Nhân giống lan hồ điệp phalaenopsis SP bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (tis temporary immersion system)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

Giảng viên hướng dẫn: Th.S. Trịnh Thị Lan Anh
Sinh viên thực hiện
MSSV: 0811110086

: Ưng Thị Mỹ Tiên
Lớp: 08CSH2

TP. Hồ Chí Minh, 2011


LỜI CAM ĐOAN
----- ----Em xin cam đoan bài khóa luận tốt nghiệp này là công trình nghiên
cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và
một phần thực nghiệm.
SVTH
Ưng Thị Mỹ Tiên

 
 
 
 

LỜI CẢM ƠN
-----  ----Trước tiên con xin gửi những lời thân thương nhất đến cha mẹ, người
đã nuôi nấng dạy dỗ con từng ngày. Ba mẹ là chỗ dựa vững chắc nhất của
con, là nguồn động viên, giúp con đứng vững sau những lần vấp ngã và là
nguồn động lực lớn để con tiếp tục phấn đấu hơn trong học tập và cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành bày tỏ lời cám ơn đến:
- Toàn thể quý Thầy Cô Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học,
cùng toàn thể Thầy Cô Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM đã
quan tâm, nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu về cơ
sở cũng như chuyên ngành cho em trong suốt ba năm học và đã tạo điều kiện
tốt cho em trong thời gian làm đề tài tốt nghiệp.
- Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Th.S. Trịnh Thị Lan Anh,
người cô đáng kính đã hết lòng quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt
kiến thức và tài liệu tham khảo để em có thể hoàn thành tốt đề tài này.
- Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các anh chị Phòng Công Nghệ
Sinh Học Thực Vật - toàn thể cô chú, các anh chị cán bộ công nhân viên tại
Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em được học hỏi, tích lũy kinh nghiệm, truyền đạt kiến
thức và tài liệu tham khảo để em hoàn thành đề tài một cách tốt đẹp.
- Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể tập thể 08CSH đã
nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2011
SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................
MỤC LỤC ..................................................................................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG.................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... x
DANH MỤC ĐỒ THỊ ................................................................................ xii
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................... 3
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu............................ 3
5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 5
1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy in vitro ............................. 5
1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong nuôi cấy in vitro ......
............................................................................................................. 5
1.1.2. Các bước nhân giống in vitro ..................................................... 6
1.1.3. Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro .................................................... 6
1.1.3.1. Nuôi cấy nốt đơn thân ........................................................ 6
1.1.3.2. Nuôi cấy chồi bên .............................................................. 6
1.1.3.3. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ................................................. 6
1.1.3.4. Nuôi cấy mô sẹo ................................................................ 7
 

i

1.1.3.5. Nuôi cấy huyền phù tế bào ................................................. 7
1.1.3.6. Nuôi cấy thể đơn bội .......................................................... 7
1.1.3.7. Nuôi cấy protoplast (tế bào trần)........................................ 8
1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro .................. 8
1.1.4.1. Ưu điểm ............................................................................. 8
1.1.4.2. Nhược điểm ....................................................................... 9
1.2. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới và ở Việt Nam ............. 9
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới ................................... 9
1.2.2. Tình hình sản xuất hoa Lan ở Việt Nam .................................. 11
1.3. Giới thiệu về Lan Hồ Điệp............................................................. 12
1.3.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................. 12
1.3.2. Phân loại khoa học................................................................... 15
1.3.3. Đặc điểm hình thái ................................................................... 16
1.3.3.1. Cơ quan sinh dưỡng ......................................................... 18
1.3.3.2. Cơ quan sinh sản .............................................................. 18
1.3.4. Điều kiện sinh thái của Lan Hồ Điệp ....................................... 20
1.3.4.1. Nhiệt độ ........................................................................... 20
1.3.4.2. Độ ẩm .............................................................................. 20
1.3.4.3. Ánh sáng .......................................................................... 20
1.3.4.4. Độ thông thoáng .............................................................. 21
1.3.4.5. Nhu cầu nước tưới ........................................................... 21
1.3.4.6. Dinh dưỡng ...................................................................... 22
1.3.4.7. Một số sâu bệnh và cách phòng trị ................................... 22
1.3.4.8. Chậu, giá thể và cách trồng .............................................. 24
1.3.5. Giá trị kinh tế và tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp ................... 24
1.3.5.1. Giá trị kinh tế của Lan Hồ Điệp ....................................... 24
1.3.5.2. Tình hình sản xuất Lan Hồ Điệp ...................................... 26
 

ii

1.3.6. Các phương pháp nhân giống Lan Hồ Điệp ............................. 28
1.3.6.1. Phương pháp nhân giống truyền thống ............................ 28
1.3.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại .................................... 30
1.4. Giới thiệu hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TIS ................ 32
1.4.1. Giới thiệu ................................................................................. 32
1.4.2. Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống ................... 33
1.4.3. Phân loại hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ..................... 34
1.4.3.1. Hệ thống thùng nghiêng và hệ thống Rocker ................... 35
1.4.3.2. Hệ thống ngập hoàn toàn và cơ chế thay mới môi trường
dinh dưỡng ....................................................................... 35
1.4.3.3. Hệ thống ngập một phần và cơ chế thay mới môi trường
dinh dưỡng ....................................................................... 36
1.4.3.4. Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường
lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi
trường............................................................................... 37
1.4.4. Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ......................... 38
1.4.4.1. Hệ thống RITA® .............................................................. 38
1.4.4.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT® ........................................... 39
1.4.4.3. Hệ thống Plantima® ......................................................... 40
1.4.5. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân
giống trên thế giới và ở Việt Nam ........................................... 42
1.4.5.1. Thành tựu trên thế giới ................................................... 42
1.4.5.2. Thành tựu ở Việt Nam .................................................... 46
1.4.6. Ưu và nhược điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
................................................................................................. 47
1.4.6.1. Ưu điểm .......................................................................... 47
1.4.6.2. Nhược điểm ................................................................... 48
 

iii


1.5. Môi trường nuôi cấy in vitro.......................................................... 49
1.5.1. Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy ............ 49
1.5.2. Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy in vitro
................................................................................................. 49
1.5.3. Thành phần các chất khoáng vô cơ .......................................... 50
1.5.3.1. Khoáng đa lượng ............................................................. 50
1.5.3.2. Khoáng vi lượng .............................................................. 52
1.5.4. Carbon và nguồn năng lượng ................................................... 54
1.5.5. Vitamin .................................................................................... 55
1.5.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật .................................... 55
1.5.7. Một số yếu tố khác trong môi trường nuôi cấy mô Lan ........... 55
1.5.7.1. Các chất hấp phụ phenol .................................................. 55
1.5.7.2. Nước dừa và các dịch chiết khác ..................................... 56
1.5.7.3. Yếu tố làm đặc môi trường .............................................. 57
1.5.7.4. Ảnh hưởng của pH ........................................................... 58
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................... 59
2.1. Địa điểm thí nghiệm ....................................................................... 59
2.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................ 59
2.2.1. Vật liệu .................................................................................... 59
2.2.2. Môi trường nuôi cấy ................................................................ 61
2.2.3. Điều kiện thí nghiệm................................................................ 61
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 61
2.3.1. Cách pha môi trường ............................................................... 61
2.3.1.1. Cách pha dung dịch mẹ .................................................... 61
2.3.1.2. Cách pha môi trường cấy ................................................. 62
2.3.2. Hấp khử trùng .......................................................................... 62

2.3.2.1. Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy ................................. 62
 

iv


2.3.2.2. Hấp khử trùng dụng cụ nuôi cấy ...................................... 62
2.3.3. Các thao tác trong phòng cấy ................................................... 63
2.3.4. Cách bố trí thí nghiệm ............................................................. 64
2.3.4.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích
hợp để vi nhân giống........................................................ 64
2.3.4.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ
thống Plantima của Đài Loan ........................................... 67
2.3.4.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sự nhân nhanh PLB trong hệ
thống Plantima của Đài Loan ........................................... 68
2.4. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu......................................... 69
2.5. Chuyển cây con ra vườn ươm ....................................................... 69
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 70
3.1. Thí nghiệm 1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp để
vi nhân giống.................................................................................. 70
3.1.1. Thí nghiệm 1.1: Thiết lập môi trường và điều kiện thích hợp
để khởi tạo và nhân nhanh PLB ............................................... 70
3.1.1.1. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa
PLB từ mẫu lá .................................................................. 70
3.1.1.2. Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu để nhân nhanh
PLB .................................................................................. 74
3.1.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của đường lên sự nhân nhanh PLB
......................................................................................... 79
3.1.2. Thí nghiệm 1.2: Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLB. .................. 83
3.1.3. Thí nghiệm 1.3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ

của chồi Lan Hồ Điệp ............................................................. 87
3.2. Thí nghiệm 2: Thiết lập nuôi cấy vô trùng trong hệ thống
Plantima của Đài Loan ................................................................. 89
 

v


3.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu nhân nhanh PLB trong hệ thống
Plantima của Đài Loan ................................................................. 93
3.3.1. Thí nghiệm 3.1: Khảo sát mật độ nuôi cấy, thể tích môi
trường lên nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima .............. 93
3.3.2. Thí nghiệm 3.2: Khảo sát ảnh hưởng của tần suất ngập lên
quá trình nhân nhanh PLB trong hệ thống Plantima .............. 101
3.4. Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của cây Hồ Điệp ngoài
vườn ươm ..................................................................................... 106
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................. 109
4.1. Kết luận ........................................................................................ 109
4.1.1. Thiết lập môi trường vi nhân giống ....................................... 109
4.1.2. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân
giống cây lan Hồ Điệp lai Dtps. Taida Salu cho phép đưa ra
các kết luận sau...................................................................... 109
4.2. Đề nghị .......................................................................................... 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 111
PHỤ LỤC ................................................................................................. 118

 

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
----- ----BA

6- benzylaminopurine

MS

Murashige và Skoog (1962)

PVP

Polyvinylpyrolidone

NAA

 - naphthaleneacetic acid

FeEDTA

Ferric Ethylenediamine - tetraacetic Acid

PLB

Protocom like body

TIS

Temporary Immersion System (hệ thống
nuôi cấy ngập chìm tạm thời)

CW

Nước dừa

CA

Than hoạt tính

SPSS

Chương trình Statistical Program Scientific
System

APCS

Automated Plant Culture System (hệ thống
nuôi cấy thực vật tự động)

RITA

The Recipient for Automated Temporary
Immersion System

 

TP. HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

ĐHSTTV

Điều hòa sinh trưởng thực vật

NN& PTNT

Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

vii


DANH MỤC BẢNG
----- ----Bảng 1.1. Thành phần các chất khoáng vô cơ trong một số môi trường
nuôi cấy thông dụng (mg/l) ........................................................ 53
Bảng 2.1. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất
ĐHSTTV lên sự hình thành PLB từ lá ....................................... 65
Bảng 2.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự
nhân PLB ................................................................................... 65
Bảng 2.3. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của loại đường và nồng độ
đường sử dụng lên sự nhân PLB ................................................ 66
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHSTTV lên sự hình thành
PLB từ lá .................................................................................... 70
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân nhanh PLB từ một
PLB ban đầu............................................................................... 74
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB .......................... 79
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB của giống 1
(Dtps. Taida Salu) ...................................................................... 83
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB của giống 2
(Dtps. Taida FireBird) ............................................................... 84
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của NAA lên sự ra rễ của hai giống Lan Hồ Điệp

.................................................................................................. 87
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự nhân nhanh PLB trên
hệ thống Plantima...................................................................... 93
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân
nhanh PLB ................................................................................ 97
 

viii


Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB .............. 101
Bảng 3.10. So sánh hệ số nhân PLB của các hệ thống nuôi cấy khác nhau
................................................................................................. 103

 

ix


DANH MỤC HÌNH
----- ----Hình 1.1. Lan Hồ Điệp ấn .......................................................................... 14
Hình 1.2. Lan tiểu Hồ Điệp ........................................................................ 14
Hình 1.3. Phalaenopsis cornu x cervi ........................................................ 15
Hình 1.4. Sự đa dạng và phong phú về màu sắc, hình dáng Lan Hồ Điệp
................................................................................................... 17
Hình 1.5. Keiki của Lan Hồ Điệp .............................................................. 20
Hình 1.6. Nhện đỏ hại Lan ......................................................................... 24
Hình 1.7. Hệ thống APCS của Tisserat và Vandercook, (1985). ............... 35
Hình 1.8a. Hệ thống của Aitken – Christie và Davies (1988) ..................... 37
Hình 1.8b. Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991) ................................ 37

Hình 1.9. Hệ thống RITA®......................................................................... 39
Hình 1.10. Hệ thống bình đôi BIT® ............................................................. 40
Hình 1.11. Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan ............................ 41
Hình 1.12. Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập ........... 41
Hình 1.13. Hệ thống Plantima ...................................................................... 42
Hình 2.1. Các giống Lan Hồ Điệp sử dụng trong các thí nghiệm .............. 60
Hình 3.1. PLBs hình thành từ mẫu lá nuôi cấy trên các môi trường
khác nhau ................................................................................... 73
Hình 3.2. PLBs và chồi của giống 1 (Dtps. Taida Salu) trên các môi
trường MS có nồng độ chất ĐHSTTV khác nhau ...................... 77
Hình 3.3. PLBs và chồi của giống 2 (Dtps. Taida Firebird) trên các môi
trường MS có nồng độ chất ĐHSTTV khác nhau ...................... 78
 

x


Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại và nồng độ đường khác nhau lên sự
nhân nhanh PLBs của giống 1 và 2 trên môi trường MS ½........ 82
Hình 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi từ PLB ......................... 86
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các nồng độ NAA khác nhau lên sự ra rễ và
sinh trưởng chồi của hai giống Lan Hồ Điệp giống 1 và giống
2 ................................................................................................. 88
Hình 3.7. Sự sinh trưởng và phát triển của Lan Hồ Điệp trong bình
Plantima .................................................................................... 92
Hình 3.8. Ảnh hưởng mật độ mẫu cấy lên sự nhân nhanh PLBs................ 96
Hình 3.9. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự nhân
nhanh PLBs .............................................................................. 100
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân nhanh PLBs
................................................................................................ 105

Hình 3.11. Cây con Lan Hồ Điệp giai đoạn vườn ươm ............................ 107
Hình 3.12. Tóm tắt qui trình nhân giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp.
có sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời................................. 108

 

xi


DANH MỤC ĐỒ THỊ
----- ----Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự nhân nhanh PLB từ một
PLB ban đầu............................................................................... 75
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của 2 loại đường lên sự nhân PLB .......................... 81
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy đến sự nhân nhanh PLB trên
hệ thống Plantima....................................................................... 94
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên việc nhân
nhanh PLB ................................................................................. 98
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của tần suất ngập chìm lên sự nhân PLB............... 102

 

xii


 

 

xiii

Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) nói chung với các loại Lan
khác nói riêng được xem là cây trồng đem lại nhiều hiệu quả kinh tế cao; do
đó đã có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ
lúa, hoa màu sang trồng Lan và đạt hiệu quả kinh tế cao gấp 2 - 3 lần so với
cây trồng khác. Lan Hồ Điệp là một trong những lồi Lan q đang rất được
ưa chuộng và đóng vai trò quan trọng trong ngành cơng nghiệp hoa cắt cành
cũng như cây cảnh trên thế giới. Chúng khơng chỉ đẹp về màu sắc, kiểu dáng
mà còn mang một vẻ đẹp sang trọng và trang nhã.
Tuy nhiên, số lượng sản xuất cây Lan hiện nay vẫn chưa đáp ứng được
nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Ngun nhân do Lan Hồ Điệp là lồi
sinh trưởng chậm và là một lồi Lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số
nhân thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống
chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất còn gặp nhiều khó khăn.
Hiện tại có một số trường Đại Học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển
trên những kỹ thuật mới như: Bioreactor, Ni cấy quang tự dưỡng… nhưng
vẫn chưa được áp dụng rộng rãi.
Trong những năm gần đây, phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng
đối với cây Lan Hồ Điệp nhằm tạo cây giống sạch bệnh rất được quan tâm.
Tuy nhiên phương pháp này thực hiện khó thành cơng vì đỉnh sinh trưởng
q nhỏ nên khơng thể tái sinh hoặc chết đi qua các lần khử trùng. Lan Hồ
Điệp là loại Lan đơn thân, thân ngắn và mỗi cây cho một đỉnh sinh trưởng
nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi
phí q trình ni cấy. Vì vậy, hiện nay các nhà ni cấy mơ trong nước

SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

1

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

cũng như trên thế giới thường dùng phát hoa làm vật liệu ni cấy, phát hoa
Lan Hồ Điệp có chứa các mắt ngủ có thể tạo thành chồi. Do đó, phương
pháp ni cấy phát hoa in vitro để tạo chồi được xem là đặc trưng ở Lan Hồ
Điệp nhưng hệ số nhân giống từ phương pháp này cũng rất thấp.
Gần đây, các hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời đã được nhiều
nước trên thế giới triển khai và ứng dụng trong nhân giống nhiều loại cây
trồng. Hệ thống này có tác dụng làm tăng cường sức sống của chồi và tăng
khả năng tạo phơi soma, phơi được tạo ra khơng bị biến dị; loại bỏ được hiện
tượng thủy tinh thể khi ni cấy lỏng. Thực vật được nhân giống trong hệ
thống ngập chìm có khả năng thích nghi tốt hơn trong giai đoạn thuần hóa
ngồi vườn ươm so với các thực vật được ni cấy trong hệ thống bán rắn
hay lỏng.
Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời trong nhân giống hoa
kiểng đặc biệt là Lan Hồ Điệp ở Việt Nam chỉ mới được ứng dụng trong thời
gian gần đây. Với mục đích là khảo sát khả năng ứng dụng hệ thống này
trong nâng cao số lượng cũng như chất lượng của cây giống Lan Hồ Điệp
khi so sánh với các hệ thống ni cấy thơng thường Th.S. Cung Hồng Phi
Phượng và các cộng sự đã ứng dụng thành cơng hệ thống góp phần mở ra
khả năng sản xuất với số lượng lớn cây giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu

cầu thị trường tại Việt Nam.
Để từng bước áp dụng cơng nghệ mới trong sản xuất cây Lan giống ở
nước ta, đẩy nhanh tiến độ sản xuất cây giống theo qui mơ cơng nghiệp, góp
phần khắc phục sự thiếu hụt cây giống trên thị trường. Qua đề tài "NHÂN
GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP PHALAENOPSIS SP. BẰNG KỸ THUẬT NI
CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS – Temporary Immersion System)" với
mong muốn có thể tìm hiểu rõ về kỹ thuật ni cấy này cũng như những ưu
SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

2

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

điểm nhân giống Lan Hồ Điệp bằng ni cấy ngập chìm so với những
phương pháp ni cấy khác. 
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho sự biệt hóa PLB từ mẫu
lá, đồng thời tìm mơi trường thích hợp cho sự ra rễ của các chồi Lan Hồ
Điệp nhằm thiết lập nhân nhanh giống cây Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp.
bằng kỹ thuật ni cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion
System).
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đề tài nghiên cứu nồng độ các khống đa lượng trong mơi trường MS
và ảnh hưởng của nồng độ và loại đường lên sự nhân nhanh PLB của Lan
Hồ Điệp. Qua đó khảo sát việc nhân nhanh PLB bằng hệ thống ni cấy

ngập chìm tạm thời Plantima của Đài Loan trên đối tượng Phalaenopsis
Dtps. Taida Salu.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu
Ý nghĩa khoa học:
Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời TIS thuộc dạng bioreator đơn
giản. Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã xác định việc áp dụng cơng nghệ TIS
trong vi nhân giống cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao, chất lượng cây
giống tốt, nâng cao hệ số nhân chồi gấp 3 - 20 lần so với phương pháp nhân
truyền thống, rút ngắn được thời gian ni cấy trong phòng, góp phần làm
giảm giá thành sản phẩm cây giống.
Ý nghĩa thực tiễn:
Áp dụng hệ thống TIS trong vi nhân giống hoa Lan ở nước ta là một
cơng nghệ mới, nó sẽ mở ra triển vọng cho việc sản xuất cây giống theo qui
mơ cơng nghiệp, đáp ứng đủ lượng cây trồng với chất lượng cao cho sản
xuất trong nước và cho xuất khẩu.
SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

3

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

Cây Lan giống sản xuất bằng hệ thống TIS trong nước giúp người
nơng dân chủ động sản xuất, hạn chế nhập cây giống từ nước ngồi, góp
phần ngăn chặn được dịch bệnh lây lan từ nước ngồi qua con đường cây
giống.

5. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp ni cấy PLB trong hệ thống ni cấy ngập
chìm tạm thời, nghiên cứu trên 5 giống Lan Hồ Điệp chủ yếu là giống 1
(Dtps. Taida Salu) và giống 2 (Dtps. Taida Firebird). Thí nghiệm bố trí kiểu
đầy đủ và ngẫu nhiên hồn tồn.

SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

4

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu sơ lược về kỹ thuật ni cấy in vitro
1.1.1. Lịch sử và những thành tựu đạt được trong ni cấy in vitro
Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức, Schleiden và Schwanm
đưa ra thuyết tế bào và nêu rõ mọi cơ thể sinh vật có phức tạp tới đâu thì đều
có cấu tạo đơn vị rất nhỏ là tế bào.
Năm 1902, Haberlandt thực hiện ni cấy tế bào thực vật đầu tiên từ
lá của một số cây một lá mầm như: Errythronium, Orrnithogalum…
Năm 1922, Kotte và Robins lập lại thí nghiệm của Haberlandt nhưng
trên đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo, trên mơi trường lỏng có muối
khống và glucose. Tuy nhiên sự sinh trưởng này chỉ kéo dài trong thời gian
ngắn.
Năm 1934, White và Gautheret đã ni cấy thành cơng rễ cà chua trên

mơi trường muối khống và dịch chiết nấm men. Cùng thời điểm Nobecourt
và Gautheret duy trì sự sinh trưởng của mơ sẹo cà rốt.
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều
khiển sự nhân chồi.
Năm 1955, các chất kích thích sự phân bào được Skoog đặt tên là
kinetin và gộp với các chất kích thích phân bào tự nhiên gọi là cytokinin.
Năm 1956, Morel, học trò của Gautheret, áp dụng thành cơng ni
cấy mơ vào cây Lan (Cymbidium) tạo ra các protocorm.
Năm 1960 – 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vơ tính Lan
bằng ni cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó, Lan được xem là cây ni
cấy mơ đầu tiên được thương mại hóa.

SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

5

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

Đến nay, hầu hết các giống Lan đã được nhân giống nhanh bằng
phương pháp ni cấy mơ như: Dendrobium, Cattleya, Phalaenopsis, Ngọc
Điểm... và ngay cả Lan Hài nổi tiếng của Việt Nam.
1.1.2. Các bước nhân giống in vitro
Nhân giống vơ tính các cây trồng in vitro gồm các giai đoạn sau:
- Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy.
- Tạo thể nhân giống in vitro.

- Nhân giống in vitro.
- Tái sinh cây in vitro hồn chỉnh.
- Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm.
1.1.3. Các kỹ thuật ni cấy in vitro
1.1.3.1. Ni cấy nốt đơn thân
Sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có mang một đoạn thân
ngắn. Chồi này được kích thích tăng trưởng, ra rễ tạo cây ngun vẹn, nhiều
chồi và lá được hình thành. Tiếp tục cấy chuyền trên mơi trường dinh dưỡng
thích hợp đến khi đủ số lượng chồi cần thiết để chúng được cảm ứng ra rễ
trở thành cây con hồn chỉnh và được chuyển ra trồng trong đất.
1.1.3.2. Ni cấy chồi bên
Về ngun tắc, phương pháp này giống như phương pháp ni cấy nốt
đơn thân. Nhưng khác nhau là trong phương pháp ni cấy nốt đơn thân có
sự kéo dài chồi, thân và thường khơng cần đến cytokinin để phát triển. Còn
phương pháp nhân chồi bên, chồi được cơ lập trên mơi trường dinh dưỡng
và các chồi bên từ nách lá phát triển dưới tác dụng của cytokinin nồng độ
cao. Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi
bên có thể phát triển.
1.1.3.3. Ni cấy đỉnh sinh trưởng
Chồi ngọn được rửa sạch và khử trùng bằng cồn, hypochlorite
SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

6

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

calcium. Sau đó dùng dao mổ tách rời đỉnh sinh trưởng (gồm vùng mơ phân
sinh và cả phần dưới ngọn) ra khỏi ngọn và cấy trên mơi trường tái sinh cây
hồn chỉnh. Với phương pháp này, chúng ta tạo được cây sạch bệnh, sạch
virus.
1.1.3.4. Ni cấy mơ sẹo
Tạo mơ sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào năm 1920, mơ sẹo là một
khối tế bào khơng có tổ chức, hình thành từ các mơ hoặc cơ quan đã phân
hố dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý hố chất, tia phóng xạ,...).
Các tế bào của mơ sẹo phải chịu sự phản phân hố trước lần phân chia đầu
tiên (Halperin, 1969).
Mơ sẹo tăng trưởng nhanh trên mơi trường có chất auxin và trong mơi
trường khơng có chất kích thích thì mơ sẹo có thể tái sinh thành cây hồn
chỉnh. Cụm mơ sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là ni cấy
đỉnh sinh trưởng, nhưng khả năng bị biến dị tế bào soma lại cao hơn.
1.1.3.5. Ni cấy huyền phù tế bào
Huyền phù tế bào được tạo từ các mảnh mơ sẹo ni cấy trong mơi
trường lỏng lắc liên tục. Trong mơi trường lỏng, mơ sẹo phóng thích ra
những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào dính nhau để hấp thụ các chất
dinh dưỡng. Sau đó tế bào được chuyển sang mơi trường đặc để tái sinh
thành cây.
1.1.3.6. Ni cấy thể đơn bội
Cây thể đơn bội mang bộ nhiễm sắc thể giảm đi một nửa, sử dụng
những phần sau cho việc ni cấy in vitro:
- Túi phấn: Thu túi phấn từ chồi hoa thì chỉ khử trùng chồi hoa. Còn
thu túi phấn của hoa đã nở thì phải khử trùng túi phấn.
- Hạt phấn: Được ni cấy trên mơi trường để tạo mơ sẹo.
- Cụm hoa: Thường ni cấy trong mơi trường lỏng.
SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

7

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

1.1.3.7. Ni cấy protoplast (tế bào trần)
Tế bào thực vật được xử lý bằng hố lý để tách lớp vỏ cenlulose,
nhưng vẫn còn giữ chức năng của tế bào. Trong mơi trường thích hợp,
protoplast có thể phân chia tế bào hay tái sinh thành cây (Nguyễn Đức
Lượng, 2002).
Với cách ni cấy này, ta có thể áp dụng để chuyển gene vào tế bào
trần hay tạo cây đa bội bằng cách dung hợp hai tế bào trần với nhau.
1.1.4. Ưu và nhược điểm của kỹ thuật nhân giống in vitro
1.1.4.1. Ưu điểm
Thuận lợi của phương pháp vi nhân giống trên mơi trường bán rắn so
với phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép...) là:
- Những cây nhân giống in vitro đồng nhất về di truyền.
- Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mơ và cơ quan khác nhau
của cây như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt
phấn… mà ngồi tự nhiên khơng thể thực hiện được.
- Hệ số nhân cao, sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một
thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại.
- Được ni cấy trong điều kiện vơ trùng, cây khỏe mạnh, sạch virus
thơng qua xử lý nhiệt hay ni cấy đỉnh sinh trưởng.
- Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm sốt được các yếu tố ngoại
cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…

- Tạo cây có khả năng ra hoa, tạo quả sớm.
- Tạo dòng tồn cây cái (cây chà là) hoặc tồn cây đực (cây măng
tây) theo mong muốn.
- Dễ dàng tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chuyển gen.

SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

8

MSSV: 0811110086


Khóa Luận Tốt Nghiệp

GVHD: Th.S. Trònh Thò Lan Anh

Ngồi ra, phương pháp vi nhân giống còn giảm được nhiều cơng sức
chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài và chiếm ít khơng gian so với phương
pháp nhân giống truyền thống.
1.1.4.2. Nhược điểm
Dễ xuất hiện các biến dị soma trong q trình ni cấy, đặc biệt tái
sinh qua mơ sẹo.
Q trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần
khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngồi vườn ươm.
Nhân giống trên mơi trường bán rắn có giá thành sản xuất vẫn còn cao
(do sử dụng agar) và thời gian cấy chuyền dài. Khi sản xuất ở qui mơ cơng
nghiệp, chi phí cho năng lượng và nhân cơng vẫn còn rất lớn.
Sự đa dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế cụ thể như đối
với các lồi ngũ cốc và sự tái hình thành cây in vitro thường khó xảy ra, đặc
biệt với các cây thân gỗ.

1.2. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất hoa Lan trên thế giới
Hiện nay nhu cầu về hoa Lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày
càng tăng và mang lại lợi nhuận kinh tế cao. Tỷ lệ hàng năm của ngành sản
xuất hoa trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỉ USD. Trong năm 2000, kim
ngạch xuất nhập khẩu của Lan cắt cành và cây Lan trên thế giới đạt 150 triệu
USD, trong đó Lan cắt cành đạt 128 triệu USD.
Thị trường tiêu thụ hoa Lan ở Châu Âu rất hấp dẫn. Năm 2006, khối
EU có sản lượng xuất khẩu hoa Lan trên thế giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang
lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa Lan là 73 EUR. Trong đó, Hà Lan là
quốc gia duy nhất ở Châu âu có cơng nghiệp trồng Lan xuất khẩu, do trồng
nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời là đầu mối
trung gian nhập khẩu hoa Lan (37%) từ các nước khác trên thế giới. Năm
SVTH: Ưng Thò Mỹ Tiên

9

MSSV: 0811110086