

giai o n này là c y

nh ch i. theo cách này có hai ki u ch i

nh sinh tr

ng hay c y

c t o thành là: ch i dài và c m ch i.

ch i dài, các ch i phát tri n lóng dài và các ch i ngang c ng phát tri n dài, trong
khi

c m ch i t o ra nhi u ch i nh ng lóng ng n (George, 1993)

Trong giai o n này thì cytokinin óng vai trò r t quan tr ng trong vi c t ng s ch i
tuy nhiên v i hàm l

ng cao c ng gây m t s v n

b i r m, bi n d vô tính, các v n
-Giai o n 3: Chu n b và

nh : s thi u n

c, t o thành

r (Nguy n B o Toàn, 2005).

a cây ra ngoài môi tr

Ch i và cây con

c t o ra

tri n ngoài môi tr

ng t nhiên. Vì v y m c ích c a giai o n này là t o cây phát

tri n

y

giai o n 2 th

ng t nhiên
kh n ng

phát

: r , thân, lá có kh n ng th c hi n quang h p và s ng sót mà không c n

cung c p ngu n carbohydrate nhân t o,
+Giai o n 3a: Kéo dài các ch i
thích h p cho vi c t o r
hay m t l

ng r t nh ch a

y

c hình thành

. Môi tr

ng cytokinin th p h n

c chia hai giai o n:
giai o n 2

ng kéo dài th

t kích th

ng không ch a cytokinin

giai o n 2. Tu thu c vào ki u cây mà có th

10

c


kéo dài trên ch i

n hay c m ch i (Nguy n

c L

ng và Lê Th Th y Tiên,

2002)
+Giai o n 3b: Kích thích t o r và ti n thu n d
Auxin là h p ch t th

ng

d ng ph bi n trên môi tr

c s d ng nh t

thích h p cho vi c ti n thu n d
c khi

ng t nhiên v i các ph

ng carbohydrate, làm th p m

ngoài i u ki n t nhiên tr

c khi

cs

ng và h p th

ng ra r . Ngoài ra, ây c ng là giai o n

ng nh m t ng kh n ng t d

a ra ngoài môi tr

cung c p cây con l

t o r , than ho t tính c ng

ng t o r do có tác d ng làm t i môi tr

h p ch t cytokinin d th a trong môi tr

mô tr

ng

t

ng c a cây nuôi c y

ng pháp th c hi n nh :
ng

a ra ngoài (Nguy n

i trong bình,
cL

keo

ng và Lê Th

Th y Tiên, 2000).
-Giai o n 4: Chuy n cây ra ngoài môi tr
Ch t l

ng t nhiên

ng cu i cùng c a công vi c nhân gi ng in vitro ph thu c m t ph n vào

vi c thu n d

ng. Th

ng các cây con sau giai o n c y mô

ti p ra nhà l

i hay môi tr

gây ra hi n t

ng này là do c u trúc gi i ph u c a cây nuôi c y mô không thích h p

ng t nhiên t l ch t r t cao. Nguyên nhân ch y u

v i i u ki n t nhiên, th hai là do s thay
Vì v y

c mang tr ng tr c

i

t ng t v i i u ki n môi tr

t ng kh n ng s ng sót c a cây con ngoài nhà l

hu n luy n thích nghi v i s thay

i c a nhi t

, m

ng.

i ph i trãi qua giai o n
,s m tn

c, sâu b nh

(Lê Tr n Bình và ctv., 1997).
Cây con chuy n t giai o n 3
h p,

c gi

m

c r a s ch agar, sau ó tr ng trên giá th thích

cao, tránh ánh sáng cao. Th i gian t i thi u cho s thích nghi

kho ng 2-3 tu n, trong th i gian này ph i h n ch t i a nh ng y u t b t l i: m t
n

c nhanh chóng làm cho cây khô héo, nhi m vi khu n và n m làm cây th i

nh ng, cháy lá do n ng (George, 1993).

11