KHẢO sát HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN của cây BÀNG (terminalia catappa), cây từ BI (pluchea indica) và cỏ bạc đầu lá NGẮN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ QUANG SUNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CÂY BÀNG (Terminalia catappa), CÂY TỪ BI (Pluchea
indica) VÀ CỎ BẠC ĐẦU LÁ NGẮN (Kyllinga
brevifolia)

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y

Cần Thơ, 2009

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA
CÂY BÀNG (Terminalia catappa), CÂY TỪ BI (Pluchea
indica) VÀ CỎ BẠC ĐẦU LÁ NGẮN (Kyllinga
brevifolia)

Giáo viên hướng dẫn:
TS. HUỲNH KIM DIỆU

Sinh viên thực hiện:
LÊ QUANG SUNG
MSSV: 3042834
Lớp: TY K30

Cần Thơ, 2009

ii


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
Trangduyệt của hội đồng Khoa
Tờ duyệt của hội đồng Khoa
Đề tài: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây Bàng (Terminalia
catappa), cây Từ Bi (Pluchea indica) và cỏ Bạc Đầu lá ngắn (Kyllinga
brevifolia)
do sinh viên : …Lê Quang Sung … thực hiện tại …..khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng trường Đại học Cần Thơ… từ…01/03/2009…
đến…15/05/2009…..

Cần thơ, ngày …. tháng …. năm 2009 Cần thơ, ngày …. tháng …. năm 2009
Duyệt Bộ môn

Duyệt giáo viên hướng dẫn

…………………….

…………………………

Cần thơ, ngày …. tháng …. năm 2009
Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

……………………………

iii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi, không sao
chép của bất cứ ai, số liệu chưa từng được công bố trước đây.

Cần Thơ, ngày ……tháng……năm 2009
Tác giả

Lê Quang Sung
iv


LỜI CẢM ƠN
Cảm ơn những người thân yêu sống bên cạnh tôi bởi vì mọi người đã luôn
mong muốn tôi thành công.
Cám ơn thầy cô đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báo để giúp tôi
sống tốt hơn.
Xin gởi lời cám ơn đến thầy cô trong bộ môn Thú Y, cô Huỳnh Kim Diệu đã
nhiệt tình giúp đỡ trong suốt 5 năm qua và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn
thành tốt bài luận văn này.

Cám ơn thầy Trần Kim Tính và các anh, chị phòng thí nghiệm chuyên sâu ,
phòng thí nghiệm vi sinh vật đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện
đề tài.
Cám ơn các bạn trong nhóm luôn quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong thời
gian qua. Tôi chân thành gởi lời cảm ơn đến bạn Bá Duy, Thùy Dương, Hạnh
Dung, Duy Khánh, Cẩm Giang và tất cả các bạn trong nhóm đã luôn giúp đỡ và
khích lệ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài này.

v


MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................. 1
CHƯƠNG 2:CƠ SỞ LÝ LUẬN ........................................................................................ 2
2.1.SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY DÙNG LÀM THÍ NGHIỆM .......................................... 2
2.1.1.Cây Bàng .......................................................................................................... 2
2.1.2.Cây Từ Bi ......................................................................................................... 2
2.1.3.Cỏ Bạc Đầu Lá Ngắn ........................................................................................ 3
2.2.SƠ LƯỢC VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM ...... 4
2.2.1.Vi khuẩn Staphylococcus aureus....................................................................... 4
2.2.2.Vi khuẩn Streptococcus faecalis........................................................................ 5
2.2.3.Vi khuẩn E.coli ................................................................................................. 6
2.2.4.Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa................................................................... 7
2.2.5.Vi khuẩn Salmonella spp................................................................................... 8
2.2.6.Vi khuẩn Aeromonas hydrophila....................................................................... 9
2.2.7.Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ....................................................................... 10
2.2.8.Vi khuẩn Edwardsiella tarda .......................................................................... 11
CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 12
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................. 12
3.2.PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ........................................................................... 12

3.2.1.
Thời gian và địa điểm............................................................................... 12
3.2.2.
Nguyên liệu.............................................................................................. 12
3.2.3.
Thiết bị và hóa chất .................................................................................. 12
3.2.4.
Vi khuẩn .................................................................................................. 13
3.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 13
3.3.1.
Điều chế cao............................................................................................. 13
3.3.2.
Thử hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................... 14
3.3.3.
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu ............................................................ 15
3.3.4.
Chỉ tiêu theo dõi....................................................................................... 16
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 17
4.1.HIỆU SUẤT ĐIỀU CHẾ CAO THÔ ..................................................................... 17
4.2.ẨM ĐỘ CAO THÔ ............................................................................................... 17
4.3.KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH KHÁNG KHUẨN ............................................ 17
4.4.KẾT QUẢ NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU........................................................ 19
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................ 21
5.1.KẾT LUẬN ........................................................................................................... 21
5.2. ĐỀ NGHỊ ............................................................................................................. 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 22

vi

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

MIC
MHA
NB
NA
DMSO
TSA
E.M.B
E. coli
S. aureus
S. faecalis
A. hydrophilla
Sal. spp.
P. aeruginosa
E. ictaluri
E. tarda

Minimum Inhibitory Concentration
Mueller Hinton Agar
Nutrient Broth
Nutrient Agar
Dimethyl Sulfoxide
Trypticase Soy Agar
Eosinmethylen blue
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Streptococcus faecalis
Aeromonas hydrophilla
Salmonella spp.

Pseudomonas aeruginosa
Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella tarda

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Hiệu suất điều chế cao thô .................................................................................. 18
Bảng 2: Kết quả ẩm độ của 3 loại cao thô ........................................................................ 18
Bảng 3: Đường kính vòng vô khuẩn của 3 mẫu cao ......................................................... 19
Bảng 4: Kết quả về nồng độ ức chế tối thiểu của 3 loại cao.............................................. 20
Bảng 5: Nồng độ ức chế tối thiểu của 3 loại cao ở trạng thái khô hoàn toàn ..................... 21

viii


CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi như: chế độ dinh dưỡng,
cách cho ăn , kỹ thuật chăm sóc, yếu tố ngoại cảnh (nhiệt độ, ẩm độ, tốc độ gió, ánh
sáng),… Trong đó, người chăn nuôi đóng vai trò rất lớn trong việc giúp vật nuôi
sống khỏe mạnh, không bệnh tật và sinh trưởng nhanh.
Trong quá trình nuôi, để phòng và trị bệnh cho gia súc gia cầm, người chăn
nuôi có thể áp dụng nhiều phương pháp như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa
dược, phương pháp sinh vật học… Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm riêng.
Hóa dược rất dễ mua và dễ dàng sử dụng, do đó người chăn nuôi thường lạm dụng,
nhất là các chất kháng sinh tổng hợp. Hậu quả dẫn đến tình trạng dư lượng kháng
sinh trong sản phẩm động vật, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người về lâu
dài, bên cạnh đó thuốc sẽ mau chóng bị kháng thuốc làm cho việc điều trị trong
những lần sau kém hiệu quả, năng suất chăn nuôi cũng vì thế sẽ giảm xuống.

Để nâng cao năng suất chăn nuôi và tạo sản phẩm động vật sạch, không còn
dư lượng kháng sinh đồng thời tận dụng được nguồn dược liệu phong phú trong
thiên nhiên, nghiên cứu sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật
đang được quan tâm. Góp phần vào xu hướng của thế giới nói chung và Việt Nam
nói riêng, hôm nay tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY BÀNG (Terminalia catappa), CÂY TỪ BI (Pluchea
indica) VÀ CỎ BẠC ĐẦU LÁ NGẮN (Killinga brevifolia)”. Đề tài có hai mục tiêu
chính: xác định vòng vô khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên thạch và xác định
nồng độ ức chế tối thiểu của ba loài cây trên.

.

1


CHƯƠNG 2:CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1.SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY DÙNG LÀM THÍ NGHIỆM
2.1.1.Cây Bàng
Cây Bàng có tên khoa học là Terminalia catappa .
Tên khác: Quang Lang.
Tên nước ngoài: Indian Almond tree.
Họ: Bàng (Cambretaceae)
Mô tả: cây to, cao 8-10 m , có khi ít hơn. Thân phân cành nằm ngang gần
như mọc vòng làm thành nhiều tần. Lá to, mọc so le, đầu tròn hơi có mũi nhọn, dài
20-30cm, rộng 10-13cm, mặt trên nhẵn bong, mặt dưới nhạt, có lông màu hung nhạt.
Phân bố: chi Terminalia có khoảng 150 loài trên thế giới, hầu hết là cây gỗ,
rụng lá, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới.Ở Việt Nam có 11 loài, trong đó có cây
bàng rất quen thuộc và đáng chú ý.
Sinh thái: Bàng là loài cây nhiệt đới, có nguồn gốc ở vùng Nam Á. Ở Ấn Độ,

cây mọc tự nhiên ở ven rừng và cả ở những nơi đất khô cằn có nhiều sỏi đá. Ở Việt
Nam, không thấy Bàng mọc trong trạng thái tự nhiên. Cây được trồng nhiều ở các
vùng đô thị, ven đường đi hoặc trong các đình chùa, trường học để lấy bóng mát.
Bàng là loài cây gỗ mọc nhanh, cây trồng từ hạt và sau một năm có thể cao
đến 2m.
Sau 10-15 năm, cây sinh trưởng chậm đi rất nhiều, rụng lá hoàn toàn vào
mùa đông, ra hoa quả nhiều hàng năm. Tỷ lệ hạt nảy mầm cao.
Thời điểm trồng Bàng tốt nhất là sau Tết Nguyên Đán.
Bàng không cần chăm sóc nhiều, ít sâu bệnh.
Bàng có khả năng chịu hạn tốt, không kén đất, ưa ánh sáng, được nhân giống
từ hạt.
Thành phần hóa học: Vỏ thân cây Bàng chứa 25-35% tannin pyrogalic và
tannin catechic. Lá chứa corilagin, acid galic, acid egalic, brevifolincarboxylic acid.
Gỗ chứa acid elagic, acid galic. (Đỗ Huy Bích, 2004)
Tác dụng dược lý: Trong y học, búp và lá Bàng non chữa cảm sốt, làm ra mồ
hôi, chữa tê thấp, đâu nhức, ghẻ, sâu răng. Vỏ thân chữa kiết lỵ, tiêu chảy, vết
thương lở loét.
2.1.2.Cây Từ Bi
Tên khoa học: Pluchea indica.
Tên khác: Cúc Tần, Phật Phà.
Họ: Cúc (Asteraceae)
Mô tả: cây bụi, cao 1- 2m, cành mảnh. Lá mọc so le, hình bầu dục, mặt trên
và mặt dưới màu lục xám, mép khía răng, gần như không cuống. Toàn cây có lông
tơ mịn và mùi thơm. Hoa tím nhạt, mọc ở ngọn. Quả nhỏ, có cạnh. Trên cây thường
có dây tơ hồng mọc và sống nhờ.
Cây mọc hoang dã hoặc được trồng làm hàng rào. Cây ưa sáng và chịu nhiệt
tốt. cây gần như không cần chăm sóc, có thể thu hoạch quanh năm.

2

Bộ phận dùng : rễ, lá. Thu hái quanh năm, rửa sạch. Dùng tươi hoặc phơi, sấy
khô. Cây có khả năng tái sinh mạnh nên có thể tỉa cành và tuốt lấy lá.
Thành phần hóa học: lá chứa acid chlorogenic. Rễ chứa 2 dẫn chất thiophen.
Lá và rễ cây Từ Bi có tác dụng:
- Chống viêm cấp tính trên mô hình gây phù thực nghiệm trên chân chuột
cống trắng bằng Kaolin.
- Chống viêm mạn tính trên mô hình gây u hạt thực nghiệm dưới da chuột
cống trắng với amian. Tác dụng này yếu hơn nhiều so với tác dụng chống viêm cấp
tính.
- Hạ nhiệt rõ rệt đối với mô hình gây sốt thực nghiệm bằng men bia.(Đỗ
Huy Bích et al, 2004)
Các bài thuốc có dùng cây Từ Bi để chữa bệnh:
- Chữa cảm, sốt không ra mồ hôi, nhức đầu, thấp khớp, đau lưng, bong gân,
kiết lỵ, tiêu hóa kém.Mỗi ngày sắc 8 - 16g rễ lấy nước uống.
- Lá tươi nấu nước xông chữa cảm.
- Tắm chữa ghẻ, giã nát thêm rượu đắp chỗ đau.
- Bột lá thêm sáp ong, dầu thầu dầu bó gãy xương.
2.1.3.Cỏ Bạc Đầu Lá Ngắn
Tên khoa học:Kyllinga brevifolia.
Họ: Cyperaceae
Mô tả: cây cỏ thảo. Thân rễ mảnh, mọc đơn độc hoặc thành bụi. Lá mọc
thành 2 dãy cách nhau, thường ngắn, gốc có bẹ, đầu nhọn, gân song song, mặt dưới
rất nhạt.
Cây ưa sáng hoặc hơi chịu bóng, thường mọc thành đám nhỏ, xen lẫn với các
loại cỏ khác trên đất ẩm ở ruộng, bờ ao và các bãi cỏ ven sông.
Không chịu được sự giẫm đạp và khô hạn.
Thành phần hóa học: Shin Dongin et al (1994), đã chứng minh cỏ bạc đầu có
chứa Vitexin. Vitexin có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, chống viêm.
(Đỗ Huy Bích et al, 2004)

Bộ phận dùng: toàn cây.
Tính vị, tác dụng: Vị cay, tính bình; có tác dụng khu phong giải biểu, làm
toát mồ hôi, lợi tiểu, trừ ho, tiêu thũng giảm đau.
Công dụng: Ðược dùng để trị:
- Phong nhiệt, phong hàn cảm mạo;
- Viêm khí quản, ho gà, viêm họng sưng đau;
- Sốt, lỵ trực trùng;
- Viêm gan vàng da;
- Ðái ra dưỡng trấp. Thấp khớp đau nhức xương đòn ngã tổn thương.
- Dùng trị mụn nhọt, viêm mủ da.
Liều dùng 30-60g, dạng thuốc sắc uống.
Dùng ngoài da: cây cỏ được giã ra, rồi đắp lên chỗ đau hoặc nấu nước rửa. Ở
Malaysia, người ta dùng thân rễ làm thuốc đắp trị đau chân.
* Ðơn thuốc: Ở Trung Quốc
- Ho gà, viêm khí quản: dùng cỏ bạc đầu lá ngắn 60g, sắc nước và chia làm
2 lần uống trong ngày.

3


- Sốt rét: dùng cỏ bạc đầu lá ngắn 60g, sắc nước, uống trước 4 gìờ khi đã có
triệu chứng.
- Ðái ra dưỡng trấp: dùng cỏ bạc đầu lá ngắn, Cùi nhân (Long nhãn), mỗi vị
50g, sắc nước uống.
2.2.SƠ LƯỢC VỀ CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG
QUÁ TRÌNH THÍ NGHIỆM
2.2.1.Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus thuộc họ Micrococcaceae, do Rosenbach phân lập
được vào năm 1884 (Bergey’s Manual, 2005).
Vi khuẩn bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường

không có vỏ nhầy (Asperger, 1994).
Vi khuẩn gồm nhiều cầu khuẩn gắn liền nhau tạo thành hình giống như
chùm nho, nên được gọi là tụ cầu khuẩn.
Là vi khuẩn sinh mủ điển hình, làm cho các tổ chức của động vật, người bị
sưng, vết thương nung mủ, gây những chứng viêm có mủ, một số trường hợp
chuyển sang chứng huyết nhiễm mủ và bại huyết (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Staphylococcus aureus còn có khả năng hình thành độc tố ruột trong thực
phẩm, do đó mới gây nên chứng nhiễm độc (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).
Dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10-450C, nhiệt độ thích hợp 30-370C,
nồng độ muối từ 10-15%, pH tốt nhất là 7-7,5 (Asperger, 1994).
Trên môi trường thạch: 12 – 24 giờ khuẩn lạc tròn đường kính 2 – 4 mm,
màu trắng, vàng, vàng chanh, hơi ướt. Phần lớn khuẩn lạc có màu vàng thẫm
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Môi trường thạch máu S. aureus làm dung huyết và làm đông huyết tương
thỏ (Trần Thị Phận, 2004).
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977) căn cứ vào mức độ bệnh có thể phân loại
độc tố như sau:
 Độc tố dung huyết hay độc tố dung giải: là ngoại độc tố có thể làm tan hồng
cầu thỏ, dê và các động vật khác. Dung huyết tố bị hủy ở nhiệt độ 65oC sau
30 phút. Khi cấy tụ cầu vào thạch máu có 5% máu cừu hoặc thỏ thấy tan
huyết rõ rệt. Để tủ ấm 36 oC sau 24 giờ, chung quanh khuẩn lạc có một vòng
dung huyết.
 Độc tố diệt bạch cầu: có thể làm cho bạch cầu chết, không hoạt động, biến
thành không bào, tan rã thành hạt. Độc tố diệt bạch cầu thông qua lọc, ít chịu
được nhiệt hơn độc tố dung huyết, ở nhiệt độ 56 – 58oC đã bị phá hoại.
 Độc tố hoại tử: chế bằng cách lọc canh trùng tụ cầu. Tiêm vào thỏ độc tố pha
loãng (0,2 ml) qua 24 giờ ở chỗ tiêm phát sinh phản ứng hoại tử, chung
quanh nóng và ứ máu.
4

 Độc tố làm chết: nếu tiêm vào tĩnh mạch động vật cảm nhiễm nước lọc canh
trùng tụ cầu thì sẽ sinh ra độc tố làm chết con vật. Với lượng 0,1 – 0,75 ml
có thể làm chết con thỏ nặng 1 kg. Sau khi tiêm 15 phút thỏ bị giật rất mạnh,
thở khó khăn, mê man rồi chết.
 Độc tố đường ruột: độc tố này gây trúng độc về thức ăn cấp tính, thấy trong
nước lọc canh trùng, có sức chịu nhiệt cao.
Nhiệt độ 800C diệt vi khuẩn trong 1 giờ. Đun sôi 100 0C vi khuẩn chết sau
1-2 phút. Dễ bị tiêu diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường nhưng đề kháng cao
với sự khô và sự đóng băng. Ở nơi khô ráo, vi khuẩn sống được từ 4-5 tháng (Trần
Thị Phận, 2004).
Theo Võ Thị Huyền Trân (2007), Staphylococcus aureus có tỉ lệ nhạy cảm
thấp đối với kháng sinh như Tetracycline (41,46%), Ampicillin (36,59%).
Staphylococcus aureus đã đề kháng cao với Erythromycin (70,73%).
Những kháng sinh có hoạt lực mạnh như ceftriazol, Ciprofloxacin cũng bắt
đầu bị vi khuẩn này kháng lại. Đáng chú ý là tỷ lệ đề kháng của Staphylococcus
aureus với methicillin lên tới 50%. Theo một số tác giả Việt Nam, mức độ kháng
của Staphylococcus aureus với oxacillin cũng tăng khá nhanh, từ 9,6% năm 1989
lên đến 20,7% năm 1994. Những nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy nguy cơ
lan rộng của Staphylococcus aureus kháng Methicilline trong nhiễm trùng bệnh
viện nói chung và nhiễm khuẩn ngoại khoa nói riêng ().
2.2.2.Vi khuẩn Streptococcus faecalis
Liên cầu khuẩn xếp thành chuỗi dài hay ngắn như chuỗi hạt. Đường kính có
khi đến 1µm. Gram +, không di động, không có giáp mô (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977).
Liên cầu khuẩn có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên: đất, nước, không khí. Trên
cơ thể người và động vật liên cầu khuẩn thường ký sinh trên da, niêm mạc, đường
tiêu hóa, hô hấp. Một số loài có khả năng gây bệnh như: Streptococcus pneumoniae
(gây viêm phổi), Streptococcus pyogenes (tiết độc tố gây bệnh cấp tính ở người).
(Nguyễn Như Thanh, 1997).

Môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc
nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám. Khi làm tiêu bản, liên cầu khuẩn không xếp
thành chuỗi dài mà thường hình thành chuỗi ngắn (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Theo Susan Fraser, L. (2008) Trường Đại học Case Western Reserve
Enterococcus bao gồm hơn 17 loài, nhưng chỉ có một vài loài gây bệnh cho người.
Sự đề kháng với kháng sinh ngày càng tăng gây khó khăn cho việc chữa trị
( />
5


Phần lớn các chủng Streptococcus faecalis (nay là Enterococcus faecalis) đề
kháng với cefaclor và các loại cephalosporin khác. (ocbietduoc. com.
vn/thuoc/thuoc-goc92 .aspx).
Theo Thal et al (1993) nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Gentamycin đối
với Streptococcus faecalis lớn hơn 2000 µg/ml, Ampicillin là 0,5 – 1 µg/ml,
Penicillin là 4 µg/ml và Streptomycin là 125 µg/ml.
Enterococcus faecalis gây viêm nội tâm mạc, viêm bàng quang, viêm tiết
niệu, viêm mào tinh hoàn. E. faecalis kháng nhiều nhóm kháng sinh như:
aminoglycosides, aztreonam, cephalosporins, clindamycin và kháng sinh như:
nafcillin, oxacillin, trimethoprim-sulfamethoxazol (Nguyễn Thị Chính và Trương
Thị Hòa, 2005).
2.2.3.Vi khuẩn E.coli (Escherichia coli)
E.coli thuộc họ Enterobacteriaeceae được Escherich phân lập đầu tiên và
đưa ra đặc điểm vi khuẩn vào năm 1885. E.coli là loài quan trọng được tìm thấy
trong phân (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).
E. coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2 – 3 µ, đôi khi xếp thành
chuỗi ngắn, có lông ở chung quanh thân nên có thể di động, không hình thành nha
bào, gram(-) trong tổ chức và dịch thấm ra từ bệnh tích, thỉnh thoảng thấy hiện
tượng bắt màu ở hai đầu (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
E. coli bắt màu Gram âm, là trực khuẩn hình gậy ngắn. Trong cơ thể, vi

khuẩn có hình cầu trực khuẩn. Vi khuẩn không sinh nha bào. Nếu lấy vi khuẩn từ
khuẩn lạc nhầy có thể thấy giáp mô, còn khi soi tươi không thấy được (Nguyễn Như
Thanh, 1997).
Đặc điểm nuôi cấy vi khuẩn: Nhiệt độ thích hợp là 370C, có thể dao động từ
10-46 0C. Mọc dễ dàng trên môi trường MC (Mac Conkey), EMB (Eosin Methylene
Blue Agar), NB (Nutrient Broth).(Nguyễn Thanh Bảo, 2005)
Trên thạch thường, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không
trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi. Nuôi lâu khuẩn lạc gần như nâu nhạt và mọc
rộng ra (Nguyễn Như Thanh, 1997).
Trong các bệnh ở lợn con sau cai sữa, bệnh phù đầu gây ra bởi các chủng
E.coli sản sinh độc tố verotoxin VT2e là khá phổ biến với tỷ lệ chết lên tới 61,44%
(Nguyễn Kim Lan, 2002).
E.coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác tác động gây bệnh khi
sức đề kháng của con vật kém đi, lúc động vật gầy yếu, chăm sóc quản lý chăn nuôi
kém, bị cảm lạnh hay cảm nắng, mắc bệnh truyền nhiễm hay không truyền nhiễm,
bệnh giun sán. E. coli thường gây bệnh cho súc vật mới đẻ từ 2 – 3 ngày tuổi, có khi
từ 4 – 8 ngày, gây bệnh đường ruột cho ngựa con, bê, cừu con, heo con, gia cầm
non (Nguyễn Như Thanh, 1997).

6


E. coli không chịu được nhiệt độ cao, đun 55oC trong 1 giờ, 60oC trong 30
phút, đun sôi 100 oC chết ngay. Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài các chủng E.
coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)
Một số hóa chất ức chế sự phát triển của E.coli như chlorine và dẫn xuất của
nó, muối mật (Nguyễn Thanh Bảo, 2005).
E.coli không chịu được nhiệt độ cao, đun 550C trong 1 giờ, 600C trong 30
phút, đun sôi 100 0C chết ngay. Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài, các chủng E.coli
độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978).

Tỷ lệ E. coli kháng lại Streptomycine trong bệnh heo con phân trắng
(77,07%) và bệnh viêm tử cung trâu bò (77,78%) cao gấp hơn 2 lần so với bệnh
viêm vú ở bò (30,77%). Trong bệnh bò bị viêm vú tỷ lệ E. coli kháng ampicilline
thấp nhất (46,15%), trong khi đó ở bệnh trâu bị viêm tử cung là 56,56% và ở bệnh
heo con phân trắng có tỷ lệ cao nhất (56,73%) (Bùi Thị Tho, 2003).
E.coli rất nhạy cảm với kháng sinh Ciprofloxacin, Gentamycin, Neomycin,
Ofloxacin, Kanamycin (Nguyễn Ngọc Thanh Hà, 2004).
Theo Hồ Xuân Ngân (2007), E.coli nhạy cảm với Gentamycin (100,00%),
Norfloxacin (96,40%), Bactrim (60,71%). E.coli đề kháng cao với Ampicillin
(96,40%).
2.2.4.Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa là một trực khuẩn hình gậy, hai đầu tròn, đứng
riêng từng đơn vị hoặc từng đôi, từng chuỗi ngắn, thỉnh thoảng có hình sợi hoặc
hình dấu phẩy, di động, có 1-3 lông ở đầu, không hình thành nha bào, giáp mô,
Gram(-), không kháng cồn kháng toan (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Trong môi trường ít chất dinh dưỡng thì Pseudomonas aeruginosa vẫn có thể
sống được vì vậy người ta còn có thể tìm thấy chúng trong nước tinh khiết, nước
uống đóng chai (Botzenhart và Ruden, 1987).
Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh trên nhiều loài vật, hiện tượng viêm teo
mũi, thỉnh thoảng có viêm tử cung ở bò và được cho là gây sẩy thai trên bò và ngựa,
chứng chảy nước mũi tai ở chó, mèo, nhiễm trùng máu ở gà (Carter, 1978).
Nhiệt độ thích hợp là từ 30-370C, pH thích hợp 6,6-7,0.
Loài này có khả năng tăng trưởng trên môi trường nghèo dinh dưỡng (Trần
Linh Thước, 2006).
Trên môi trường thạch dinh dưỡng như TSA, NA khuẩn lạc hơi tròn, rìa
không phẳng, trong óng ánh. Đặc điểm nhận biết Pseudomonas aeruginosa là môi
trường xung quanh khuẩn lạc có màu xanh, có mùi trái cây (Carter, 1978).
Trong môi trường nuôi cấy và tự nhiên vi khuẩn sống rất lâu. Vi khuẩn bị
diệt sau 1 giờ ở nhiệt độ 55 0C (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Theo Bonfiglio (1998) Pseudomonas aeruginosa kháng một số kháng sinh

theo tỷ lệ như sau: meropenem 9,1%, ceftazidime 13,4%, carbenicillin 27,3%,
ticarcillin/clavulanic acid 22,8%, amikacin 10,6% và ciprofloxacin 31,9%.
7


Pseudomonas aeruginosa rất dễ đề kháng với nhiều loại kháng sinh, vì vậy
nó rất nguy hiểm. Loại vi khuẩn này có khả năng kháng thuốc tự nhiên do có hàng
rào ngăn cản tính thấm ở màng ngoài lipopolysaccharide (LPS). Đồng thời các
nghiên cứu còn cho thấy Pseudomonas còn mang các plasmid kháng kháng sinh và
các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng
tải nạp và chuyển nạp, tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới. Các kháng sinh
ưa nước vẫn đi qua được các kênh dẫn nước (porin), nhưng Pseudomonas
aeruginosa không có kênh dẫn nước có tính thấm cao, nên kháng thuốc đối với hầu
hết kháng sinh (Botzenhart và Ruden, 1987).
2.2.5.Vi khuẩn Salmonella spp
Salmonella spp. là một loại vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước
0,4 – 0,6 µ x 1 – 3 µ, không hình thành giáp mô và nha bào, phần lớn vi khuẩn
thuộc giống Salmonella spp. có thể di động, trên thân có lông (7 – 12 lông chung
quanh thân), trừ Salmonella pullorum và S. gallinarum không có lông, gram(-), dễ
nhuộm với các thứ thuốc nhuộm thông thường (aniline) (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977).
Salmonella gây bệnh đường ruột người, gia súc và gia cầm gọi là bệnh
thương hàn và phó thương hàn, gây ngộ độc thực phẩm cho người do vi khuẩn sản
sinh nội độc tố. Salmonela bình thường được phát hiện trong trong ruột: người, bò,
heo, gà, vịt,…và một số động vật khỏe khác, khi sức đề kháng cơ thể giảm vi khuẩn
xâm nhập và gây bệnh. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
Tùy theo độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể mà mức độ bệnh
khác nhau. Nếu vi khuẩn có độc lực yếu, sau khi xâm nhập vào cơ thể vi khuẩn
theo đường tiêu hóa gây viêm dạ dày ruột. Nếu vi khuẩn có độc lực cao, sau khi
vào đường tiêu hóa, vi khuẩn tiến đến các hạch lâm ba, gây viêm hạch rồi vào máu

gây nhiễm trùng huyết, lách sưng, gan hoại tử (Trần Thị Phận, 2004).
Hiện nay có khoảng 37.4 – 68.1% số chủng Salmonella kháng với
Chloramfenicol, 33.4 - 59.6% kháng với Tetrecycline, 74.6 – 89.2% kháng với
Stretomycine (Bùi Thị Tho, 2003).
Salmonella spp. có tỷ lệ kháng thuốc thấp hơn E. coli nhưng kháng cũng khá
cao với 6 loại kháng sinh: Tetracycline và Nalidixic acid (82,4%), Amoxicillin
(76,5%),
Sulfonamide
(64,7%),
Chloramphenicol
(58,8%)
và
Cotrimoxazole/Bactrim (52,9%). Salmonella spp. có tỷ lệ kháng thấp với
Cesfoxitine (5,9%), Gentamicin và Cephalothin (23,5%) (Nguyễn Thị Nguyệt,
2006).
Trực khuẩn Salmonella spp. bị nhiệt độ 60 oC tiêu diệt trong một giờ, 70 oC
trong 12 phút, 75oC trong 5 phút, có thể sinh trưởng trong môi trường thạch ở nhiệt
độ 10oC trong 115 ngày, Ánh sáng mặt trời chiết thẳng diệt vi khuẩn trong nước

8


trong 5 giờ, trong nước đục 9 giờ, Salmonella spp. có thể sống từ 4 – 8 tháng trong
nước thịt ướp muối có tỷ lệ muối là 29% ở nhiệt độ 6 – 12oC. xử lý bằng cách hơ
lửa hay nướng miếng thịt nhiễm trùng ít có tác dụng diệt Salmonella spp. ở bên
trong (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).
2.2.6.Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Aeromonas hydrophila thuộc nhóm Aeromonas di động, giống Aeromonas,
họ Aeeromonasaceae, bộ Aeromonasles, lớp Gammaproteobacteria, ngành
Proteobacteria (Bùi Quang Tề, 2004).

Aeromonas hydrophila là trực khuẩn hình que ngắn, hai đầu hơi tròn, đầu có
một tiên mao, không có nha bào, không có giáp mô, di động, Gram âm (Từ Thanh
Dung, 2005).
Aeromonas hydrophila thường gây bệnh trên cá nuôi lẫn cá trong tự nhiên ở
môi trường nước ngọt. Mặc dù, Aeromonas hydrophila được cho là nguyên nhân
gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng huyết trên cá nhưng một điều quan trọng là vi
khuẫn này vẫn tồn tại trong đường ruột cá khỏe mạnh (Trust và cộng tác viên, 1974).
Bệnh bùng phát do sự thay đổi điều kiện môi trường, mật độ nuôi quá cao, sự
thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột, chất lượng nguồn nước, nitrite và mức carbon
dioxide cao, ngoài ra còn tùy thuộc vào đặc điểm sinh lý của từng cá thể (Hulya,
2007).
Aeromonas hydrophila có khả năng sinh các độ tố như: độc tố đường ruột
(enterotoxins), dung huyết (hemolysins), phân giải protein (proteinase), độc tố gây
hoại tử da (dermonecrotic), đông máu (haemagglutinins), và nội độc tố (endotoxin)
(Cahill,1990).
Nhiệt độ nuôi cấy tốt nhất là 28-300C. Sinh trưởng tốt trong môi trường có
độ pH từ 7,1-7,2. Trên môi trường thạch, khuẩn lạc tròn, có rìa đều hơi lồi, nhẵn
bóng, màu vàng rất nhạt (Từ Thanh Dung, 2005).
Theo Bùi Quang Tề et al (2004) ở Việt Nam cá nuôi lồng, bè và ao hồ nước
ngọt đều có thể bị bệnh đốm đỏ do A. hydrophyla như: trắm cỏ, cá trôi, cá chép, cá
mè, cá basa, cá bống tượng, tôm càng xanh,…tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản
thường 30 – 700C, nhưng ở giai đoạn giống của cá trê, basa có thể là 100%.
Theo Tạ Thị Kim Chi (2008) 100% (n = 15) giống Aeromonas spp đều nhạy
cảm với cao Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) với MIC = 512 µg/ml.
Aeromonas hydrophila kháng với các kháng sinh như: amoxilin,
chloramphenicol, tetracycline là 90%, trimethoprim/sulfadiazine là 89%, ampicillin
76%, nitrofurantion 65%, norfloxacin là 33% ( departments
/dra/journal/inter/ds2/ 39. pdf)

9

2.2.7.Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm, thành viên của họ vi khuẩn đường
ruột Enterobacteriaceae. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển vào khoảng 25300C, khoảng nhiệt độ này trùng hợp với nhiệt độ của môi trường mà cá thường xảy
ra bệnh 22-280C (Francis- Floyd, 1987).
Edwardsiella ictaluri có dạng hình que mảnh, không sinh bào tử, gram âm, có
kích thước khoảng 0,75 x 2,5 µm, di động ở 26oC là nhờ lông rung (Plumb và
Vinitnantharat, 1989).
Từ Thanh Dung (2005) xác định nguyên nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá
tra nuôi thâm canh ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tác giả kết luận, nguyên
nhân chính gây ra bệnh là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri.
Bệnh gan thận mủ gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế đối với cá tra nuôi
thâm canh ở Việt Nam, khi cá mắc bệnh tỷ lệ chết có thể lên đến 90% (Từ Thanh
Dung, 2005).
E. ictaluri là vi khuẩn kỵ khí, catalase dương tính, Cytochrom Oxidase âm tính,
phản ứng oxy hóa âm và lên mên Glucose, phát triển ở nồng độ muối 1.5% và di
động ở nhiệt độ 250C, E. ictaluri là loại khó tính nhất trong giống Edwardsiella.
Phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy từ 36 – 48 giờ ở 25 – 30 0C mới xuất hiện
khuẩn lạc trên thạch BHI (Brain heart infusion Agar) và vi khuẩn phát triển chậm
hoặc không phát triển khi ủ ở 370C. Ed. ictaluri phát triển ở 260C trên MHA sau
48giờ (Từ Thanh Dung, 2005).
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 25-300C.
Booth (2006) đã nghiên cứu vai trò quan trọng của enzyme urease giúp vi
khuẩn tồn tại và phát triển trong môi trường có tính acid và giải thích tại sao trong
các phản ứng sinh hóa chuẩn của vi khuẩn lại cho kết quả kiểm tra urease âm tính.
Enzyme của vi khuẩn sẽ tạo ra một đám mây ammonia xung quanh tế bào giúp bảo
vệ vi khuẩn trong môi trường có tính acid.
Vi khuẩn không thể phát triển được ở môi trường dinh dưỡng có nồng độ muối
khoảng 2-3%. Đây là yếu tố thuận lợi cần được chú ý để khống chế bệnh ( Waltman

và cộng sự, 1985).
E. ictaluri có thể phân lập từ cá bệnh (gan, thận, tỳ tạng) trên môi trường TSA
(Tryptic Soy Agar) hoặc EMB (Eosine Methylene blue lactase Agar) sau 48 giờ ở
280C xuất hiện khuẩn lạc trắng đục.
E. ictaluri gây bệnh gan thận mũ trên cá như: cá tra, cá trê, basa, cá nheo
Mỹ,… bệnh thường xảy ra vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô (Bùi Quang Tề et
al, 2004)..
Theo Tạ Thị Kim Chi (2008) 100% (n = 15) giống Edwardsiella spp đều nhạy
với cao chiết thô Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) với MIC = 256 µg/ml.

10


2.2.8.Vi khuẩn Edwardsiella tarda
E. tarda một thành viên của họ Enterobacteriaceae, gram âm, sinh hơi, di
động (Từ Thanh Dung, 2005).
Edwardsiella thường thấy nhất Edwardsiella tarda gây viêm ruột dạ dày
dạng cấp tính, tiêu chảy dạng phân lỏng, kiết lỵ cũng thường xảy ra. Đối với những
bệnh nhân tổn thương hệ miễn dịch, người lớn tuổi, trẻ em thường bị nhiễm
Edwardsiella tarda. Nhiễm bệnh dạng bên ngoài đường tiêu hóa như nhiễm trùng
máu với tỷ lệ tử vong tương đương 50%. Ngoại lệ, Edwardsiella tarda cũng được
tìm thấy gây ra viêm màng não, viêm phúc mạc, viêm tủy và áp xe ở gan (Janda và
Abbott, 1993)
E. tarda phát triển 25 - 370C trên TSB và 250C trên TSA (Từ Thanh Dung,
2005).
Phát triển ở 370C trên MHA sau 18 giờ.
Quan sát mô bệnh học cho thấy các vết thương tổn được đặc trưng bởi sự
hoại tử, thường phát triển ở mô cơ, mô tạo máu và mô gan (Bùi Quang tề et al,
2004).
E. tarda phân lập được từ cá da trơn, động vật thủy sản, người, động vật lớn,

động vật hoang dã, động vật máu lạnh, chuột và chim.
E. tarda gây nhiễm khuẩn máu trên cá da trơn, gây áp xe gan thận, gây bệnh
trên tôm càng xanh. Ngoài ra, E. tarda nhiễm từ cá sang người như tiêu chảy, viêm
hệ thống niệu, viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm dạ dày ruột, áp xe vòi trứng,
áp xe vùng chậu (Từ Thanh Dung, 2005).
E. tarda kháng với benzylpenicillin, oxacillin, colistin, rifamycin,
lincomycin và polymyxin B (Ingo S. and Bernd W., 2001).

11


CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao lá Bàng, cao Từ Bi và cao cỏ Bạc
Đầu lá ngắn.
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các loại cao trên .
3.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
3.2.1. Thời gian và địa điểm
 Thời gian: từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2009.
 Địa điểm thực hiện đề tài:
Phòng thí nghiệm Dược Lý, phòng thí nghiệm Vi Sinh bộ môn Thú Y, khoa
Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Phòng thí nghiệm Sinh Hóa, bộ môn Sinh Hóa, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ.
Phòng thí nghiệm Chuyên Sâu, trường Đại học Cần Thơ.
3.2.2. Nguyên liệu
 Cây Bàng: bộ phận dùng là lá trưởng thành, thu hái vào buổi sáng, tại khu II
trường Đại Học Cần Thơ.
 Cây Từ Bi: bộ phận dùng là đọt non, thu hái vào buổi sáng tại phường An
Bình, TP Cần Thơ.

 Cỏ Bạc Đầu lá ngắn: bộ phận dùng là thân lá (nếu có hoa thì lấy cả hoa, bỏ
rễ), thu hái vào buổi sáng tại phường Hưng Lợi, TP Cần Thơ.
3.2.3. Thiết bị và hóa chất
3.2.3.1. Thiết bị
 Autoclave: tủ hấp khử trùng dụng cụ, hấp môi trường và hấp hủy đĩa.
 Classware Drying Oven: Tủ sấy dụng cụ thủy tinh.
 Incubator: tủ ấm.
 Máy cô quay chân không lạnh.
 Một số dụng cụ khác: cân điện tử, bình nón, phễu, đũa thủy tinh, đĩa Petri,
que cấy, ống nghiệm, chai nấu môi trường,…
3.2.3.2. Hóa chất
 Môi trường MHA (Mueller Hinton Aga) là môi trường thử tính kháng khuẩn
và tìm MIC.
 Dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxide) là chất dùng hòa tan cao.
 Methanol là hóa chất điều chế cao.
 Nước cất
 Nước muối sinh lý NaCl 9‰.

12


 Cồn 96 o và 70 o.
 H2SO41%, BaCl2.2H2O.
3.2.4. Vi khuẩn
Nguồn vi khuẩn: viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh.
 Staphylococcus aureus 081008
 Streptococcus faecalis 010408


Escherichia coli 101008






Pseudonomas aeruginosa 1110008
Salmonella spp. 291003
Aeromonas hydrophilla 011004
Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda 280208

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Điều chế cao
3.3.1.1. Thu mẫu
Mẫu được lấy vào buổi sáng thời gian từ 8 – 10 giờ.
 Bàng: hái lá trưởng thành, đem cân, rửa sạch, để ráo nước trong mát.
 Từ Bi: hái đọt non, đem cân, rửa sạch, để ráo nước trong mát.
 Cỏ Bạc Đầu lá ngắn: hái thân lá, đem cân, rửa sạch, để ráo nước trong
mát.
3.3.1.2. Cách chiết xuất
Mỗi dược liệu được tiến hành theo quy trình chung và theo những bước sau:
(Huỳnh Kim Diệu, 2008).
Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ là 50oC đến khi khô giòn.
- Xay nhỏ và ngâm trong methanol 3 ngày chiết lấy dịch chiết, tiếp tục
ngâm và chiết với methanol 2 ngày nữa mỗi ngày chiết 1 lần (24 giờ/lần).
- Loại bỏ dung môi trong dịch chiết bằng máy cô quay và lấy phần cô đặc,
phần này được gọi là cao thô.
3.3.1.3. Tính ẩm độ của cao
Cao được xác định ẩm độ theo phương pháp sau:
Chén dùng để đựng mẫu được sấy ở 105 oC cho đến khi cân 3 lần mà trọng

lượng chén không đổi (sai số cho phép 3‰). Ta được trọng lượng chén .
Cân khoảng 1g mẫu vào chén và sấy ở 105oC đến khi cân 3 lần trọng lượng
chén (có chứa mẫu) không đổi. Ta được trọng lượng chén (có mẫu) sau sấy. (Lưu
Hữu Mãnh và Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 1997)

13


Ẩm độ được tính theo công thức:

H = 100% -

Với DM =

DM

msau sấy - mchén
mmẫu

x 100%

H: ẩm độ của cao (%)
DM: vật chất khô của mẫu (%)
msau sấy: trọng lượng mẫu và chén sau sấy (g)
mchén: trọng lượng chén (g)
mmẫu: trọng lượng mẫu trước sấy (g)

3.3.1.4. Tính hiệu suất
Cao được tính hiệu suất dựa vào khối lượng cao thu được và khối lượng mẫu
tươi ban đầu :

HS =

mcao
mmẫu tươi

x 100%

HS: hiệu suất (%)
mcao: trọng lượng cao sau cô quay (g)
mmẫu tươi: trọng lượng mẫu tươi (g)

3.3.2. Thử hoạt tính kháng khuẩn
3.3.2.1. Chuẩn độ đục
Sử dụng thang độ đục Mac Facland 0,5 được pha chế như sau: thêm 0,5 ml
BaCl2 0,048 M (BaCl2.2H2O 1,175 % kl.tt) vào 99,5 ml H2SO4 0,18 M (1% tt/tt)
đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền dịch.
Điều chỉnh độ đục của huyền dịch sao cho mật độ quang khi đo ở bước sóng
625 nm với ống đo 1 cm nằm trong khoảng 0,08 – 0,1.
Phân phối thành các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn độ vi sinh vật, mỗi
ống 4 – 6 ml huyền dịch, đậy nút chặt.
Huyền dịch được bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng, trước khi sử dụng phải
lắc mạnh để huyền dịch phân tán đều trở lại. Nếu thấy lợn cợn phải loại bỏ. Hàng
tháng phải kiểm tra lại độ hấp thu.

14


3.3.2.2. Chuẩn độ vi khuẩn
Vi khuẩn được nuôi trong môi trường NA ủ 37oC trong 24 giờ đối với nhóm vi
khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Pseudonomas aeruginosa,

Escherichia coli, Salmonella spp. và Aeromonas hydrophilla, ở 28 – 30 oC trong
24 – 48 giờ đối với nhóm vi khuẩn Edwardsiella tarda và Edwardsiella ictaluri .
Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa dung dịch
NaCl 9‰. Điều chỉnh độ đục cho bằng với Mac Facland 0,5. Với phương pháp làm
kháng sinh đồ và xác định MIC bằng cách pha loãng trong thạch, huyền dịch vi
khuẩn trên được pha loãng 100 lần để có mật độ vi khuẩn khoảng 106 CFU/ml
(Nguyễn Thanh Bảo, 2005).
3.3.2.3. Thử hoạt tính kháng khuẩn
Theo phương pháp khuếch tán trên thạch (Nguyễn Hữu Bảy và ctv, 1986).
Giấy lọc được bấm thành những mảnh nhỏ hình tròn đường kính 5mm sau đó
đem hấp khử trùng.
Cân 500mg mẫu cao hòa tan vào 1 ml DMSO đã tiệt trùng, ta được dung dịch
gốc với nồng độ 500 mg/ml.
Giấy đã hấp khử trùng được cho vào đĩa đồng hồ sau đó dùng Micropipet hút
1µl cho vào đĩa đồng hồ sao cho thấm đều tờ giấy và sấy trong ở nhiệt độ dưới 50 oC
khô rồi tiếp tục rút 1µl cho vào và sấy khô và lặp lại 10 lần. Ước tính trong mỗi tờ
giấy có khoảng 5000 µg cao.
Đồng thời tẩm đĩa giấy đối chứng bằng dung môi DMSO.
Môi trường MHA đem nấu, để nguội đến 48 – 50oC, lắc đều và đổ vào đĩa, lúc
đỗ đĩa phải thực hiện trong buồng cấy và phải đổ thật nhanh đễ tránh nhiễm khuẩn,
để 15 phút cho thạch đặc lại, cho vào tủ sấy để sấy khô mặt thạch sau đó dùng tâm
bông vô trùng quét vi khuẩn đều lên thạch.
Đặt những đĩa giấy đã tẩm thuốc thử lên mặt thạch đã quét vi khuẩn, mỗi đĩa đặt
3 mẫu giấy của 3 loại cao và một mẫu giấy đối chứng đã tẩm DMSO.
Để những đĩa này vào tủ lạnh ở 4oC trong 6 giờ.
Sau đó đem để vào tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ, riêng đối với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda đem ủ ở 28 – 30 oC từ 24 – 48 giờ.
3.3.3. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: minimum inhibitory
concentration)
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng theo phương pháp pha loãng liên tiếp

trong thạch (Nguyễn Thanh Bảo, 2005).
3.3.3.1. Chuẩn bị nồng độ chất thử
Cân 800mg cao hòa tan vào 10ml DMSO, ta thu được dung dịch gốc. Từ dung
dịch gốc ta pha thành một dãy nồng độ để thử nghiệm, nồng độ sau bằng 1/2 nồng
độ trước: 4096 µg/ml, 2048 µg/ml, … 64 µg/ml.
15


Môi trường MHA được nấu và để nguội đến 48 – 50oC, cho cao vào (lượng cao
được xác định tương ứng với nồng độ thử nghiệm) và lắc để bảo đảm dung môi và
cao được trộn đều, sau đó đổ vào đĩa Petri và cho thạch đông lại.
Song song đó, ta tiến hành đĩa đối chứng chỉ có dung môi pha loãng DMSO
(không chứa mẫu cao).
3.3.3.2. Tiến hành cấy vi khuẩn
Dùng micropipette cấy 1µl huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn độ lên bề mặt môi
trường thạch có chất thử nghiệm.
Bắt đầu cấy từ nồng độ thấp nhất. Mỗi chủng vi khuẩn được cấy thành một
chấm (thí nghiệm được tiến hành trên 8 chủng vi khuẩn). Khi thay đổi chủng vi
khuẩn đầu cấy được thay bằng đầu khác. Do hai chủng Edwardsiella tarda và
Edwardsiella ictaluri được ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC và sau 24 - 48 giờ mới đọc kết
quả nên hai chủng này được cấy trên một đĩa và 6 chủng còn lại cấy trên một đĩa
cho mỗi nồng độ và được ủ ở 37oC, đọc kết quả sau 24 giờ.
Bên cạnh đó, ta cũng tiến hành đĩa đối chứng chỉ chứa dung môi pha loãng
DMSO được pha ở nồng độ cao nhất, tương đương với nồng độ 4096 µg/ml khi có
chất thử nghiệm.
Để yên 15 phút cho vết chấm vi khuẩn khô, lật ngược đĩa thạch và ủ ở 37 oC
trong 24 giờ và 24 - 48 giờ đối với Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri ở
nhiệt độ 28 - 30 oC.
Cách tiến hành giống nhau cho 3 loại cao và giống nhau cho cả những nồng độ
khác nhau.

3.3.3.3. Tính MIC quy ra trạng thái khô hoàn toàn
Từ ẩm độ có được, ta quy ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ở trạng thái khô
hoàn toàn theo công thức:
MIC100%DM = DM x MIC
MIC100%DM: nồng độ ức chế tối thiểu ở trạng thái khô hoàn toàn (µg/ml)
MIC: nồng độ ức chế tối thiểu dùng trong thử nghiệm (µg/ml)
DM: vật chất khô của cao (%)

3.3.4. Chỉ tiêu theo dõi
- Hiệu suất điều chế cao
- Ẩm độ của cao
- Thử hoạt tính kháng khuẩn: đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô
khuẩn xung quanh các đĩa giấy.
- Xác định nồng độ ức chế tối thiểu: đọc kết quả dựa vào sự phát triển của
khuẩn lạc. Ở nồng độ thấp nhất mà không có sự phát triển của khuẩn lạc trên đĩa
thạch thì được xác định là nồng độ ức chế tối thiểu.

16


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.HIỆU SUẤT ĐIỀU CHẾ CAO THÔ
Được thể hiện qua bảng 1.
Bảng 1: Hiệu suất điều chế cao thô

Trọng Lượng tươi (g) Trọng Lượng Chiết (g)

Hiệu Suất (%)

Tên mẫu

Cây Bàng

560

9,621

1,72

Cây Từ Bi

500

7,677

1.54

Bạc Đầu Lá Ngắn

600

7,135

1,19

Nhận xét:
- Trong 3 loại cao, hiệu suất của cao lá Bàng là cao nhất (1,72%), cao cỏ bạc đầu
lá ngắn thì thấp nhất (1,19%).
- Mẫu nào có hiệu suất càng lớn thì cao thu được sẽ càng nhiều .
4.2.ẨM ĐỘ CAO THÔ
Được thể hiện qua bảng 2.

Bảng 2:Kết quả ẩm độ của 3 loại cao thô

Tên mẫu

Trọng Lượng trước Trọng Lượng sau
sấy(g)
sấy(g)

H
(%)

DM
(%)

Cây Bàng

1,022

0,895

12,43

87,57

Cây Từ Bi

1,035

0,918

11,30

88,70

Bạc Đầu Lá Ngắn

1,053

0,926

12,06

87,94

Chú thích: D: ẩm độ của cao thô;
DM: vật chất khô của cao thô.

Nhận xét: Qua bảng 2 ta thấy, cao lá Bàng có ẩm độ cao nhất (12,43%), cao đọt
Từ Bi có ẩm độ thấp nhất (11,30%). Ẩm độ của cao sẽ ảnh hưởng đến giá trị của
MIC.

4.3.KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH KHÁNG KHUẨN:
17