Xây dựng quy trình phát hiện microsporidla trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng kỹ thuật PCR và realtime PCR

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
----------

PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU
BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR
VÀ REALTIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
----------

PHẠM QUỲNH TRANG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MICROSPORIDIA TRÊN MẪU
BỆNH PHẨM VIÊM LOÉT GIÁC MẠC BẰNG KỸ THUẬT PCR
VÀ REALTIME PCR

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Văn Long

Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương quân đội 108

Thái Nguyên - 2017


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu cửa tôi dưới sự hưỡng dẫn
của TS. Nguyễn Văn long. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai
công bố trong một công trình nào khác.
Thái nguyên,

tháng 11 năm 2017
Tác giả

Phạm Quỳnh Trang


ii

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu
sắc tới TS. Nguyễn Văn Long đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong
suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Bs. Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện để
tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân
đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân

đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học,
Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ,
giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này.
Thái Nguyên,

tháng 11 năm 2017
Học viên

Phạm Quỳnh Trang


iii

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC VIẾT TẮT................................................................................................ix
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1.
Đặt
vấn
....................................................................................................................1

đề

2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................2
CHƯƠNG I......................................................................................................................3

TỔNG QUAN..................................................................................................................3
1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc ...............................................................................3
1.1. Giác mạc ...........................................................................................................4
1.1.1. Biểu mô ....................................................................................................4
1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann ...................................................................5
1.1.3. Nhu mô ......................................................................................................5
1.1.4. Màng Descemet .........................................................................................5
1.1.5. Nội mô .......................................................................................................5
1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc ...........................................................6
1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc ...........................6
1.3.1. Triệu chứng cơ năng ..................................................................................6
1.3.2. Triệu chứng thực thể..................................................................................7
2. Microsporidia .........................................................................................................8
2.1. Giới thiệu chung ...............................................................................................8
2.2. Bệnh học và nguy cơ ......................................................................................11
2.3. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia ...............................................12
2.4. Chẩn đoán viêm loét giác mạc........................................................................12
2.5. Các phương pháp phát hiện Microsporidia ....................................................13
2.5.1. Chẩn đoán phân biệt ...................................................................................13
2.5.2. Chẩn đoán xác định .................................................................................14


iv
3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong điều trị Microsporidia gây bệnh
viêm loét giác mạc ở Việt Nam. ............................................................................19
3.1. Tình hình điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam
hiện nay..................................................................................................................19
3.2. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng phương pháp PCR và Realtime
PCR để điều trị Microsporidia gây bệnh viêm loét giác mạc ở Việt Nam. ..........20
Chương II.......................................................................................................................22

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP........................................................................................22
1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................22
2. Hóa chất, thiết bị....................................................................................................22
2.1. Hóa chất ..........................................................................................................22
2.2. Thiết bị, máy móc ...........................................................................................23
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................24
2.3.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số .....................................................24
2.3.2. Phương pháp xác định nồng độ và đo độ tinh sạch bằng máy quang phổ
...........................................................................................................................25
2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................25
2.3.4. Phương pháp xác định trình tự axit nucleic.............................................26
2.3.5. Xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng phương pháp PCR và
Realtime PCR ....................................................................................................28
2.3.5.1. Xác định độ nhạy của phương pháp PCR và Realtime PCR................30
CHƯƠNG III .................................................................................................................36
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................................36
3.1. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR và
Realtime PCR ........................................................................................................36
3.2. Đánh giá độ nhạy, đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR ..................39
3.2.1. Đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR và Realtime PCR...........................39
3.2.2. Đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và Realtime PCR .....................41
3.3. Thiết kế tạo plasmid chuẩn dương Microsporidia .........................................43
3.4. Thử nghiệm kỹ thuật PCR và Realtime PCR phát hiện Microsporidia trên các
mẫu bệnh phẩm viêm kết giác mạc mắt ................................................................46


v
KẾT LUẬN ...................................................................................................................53
KIẾN NGHỊ...................................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................55

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Biểu đồ thể hiện các tác nhân gây ra tai nạn về mắt trong lao động sản
xuất (theo thống kê hàng năm của BV Mắt TP HCM)(%) .................................. 3
Hình 2. Thiết đồ cắt dọc giác mạc......................................................................... 4
Hình 1.3. Hình ảnh minh họa Microsporidia...................................................... 10
Hình 1.4. Nguyên lí của phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman ..... 18
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA
ribosomal của Microsporidia.. ............................................................................ 36
Hình 3.2. Minh họa kết quả giải trình tự đoạn gen (SSU) rRNA Microsporidia
từ bệnh phẩm chất nạo giác mạc của bệnh nhân KHUYEN. .............................. 37
Hình 3.3. Kết quả so sánh trực tuyến trình tự đoạn gen từ mẫu
Microsporidia_KHUYEN.scf với ngân hàng gen thế giới. ................................ 38
Hình 3.4. Kết quả khuếch đại tiểu phần nhỏ RNA ribosomal của Microsporidia
bằng phản ứng Realtime PCR. ............................................................................ 39
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật PCR
phát hiện Vittaforma corneae.. ............................................................................ 40
Hình 3.6. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime phát
hiện Vittaforma corneae. ..................................................................................... 41
Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR
phát hiện Microsporidia. ..................................................................................... 42
Hình 3.8. Kết quả Realtime PCR đánh giá độ đặc hiệu của kỹ thuật Realtime
PCR phát hiện Microsporidia. ............................................................................ 42
Hình 3.9a. Kết quả điện di sản phẩm PCR clony kiểm tra kết quả phản ứng
ligation tạo plasmid chuẩn dương microsporida bằng cặp mồi vector M13....... 43
Hình 3.9b. Kết quả điện di sản phẩm plasmid PCR bằng cặp mồi vector M13
trên plasmid nghi ngờ mang đoạn gen Microsporidia. .......................................

44
Hình 3.10. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia
pha loãng nồng độ. .............................................................................................. 45


vii

Hình 3.11. Kết quả Realtime PCR trên mẫu plasmid chuẩn dương Microsporidia
pha loãng nồng độ. .............................................................................................. 45
Hình 3.12. A,B. Kết quả điện di PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện
Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 47
Hình 3.13 A. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện
Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 47
Hình 3.13 B. Kết quả Realtime PCR 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện
Mắt Trung Ương. ................................................................................................ 48


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại trình tự đoạn gen
tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng cặp mồi
MF1&MF2 .......................................................................................................... 28
Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá chất lượng ADN sau
tách chiết sử dụng cặp mồi Betaglobin F và Betaglobin R .................................
29
Bảng 2.3. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR khuếch đại trình tự
đoạn gen tiểu phần nhỏ small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia sử dụng
cặp mồi MSRT1&MSRT2 và probe MSRT ....................................................... 30
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ nhạy của phương

pháp ..................................................................................................................... 30
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ nhạy
của phương pháp ................................................................................................. 31
Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá độ đặc hiệu của
phương pháp ........................................................................................................ 32
Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng Realtime PCR đánh giá độ đặc
hiệu của phương pháp ......................................................................................... 32
Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid ........................ 33
chuẩn dương ........................................................................................................ 33
Bảng 2.9. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tạo plasmid ........................ 34
chuẩn dương ........................................................................................................ 34
Bảng 3.1. Bảng pha loãng ADN tổng số từ mẫu bệnh phẩm chẩn đoán dương
tính với Vittaforma corneae ................................................................................ 40
Bảng 3.2. Bảng tổng hợp số liệu kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu
bệnh phẩm lâm sàng bằng 3 phương pháp nhuộm soi, PCR, realtime PCR....... 49
Bảng 3.3. Kết quả phát hiện Microsporidia trên 30 mẫu bệnh phẩm lâm sàng......
50


ix

DANH MỤC VIẾT TẮT
AND

Axit deoxyribonucleic

RNA

Axít ribonucleic

SUU

Small-subunit

VLGM

Viêm loét giác mạc


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Viêm loét giác mạc là một bệnh phổ biến nhất trong các bệnh về mắt. Bệnh
phân bố trên toàn thế giới với tỷ lệ từ 17% đến 36% trong bệnh viêm loét giác
mạc nói chung. Tuy vậy, tại các quốc gia có khí hậu nóng, ẩm tỷ lệ bệnh cao
hơn, như ở Ấn độ tỷ lệ bệnh từ 44% đến 47%. Mặt khác, bệnh cũng có liên quan
đến các chấn thương giác mạc và việc sử dụng thuốc không đúng chỉ định
Giác mạc không chỉ dễ bị viêm loét do những tác nhân từ bên ngoài mà
cũng có thể là do mắt chưa được chăm sóc và bảo vệ đúng cách từ bên trong. Có
nhiều tác nhân gây ra vết loét bị nhiễm trùng; thường là do sự tấn công của các
loại vi khuẩn (tụ cầu, liên cầu, phế cầu, lậu cầu, trực khuẩn mủ xanh,
Moraxella,.), do nấm (Aspergillus fumigatus, Fusarium solant, Candida
albicans, Histoblasma,..), do virus (Herpes simplex, Herpes zoster) hoặc do ký
sinh trùng (Acanthamoeba).
Theo các báo cáo gần đây, tỷ lệ viêm loét giác mạc do Microsporidia ngày
càng tăng, nhất là ở các nước vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm như nước ta,
chiếm 0,4% các trường hợp mắc viêm giác mạc do vinh sinh vật gây ra [13].
Loài kí sinh này có thể gây bệnh ở mọi lứa tuổi và nguồn nước không đảm bảo
vệ sinh là tác nhân lây truyền bệnh. Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử,

kí sinh nội bào, được tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Bệnh nhân bị
nhiễm Microsporidia biểu hiện các triệu chứng trên lâm sàng như: tiêu chảy cấp,
viêm thành phế nang, viêm loét giác mạc, viêm phế quản, viêm thận, viêm niệu
đạo, viêm tuyến tiền liệt, viêm gan, viêm não, viêm cơ và viêm phúc mạc. Triệu
chứng phổ biến hay gặp nhất ở người liên quan đến bệnh tiêu hóa kết hợp nhiễm
HIV.
Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán
nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh
cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia.
Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực


hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electron
microscopy). Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòi
hỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụng
thường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh
quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia,
tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế về
kháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại
bỏ trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã
làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ
thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng. Hiện
nay, ở Việt Nam chưa có nhiều công bố về việc sử dụng công nghệ sinh học
phân tử trong việc hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh viêm loét giác mạc do
Microsporida gây ra. Do đó, để hỗ trợ giúp đỡ cho khả năng chẩn đoán nhanh
phát hiện Microsporida chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy
trình phát hiện Microsporidia trên mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc bằng
kỹ thuật PCR và Realtime PCR.”
1.Mục tiêu của đề tài:
Xây dựng và tối ưu hóa phản ứng PCR và Realtime PCR để phát hiện ra

Microsporidia trên các mẫu bệnh phẩm viêm giác mạc.
2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật PCR trên
mẫu bênh phẩm viêm giác mạc.
- Xây dựng được quy trình phát hiện Microsporidia bằng kỹ thuật Realtime
PCR trên mẫu bênh phẩm viêm giác mạc.
- Áp dụng kỹ thuật PCR và Realtime PCR vào việc phát hiện Micrisporidia
trên các mẫu bệnh phẩm viêm loét giác mạc tại Việt Nam.


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN
1. Bệnh mắt - Viêm loét giác mạc
Viêm loét giác mạc (VLGM) là bệnh nhiễm trùng nặng ở mắt do vi sinh vật
bao gồm vi khuẩn, nấm, virut, kí sinh trùng.v.v… Bệnh viêm loét giác mạc
thường tiến triển nặng, gây nhiều biến chứng và khi khỏi để lại sẹo dày ở giác
mạc gây mờ đục giác mạc, làm giảm thị lực nghiêm trọng [1, 8].
Ở các nước phát triển như Mỹ, Tây Âu tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm
chiếm khoảng 3% trong tổng số các nguyên nhân gây viêm loét giác mạc. Tỷ lệ
này cao hơn ở các nước đang phát triển như: Ấn Độ, Nê-pan, Băng-la-đét...(dao
động từ 20% đến 60%) [8, 9, 13, 14]. Ở Việt Nam, tại bệnh viện Mắt trung ương
trong 10 năm (1998 - 2007) trong số 3210 bệnh nhân viêm loét giác mạc được
điều trị nội trú thì viêm loét giác mạc chiếm tỷ lệ cao nhất, chiếm tới 50,8% [1].
Có nhiều nguyên nhân gây ra viêm loét giác mạc như: vi khuẩn, vi rút,
nấm, kí sinh trùng, Microsporidia… Tỷ lệ gặp các tác nhân gây bệnh này thay
đổi theo thời gian do có sự thay đổi về môi trường, kinh tế, các yếu tố nguy cơ
và sự hiểu biết của người dân.Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu tại bệnh viện
mắt Trung ương những năm 1991- 1996 thì tỷ lệ viêm loét giác mạc do nấm khá
cao 42,11% nhưng vào năm 2004- 2005 thì tỉ lệ viêm loét giác mạc do nấm lại
được ghi nhận nhiều hơn 59,8% trong khi vi khuẩn chỉ chiếm 29,4%. Điều trị

viêm loét giác mạc tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh và mức độ trầm trọng của
bệnh. Việc điều trị viêm loét giác mạc ở nước ta hiện nay tương đối hiệu quả.
Song tỉ lệ biến chứng sẹo thủng giác mạc, giảm thị lực thậm chí mù lòa tăng lên
rất nhiều nếu việc chẩn đoán và điều trị không kịp thời. Nhất là khi điều kiện kĩ
thuật giúp chẩn đoán ở các cơ sở chưa phát triển và bệnh nhân chưa ý tức được
sự nguy hiểm của bệnh viêm loét giác mạc. Điều này không chỉ gây nên gánh
nặng cho bản thân người bệnh mà còn làm tăng gánh nặng cho gia đình và toàn
xã hội [2, 6, 7].


1.1. Giác mạc
Giác mạc là một màng xơ trong suốt, không có mạch máu, chiếm 1/5 diện
tích phía trước của vỏ nhãn cầu diện tích khoảng 123mm vuông. Bán kính độ
cong giác mạc trung bình ở người Việt Nam trưởng thành là 7,71±0,24mm
Đường kính ngang bằng 12mm, đường kính dọc bằng 11mm. Độ dày là
0,509mm ở trung tâm, 0,74mm ở sát vùng rìa. Ranh giới giữa giác mạc và củng
mạc là vùng rìa giác mạc bề rộng của vùng rìa chừng 1mm. Đây là vùng có cấu
tạo giải phẫu rất đặc biệt và vai trò sinh lý rất quan trọng của nhãn cầu [1, 8, 19].
Giác mạc được cấu tạo gồm 5 lớp từ trước ra sau, bao gồm:
- Lớp biểu mô giác mạc
- Lớp màng Bowman
- Lớp nhu mô
- Lớp màng Descemet
- Lớp nội mô

Hình 1.1. Thiết đồ cắt dọc giác mạc
1.1.1. Biểu mô
Biểu mô giác mạc là lớp ngoài cùng, liên tiếp với biểu mô của kết mạc
nhãn cầu và dễ tách ra khỏi màng Bowmann ở dưới, dày khoảng 32-50 µm, gồm
5-7 hàng tế bào không sừng hoá, có dạng trụ ở lớp đay, càng lên phía trước càng

dẹt đi [1, 8].
Biểu mô giác mạc là lớp bảo vệ, ngăn không cho các vi sinh vật xâm nhập
vào nhu mô giác mạc. Tuy nhiên, khi biểu mô toàn vẹn, các thuốc cũng rất khó
thấm qua biểu mô, nhất là các thuốc không tan trong nước [1, 8].


1.1.2. Màng đáy và màng Bowmann
Màng đáy là một màng rất mỏng nằm sát ngay dưới lớp tế bào đáy của biểu
mô (thực chất do tế bào đáy tạo thành), dày khoảng 40-60 µm [1, 8].
Màng Bowmann là một màng trong suốt, dày khoảng 12µm và khá dai. Mặt
trước có giới hạn rõ rệt, mặt sau khó phân tách với nhu mô giác mạc. Màng này
khi bị tổn thương thì không có khả năng hồi phục, ở vùng tổn thương sẽ để lại
sẹo mỏng [2, 19].
1.1.3. Nhu mô
Nhu mô chiếm 90% bề dày giác mạc, cơ bản được tạo thành bởi các lá sợi
collagen xếp song song nhau, các giác mạc bào (keratocytes) và các chất ngoại
bào. Ngoài ra trong nhu mô giác mạc còn có một số bạch cầu di động giữa các lá
collagen và các sợi thần kinh không myelin xuất phat từ thần kinh mi (thuộc
nhánh mắt của dây thần kinh số V) đi theo hình nan hoa vào lớp giữa nhu mô ở
trung tâm giác mạc, sau đó chia nhánh theo kiểu phân đôi và đi lên các lớp nông
giác mạc, qua màng Bowmann và tận cùng bằng các đầu tiếp nhận cảm giác ở
giữa các tế bào biểu mô. Do đó tổn thương giác mạc càng nông thì các triệu
chứng chủ quan của bệnh nhân càng mạnh [1, 8]. Khi nhu mô tổn thương sẽ để
lại sẹo dày.
1.1.4. Màng Descemet
Màng Descemet được cấu tạo bởi các sợi collagen dạng lưới. Màng
Descemet chỉ dày 6µm, tách khỏi nhu mô dễ dàng và có thể được tái tạo bởi lớp
nội mô. Màng Descemet rất dai, có tính đàn hồi cao nên khi bị rách hai mép dễ
thun lại và tách rời nhau khỏi chỗ tổn thương [2]. Màng Descemet tương đối bền
vững, có thể tồn tại kể cả khi giác mạc bị hoại tử gần hết nhu mô [1, 8].

1.1.5. Nội mô
Nội mô gồm một hàng tế bào hình đa giác, đường kính khoảng 20 µm, dày
4 - 6 µm với một nhân lớn chiếm gần hết tế bào, liên kết với nhau bằng những
liên kết chặt và liên kết dạng khe hở [1]. Tế bào nội mô không phân chia và số


lượng tế bào nội mô giảm dần theo tuổi tác: lúc sinh mật độ tế bào là 4000 tế
bào/mm2, số lượng tế bào giảm xuống còn khoảng 1400 - 2500 tế bào/mm2 ở
người trưởng thành. Khi mật độ tế bào chỉ còn 400 - 700 tế bào/mm2 hoặc thấp
hơn thì các tế bào nội mô còn lại sẽ mất khả năng bù trừ. Giác mạc sẽ bị ngấm
nước và trở nên phù đục mất đặc tính trong suốt [3, 8].
1.2. Yếu tố nguy cơ gây viêm loét giác mạc
- Chấn thương: làm tổn thương một phần hay toàn bộ giác mạc.
+ Chấn thương nông nghiệp: là yếu tố thường gặp nhất, chủ yếu do các tác
nhân thực vật (cành cây, gai, mảnh gỗ, hạt thóc, lá lúa,…).
+ Chấn thương công nghiệp: các dị vật bắn vào giác mạc (phoi tiện, mảnh
sắt vụn, đá….).
- Các bệnh mãn tính trên bề mặt nhãn cầu (hở mi, lông xiêu, lông quặm,
viêm giác mạc do herpes…) làm khô giác mạc và xước giác mạc.
- Liệt dây thần kinh số V: làm cho giác mạc mất cảm giác. Vì vậy, giác
mạc không được bảo vệ bởi phản xạ nhắm mắt.
- Các yếu tố nguy cơ khác: sử dụng kính tiếp xúc, phẫu thuật ở giác mạc
và kết mạc, suy giảm miễn dịch, sử dụng thuốc kháng sinh và các thuốc
corticosteroid mà không có sự kiểm soát của các bác sĩ chuyên khoa mắt, bệnh
nhân có tiền sử mắc bệnh nấm ở da, niêm mạc, nội tạng… [8, 19].
1.3. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ở viêm loét giác mạc
Viêm loét giác mạc do kí sinh trùng có biểu hiện lâm sàng rất đa dạng. Tuy
nhiên, bệnh có các triệu chứng đặc trưng. Do đó, các triệu chứng có thể giúp
định hướng chẩn đoán nguyên nhân trong trường hợp chưa có kết quả cận lâm
sàng [1, 3, 19].

1.3.1. Triệu chứng cơ năng
- Dấu hiệu kích thích mắt: sợ ánh sáng, cộm, chói, chảy nước mắt, co quắp
mi.
- Đau nhức: đau âm ỉ tại mắt, đau có thể lan ra xung quanh hốc mắt hoặc
lan lên đầu.


- Nhìn mờ: thị lực giảm nhiều hay ít phụ thuộc vào mức độ tổn thương trên
giác mạc [19].
1.3.2. Triệu chứng thực thể
Các dấu hiệu thường gặp:
- Kết mạc cương tụ rìa hoặc toàn bộ.
- Đặc điểm của ổ loét giác mạc:
+ Vị trí: có thể ở vùng rìa, cạnh trung tâm,
trung tâm hoặc toàn bộ giác mạc.
+ Màu sắc: thường có màu trắng xám và giác mạc xung quanh mờ đục do
phù nề.
+ Kích thước: từ những chấm nhỏ đến toàn bộ giác mạc.
+ Hình thái:
* Bờ ổ loét: thâm nhiễm như lông hoặc dạng sợi, trong nhu mô giác mạc có
những đường phân nhánh tỏa theo hình nan hoa từ bờ của ổ loét ra nhu mô xung
quanh được gọi là thẩm lậu dạng ngón tay hay dấu hiệu chân giả.
* Bề mặt ổ loét: bề mặt gồ cao, toàn bộ hoặc phần lớn đáy ổ loét cao hơn
giác mạc xung quanh, không có hoại tử mềm mà thô ráp khô như một miếng
màng cứng, dạng vảy.
* Áp xe giác mạc: ổ áp xe đặc chiếm hết bề dày nhu mô và tiến triển vào
tiền phòng.
* Mảng nội mô: là mảng xuất tiết trắng, dày bám mặt sau nội mô, có thể
xuất hiện trong trường hợp viêm loét giác mạc không phải do nấm. Một số
trường hợp biểu mô đã hàn gắn hoàn toàn nhưng mảng này vẫn còn tồn tại thì

nghĩ nhiều đến nấm.
* Vòng thâm nhiễm: hay còn gọi là vòng miễn dịch, là vòng trắng bao
quanh ổ loét, thường có một khoảng giác mạc lành ngăn cách với ổ loét, có thể
đây là đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh.
* Tổn thương vệ tinh: ở cạnh ổ loét và có vẻ như tách rời ổ loét.


+ Phản ứng tiền phòng: biểu hiện của một phản ứng viêm nặng ở mắt,
thường xuất hiện dấu hiệu Tyndall kèm theo nếp gấp ở màng Descemet.
* Mủ tiền phòng: là dấu hiệu thường gặp trong viêm loét giác mạc. Kí sinh
trùng có thể xuyên qua màng Descemet vào tiền phòng ngay cả khi ổ loét giác
mạc nhỏ. Có thể đó là mủ vô trùng do lắng đọng các tế bào viêm. Mủ có thể tái
phát, tái xuất hiện nhanh sau khi rửa mủ tiền phòng [16, 19].
2. Microsporidia
2.1. Giới thiệu chung
Microsporidia là kí sinh trùng dạng bào tử, kí sinh nội bào bắt buộc, được
tìm thấy lần đầu tiên vào hơn 100 năm trước. Microsporidia” không phải là một
từ thuộc phân loại học, có liên hệ đến một vi sinh vật thuộc bộ Microsporida,
ngành Microspora. Thuật ngữ về phân loại học của Microsporidia phức tạp và
thay đổi. Có 14 loài thuộc 07 họ được báo cáo gây bệnh trực tiếp cho người
(Enterocytozoon,

Encephalitozoon,

Nosema,

Pleistophora,

Vittaforma,

Trachipleistophora và Brachiola).Trong đó chỉ có hai loài được công nhận gây
bệnh trên mắt là Nosema, Vittaforma. Microsporidia ngày càng được công nhận
là tác nhân truyền nhiễm gây bệnh đường ruột, mắt, viêm xoang, phổi và tiết
niệu. Microsporidia là kí sinh trùng đơn bào nhỏ (dài 3,5-5µm và rộng 2-3µm),
hình oval, kí sinh bắt buộc nội tế bào sinh dưỡng. Theo cây phả hệ,
Microsporidia là sinh vật sinh dưỡng, bởi vì chúng có nhân thực, ribosome
giống sinh vật nhân sơ và thiếu ti thể. Có 7 chi và cả các loài Microsporidia
chưa được phân loại gây bệnh trên bệnh nhân suy giảm miễn dịch và bệnh nhân
có hệ miễn dịch khỏe mạnh [5, 20].
Phần lớn chu kỳ phát triển của Microsporidia ở dạng bào tử, là trạng thái
dễ phát hiện hơn so với ở giai đoạn tăng sinh nội bào. Bào tử kháng lại các yếu
tố bên ngoài, chúng có thể sống sót trong môi trường khắc nghiệt trong thời gian
dài. Sự hình thành ống phân cực ở hầu hết cấu trúc bào tử Microsporidia đánh
dấu sự xâm nhiễm đầu tiên vào tế bào vật chủ, với sự xâm nhiễm trực tiếp thông


qua ống phân cực của bào tử được lộn ra phía bên ngoài, tiếp đó chất nguyên
sinh bào tử (sporoplasm) được chuyển vào bên trong tế bào lây nhiễm. Có hai
giai đoạn trong chu kỳ phát triển của Microsporidia: pha bắt đầu tăng sinh
(merogony) tiếp đến là pha tạo bào tử (sporogony) [7, 11, 12].
Chỉ có 2 loài được công nhận gây viêm nhiễm ở mắt. Hai biểu hiện lâm
sàng của bệnh vi bào tử mắt là Viêm giác mạc nhu mô gây bởi Nosema corneum
trên bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh và Viêm kết giác mạc chấm nông do
dòng Encephalitozoon ở bệnh nhân AIDS hoặc người đeo kính áp tròng. Tuy
nhiên, các báo cáo hiện nay chỉ ra rằng viêm dính giác mạc cũng có thể xảy ra ở
bệnh nhân không bị suy giảm miễn dịch. Năm 2015, Phạm Ngọc Đông và cs. đã
nghiên cứu hồi cứu 12 mắt (11 bệnh nhân) viêm giác mạc nhu mô do
Microsporidia. Tất cả bệnh nhân đều có HIV (-). Thời gian mắc bệnh trung
bình 5,25 ± 6,56 tháng, đã dùng nhiều loại kháng sinh, corticosteroid. Tổn
thương nhu mô kèm theo loét giác mạc gặp ở 10/12 mắt; 2 mắt chỉ có áp xe sâu

trong nhu mô, không có loét giác mạc; 7/12 mắt có mủ tiền phòng; 3/12 mắt
tăng nhãn áp. Điều trị nội khoa gồm kháng sinh fluoquinolon, chống nấm,
albendazol. Chỉ 1 mắt điều trị khỏi bằng thuốc, 2 mắt (của 1 bệnh nhân) bỏ điều
trị. Số còn lại đều phải ghép giác mạc điều trị [2]. Kết luận: viêm giác mạc nhu
mô do Microsporidia lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam, với các tổn
thương nhu mô không đặc hiệu, chủ yếu gặp ở nữ, người lao động chân tay, có
HIV (-). Việc điều trị nội khoa khó khăn, hầu hết phải ghép giác mạc điều trị.
Bệnh vi bào tử ở mắt của bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh có thể bị
lẫn với viêm giác mạc do vi rút herpes gây ra. Bệnh nhân thường có biểu hiện
đau kéo dài, đỏ mắt, chảy nước mắt, mờ mắt và giảm tầm nhìn [5, 6, 19].
Một số bệnh nhân bị chẩn đoán nhầm sang trường hợp viêm giác mạc nhu
mô do Herpes vi-rút và được điều trị bằng thuốc kháng vi-rút và steroids. Trong
thăm khám, bệnh nhân có thể có biểu hiện sưng phù mí mắt, xung huyết kết
mạc. Tổn thương ở giác mạc thường thâm nhiễm nhu mô từ nông đến sâu cùng


với sưng phù nhu mô xung quanh. Lớp biểu mô phủ trên cùng có thể phù hoặc
trong một số trường hợp có thể có khuyết biểu mô. Có thể có dịch trong nội mô
[19].
Trong số 14 loài Microsporidia có 7 họ lây nhiễm vào con người. Nhận
dạng chúng là một công việc khó khăn bởi chúng không thể tồn tại ngoài tế bào
vật chủ bị nhiễm, chúng có số lượng gen rất nhỏ nhưng lại phát triển rất nhanh.
Các nhà khoa học thuộc đại học Duke đã ứng dụng hai nghiêm cứu di truyền để
chứng minh rằng Microsporidia phát triển rõ rệt từ nấm sinh sản hữu tính, và
đặc biệt là có mối liên hệ chặt chẽ với nấm tiếp hợp [11, 12].
Tín hiệu di truyền này cũng cho thấy rằng Microsporidia và nấm tiếp hợp
dường như có chung tổ tiên, và có quan hệ gần gũi hơn các dòng nấm khác được
biết đến.
Ngoài ra, Microsporidia và nấm tiếp hợp này có cùng gen quy định giới
tính, cùng trình tự trên ADN. Các gen khác có liên quan đến sinh sản hữu tính

cũng có mặt. Điều này cho thấy Microsporidia có thể có chu trình sinh sản quy
định bởi đặc điểm di truyền, có thể nó phải trải qua sinh sản hữu tính khi lây
nhiễm vào cơ thể vật chủ [8].
Ảnh quét điện tử giao tử Microsporidia với một cái ống nhô ra ngoài dùng
để đưa vào tế bào nhân chuẩn. Giao tử sẽ bơm dịch lây nhiễm qua cái ống này.
(Ảnh: CDC/NCID/DPD Parasite Image Library)

Hình 1.2. Hình ảnh m inh họa Microsporidia


Phát hiện chính xác Microsporidia giữ vai trò quan trọng trong chẩn đoán
nhanh, phát hiện chủng để lựa chọn đúng phác đồ điều trị và tiên lượng bệnh
cũng như hiểu biết cơ chế bệnh sinh, dịch tễ học phân bố của Microsporidia.
Tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán và phát hiện chủng Microsporidia được thực
hiện qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM, transmission electron
microscopy). Tuy nhiên, đây là kỹ thuật chi phí cao, thời gian phân tích lâu, đòi
hỏi người phân tích có trình độ chuyên môn sâu nên không khả thi ứng dụng
thường quy kỹ thuật này trong chẩn đoán. Kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh
quang được phát triển từ những năm 1994 để phát hiện chủng Microsporidia,
tuy nhiên kỹ thuật này cũng không được áp dụng rộng rãi do những hạn chế về
kháng thể, các phản ứng không đặc hiệu và những tín hiệu nhiễu không thể loại
bỏ trong mẫu bệnh phẩm. Chính vì vậy, các kỹ thuật sinh học phân tử ra đời đã
làm tăng độ nhạy, đặc hiệu trong chẩn đoán phát hiện Microsporidia và các kỹ
thuật này dần được đưa vào sử dụng trong thực hành chẩn đoán lâm sàng. Một
vài cặp primer và cặp primer lồng đã được mô tả sử dụng để khuếch đại trình tự
gen chủng Encephalitozoon và Enterocytozoon bieneusi. Phần lớn các nghiên
cứu ứng dụng kỹ thuật PCR được thiết kế khuếch đại đoạn gen tiểu phần nhỏ
small-subunit (SSU) rRNA của Microsporidia. Trong nghiên cứu này, bước đầu
xây dựng quy trình phát hiện Microsporidia dựa trên việc áp dụng kỹ thuật PCR
sử dụng cặp mồi có khả năng khuếch đại vùng gen bảo thủ (SSU) rRNA đã được

mô tả phát hiện các chủng gây viêm giác mạc: Nosema và Vittaforma corneae
[2].
2.2. Bệnh học và nguy cơ
Microsporidia được coi là tác nhân nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân suy
giảm miễn dịch. Nguồn lây nhiễm cho người và con đường truyền bệnh vẫn còn
là bí ẩn, tuy nhiên chúng có thể lây qua đường phân-miệng do phơi nhiễm trực
tiếp hoặc sau tổn thương. Phơi nhiễm trực tiếp có thể do tiếp xúc gần với vật
nuôi như mèo và chim hoặc phát tán từ người mang bệnh. Vòng đời thông


thường của Microsporidia bao gồm bao tử xâm nhập vào cơ thể người sau đó
đưa các thành phần cấu tạo của loài này vào tế bào chất.Trong tế bào, bào tử
phân chia để tạo thành thể phân liệt (scizont) có 2-6 nhân, sau đó thể này phân
thành thể đơn bào meront. Tiếp đó, thể này sẽ tiết ra vỏ capsule cứng và trở
thành bào tử hoàn chỉnh có kích thước 2,5x1,5 micron. Tế bào sau cùng vỡ ra để
tiếp tục vòng đời tiếp theo và sau đó phá hủy vật chủ đồng thời phát tán trong
môi trường qua các chất thải của ký chủ như phân, nước tiểu, chất tiết hô hấp [1].
2.3. Đặc điểm dịch tễ kí sinh trùng Microsporidia
Nhiễm Microsporidia ở người gặp ở khắp nơi trên thế giới. Ký sinh trùng
này là nguyên nhân gây bệnh đáng kể ở bệnh nhân bị AIDS, bệnh nhân bị ức chế
miễn dịch sau ghép cơ quan, và ở nhóm người cạnh tranh miễn dịch. Loại nhiễm
ở người thường gặp nhất là Enterocytozoo bieneusi. Tỷ lệ nhiễm toàn bộ
Enterocytozoon bieneusi được báo cáo ở những quần thể chọn lọc như những
người nhiễm HIV có tiêu chảy thay đổi từ 7% - 50%. Nhiễm Encephalitozoon
(trước đây là Septata) intestinalis, Encephalitozoon hellem và Encephalitozoon
cuniculi cũng được ghi nhận với tần số tăng dần, trong khi nhiễm những giống
khác ít hơn [2].
Cách lây nhiễm và những yếu tố nguy cơ lây nhiễm chưa được biết nhiều.
sự có mặt của bào tử Microsporidia trong nước tiểu, phân, dịch hút tá tràng và
chất tiết đường hô hấp cho thấy khả năng lây lan là từ người qua người. Nhiễm ở

mắt có thể do từ bên ngoài do tay bẩn dụi vào mắt. Nhiễm ở đường niệu dục có
thể do lây lan qua đường tình dục. Nước cũng là nguồn nhiễm chủ yếu
Microsporidia. Bệnh do Microsporidia ở người có thể là bệnh động vật, nguồn
nhiễm chủ yếu có liên hệ đến các động vật như chim, chó, heo và thỏ [11, 12].
2.4. Chẩn đoán viêm loét giác mạc
Microsporidia là kí sinh trùng nhỏ, kí sinh nội bào bắt buộc, sản sinh bào
tử gây nhiễm. Chúng là loại vi sinh vật khó nuôi cấy. Ta có thể thu được sinh vật
này bằng cách sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô đặc biệt hiện đang được sử dụng


trong một số ít phòng thí nghiệm, do đó việc chẩn đoán vi sinh thường quy khá
khó. Các mẫu tế bào (cố định trong cồn) từ mảnh cạo từ kết mạc, biểu mô mắt
hoặc cả hai hoặc mảnh sinh thiết được chứng minh là rất hữu dụng cho việc biểu
hiện dạng bào tử của Microsporidia. Thường thì mảnh cạo từ kết mạc cũng đủ
cung cấp mẫu đạt tiêu chuẩn cho chẩn đoán tế bào học trong trường hợp viêm
kết giác mạc chấm nông . Kết quả tế bào học cho thấy sinh vật nhỏ hình oval tồn
tại trong tế bào biểu mô, tế bào sừng, mô bào và cấu trúc ngoại bào. Các bào tử
này có dạng oval giống nhau và không có mầm, giúp phân biệt chúng với vi
khuẩn và nấm khác. Chất nhuộm Giemsa được dùng để hiển thị bào tử của
Microsporidia. Trong một số trường hợp bất kì, bào tử bắt màu kém hoặc không
bắt màu chất nhuộm định kì [20].

Hinh 2.1. Hình ảnh nhuộm soi Microsporidia
Bệnh vi bào tử ở mắt, mặc dù không phổ biến, có thể tách là một phần của
nhiễm khuẩn hệ thống. Bệnh này chủ yếu có 2 dạng: viêm dính giác mạc,
thường thấy ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch; viêm giác mạc nhu mô thấy ở
bệnh nhân có hệ miễn dịch khỏe mạnh. Bệnh này được coi là bệnh cơ hội ở bệnh
nhân suy giảm miễn dịch.
2.5. Các phương pháp phát hiện Microsporidia
2.5.1. Chẩn đoán phân biệt

Cần phân biệt với những bệnh lý do các nguyên nhân khác khi biểu hiện
lâm sàng gặp ở đường ruột, gan, mật, hô hấp, niệu dục, mắt, xương cơ, thần kinh
trung ương. Bệnh lý đường ruột nên nghĩ dến nguyên nhân do Microsporidia ở


những cá thể suy giảm miễn dịch có tiêu chảy kéo dài hay bệnh gan mật không
rõ nguyên nhân.
Cần chẩn đoán phân biệt với nhiễm những đơn bào đường ruột khác cũng
gây tiêu chảy kéo dài như Cryptosporidium, Cyclospora, Giardia và Isospora. Ở
những cá thể miễn dịch bình thường, bệnh do Microsporidia được nghĩ đến ở
những khách du lịch bị tiêu chảy, trong đó những nguyên nhân bệnh lý thường
qui không thể xác định.
Chẩn đoán nguyên nhân do Microsporidia cũng nên được nghĩ đến ở bệnh
nhân viêm kết giác mạc hay loét giác mạc không giải thích được nguyên do,
bệnh viêm xoang hay bệnh đường hô hấp dưới lan tỏa, suy thận không rõ
nguyên nhân hay có những ca lắng bất thường trong nước tiểu, viêm cơ. Bệnh có
khuynh hướng lan tỏa. Kí sinh trùng này có thể xâm nhập bất kỳ cơ quan nào, kể
cả xương và hệ thần kinh trung ương. Cần xác định được mầm bệnh ở nhiều loại
bệnh phẩm nếu có thể như phân, đàm, nước tiểu, phết mũi, kết mạc, dịch não tủy
bằng tất cả những phương pháp có thể làm được [1, 11].
2.5.2. Chẩn đoán xác định
Chẩn đoán xác định dựa vào tìm thấy bào tử Microsporidia trong phân
sau khi nhuộm bằng các phương pháp đặc biệt như Weber chromotrope, hóa
huỳnh quang, Gram – chromotrope.
Các bệnh phẩm khác như nước tiểu, đờm, dịch rửa phế quản, dịch tá
tràng, phết từ màng nhày mũi, giác mạc, kết mạc. Ly tâm lấy cặn nhuộm bằng
các phương pháp như Gram, Weber chromotrope, Giemsa,Steiner bạc,
trichorome blue cải biến. PAS, kháng thể huỳnh quang đặc hiệu. Nhuộm gram
bào tử ăn màu gram dương rất rõ, nhưng đôi khi ăn màu gram âm hay gram
dương yếu.

Nhuộm mô giải phẫu bệnh từ mẫu sinh thiết hay giải phẫu thì từ các mô bệnh
như giác mạc, kết mạc, xương cơ, ruột non, ruột già, gan, túi mật, mạc treo,
thận, bọng đái, khí quản, phế quản. xương, não. Ở bệnh nhân nhiễm trùng ở mặt