ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐẾN VI NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN MỸ KHUÊ

ẢNH HƯỞNG CỦA
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
VÀ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH
ĐẾN VI NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN
(Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe)

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: TRỒNG TRỌT

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: TRỒNG TRỌT

ẢNH HƯỞNG CỦA
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
VÀ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH
ĐẾN VI NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN
(Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe)

Giảng viên hướng dẫn:
TS. Lê Văn Bé

Sinh viên thực hiện:
Trần Mỹ Khuê
MSSV: 3065357
Lớp: Trồng Trọt K32

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

Chứng nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài: “ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU
HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN VI
NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA (BERG.)
ROSCOE)”. Do sinh viên TRẦN MỸ KHUÊ thực hiện và đề nạp.
Kính trình Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng 6 năm 2010.

TS. Lê Văn Bé

ii


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG

Luận văn tốt nghiệp kèm theo với đề tài: “ ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU
HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN VI
NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA (BERG.)
ROSCOE) ”, do sinh viên TRẦN MỸ KHUÊ thực hiện và bảo vệ trước Hội Đồng
chấm luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua.
Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:…………………………..
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:…………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày…..tháng 6 năm 2010.

Duyệt Khoa
Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Chủ tịch Hội đồng

iii


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ tên:

Trần Mỹ Khuê

Ngày sinh:

16/07/1988

Nơi sinh:

TP. Cần Thơ

Nguyên quán:

Thị trấn Thới Lai, Huyện Thới Lai, TP. Cần Thơ

Họ tên cha:

Nguyễn Ngọc Minh

Họ tên mẹ:

Trần Thị Vân

Đã tốt nghiệp tại trường THPT Thới Lai, Huyện Thới Lai, TP. Cần Thơ. Theo học
ngành Trồng trọt K32 (2006 – 2010) thuộc Khoa Nông Nghiệp và SHƯD, Trường
Đại học Cần Thơ.
Cần Thơ, ngày 14 tháng 6 năm 2010

TRẦN MỸ KHUÊ

iv


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Tất cả các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
ở bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

TRẦN MỸ KHUÊ

v


LỜI CẢM ƠN

Xin tỏ lòng tri ân sâu sắc!
Thầy Lê Văn Bé đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu
trong suốt quá trình thực hiện đề tài, người đã chỉ cho tôi cách mở khóa đến với
thành công.
Cô Lê Thị Điểu, anh Nguyễn Văn Kha, thầy Nguyễn Văn Ây đã trực tiếp chỉ
dẫn, luôn động viên và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong thời gian qua.
Cô cố vấn học tập Lê Thị Xua, đã quan tâm dìu dắt và giúp đỡ tôi trong
những năm học vừa qua.
Quý Thầy, Cô Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng
dụng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt
khóa học.
Chân thành cảm ơn!
Chị Nguyễn Thị Phiên, các bạn lớp Nông học K32: Thúy Hằng, Diễm Trinh,
Thị Linh, các bạn lớp Trồng trọt K32: Minh Truyền, Liên Quốc, Hoàng Anh, Hồ
Nam, Băng Tuyền, Kiều Oanh, Minh Thuận, Thị Diểm… và các em Như Thơ,
Thành Nhân… đã nhiệt tình giúp đỡ, luôn gắn bó, động viên, chia sẻ những khó
khăn cũng như vui, buồn trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.

Thân gửi đến mọi người những lời chúc tốt đẹp và thành công trong tương lai!
Xin cảm ơn gia đình tôi, nơi khởi nguồn của những tin yêu và là điểm kết
thúc của những hoài nghi trong cuộc sống.
TRẦN MỸ KHUÊ

vi


MỤC LỤC
TÓM LƯỢC
MỤC LỤC
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... ix
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................. x
DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 2
1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY NGHỆ ĐEN ..................................................................... 2
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố................................................................................ 2
1.1.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 2
1.1.3 Đặc điểm sinh thái ..................................................................................... 4
1.1.4 Phương pháp trồng ..................................................................................... 4
1.1.5 Thành phần hóa học của củ nghệ đen ......................................................... 4
1.1.6 Tác dụng dược lý của nghệ đen .................................................................. 5
1.2 PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG ............................................................... 6
1.2.1 Các giai đoạn vi nhân giống ....................................................................... 6
1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống ................................ 8
1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy .......................................................................... 8
1.2.2.2 Ánh sáng ......................................................................................... 10
1.2.2.3 Nhiệt độ ........................................................................................... 12
1.2.2.4 Số lần cấy chuyền ............................................................................ 12

1.2.3 Ưu và khuyết điểm của phương pháp vi nhân giống ................................. 12
1.2.3.1 Ưu điểm........................................................................................... 12
1.2.3.2 Khuyết điểm .................................................................................... 13
1.3 KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ ZINGIBERACAE .
............................................................................................................................. 14
1.4 TÍNH ƯU VIỆT KHI VI NHÂN GIỐNG CÂY VỚI GIÁ THÀNH THẤP ..... 16
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................. 17

vii


2.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ..................................................................... 17
2.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................. 17
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm................................................................................... 17
2.1.3 Điều kiện thí nghiệm ................................................................................ 17
2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................................................... 18
2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị ................................................................................... 18
2.2.2 Giai đoạn nhân chồi in vitro ..................................................................... 19
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IBA và điều
kiện môi trường ngoại cảnh đến khả năng nhân chồi nghệ đen ................... 19
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện môi trường
ngoại cảnh đến sự thành lập rễ in vitro ....................................................... 20
2.3 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU ................................................................................... 21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 22
3.1 GHI NHẬN TỔNG QUAN ............................................................................ 22
3.2 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA ,IBA VÀ ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI NGHỆ ĐEN IN
VITRO .................................................................................................................. 22
3.2.1 Các chỉ tiêu về chồi .................................................................................. 22
3.2.2 Hàm lượng diệp lục tố .............................................................................. 25

3.3 THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NAA VÀ ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐẾN SỰ THÀNH LẬP RỄ IN VITRO ....................... 29
3.4 ƯỚC TÍNH CHI PHÍ SẢN XUẤT ................................................................. 32
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 36
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

NT

nghiệm thức

BA

benzyladenin

NAA

α-naphthalene acetic acid

IBA

indole-3-butyric acid

IAA

indole acetic acid

HgCl2

Clorua thủy ngân

DPU

diphenylurea

IMA

imazalil

TDZ

thidiazuron

MS

môi trường Murashige & Skoog (1962)

ANOVA

Analysis of variance

dd

dung dịch

ix


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và điều kiện môi trường ngoại cảnh
đến sự sinh trưởng và phát triển chồi nghệ đen sau 5 tuần quan sát

23

3.2

Ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và điều kiện môi trường ngoại cảnh
đến hàm lượng diệp lục tố a, b, carotenoid (µg/g lá tươi) của nghệ đen
sau 5 tuần quan sát

26

3.3

Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện môi trường ngoại cảnh đến
sự ra rễ của cây nghệ đen sau 2 tuần

30

3.4

Ước tính giá thành sản xuất một chồi nghệ đen (C. zedoaria) cấy mô

34
35

x


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Đặc điểm hình thái và cấu trúc giải phẫu cây nghệ đen (Curcuma
zedoaria (Berg.) Roscoe)

3

2.1

Lồng kiếng đặt trong nhà lưới để vi nhân chồi

17

3.1

Ảnh hưởng của BA và IBA đến số chồi cây nghệ đen 5 tuần sau khi cấy

24

3.2

Chồi cấy mô cây nghệ đen sau 5 tuần nuôi cấy

27

3.3

Sự tạo rễ của chồi nghệ đen sau 2 tuần nuôi cấy

29

xi


TRẦN MỸ KHUÊ. 2010. “ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA, IBA VÀ ĐIỀU
KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN VI NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA
ZEDOARIA (BERG.) ROSCOE)”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Trồng Trọt.
Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng – Đại học Cần Thơ. 36 trang. Người hướng
dẫn khoa học: TS. LÊ VĂN BÉ

TÓM LƯỢC

Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe) là cây được sử dụng nhiều
trong đông y vào những năm gần đây. Hiện nay thực tế sản xuất cần một lượng giống
lớn để trồng. Do vậy vi nhân giống cây nghệ đen cần được nghiên cứu và sau đó áp
dụng vào sản xuất. Giai đoạn vi nhân chồi và ra rễ in vitro được thực hiện trong hai
điều kiện môi trường ngoại cảnh khác nhau là phòng tăng trưởng có ánh sáng nhiệt độ
nhân tạo (1.000 – 2.000 lux, 27 ± 3oC) và ngoài phòng tăng trưởng (lồng kiếng) với
nguồn sáng, nhiệt độ tự nhiên (6.000 – 12.000 lux, 31 ± 3oC). Kết quả cho thấy từ một
chồi ban đầu cấy vào môi trường nền MS (Murashige and Skoog, 1962), bổ sung 20%
nước dừa có hay không có mặt 1 mgBA/lít + 0,5 mgIBA/lít đều cho ra 4 chồi/1 chồi
ban đầu sau 5 tuần nuôi cấy. Nếu gia tăng nồng độ BA và IBA vào môi trường không
làm tăng thêm số chồi hữu hiệu (chồi có chiều cao 7 cm). Môi trường nuôi cấy có chứa
0,4 mgNAA/lít có tác dụng kích thích hình thành rễ cao nhất (6 rễ/chồi sau 2 tuần nuôi
cấy).
Kết quả nghiên cứu này cho thấy cây nghệ đen có thể nuôi cấy trong lồng kiếng
với ánh sáng tự nhiên thay cho phòng tăng trưởng với ánh sáng và nhiệt độ nhân tạo sẽ
giảm được khoảng 28% giá thành sản xuất do không phải chi trả tiền điện.


MỞ ĐẦU

Xu thế sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên của y học cổ truyền ngày càng gia tăng
và trở thành xu thế chung của lĩnh vực y học đương đại. Nghệ đen (Curcuma zedoaria
(Berg.) Roscoe), thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) được biết đến một cách gần gũi và
phổ biến như vị thuốc có tác dụng rất tốt đối với các bệnh lý về đường tiêu hóa: viêm
niêm mạc dạ dày và loét tá tràng, ăn uống chậm tiêu, đầy hơi, đau bụng, buồn nôn…
Đây là loại thuốc hoạt huyết chữa các chứng bệnh gây ra do xung huyết, ứ huyết (huyết
trệ). Ngoài ra còn dùng làm thuốc bổ dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột hoặc viên.

Nghệ đen là vị thuốc được dùng cả trong Đông y và Tây y. Khoa học hiện đại
đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của nghệ đen. Nghiên cứu thực nghiệm
trên động vật phòng thí nghiệm cho thấy nghệ đen có tác dụng rõ rệt bài tiết mật, ức
chế nhẹ sự tiết dịch dạ dày, kích thích tiêu hóa, tăng trương lực ống tiêu hóa. Nghiên
cứu ở các nước trên thế giới còn cho thấy tinh dầu nghệ đen có tính kháng khuẩn, tính
kháng oxy hóa cao. Hiện nay cây nghệ đen và nghệ Hồng Đào là hai giống được sử
dụng nhiều trong ngành dược, chữa được các chứng bệnh ở trẻ nhỏ và người già.
Có giá trị sử dụng rộng trong nhiều lĩnh vực mà đặc biệt là y học nhưng việc
trồng nghệ đen với số lượng lớn để cung cấp cho người tiêu dùng còn rất hạn chế. Và
do không phải là loại cây trồng mang lại thu nhập cao trên thị trường nên đa số nghệ
đen là mọc hoang hoặc chỉ được trồng để sử dụng riêng cho từng hộ gia đình. Do vậy,
song song với việc khai thác cây thuốc mọc hoang, để đảm bảo nguồn nguyên liệu lâu
dài và có hiệu lực đồng đều, việc nghiên cứu nuôi trồng cây con làm thuốc và áp dụng
nghiên cứu này vào thực tế sản xuất là công việc hết sức cần thiết.
Đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và điều kiện môi trường ngoại cảnh
đến vi nhân giống cây nghệ đen (Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe)” được thực hiện
nhằm mục tiêu nhân nhanh cây nghệ đen cấy mô với giá thành thấp.


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY NGHỆ ĐEN
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Nghệ đen, tên khoa học là Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe, thuộc họ Gừng
(Zingiberaceae). Nghệ đen còn có các tên khác như: nghệ tím, ngải tím, tam nại, nga
truật, bồng truật, ngải xanh, bồng nga, bồng dược, nghệ đăm (Tày), sùng meng (Dao),
m'gang mơ lung (Ba Na). Tên nước ngoài: round zedoary, long zedoary, cochinturmeric (Anh); zédoaire (Pháp).
Nghệ đen có nguồn gốc từ vùng Đông – Bắc Ấn Độ. Cây mọc tự nhiên và được
trồng khắp vùng nhiệt đới Nam và Đông – Nam châu Á, bao gồm Ấn Độ, Malaysia,
Srilanca, Thái Lan, Philippin, Indonesia, Campuchia, Lào, Việt Nam, đảo Hải Nam,

Đài Loan và các tỉnh phía nam lục địa Trung Quốc. Ngoài ra, cây còn phân bố cả ở
Madagasca. Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố rộng rãi khắp các tỉnh miền núi và trung
du, nhất là Hà Giang, Lai Châu, Yên Bái, Lào Cai, Tuyên Quang, Sơn La, Cao
Bằng,… ở phía nam có tỉnh Bình Định và Quảng Nam. Cây còn được trồng rải rác
trong nhân dân. Ở Hưng Yên (vùng Nghĩa Trai), nghệ đen được trồng đại trà ở ruộng,
để chủ động cho việc cung cấp nguyên liệu (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Theo Võ Văn Chi (2003), nghệ đen thuộc loại thân thảo, cao từ 1 – 1,5m, có
thân rễ hình nón, có khía dọc; củ tỏa ra theo hình chân vịt, dày, nạc, màu vàng nhạt ở
trong; củ già có những vòng màu đen. Ngoài những củ chính ra, còn có những củ phụ
có cuống trái xoan hay hình quả lê, màu trắng. Lá có bẹ dài ở gốc, phiến hình mũi mác,
dài tới 60 cm, rộng 8cm, có những đốm đỏ dọc theo gân chính, không có cuống hay có
cuống ngắn. Cán hoa ở bên cạnh thân có lá, mọc từ rễ, dài tới 20 cm, thường xuất hiện
trước khi ra lá. Cụm hoa hình trụ, dài tới 20 cm, rộng 5 cm; lá bắc phía dưới hình trái
xoan hay hình mũi mác tù, lợp lên nhau, màu lục nhạt, viền đỏ ở mép; các lá bắc trên
không sinh sản màu vàng nhạt, điểm thêm màu hồng ở chóp. Hoa nhiều, dài 4 – 5 cm,


màu vàng. Đài hình ống, có lông, có 3 răng không đều. Tràng hình ống dài hơn đài 3
lần, các thùy hình mũi mác tù. Bao phấn hình trái xoan có các ô kéo dài xuống phía
dưới thành cựa rẽ ra, ngọn trung đới dạng bản tròn; chỉ nhị dính với các nhị lép. Cánh
môi thót lại ở gốc, lõm lại ở đỉnh, màu vàng. Nhị lép hình mũi mác tù hay thuôn, dính
nhau ở nửa dưới. Bầu có lông; nhụy lép hình dùi.

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc giải phẫu cây nghệ đen
Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe
(Nguồn: Koehler's Medicinal-Plants, 1887)

3

1.1.3 Đặc điểm sinh thái
Nghệ đen là loài có hệ thống thân rễ phân nhánh phát triển, phần trên mặt đất lụi
vào mùa đông (ở miền Bắc) và mùa khô (ở miền Nam). Cây thường mọc thành khóm,
đôi khi trở thành quần thể thuần loại trên đất ẩm, gần bờ suối trong thung lũng hay trên
nương rẫy. Độ cao từ vài trăm mét đến 1600m. Cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng.
Vào giữa mùa xuân, từ thân rễ mọc lên nhiều thân khí sinh. Song trong một khóm
thường chỉ có một thân chính sinh ra từ thân rễ. Phần thân rễ này, thường được gọi là
“củ cái”, chỉ tồn tại được 2 năm sau tự thối rữa, để lại các phần thân rễ non hơn phát
triển thành những “củ cái” mới. Hoa nghệ đen tự thụ phấn hoặc nhờ côn trùng. Chưa
quan sát được quả và cây non mọc từ hạt, nhưng chắc chắn sự phát triển tự nhiên để
mở rộng khu phân bố cây vẫn phải từ hạt. (Đỗ Huy Bích et al., 2004)
1.1.4 Phương pháp trồng
Theo Đỗ Huy Bích et al., (2004), trồng nghệ đen bằng rễ củ vào mùa xuân, thu
hoạch vào mùa đông. Khi thu hoạch chọn củ non có mầm để làm giống. Vùng trung du
và miền núi chủ yếu tận dụng đất ở bờ ao, bờ suối, nơi có bóng râm để trồng. Đất trồng
thường không cần cày bừa mà chỉ cần cuốc xới, không lên luống mà trồng theo hốc,
mỗi hốc 1 – 2 mầm giống. Khoảng cách trồng 30 – 40 cm cho một cây. Khi cây mọc
thỉnh thoảng làm cỏ, xới xáo, tưới phân chuồng hoặc phân đạm.
Theo Võ Văn Chi (2003), cây nghệ đen mọc hoang trong rừng ẩm và thường
được trồng khắp nơi từ Bắc vào Nam. Tuy nhiên, cây thường được trồng theo tập quán
quảng canh với năng suất thấp (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
1.1.5 Thành phần hóa học của củ nghệ đen
Theo Đỗ Tất Lợi (2003), trong củ có 1 – 1,5% tinh dầu màu vàng xanh nhạt,
sánh, tỷ trọng 0,982, có mùi gần như long não; và 3,5% chất nhựa và chất nhầy. Thành
phần của tinh dầu chủ yếu gồm có 48% sesquyterpen, 35% zingiberen, 9,65% cineol và
một chất có tinh thể.

4

Theo Đỗ Huy Bích et al., (2004), các sesquyterpen trong củ nghệ đen thuộc
nhiều nhóm:
o Germaran: curdion, dehydrocurdion, germacron – 7, 8 – epoxyd, 13 –
hydroxygermacron, zederon, furanodienon, furanogermenon, furanodien,
isofuranodienon.
o Eleman:

zedoaron,

curzerenon,

epicurzerenon,

curzeren

(isofuranogermacren).
o Cadinan: curzeon
o Eudesman: curcolon
o Guaian: procurcumenol, curcumadiol, isocurcumenol, zedoarondiol,
zedoarol, và một số chất thuộc nhóm khác: curcumenon, curcumanolid
A, curcumanolid B.
Ngoài ra, còn có một số chất khác như curcumin, bis (4 – hydroxycinamoyl) –
methan, 4 – hydroxy – cinamoyl feruloylmethan, ethyl p – methoxycinamat. Chất ethyl
p – methoxycinamat có tính kháng nấm. Trong củ nghệ đen còn chứa Sr, Zn, Cu, Ni,
Fe, Mn, Ti, Cr, Pb, Ca, K (Vũ Ngọc Lộ et al.,1997).
1.1.6 Tác dụng dược lý của nghệ đen
Trong y học cổ truyền, nghệ đen được xếp vào nhóm thuốc hoạt huyết cùng các
vị thuốc như ngưu tất, xuyên khung, ích mẫu, khương hoàng, tô mộc với tên nga truật
(Rhioma curcumae zedoriae). Thuốc hoạt huyết là những thuốc chữa các chứng bệnh

gây ra do xung huyết, ứ huyết (huyết trệ). Thường nguyên nhân do viêm nhiễm, do rối
loạn vận mạch hoặc do chấn thương gây ra. Nhóm thuốc này có tác dụng chung là tăng
cường lưu thông máu trong cơ thể và được sử dụng phối hợp với thuốc hành khí để làm
tăng tác dụng.
Nga truật dùng để chỉ thân rễ phơi khô của cây nghệ đen, thành phần sử dụng
trong Đông dược. Theo Đỗ Tất Lợi (2003), nga truật là vị thuốc được dùng trong cả
đông y và tây y; có vị đắng, cay, tính ôn, đi vào can kinh. Tác dụng hành khí, phá

5


huyết, tiêu tích hóa thực. Chữa ngực bụng đau, ăn uống không tiêu, kích thích tiêu hóa,
bổ, chữa ho, bế kinh không đều khi dùng 3 – 6g/ngày dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột
hoặc thuốc viên. Tây y dùng nga truật làm thuốc bổ trong rượu trường sinh (Elixir de
longue vie). Công thức gồm lô hội 25g, long đởm thảo 5g, đại hoàng 2,5g, nga truật
2,5g, phan hồng hoa 2,5g, Polyporus officinalis 2,5g; tất cả thái nhỏ ngâm trong
2000ml cồn 600 trong 10 ngày; lọc lấy rượu uống 2 – 5 ml/ngày.
Theo Võ Văn Chi (2003), ở Ấn Độ sử dụng nga truật phối hợp với hồ tiêu, quế
và mật ong sắc uống trị cảm lạnh; ở Vân Nam, Trung Quốc thì củ của rễ được sử dụng
như củ nghệ trắng, nghệ vàng.
Trong y học hiện đại, bột bào chế từ thân rễ nga truật thí nghiệm trên chuột
cống trắng bằng đường uống, có tác dụng tăng cường sự bài tiết mật một cách rõ rệt,
đồng thời ức chế nhẹ sự phân tiết dịch dạ dày; thí nghiệm trên chuột nhắt trắng có tác
dụng ức chế tốc độ chuyển dịch than hoạt trong ruột; tinh dầu có tính kháng khuẩn và
cao cồn từ thân rễ có tác dụng ngừa thai trên súc vật thí nghiệm (Đỗ Huy Bích et al.,
2004).
1.2 PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG
1.2.1 Các giai đoạn vi nhân giống
Theo Debergh và Read (1991), Altman (2000), quá trình vi nhân giống có thể
chia làm bốn giai đoạn:

* Giai đoạn chuẩn bị: lựa chọn, chuẩn bị cây mẹ
Theo George (1993) trước khi tiến hành vi nhân giống, cần phải chú ý đến sự
lựa chọn cây mẹ. Chúng phải là điển hình của giống hoặc loài và không có bất kỳ triệu
chứng bệnh nào. Sự chuẩn bị này có thể tạo thuận lợi cho việc xử lý mẫu cấy của cây
trồng được chọn góp phần thành công cho quá trình nuôi cấy in vitro.
* Giai đoạn 1: Bắt đầu nuôi cấy, giai đoạn này bao gồm việc lấy mẫu, khử trùng và
nuôi dưỡng trong điều kiện vô trùng
Thông thường một đợt khử trùng mẫu cấy được chuyển vào môi trường trong
cùng một thời gian. Sau một thời gian nuôi cấy, bất kỳ mẫu nào bị phát hiện nhiễm vi

6


sinh vật đều bị loại bỏ. Giai đoạn này được xem là thành công nếu có đủ một số lượng
mẫu sống sót và phát triển mà không nhiễm vi sinh vật (George, 1993).
* Giai đoạn 2: Nhân nhanh số lượng.
Số lượng cây sẽ được nhân nhanh thông qua số lần cấy chuyền sang môi trường
mới (Debergh và Read, 1991; Altman, 2000).
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là kích thích sự tái sinh chồi từ các
mầm ngủ. Mầm ngủ thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân. Do tính ưu
thế chồi ngọn, các chồi bên ở trạng thái miên trạng và không phát triển. Do đó, khi các
chồi bên được xử lý với chất điều hoà sinh trưởng sẽ phá vỡ miên trạng và phát triển
thành những chồi có đầy đủ như thân chính. Các chồi có thể được tách ra, đưa vào môi
trường tạo rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh hay sử dụng cho quá trình nhân giống trở lại.
* Giai đoạn 3: Kéo dài và kích thích ra rễ.
Giai đoạn này giúp cây con phát triển hoàn chỉnh trước khi chuyển ra điều kiện
bên ngoài (Debergh và Read, 1991; Altman, 2000). Ra rễ là giai đoạn rất quan trọng
của bất kỳ chương trình nhân giống in vitro nào. Một số ít loài hình thành rễ bất định
trong suốt giai đoạn 3, nhưng thông thường cần phải tiến hành ra rễ trong một môi
trường hoặc một phương pháp đặc biệt để kích thích ra rễ. Để giảm chi phí vi nhân

giống, nhiều phòng thí nghiệm không ra rễ trong ống nghiệm mà tiến hành ra rễ bên
ngoài nhà lưới (George, 1993). Debergh và Manene (1981) đã chia giai đoạn này thành
2 giai đoạn nhỏ:
3a: Kéo dài các mầm chồi đã hình thành trong giai đoạn 2 đến một kích thước
phù hợp cho giai đoạn 3b.
3b: Ra rễ cho những chồi giai đoạn 3a trong điều kiện in vitro hoặc extra vitrum
* Giai đoạn 4: Giai đoạn thuần dưỡng.
Giai đoạn này tạo ra môi trường gần giống bên ngoài, giúp cây quen dần với
môi trường mới. Đây là giai đoạn cuối nhưng là một bước rất cần thiết trong các quy
trình vi nhân giống. Trong suốt tiến trình này cây con phải thích nghi với điều kiện môi
trường mới như ẩm độ tương đối thấp, cường độ ánh sáng cao, những biến động về
nhiệt độ và các tác nhân gây bệnh (Preece và Sutter, 1991). Chất lượng của cây con
7


trong giai đoạn in vitro là một trong những nhân tố quan trọng nhất quyết định tỷ lệ
thành công trong suốt quá trình chuyển ra ngoài nhà lưới (Huylenbroeck và Debergh,
1996a).
1.2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống
Sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của cây con nuôi cấy mô bị ảnh hưởng
bởi rất nhiều yếu tố. Trong đó:
1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy
Sự sinh trưởng của thực vật in vitro phần lớn được quyết định bởi các thành
phần của môi trường nuôi cấy, chủ yếu là các muối khoáng, nguồn cacbon, nước, ngoài
ra có thể bổ sung thêm chất hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng hoặc chất làm rắn môi
trường (Gamborg et al., 1968; Gamborg và Phillips, 1995).
* Dinh dưỡng khoáng
Môi trường được sử dụng phổ biến là Murashige và Skoog (1962) (môi trường
MS), vì nó thích hợp với nhiều loại cây trồng. Nó được cho là môi trường có hàm
lượng muối cao so với các công thức môi trường khác (hàm lượng đạm, potassium và

một số vi lượng đặt biệt là boron và maganese (Cohen, 1995).
* Nguồn cacbon
Đường sucrose là nguồn cacbon được sử dụng phổ biến vì giá thành rẻ, dễ kiếm,
khá bền khi thanh trùng, cây trồng dễ đồng hóa. Một số cacbohydrate khác cũng được
sử dụng như glucose, maltose, galactose…(Fowler, 2000).
* Chất điều hòa sinh trưởng
Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm: cytokinin, auxin, gibberellin,
ethylene và abscisic acid.
Sự sinh trưởng và phát triển hình thái in vitro được điều hòa bởi sự tác động qua
lại và cân bằng giữa những chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung trong môi trường
nuôi cấy và những chất điều hòa sinh trưởng nội sinh (George, 1993). Cung cấp auxin
và cytokinin vào môi trường nuôi cấy là công cụ để điều khiển sự phân chia tế bào, kéo
dài tế bào và sự hình thành hình thái (John và Lorin, 1985). Sự cân bằng giữa hàm
lượng auxin và cytokinin là nhu cầu chủ yếu cho sự thành lập chồi và rễ bất định. Ở
8


cây thuốc lá nuôi cấy mô, người ta thấy rằng sự thành lập chồi và rễ tùy thuộc vào tỷ lệ
auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích
sự ra rễ, còn tỷ lệ auxin/cytokinin thấp lại dẫn đến sự thành lập chồi (Taiz và Zeiger,
1991).
Sự cân bằng chất điều hòa sinh trưởng còn tùy thuộc và các yếu tố khách quan
trong in vitro (cấy chồi, rễ, mô) và vi nhân giống ở giai đoạn nào (khởi đầu, nhân
nhanh hay ra rễ). Ở giai đoạn nhân nhanh, mức độ cytokinin thông thường phải cao
hơn auxin. Còn ở giai đoạn ra rễ, ngược lại sử dụng cytokinin trong một số trường hợp
là không cần thiết và hàm lượng auxin cao hơn có thể bổ sung vào môi trường nuôi
cấy.
Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong sự tạo chồi bên của cây nuôi cấy mô,
tuy nhiên khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao để kích thích tạo chồi bên có thể làm
cản trở sự tăng chiều cao của chồi và ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ của chồi ở giai

đoạn sau (George, 1993). Loại cytokinin được sử dụng phổ biến là kinetin, BA. Để đạt
được tỷ lệ nhân giống cao, nó cũng có liên quan đến hàm lượng cytokinin được sử
dụng trong môi trường nuôi cấy. Một số nghi nhận trong các nghiên cứu nhân chồi in
vitro cho rằng nếu tăng nồng độ cytokinin sẽ nhận được nhiều chồi, tuy nhiên sẽ dẫn
đến hiện tượng cây sinh trưởng bất thường, lá nhỏ, cong queo, mất diệp lục tố, đặc biệt
trong môi trường lỏng; người ta gọi hiện tượng này là dư thừa nước (hyperhydricity)
(Debergh et al., 1991). Để giảm bớt hiện tượng này phải giảm hàm lượng cytokinin
trong môi trường cấy hoặc kết hợp với nhóm auxin (George, 1993). Ngoài ra, trên một
số cây trồng lại cho thấy tỷ lệ nhân giống giảm khi tăng nồng độ cytokinin.
Các loại auxin như IAA, IBA, NAA hay 2,4-D cũng thường được sử dụng trong
môi trường nuôi cấy để cải thiện sự sinh trưởng của callus, huyền phù tế bào hoặc các
cơ quan, và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi kết hợp với cytokinin
(George, 1993). Auxin có liên quan trong sự điều hòa của một số tiến trình sinh lý như
là ưu thế chồi đỉnh và thành lập các rễ bên và rễ bất định. Nói chung chất này gây ra
hiện tượng vươn lóng tế bào, các mô phình to, sự phân chia tế bào (sự thành lập mô
sẹo) và sự thành lập rễ bất định cũng như là kích thích hình thành chồi nách (Pierik,
9


1997). Thông thường nồng độ auxin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy từ 0.01
đến 10 mg/l.
1.2.2.2 Ánh sáng
Ánh sáng là nhân tố môi trường quan trọng kiểm soát sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật, vì nó liên quan đến quang hợp, sự quang dưỡng và sự phát sinh hình
thái (Read và Preece, 2003). Sự chiếu sáng có thể là quan trọng nhất vì nó liên quan rất
nhiều đến quang hợp và hô hấp. Theo George (1993) các đặc tính của ánh sáng ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng in vitro là: độ dài sóng, cường độ sáng và thời gian chiếu
sáng hay chu kỳ sáng. Mỗi thuộc tính này đều ảnh hưởng lên sự phát sinh quang hình
thái và sự quang hợp. Các ảnh hưởng có thể trực tiếp lên các mô được nuôi cấy, hoặc
gián tiếp thông qua tác động của ánh sáng lên cây mẹ. Trong trường hợp sau, sự sinh

trưởng hoặc sự phát sinh hình thái thể hiện trong điều kiện in vitro bị giảm bớt khi cây
mẹ được xử lý ánh sáng trước khi lấy mẫu .
Khi được cung cấp đầy đủ CO2 và năng lượng ánh sáng, theo lý thuyết những
chồi có lá hoặc cây con in vitro đủ khả năng đồng hóa carbon từ quang hợp để tồn tại
dạng tự dưỡng. Nếu CO2 hoặc ánh sáng dưới ngưỡng cho phép, quang hợp đạt tới điểm
bù của nó, tại đây tỷ lệ chất khô tích lũy không đủ để cung cấp cho hô hấp. Nếu quá
trình này xảy ra lâu dài ở điều kiện in vivo thì một phần hay cả cây trồng sẽ chết. Trong
tình huống ánh sáng không đủ để đưa quang hợp lên trên điểm bù có thể đưa đến tích
lũy CO2 trong bình nuôi cấy, vì tỷ lệ hô hấp vượt quá sự quang hợp (George, 1993).
* Sự hình thành diệp lục tố trong nuôi cấy mô
Diệp lục tố là sắc tố màu xanh trong cây trồng rất cần cho quang hợp. Tất cả các
hoạt động của sắc tố được tìm thấy trong lục lạp. Điểm nổi bật nhất về cấu trúc lục lạp
là hệ thống mở rộng của các màng nội bào gọi là thylakoids. Tất cả các diệp lục tố
được chứa đựng trong hệ thống màng này, là vị trí của các phản ứng ánh sáng của sự
quang hợp. Các sắc tố hiện diện trên màng thylakoids của thực vật bậc cao chủ yếu
gồm có hai loại chlorophylls (chl) là chl a và chl b. Cũng có sắc tố từ màu vàng tới cam
của carotenoids, có hai loại là hydrocacbon tinh khiết carotenes và xanthophylls có

10


chứa oxygen. Ngoài ra còn có violaxanthin (là một xanthophyll) cũng hiện diện trên vỏ
lục lạp, làm cho nó có màu vàng ( Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Khi các mô sẹo hay tế bào huyền phù được chuyển ra ngoài sáng, chúng có thể
phát triển lục lạp và bắt đầu quang hợp, nhưng hiếm khi trở nên tự dưỡng. Màu xanh
nói chung xuất hiện rất chậm so với những chồi của cây nẩy mầm trong tối, và có thể
mất khoảng 8 tuần để đạt được hàm lượng diệp lục tố tối đa (George, 1993). Sự hình
thành lục lạp trong các tế bào nuôi cấy có khuynh hướng bị biến dạng cấu trúc nhiều
hơn so với lục lạp trong tế bào lá. Có thể chúng không phát triển đến một tỷ lệ nhất
định và có thể bị biến dạng phiến thylakoids (Davey et al., 1971). Ở một số ít loài thực

vật, tiền lạp thể có thể phân hóa thành lục lạp ở những chồi mọc trong tối. Tuy nhiên
hầu hết cây trồng đều cần ánh sáng kích thích để khởi đầu sự phân hóa của lục lạp và
thành lập diệp lục tố, có thể là cả một vài hệ thống sắc tố (George, 1993).
* Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của chồi trong ống nghiệm
Theo Murashige (1974) thì chồi trong ống nghiệm phát triển ở cường độ sáng
khoảng 1000 lux (14 – 15 µmol.m-2. s-1). Cây Limonium sinh trưởng trong điều kiện
quang tự dưỡng in viro kết hợp với cường độ chiếu sáng cao (200 µmol.m-2. s-1) cho
nhiều lá, hàm lượng diệp lục tố, tỷ lệ quang hợp thuần và phần trăm sống sót khi đem
ra ngoài cao hơn những cây sinh trưởng trong điều kiện chiếu sáng yếu (50 và
100µmol.m-2.s-1). Cây Siningia có thể tạo chồi ở cường độ sáng từ 3000 – 10.000lux
(Haramaki, 1971), cây hoa kiểng nhiệt đới cũng tạo chồi mạnh với điều kiện sáng từ
3000 – 10.000 lux (Miller và Murashige, 1976). Tùy theo loài mà yều cầu cường độ
sáng khác nhau trong giai đoạn nhân chồi. Cây Gloxinia tạo chồi ở cường độ sáng
khoảng 3.200 lux, nhưng khi tăng cường độ ánh sáng lên 10.700 lux thì sự sinh trưởng
của chồi bị giới hạn (Haramaki, 1971).
* Ảnh hưởng của ánh sáng đối với sự thành lập rễ
Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng ánh sáng làm tăng sự thành lập rễ và sự
sinh trưởng của chồi (Nguyễn Bảo Toàn, 2003). Một số nghiên cứu khác thì cho rằng
điều kiện tối, thích hợp cho sự thành lập rễ. Ánh sáng làm giảm sự ra rễ là do có sự suy
giảm hàm lượng IAA nội sinh trong cây (George, 1993).
11


1.2.2.3 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau lên tiến trình sinh lý như hô hấp và quang
hợp, và từ lâu người ta đã biết nó ảnh hưởng rất lớn đến nuôi cấy mô thực vật và vi
nhân giống (Altman, 2000; Read và Preece, 2003). Trong môi trường tự nhiên, thực vật
trãi qua những khoảng biến động nhiệt độ lớn, đặt biệt giữa ngày và đêm. Do đó nên
tập cho cây trồng quen với sự biến đổi này giúp cây trồng cải thiện sự sinh trưởng và ở
những phòng tăng trưởng không sử dụng máy điều hòa thì tiết kiệm được chi phí nhiên

liệu do nhiệt độ về đêm giảm (George, 1993).
1.2.2.4 Số lần cấy chuyền
Mục đích thông thường của vi nhân giống là có thể đạt được tỷ lệ nhân giống
cao nhất (Jámbor-Benczúr và Márta-Riffer, 1990) mà không bị biến dị hay thủy tinh
thể. Tuy nhiên, tính nhạy cảm của mẫu cấy thay đổi theo thời gian và số lần cấy
chuyền (Debergh và Maene, 1981). Ở cây Fragaria số lần cấy chuyền không giới hạn
đã gây ra sự biến dị nghiêm trọng khi đưa ra ngoài đồng như không mọc rễ, hoặc rễ rất
yếu, hoa mọc quá nhiều một cách bất thường, trái nhỏ và bị biến dạng, cây trồng dị
dạng. Ở cây khóm (Ananas comosus), chồi cấy chuyền nhiều lần cũng có xuất hiện
hiện tượng chồi nhỏ, nhiều bất thường, bạch tạng, sọc lá (Nguyễn Quang Thạch et al.,
2005).
1.2.3 Ưu và khuyết điểm của phương pháp vi nhân giống
1.2.3.1 Ưu điểm
Theo George (1993) vi nhân giống có các lợi điểm sau:
- Bắt đầu từ những mẫu cấy nhỏ, chỉ cần một khoảng không gian nhỏ để nuôi
cấy hoặc nhân lên thành một số lượng rất lớn.
- Quá trình nhân giống được thực hiện trong điều kiện vô trùng, không mang
mầm bệnh. Do đó cây con tạo ra không nhiễm khuẩn, nấm và các vi sinh vật khác.
- Có thể tạo ra một số lượng lớn cây sạch virus.
- Hệ số nhân giống cao, có thể tạo ra một số lượng lớn cây trồng trong cùng một
thời gian.

12