Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy(Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI & TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------

ĐỖ THỊ THỤC
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ
(EcHB1)VÀO BACHJ ĐÀN LAI PHỤC VỤ CÔNG NGHIỆP CHẾ
BIẾN GIẤY
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2014

MỞ ĐẦU
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
1




Các loài Bạch đàn được nhập vào Việt Nam từ những năm 1930 và đến nay đã trở
thành nhóm cây trồng chủ lực trong các chương trình trồng rừng tập trung và phân tán ở
nước ta. Đến năm 2011, tổng diện tích rừng trồng Bạch đàn ở Việt Nam là 353,000 ha,
chiếm 32% diện tích rừng trồng cả nước (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2011).
Bạch đàn là loài cây sinh trưởng nhanh, thích nghi tốt. Tại Việt Nam, Bạch đàn
được trồng tại các tỉnh thuộc vùng Tây Bắc, Đông Bắc, vùng trung tâm, đồng bằng sông
Hồng, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Gỗ Bạch đàn được dùng làm nguyên liệu giấy
(hiệu suất bột giấy 49.5%), ván dăm, ván sợi ép, trụ mỏ, gỗ lớn được dùng trong xây

dựng, đóng đồ mộc; gỗ nhỏ dùng làm gỗ củi. Tỷ trọng gỗ ở năm 6 tuổi là 488 kg m3 (Luo
Jianzhong , 2003), chiều dài sợi gỗ là 982,4 mm (cho phần gỗ mềm) và 110,46 mm (cho
phần gỗ cứng) (Bai Jyayu và cs , 2003) [15].
Gỗ Bạch đàn được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu chính cho ngành công nghiệp
sản xuất giấy vì gỗ Bạch đàn có thành phần hóa học và cấu tạo sợi rất thích hợp cho sản
xuất bột giấy. Mỗi năm trên thế giới có hàng triệu tấn bột giấy được sản xuất từ gỗ Bạch
đàn. Bên cạch đó, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng làm đồ mộc, sản phẩm thủ công mỹ
nghệ, sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, gỗ xây dựng, cột chống,… Ngoài ra, lá của một
số loài Bạch đàn còn được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm.
Bạch đàn lai được đánh giá có ưu thế lai và sinh trưởng tốt hơn bố mẹ của chúng
(Lê Đình Khả và cs, 1993) [6]. Cho đến nay, nhiều tổ hợp Bạch đàn lai có sinh trưởng
vượt trội hơn bố mẹ đã được công nhận giống tiến bộ khoa học kỹ thuật và được khuyến
khích gây trồng rộng rãi.
Dân số thế giới đã đạt đến con số kỷ lục 7 tỷ người và nó được dự đoán sẽ tăng lên
8 tỷ người vào năm 2025 và 10 tỷ người vào những năm 2050. Do vậy vấn đề cung cấp
lương thực cũng như các nguyên vật liệu khác cho nhu cầu sinh hoạt của con người trong
những thập niên tới là một thách thức rất lớn đối với toàn nhân loại. Các phương pháp
chọn giống truyền thống sẽ khó có thể đáp ứng nhu cầu cung cấp thực phẩm cho con
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
2




người trong tương lai. Để đáp ứng được nhu cầu đó, trong những thập kỷ vừa qua, công
nghệ sinh học đã đem lại những thành quả to lớn, đặc biệt là công nghệ biến đổi gen đã
đem lại một bước nhảy vọt không những trong việc tăng năng suất và chất lượng cây
trồng như tạo giống năng suất cao, chống bệnh sâu hại, chống chịu khí hậu lạnh, khô hạn
và thiếu nguồn dinh dưỡng, kháng thuốc trừ cỏ…mà còn cải thiện được môi trường như
giảm hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật, giảm lượng phân bón….

Trong lĩnh vực Lâm nghiệp, cây biến đổi gen cũng đã được quan tâm nghiên cứu.
Trong những năm gần đây một số kết quả nghiên cứu chuyển gen cho một số loài cây
rừng như Bạch dương, Thông radiata, Liễu và Bạch đàn đã được tiến hành và thử nghiệm
thành công ở một số nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Brasil, Chi Lê và Trung Quốc. Mục
đích chính cho nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ở đây là chuyển một số gen liên
quan đến tăng sinh khối, chống chịu sâu bệnh và điều kiện khô hạn, giảm hàm lượng
lignin, tăng hàm lượng và độ dài sợi cellulose, mang lại lợi ích to lớn cho ngành công
nghiệp giấy cũng như cải tạo môi trường tại những vùng đất suy thoái thiếu chất dinh
dưỡng…
Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rộng rãi hơn
cả, vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng lại mang lại hiệu quả cao (lượng
bản sao gen biến nạp ít tạo thuận lợi cho việc phân tích cây chuyển gen và không gây tổn
thương tế bào). Hầu hết các nghiên cứu chuyển gen vào cây lâm nghiệp đã công bố đều
sử dụng vector trung gian là vi khuẩn A. tumefaciens (Chen và cs, 2001; Han và cs, 2000;
Vengadesan và cs, 2006;…) [17].
Ở cây rừng, một số tính trạng có giá trị kinh tế như tính chất gỗ (hàm lượng
cellulose, hàm lượng lignin, chiều dài sợi gỗ ...) và khả năng ra rễ... do nhiều gen
(polygene) quy định. Những gen này tùy từng giai đoạn phát triển của cây mà có ảnh
hưởng nhất định, tuy nhiên, trong đó có những gen chính (major genes) có ảnh hưởng lớn
đến biểu hiện tính trạng của cây.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
3




Đối với tính trạng chiều dài sợi gỗ, các nhà khoa học đã xác định được một số gen
chính có ảnh hưởng đến tính trạng này, trong đó có gen EcHB1 (accession number:
AB458829). Gen EcHB1 được xác định là mã hóa cho nhân tố phiên mã HD-Zip class II
ở Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) và thường biểu hiện ở thân trưởng thành và tế bào

rễ. Các nghiên cứu cho thấy gen EcHB1 sau khi biến nạp vào cây Thuốc lá đã cho chiều
dài sợi gỗ dài hơn 1,2 lần so với đối chứng.
Xuất phát từ cơ sở trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu chuyển gen tăng chiều dài
sợi gỗ (EcHB1) vào Bạch đàn lai phục vụ công nghiệp chế biến giấy”

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
4




CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀ I LIỆU
1.1. Tổng quan về Bạch đàn nói chung và Bạch đàn lai nói riêng
Bạch đàn (Ecucalyptus) là một chi thực vật thuộc họ Sim (Myrtaceae), bộ Sim
(Myrtaces), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Hai lá mầm (Dycotyledone). Tên Bạch
đàn Ecucalyptus lần đầu tiên được nhà thực vật học người Pháp Charles Louis L’Heritier
de Brutell đặt cho vào năm 1788. Từ đó đến nay đã có tới 600 loài và biến chủng đã
được mô tả và đặt tên, gần đây 500 loài đã được chấp nhận chính thức. Theo Boland và
cs (1987), Eldridge và cs (1993) chi Bạch đàn được chia làm 8 chi phụ. Trong đó, chi phụ
Symphyomyrtus có nhiều loài được sử dụng và trồng rừng đại trà như: E. camaldulensis,
E. urophylla, E. tereticornis, E. grandis… Bạch đàn có xuất xứ từ Australia và chỉ có 2
loài phân bố ngoài Australia là loài E. deglupta Blume và E. urophylla S.T. Blake.
Bạch đàn bao gồm nhiều loài khác nhau và là cây trồng rừng phổ biến trên thế giới.
Ước tính có trên 10 triệu ha Bạch đàn được trồng ở châu Á, Nam Mỹ, Nam Âu, Úc và
New Zealand. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophyllaST. Blake) và Bạch đàn grandis (E.
grandis) thuộc chi phụ Symphyomyrtus, họ Sim (Myrtaceae), là những loài cây gỗ lớn,
mọc nhanh, được trồng nhiều tại các nước nhiệt đới có nhiệt độ trung bình từ 24 – 280C.
Bạch đàn là cây thân gỗ lâu năm, mọc nhanh, cây trồng 5-6 năm tuổi thường có
chiều cao trên 7m và đường kính thân khoảng 9- 10cm. Cây Bạch đàn có cơ chế tự bảo

vệ nhờ một cơ quan dưới mặt đất gọi là “củ gỗ” và cơ chế phát triển nhanh nhờ chồi bất
định và búp phụ, do đó cây có khẳ năng thích nghi cao với nhiều loại lập địa và khí hậu
lại cho năng suất tương đối cao (18-20m3/ha/năm).
Trên thế giới Bạch đàn là cây trồng rừng sản xuất chính với diện tích ngày càng
được mở rộng. Theo số liệu công bố năm 2009, rừng trồng Bạch đàn năm 2009 đã đạt
khoảng 19,5 triệu ha tại 3 châu lục lớn là Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á-Thái Bình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
5




Dương, Ấn Độ là nước có diện tích rừng trồng Bạch đàn lớn nhất thế giới, năm 2009 ước
tính có khoảng 3,9 triệu ha (Nguồn www.git-forestry.com).
Ở Việt Nam, cây Bạch đàn được người Pháp đưa vào gây trồng từ trước năm 1945,
song việc gây trồng Bạch đàn trên quy mô lớn mới chỉ được bắt đầu từ năm 1960 (Bùi
Thị Huế). Trong một thời gian ngắn, cây Bạch đàn đã phát triển mạnh mẽ và trở thành
một trong số các loài cây lâm nghiệp trồng rừng quan trọng của nước ta hiện nay.
Bạch đàn là nhóm cây được trồng rộng rãi ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh miền
Trung và miền Nam. Đây cũng là cây trồng chủ yếu trên các đường nông thôn, các bờ
vùng, bờ thửa ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu và
gây trồng nhiều năm qua cho thấy nhiều loài Bạch đàn được nhập vào nước ta chỉ một số
loài sinh trưởng nhanh và có khả năng thích ứng lớn. Trong đó, đáng chú ý là các loài
Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch đàn tere (E. tereticornis) và Bạch đàn trắng (E.
camaldulensis), Bạch đàn liễu (E. exserta). Ở những nơi thấp Bạch đàn urô (E.
urophylla) có thể mọc lẫn với Bạch đàn trắng (E. alba) (Martin and Cossalater, 1975 1976). Bạch đàn urô là cây thích hợp với các lập địa có vùng đất sâu ẩm ở các tỉnh miền
Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng trung tâm
miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Lê Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một
trong những xuất xứ có triển vọng nhất ở Mang Linh và Hang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê
Đình Khả, 1996; Phạm Văn Tuấn và cs, 2000) [7][14].

Bạch đàn urô là một trong những loài Bạch đàn chính được trồng chủ yếu ở Việt
Nam (Nguyễn Đức Kiên, 2009). Tác giả đã chỉ ra rằng các tính trạng sinh trưởng và chất
lượng gỗ ảnh hưởng lớn đến hiệu xuất bột giấy cho ngành công nghiệp. Các nghiên cứu
đánh giá về sinh trưởng của Bạch đàn urô tại Việt Nam cũng cho thấy tỷ lệ sinh trưởng
của Bạch đàn tại Việt Nam chậm hơn so với các nước khác như Trung Quốc, Braxin
(Santos, 1990; Wei và Borralho, 1998a; Nguyễn Đức Kiên, 2009). Vì vậy, các chương
trình chọn giống Bạch đàn ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào tăng sinh trưởng, tuy nhiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
6




ở các vùng sinh thái suy thoái, nghèo chất dinh dưỡng, tỷ lệ sinh trưởng của Bạch đàn
vẫn tồn tại ở dạng sinh trưởng chậm so với nhiều nước khác. Do vậy, các định hướng
nghiên cứu làm tăng hiệu suất bột giấy và tăng khả năng sinh trưởng của cây Bạch đàn tại
các vùng sinh thái suy thoái và nghèo chất dinh dưỡng tại Việt Nam đã và đang được
quan tâm nghiên cứu.
Bạch đàn lai được đánh giá có ưu thế lai và sinh trưởng tốt hơn bố mẹ của chúng
(Lê Đình Khả và cs, 1993) [6]. Một số giống Bạch đàn lai có năng suất cao đã được chọn
và gây trồng rất thành công ở một số nước như Brasil và Công Gô. Tại đây, trên những
lập địa tốt và áp dụng kỹ thuật trồng thâm canh có thể đạt năng suất 40 - 80m3/ha/năm.
Trung Quốc và Philippin cũng tạo được một số giống Bạch đàn lai có năng suất cao và
đang được trồng làm nguyên liệu giấy.
1.2.Tình hình trồng và sinh trưởng Bạch đàn lai ở Việt Nam
Bạch đàn là một trong những nhóm cây đang được gây trồng rộng rãi ở nước ta.
Hiện nay Bạch đàn được coi là cây nguyên liệu giấy chủ yếu ở vùng trung tâm miền Bắc.
Các nghiên cứu trong nước về lai giống và sử dụng giống lai đang là hướng đi được
nhiều nhà chọn giống quan tâm. Nghiên cứu về giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn trắng
(E. camaldulensis) với Bạch đàn đỏ (E. robusta) cho thấy giống lai có năng suất cao hơn

rất nhiều so với giống bố mẹ (Lê Đình Khả, 1970) [5]. Từ năm 1994, những nghiên cứu
về lai nhân tạo cho một số loài Bạch đàn đã được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu
Giống cây rừng và đã tạo được hàng chục tổ hợp lai thuận nghịch trong loài và khác loài
ở 3 loài Bạch đàn chính của nước ta là Bạch đàn urô (E. urophylla), Bạch đàn trắng (E.
camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E. exserta). Qua khảo nghiệm đã chọn được 31 cây trội
trong 8 tổ hợp lai Bạch đàn có năng suất cao hơn giống sản xuất tốt nhất trên 30%.
Những giống này đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống
tiến bộ kỹ thuật và cho phép triển khai khảo nghiệm trên các vùng sinh thái khác nhau.
Nghiên cứu lai giống Bạch đàn cũng cho thấy một số tổ hợp lai có hiệu suất bột giấy cao
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
7




hơn, trong lúc độ bền của giấy tương đương với các loài bố mẹ (Lê Đình Khả và Nguyễn
Việt Cường, 2001) [4].
Ở Việt Nam từ các năm 1996 – 2000, Trung tâm Nghiên cứu giống cây rừng thuộc
Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã tạo được gần 80 tổ hợp lai trong loài và lai khác
loài giữa các loài Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla), Bạch đàn trắng (E.
camaldulensis) và Bạch đàn liễu (E.exserta).
Giai đoạn 2001-2010 nghiên cứu lai giống cho các loài bạch đàn đã tạo được trên
100 tổ hợp lai đôi, ba cho các loài cho 7 loài bạch đàn là Bạch đàn urô, Bạch đàn tere
(E.tereticornis), Bạch đàn trắng (E. camaldulensis) , Bạch đàn grandis (E. grandis), Bạch
đàn saligna (E. saligna), Bạch đàn microcorys (E.microcorys), Bạch đàn pellita
(E.pellita). Sau 2 năm tại đất đồi trọc nghèo dinh dưỡng ở Cẩm Quỳ- Ba Vì- Hà Nội,
năng suất của các tổ hợp lai P18U29 đạt 17,3dm3/cây vượt mẹ (P18) là 316%, vượt bố
của chúng (U29) là 363% về thể tích, còn vượt giống lai đối chứng nhập từ Brasin GU8
là 160%. Tổ hợp lai U29S6 có thể tích thân cây đạt 16,62dm3/cây vượt thể tích của mẹ
(U29) là 349% và vượt giống lai đối chứng GU8 là 153%. Tại hiện trường Minh ĐứcBình Phước sau 2 năm tổ hợp lai T1P17, C18P17, P18U29C3, P18U29 và C9G15 đạt thể

tích thân cây tương ứng là 26,1; 26,1; 22,8; 21,8 và 21 dm3/cây vượt giống đối chứng
PN14 tương ứng là 383%, 384%, 335%, 321% và 309% về thể tích (Nguyễn Việt Cường.
2006) [13].
Qua khảo nghiệm cũng đã chọn được 30 dòng bạch đàn lai có sinh trưởng nhanh
hơn các giống đối chứng PN2, PN14, U6 và GU8 ở hầu hết các điểm khảo nghiệm và có
thể tích thân cây vượt hơn giống đối chứng từ 110% đến 300% ở năm thứ 3. Một nghiên
cứu khảo nghiệm giống Bạch đàn lai tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy trong các dòng
lai được chọn lọc có một số dòng sinh trưởng vượt trội so với dòng kiểm chứng U6,
GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc biệt là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
8




dòng lai UE24, UE83, UE5. Những dòng này có chỉ số thể tích bằng 70,4-73,9; trong khi
đó dòng GU8 có chỉ số thể tích là 50,3.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
9




Trong một vài năm gần đây công ty trồng rừng Innov Green Quảng Ninh đã tiến
hành trồng rừng các giống Bạch đàn lai nhập từ Trung Quốc (giống lai giữa Bạch đàn urô
x grandis, Bạch đàn urô x tere, với tên gọi là Bạch đàn cự vĩ và vĩ hệ) với diện tích vài
trăm ha ở Quảng Ninh. Bạch đàn lai này có sinh trưởng nhanh hơn Bạch đàn U6 (Bảng
1.1)

Bảng 1.1. Sinh trưởng dòng Bạch đàn lai cự vĩ và vĩ hệ ở Quảng Ninh (2007-2009)
Kí hiệu

IG01

IG02

IG03

IG04

U6

Tên KH

UxG

GxU

UxG

UxT

Uro

(BĐ cự vĩ)

(BĐ cự vĩ)

(BĐ cự vĩ)

(BĐ vĩ hệ)

Nơi trồng

Xã Quảng

Xã Quảng

Xã Quảng

Xã Quảng

Xã Quảng

( 2007 và

Sơn Huyện

Sơn Huyện

Sơn Huyện

Sơn Huyện

Sơn Huyện

2008)

Hải Hà- QN

Hải Hà- QN

Hải Hà- QN

Hải Hà- QN

Hải Hà- QN

D.tích (ha)

246

1,2

1,7

1

3,6

Mật độ

1500

1500

1500

1500

1500

D13 (m)

10,4

9,3

7,9

9,8

7,7

Hvn (m)

12,5

12,1

9,0

12,8

7,6

(Nguồn: Innov Green Quảng Ninh) [12].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

10




1.3. Kỹ thuật chuyển gen thực vật
1.3.1 Khái niệm chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng
DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi
sinh vật, động vật,..) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào
bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc
trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen (Nguyễn Quang
Thạch và cs, 2005) [10].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳ ng đinh
̣ tn
́ h khách
quan tự nhiên của vâ ̣t chấ t di truyề n: khả năng mã hóa cho các t n
̣ khả
́ h tra ̣ng nhấ t đinh,
năng phiên ma,̃ dich
̣ mã và khả năng di truyề n. Thông qua chuyể n gen, cách nhà sinh lý,
hóa sinh và di truyề n có thể nghiên cứu các quá tr n
̀ h điề u khiể n, thể hiê ̣n và ảnh hưởng
của các yế u tố di truyề n và ngoa ̣i cảnh lên hoa ̣t đô ̣ng của gen.
Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại thành hai
nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển
gen trực tiếp.
Phương pháp chuyển gen trực tiếp
- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm
- Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn
- Chuyển gen nhờ súng bắn gen
- Chuyển gen nhờ silicon carbide
Phương pháp chuyển gen gián tiếp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
11




- Chuyển gen nhờ virus
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 1970. Việc phát kiến ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển
gen vào thực vật vào đầu những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những
công cụ quan trọng nhất của Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu điểm
nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2
gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn). Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu
hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững hiệu quả chuyển gen cao;
tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện;
không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
Phương pháp này đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp
chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trông có nhiều bản sao của một gen
dẫn tới sự "nhiễu gen" và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp,
kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí
trên cây...
Đặc biệt là khi nhược điểm của A. tumefaciens chỉ chuyển gen trên cây Hai lá mầm
được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và được ứng
dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ngày càng
gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được ưu tiên lựa

chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới.
* Đặc điểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens
Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở
cây khi xâm nhiễm qua vết thương.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
12




A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ
máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A.
tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những
nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi đó các tế bào khối u ở thực vật có
gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình
thành một số vật chất như: nopaline, octopine gọi chung là opine. Các chất này không hề
có trước đó và không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn đã truyền vào
cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhận này có bản chất là vật chất
di truyền.

Hình 1.1. Sơ đồ Ti-Plasmit
(Nguồn: )

Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti-plasmit có
trong vi khuẩn A.tumerfaciens.
Đây là một plasmit được cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép, vòng tròn lớn có
kích thước 200kb, có khả năng tái bản độc lập với sự tái bản của DNA nhiễm sắc thể của
vi khuẩn.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
13




Trên Ti-plasmit có đoạn T-DNA được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ
trái (left border) có trình tự nucleotit tương tự nhau. T-DNA là đoạn nucleotit có kích
thước 25kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), mã hóa cho một
enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ 2 liên
quan tới tổng hợp opine. Đoạn này được gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì đây là đoạn sẽ
được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể và gây ra bệnh u. Trên Tiplasmit còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp
và tiêu hóa opine (Hình 1.1).
Khi cây bị nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt đầu hoạt
động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các
tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một
loại thức ăn, nhờ gen chuyển hóa opine trên Ti-plasmit.
* Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất độc vết thương có bản chất phenol:
Cetosyringone và Hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào
vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng Vir là E, D, C, G, B, A, F và
tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt đứt bờ phải và
bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực
vật và tiếp cận với genom cây chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A.tumefaciens sang tế bào cây chủ được thực
hiện bởi hoạt động của các gen vir A, B, C, D, E, G, F (hình 1.4). Các gen này có vai trò
quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua tín hiệu hóa học
Acetosyringone (AS). Tín hiệu hóa học được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ
tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết
thương trên cây. Protein vir A tự photphoryl hóa đồng thời làm cho protein vir G được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
14




photphoryl hóa (Jin và cs., 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H
(Ziemienowcz, 2001).

Hình 1.2. Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật
Tiếp đó các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng
sợi T-DNA, protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5' của bờ phải và 3' của bờ trái và giải phóng
sợi T-DNA, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây
(Deng và cs,. 1998). Đồng thời thực hiện chức năng này có các protein vir C1, vir C2 có
tác dụng tăng cường việc giải phóng T-DNA.
Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Vir B có chức năng tạo
kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
15




protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển TDNA (Zhu và cs, 2000).
Như vậy thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng
tồn tại trong tự nhiên.
1.3.2. Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen
Đến nay trên thế giới, phương pháp chuyển gen vào Bạch đàn phổ biến nhất được
sử dụng là chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (Chirqui và cs, 1992;
Spokevicius và cs, 2005; Mullins và cs, 1997; Machado và cs, 1997; Spokevicius, 2005)..

Các phương pháp khác có được thử nghiệm nhưng rất hạn chế: Chuyển qua xung điện
(Teuliers và cs, 1991; Manders và cs, 1992), súng bắn gen (Serrano và cs,1996; Sartoretto
và cs, 2002), siêu âm (Tournier và cs, 2003) [45].
Đối với Bạch đàn, một số gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin,
cellulose, tính chất gỗ cũng đã được xác định cho các loài Bạch đàn E.globulus (Poke và
cs, 2003) [36]; E. gunnii (Lauvergeat và cs, 2002); E. camaldulensis (Ho và cs, 2002)
[26]; E. grandis (Ranik và Myburg, 2006). Các gen liên quan đến tăng khả năng hấp thụ
lân cũng đã được phân lập từ Bạch đàn trắng (E. camaldulensis), trong số 5 gen được
phân lập thì chỉ có 2 gen có khả năng làm tăng độ hấp thụ lân trên cả điều kiện nghèo và
giàu lân (Koyama và cs, 2006). Các gen mã hóa cho quá trình tổng hợp cellulose
(cellulose synthase CesA gene) đã được phân lập và nghiên cứu (Myburg và cs, 2008).
Bảy gen mã hóa sinh tổng hợp cellulose đã được phân lập từ Bạch đàn grandis các gen
này được cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất cellulose về chất lượng
cũng như độ dài sợi gỗ.
Chuyển gen Bạch đàn đã được thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài Bạch
đàn như E. gunnii, E. globus, E. camaldulensis, E. nitens vv. (Girijashankar, 2011) và
chủ yếu tập trung cho các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
16




lượng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh,
nhiễm mặn…) và sâu bệnh hại.
Một số công trình nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng Bạch đàn urô và các
loài lai của nó đã được công bố trên thế giới. Năm 2002, Shao và cs đã công bố kết quả
chuyển gen trên đối tượng E.urophylla thu được dòng kháng Pseudomonas solanasearum
tăng 35% [41]. Năm 2003, Tounier và cs đã thu được 9 dòng E.grandis x E.urophylla
giảm hoạt tính của CAD từ 69 – 78%, từ đó làm giảm quá trình sinh tổng hợp lignin. Một

nghiên cứu khác của Kwasu và cs được tiến hành vào năm 2003 trên đối tượng E.grandis
x E.urophyllac thử nghiệm chuyển gen mtCS từ Cà rốt đã thu được những dòng chuyển
gen thích ứng được với điều kiện đất bị chua do cải thiện kênh dẫn truyền photphat vô cơ
trên loại lập địa này. Năm 2003- 2004, Shani và cs đã đã tạo thành công 25 dòng cây
Bạch đàn camal và grandis chuyển gen Cbd và cel1 là 2 gen mã hoá cho cellulose trong
chu trình sinh tổng hợp cellulose. Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 gen này biểu hiện hoạt
động mạnh hơn và dẫn đến việc phân chia tế bào trong cây nhanh hơn và các thành tế bào
được kéo dài hơn. Họ tiến hành chuyển gen này vào E. camaldulensis, E. grandis và các
dòng lai của nó.
Để tăng cường cho Bạch đàn chống chịu với các điều kiện bất lợi như khả năng
chịu lạnh, mặn, chua, khô hạn. Năm 2003, Yamada- Watanabe và cs đã chuyển gen chịu
mặn cod A từ Arthrobacter globiformis vào Bạch đàn. Công ty giấy Nhật Bản Oji paper
đã chuyển gen ti thể citrate synthetase vào Bạch đàn lai E. grandis x E. urophylla nhằm
tăng cường khả năng hấp thu phosphate vô cơ trong môi trường đất chua. Theo Kondo và
cs, 2003 [31]; Ishige và cs, 2004 đã chuyển gen dreb1 vào Bạch đàn nhằm tăng khả năng
chịu hạn hán cũng như chịu mặn.
Tại Việt Nam, nghiên cứu tạo giống Bạch đàn chuyển gen vẫn còn khá mới mẻ và
phát triển chậm. Một số thử nghiệm bước đầu đang được tiến hành, tuy nhiên tính cho
đến nay vẫn chưa có kết quả nào được công bố.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
17




1.4. Gen mục tiêu EcHB1
1.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật
Nhân tố phiên mã (transcription factors) là những protein được gắn vào điểm đặc
biệt của trình tự ADN và kiểm soát sự phiên mã của gen. Nhân tố phiên mã thực hiện
chức năng của mình bằng cách tăng cường hoạt hóa hoặc kìm hãm tốc độ phiên mã của

RNA tại vùng bắt đầu phiên mã của gen (Ruan, 2013) [38].
Nhân tố phiên mã có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phá triển của
sinh vật vì nó đảm bảo các gen được biểu hiện trong tế bào vào đúng thời điểm và đúng
số lượng trong cơ thể sinh vật. Nó có vai trò trong việc bật/tắt sự phiên mã của các gen
thích hợp để làm thay đổi quá trình trao đổi chất trong sinh vật, quá trình biệt hóa tế bào
vv.
Đã có 53.319 nhân tố phiên mã thuộc 58 nhóm (family) được tìm thấy ở 49 loài
thực vật, trong đó gồm 9 loài tảo, 1 loài rêu, 3 loài cây hạt trần và 35 loài cây hạt kín
(Zhang và cs, 2011) [48].
Protein HD-Zip là nhân tố phiên mã có trong các loài thực vật. HD-Zip có cấu tạo
gồm miền ADN có chức năng liên kết chặt chẽ với motif khóa kéo leucine (leucine
zipper motif) trong việc hình thành dimmer. Hai chuỗi polypeptide ở khóa kéo leucine
được giữ với nhau bởi tương tác kỵ nước giữa acid amin leucine và sự lồng vào của 2
vòng xoắn α. Đây là loại homeodomain (miền đồng hình) chỉ có mặt trong thực vật và
được coi là gen HD-Zip có nguồn gốc từ thực vật bằng cách trao đổi giữa một gen exon
của miền đồng hình với một chuỗi khóa kéo leucine (Schena và Davis, 1994) [40].
Protein HD-Zip bao gồm 4 phân nhóm (từ I đến IV) dựa trên 4 đặc điểm: (1) sự bảo
thủ của domain HD-Zip mà xác định vị trí ADN gắn kết, (2) cấu trúc gen, (3) các motif
bảo thủ phụ thêm (additional conserved motif) và (4) chức năng (Haake và cs, 2002)
[27].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
18




Mỗi một nhân tố phiên mã kiểm soát sự họat động và phát triển của một vùng thực
vật đặc biệt. Nhân tố phiên mã ATHB5 thuộc HD-Zip phân nhóm I có chức năng kiểm
soát sự hình thành trụ dưới lá mầm và kéo dài rễ sơ cấp (Johannesson và cs, 2001),
ATHB2 thuộc HD-ZIP phân nhóm II có chức năng kiểm soát việc kéo dài tế bào liên

quan đến chất lượng ánh sáng (Carabelli và cs, 1996), ATHB8 thuộc phân nhóm III có
chức năng kiểm soát sự phát triển của tượng tầng trong quá trình biệt hóa tế bào (Baima
và cs, 1995), ATHB10/GLABRA 2 thuộc phân nhóm IV có chức năng kiểm soát sự biệt
hóa các dạng khác nhau của tế bào trichomes trên lá và thân, và tế bào lông rễ (Di
Cristina và cs, 1996) [21].
Nhiều nhân tố phiên mã chỉ hoạt động khi có sự thay đổi của điều kiện sống.
Nghiên cứu trên cây Arabidopsis cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CBF/DREB1 chỉ hoạt
động trong điều kiện lạnh, nhân tố phiên mã CBF4 hoạt động trong điều kiện hạn và các
nhân tố phiên mã này hoạt động để thúc đẩy sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính
chống chịu với điều kiện bất lợi này (Haake và cs, 2002) [25].
1.4.2. Nhân tố phiên mã EcHB1
Năm 2009, Sonoda và cộng sự đã phân tích biểu hiện của các gen nhân tố phiên mã
trong mô gỗ Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) bằng kỹ thuật microsarray và đã
phân lập được 21 gen nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin và
cellulose và các gen này thuộc nhóm HD-Zip phân nhóm II.
Gen EcHB1 – nhân tố phiên mã liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ
đã được phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên Bạch đàn trắng (Eucalyptus
camaldulensis) và vai trò của gen này đã được đánh giá thông qua việc phân tích biểu
hiện của gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
19




Hình 1.3. Trình tự gen EcHB1 được tách dòng từ Bạch đàn E. Camaldulensis
Bằng phương pháp phân tích RT-PCR cho thấy gen EcHB1 này biểu hiện ở thân
thành thục 5 tuổi (mature stem) và mô rễ (1 tuổi) của Bạch đàn trắng.
Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở Bạch đàn biến nạp gen E. camaldulensis

chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng
hợp lignin như CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm (Sonoda và cs, 2009) [42]. Điều
này cho thấy việc tăng cường hoạt động của gen EcHB1 có ảnh hưởng đến quá trình hình
thành xylem trong cây.
Gen EcHB1 có trình tự như sau: (GenBank: AB458829.1)
1

atgtgccctatcgattcgggccgctccttcgacacgagccttagtctcggtttaggctgt

61 tatggggatcctgaagatcacgagatcaagatcaagaaaccgctcgcgaagctcagtggt
121 aactccacgtgcctcacgataggcttgcccggcggggaggcgtgcggctgggatccgcg
181 agtggggacgaggtcaggaacatcccgagcaggtcggcatcgtcgttctcaaactcaagc
241 agtgcgaagagggagaaggcggagcaaggagaggaagaagcggttgagagagggacgggc
301 tcgccgagggcgactatcaatatcgaagatgaagatgagttcagccccaggaagaagctc
361 aggctttctaaagcacaaagttccattttggaagagagcttcaaagcgcacacaaccctc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
20




421 aacactaaacaaaagcacgatttggcaaatcggttgaatctccggccacggcaagtggaa
481 gtgtggttccagaataggagagccaggactaaattaaaacaaactgaagtagagtgcgag
541 atgctgaagaaatgctgcgaaaccctaaaagaagagaacagaaggttgaagaaggagttg
601 caagagctcaactcattgaagccaactgcgtcggtttataggcagattcctgcagctgct
661 ctccctctatgcccttcttgtgaaaggattgcccatccagaattcccgttctcgactgaa
721 tctcgactttggcctgctcatccatcagccgcttgttaa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
21

CHƯƠNG 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu
Tạo được dòng Bạch đàn lai mang gen tăng chiều dài sợi gỗ ( EcHB1)
2.2. Đối tượng
Cây Bạch đàn lai trội UU dòng 89 được Viện Giống và Công nghệ sinh học Lâm
nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp.
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101) có chứa vector nhị thể
(pGWB2) mang gen làm tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) được phòng thí nghiệm tại Viện
Nghiên cứu RIKEN (Nhật Bản) cung cấp.
2.3. Nội dung
- Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển chọn
- Nghiên cứu chuyển gen EcHB1
- Xác định sự có mặt của gen EcHB1 trong cây chuyển gen (chọn lọc kháng sinh,
Kỹ thuật PCR).
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Vật liệu nghiên cứu
2.4.1.1. Mẫu nghiên cứu
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là đoạn thân, cây Bạch đàn invitro từ cây Bạch
đàn lai trội UU89

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
22

2.4.1.2. Vật liệu chuyển gen
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (GV3101) có chứa vector nhị thể
(pGWB2) và gen làm tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1).

Hình 2.1. Cấu trúc vector pGWB2 chứa gen EcHB1
2.4.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng
- Thiết bị: bao gồm các loại box cấy vô trùng; nồi khử trùng; máy nước cất một lần,
hai lần; máy đo pH; máy đo OD; máy PCR; máy điện di; máy chụp ảnh gel; tủ ấm; tủ lắc;
dàn nuôi cấy và một số dụng cụ, thiết bị và máy móc khác của các hãng: Nuaire, Wealtec,
Amerex, AB, Hoirba, Hettech, Sartorius, Olympus,...
- Hóa chất:
+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy mô, tế bào cây Bạch đàn urô là môi trường MS
cơ bản (Murashige và Skoog 1962); các chất điều hòa sinh trưởng: Benzyl amino purine
(BAP), Kinetin (K), Indol-3-butyric acid (IBA) và Naphthyl acetic acid (NAA); các chất
kháng sinh như: Kanamycin, Cefotaxim và Hygromycine... được cung cấp bởi các hãng:
New England Biolabs (Anh), Amerham Pharmacia Biotech (Thụy Điển), Chemicals
(Đức), Sigma (Mỹ), Duchefa (Hà Lan).
+ Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm là môi trường
nuôi cấy LB (Luria and Betani)
2.4.3. Địa điểm bố trí thí nghiệm
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Nghiên
cứu giống và CNSH Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
23




2.4.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.4.1. Xác định các điều kiện phù hợp cho tái sinh từ nguồn vật liệu được tuyển
chọn
Ø

Tạo mẫu Bạch đàn invitro

Đoạn thân của các dòng Bạch đàn lai UU89 được thu thập, cắt bỏ lá, được rửa dưới
vòi nước chảy khoảng 5 phút, sau đó được rửa sạch lại bằng nước cất đã khử trùng và
được khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng là 3 phút, 5 phút, 7 phút, 9
phút, 11 phút. Cuối cùng là rửa sạch mẫu bằng nước cất đã khử trùng. Sau đó được nuôi
trong môi trường MS cơ bản bổ sung thêm đường 8g/l, pH= 5.8, nuôi dưới ánh đèn Neon,
có cường độ sáng 2500 lux với thời gian 12 giờ sáng/12 giờ tối.
Ø

Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi

Chồi Bạch đàn invitro được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài 1-1,5cm với 2-4
nách lá. Mẫu được cấy trên môi trường tạo đa chồi có thành phần:
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nhân nhanh chồi
CT TN

BAP (mg/l)

NAA (mg/l)

ĐC

0

0

CT1

0.5

0.1

CT2

1

0.1

CT3

0.5

0.3

CT4

1

0.3

CT5

0.5

0.5

CT6

1

0.5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
24




Các đoạn chồi được nuôi trong tối với thời gian 1 tuần, sau đó được nuôi trong điều
kiện chiếu sáng 16giờ/ngày, nhiệt độ phòng nuôi 25 oC ± 2oC. Cường độ chiếu sáng 2500
lux.
Chỉ tiêu đánh giá: HSNC, chất lượng chồi.
Ø

Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi

Đoạn thân cây in-vitro được cắt thành các đoạn nhỏ có chiều dài 5-10mm (không
có mắt ngủ). Mẫu được cấy trên các công thức môi trường tái sinh (CT1 – CT16):
Bảng 2.2. Thành phần môi trường tái sinh
CT TN

BAP (mg/l)

K (mg/l)

NAA (mg/l)

ĐC

0

0

0

CT1

0.1

CT2

0.3

CT3

0.5

CT4

0.7

CT5

1

CT6

1.5

CT7

0.3

0.2

CT8

0.5

0.2

CT9

0.7

0.2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
25