Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LÊ THỊ HẢI YẾN

TUYỂN CHỌN CHỦNG
BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG
TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN
ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI
MÃ SỐ: 62 64 01 02

CẦN THƠ, 2018


MỤC LỤC

Lời cam kết kết quả......................................................................................... i
Lời cảm ơn ..................................................................................................... ii
Tóm lược ....................................................................................................... iii
Abstract .......................................................................................................... v
Danh sách bảng .............................................................................................. x
Danh sách hình............................................................................................. xii
Danh mục từ viết tắt..................................................................................... xv
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1
1.2. Mục tiêu .................................................................................................. 1
1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................... 2
1.4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................... 2

1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án ................................................................ 2
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....... ……………………………..3
2.1. Tổng quan về probiotic ........................................................................ 3
2.1.1. Lịch sử probiotic .................................................................................. 3
2.1.2. Các định nghĩa về probiotic ................................................................. 3
2.1.3. Xu hướng sử dụng probiotic ................................................................ 4
2.1.4. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic ............................................. 5
2.1.5. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm ............................................ 8
2.1.6. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic................................ 12
2.1.7. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic ........................... 13
2.1.8. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic ................... 14
2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis ............................................................ 15
2.2.1. Đặc điểm chung của giống Bacillus .................................................. 15
2.2.2. Đặc điểm loài Bacillus subtilis .......................................................... 16
vii


2.2.3. Dinh dưỡng và tăng trưởng ............................................................... 22
2.2.4. Các chất do B. subtilis sinh ra ............................................................ 23
2.2.5. Tính đối kháng của B. subtilis ........................................................... 25
2.2.6. Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và
vi sinh vật gây bệnh ................................................................................... 26
2.3. Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đƣờng ruột ............................................... 27
2.3.1. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ .......... 27
2.3.2. Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi ............. 30
2.4. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp trên gà ...... 31
2.4.1. Salmonella ......................................................................................... 31
2.4.2. E. coli ................................................................................................. 36
2.4.3.Clostridium perfringens ...................................................................... 39
2.5. Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam ....... 42

2.5.1. Trên thế giới ...................................................................................... 42
2.5.2. Tại Việt Nam .................................................................................... 43
2.6. Một số nghiên cứu ứng dụng B. subtilis ............................................ 44
2.6.1. B. subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi ....................................... 44
2.6.2. B. subtilis sử dụng cho gia cầm ........................................................ 45
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 47
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ..................................................................... 47
3.2.1. Vật liệu ............................................................................................... 47
3.2.2. Dụng cụ .............................................................................................. 47
3.2.3. Thiết bị .............................................................................................. 47
3.2.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ......................... 48
3.3. Nội dung nghiên cứu và phƣơng pháp nghiên cứu .......................... 49
3.3.1. Nội dung nghiên cứu.......................................................................... 49
3.3.2. Phân lập các chủng Bacillus subtilis .................................................. 50
viii


3.3.3. Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic .................... 56
3.3.4. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà .................. 61
3.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 65
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 66
4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ............................ 66
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp............................................. 66
4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp ......................................................... 67
4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic ........................................... 77
4.2.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao..................................... 77
4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh .................................................... 78
4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào .......................... 81
4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh .................. 85

4.2.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật ............................................ 98
4.2.6. Khả năng bám dính ......................................................................... 104
4.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà ........................... 109
4.3. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà ..... 111
4.3.1. Kết quả thí nghiệm 1….................................................................... 111
4.3.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................... 114
4.3.3. Kết quả thí nghiệm 3........................................................................ 123
4.4. Đăng ký trình tự B. subtilis trên Genbank…………………….....131
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................. 133
5.1. Kết luận .............................................................................................. 133
5.2. Đề nghị ............................................................................................... 134
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.............................. 135
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 136
PHỤ LỤC ................................................................................................. 154

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1. Bậc phân loại của Bacillus subtilis ...................................................... 15
Bảng 2.2. Một số đặc điểm của Bacillus subtilis ................................................. 22
Bảng 2.3. Một số loại enzyme do B. subtilis sinh tổng hợp ................................ 23
Bảng 3.1. Phân bố mẫu ........................................................................................ 50
Bảng 3.2. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ..................................... 54
Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ..................................................................... 62
Bảng 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................... 64
Bảng 3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ..................................................................... 65
Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi của
296 chủng vi khuẩn ............................................................................................. 66
Bảng 4.2. Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa ............................... 68

Bảng 4.3. Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B .............. 70
Bảng 4.4. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA .... 74
Bảng 4.5. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis ......... 77
Bảng 4.6. Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B. subtilis chọn lọc ................... 79
Bảng 4.7. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis ............... 81
Bảng 4.8. Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng
B. subtilis khảo sát ............................................................................................... 83
Bảng 4.9. Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phương pháp
kẻ vạch vuông góc .............................................................................................. 86
Bảng 4.10. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và
VL28 đối với E. coli ............................................................................................ 88
Bảng 4.11. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và
VL28 đối với S. enterica...................................................................................... 91
Bảng 4.12. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và
VL28 đối với Staphylococcus spp ....................................................................... 93
Bảng 4.13. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và
VL28 đối với Streptococcus spp. ........................................................................ 96
x


Bảng 4.14. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 4 và pH 5 ............................. 99
Bảng 4.15. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 3 ......................................... 101
Bảng 4.16. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 2 ......................................... 103
Bảng 4.17. Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính .......................................... 105
Bảng 4.18. Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E. coli và S. enterica ...... 107
Bảng 4.19. Khả năng sống của B. subtilis VL28 trong đường ruột gà .............. 109
Bảng 4.20. Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR qua 8 tuần thí nghiệm ......... 112
Bảng 4.21. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí
nghiệm 2 ............................................................................................................ 115
Bảng 4.22. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…117

Bảng 4.23. Tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi trong thí nghiệm
2.......................................................................................................................... 120
Bảng 4.24. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi
trong thí nghiệm 2 .............................................................................................. 122
Bảng 4.25. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi…...123
Bảng 4.26. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 15- 28 ngày tuổi…124
Bảng 4.27. Kết quả test sinh hóa E. coli trên bệnh phẩm gan………………...127
Bảng 4.28. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 29-56 ngày tuổi
ở thí nghiệm 3 .................................................................................................... 129
Bảng 4.29. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-56 ngày tuổi
ở thí nghiệm 3 .................................................................................................... 130

xi


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic ............................... 4
Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe ..... 8
Hình 2.3. Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vk probiotic và niêm mạc ruột . 9
Hình 2.4. Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc
chất kích thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm ........... 11
Hình 2.5. Mô hình cấu tạo tế bào vi khuẩn Bacillus spp ..................................... 16
Hình 2.6. Mô hình các vị trí nhiễm sắc thể trên bộ gen B. subtilis...................... 17
Hình 2.7. Sơ đồ quá trình hình thành bào tử B. subtilis....................................... 19
Hình 2.8. Sự biệt hóa tế bào ở B. subtilis ............................................................ 21
Hình 2.9. Sơ đồ hệ tiêu hóa gà ............................................................................. 28
Hình 3.1. Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B. subtilis .................................... 55
Hình 3.2. Sơ đồ kiểm tra khả năng chịu acid dạ dày và muối mật của vi khuẩn
B. subtilis………………………………………………………………………...59
Hình 3.3. Chuồng gà thí nghiệm………………………………………………...62

Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus spp. trên môi trường TSA và hình thái
dưới kính hiển vi ................................................................................................. 67
Hình 4.2. Kết quả test sinh hóa ............................................................................ 69
Hình 4.3. Định danh bằng kit API CH50B .......................................................... 71
Hình 4.4. Sản phẩm PCR của các chủng B. subtilis trong nghiên cứu ................ 73
Hình 4.5. Sơ đồ chọn lọc và định danh vi khuẩn B. subtilis ................................ 76
Hình 4.6. Khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis phân lập...................... 78
Hình 4.7. Mức độ nhạy cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B. subtilis…….80
Hình 4.8. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng B. subtilis AG27 và VL28 ....... 81
Hình 4.9. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis AG27 ........... 82
Hình 4.10. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng B. subtilis .... 87
Hình 4.11. Hiệu quả kháng khuẩn của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với
E. coli ................................................................................................................... 90
xii


Hình 4.12. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với
S. enterica ............................................................................................................ 92
Hình 4.13. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với
Staphylococcus spp .............................................................................................. 94
Hình 4.14. Hiệu quả đối kháng của AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với
Streptococcus spp ................................................................................................ 97
Hình 4.15. Hoạt tính đối kháng của VL28 với E. coli, S. enterica,
Staphylococcus spp và Streptococcus spp. .......................................................... 98
Hình 4.16. Khả năng chịu pH 4 và 5 của các chủng B. subtilis......................... 100
Hình 4.17. Khả năng chịu pH 3 của các chủng B. subtilis ................................ 102
Hình 4.18. Khả năng chịu pH 2 của các chủng B. subtilis ................................ 104
Hình 4.19. Khả năng tự bám dính của các chủng B. subtilis ............................. 105
Hình 4.20. Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh của AG27 và VL28 ..... 108
Hình 4.21. Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 và AG27 trong biểu mô ruột

............................................................................................................................ 108
Hình 4.22. Khả năng tồn tại của B. subtilis VL28 ở ruột non, manh tràng,
và ruột già .......................................................................................................... 110
Hình 4.23. Tóm tắt quá trình phân lập và chọn lọc vi khuẩn probiotic……….111
Hình 4.24. Biểu đồ tăng trọng và FCR của gà qua các tuần ở thí nghiệm 1 ..... 113
Hình 4.25. FCR và tăng trọng ở giai đoạn 1-14 ngày tuổi của thí nghiệm 2 .... 116
Hình 4.26. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 15-28 ngày tuổi ............................. 118
Hình 4.27. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm S. enterica ..................... 119
Hình 4.28. Khuẩn lạc S. enterica trên môi trường SS và kết quả test sinh hóa . 119
Hình 4.29. Kết quả giải trình tự vi khuẩn S. enterica phân lập từ lách gà bệnh 120
Hình 4.30. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 2..... 121
Hình 4.31. Tăng trọng và FCR giai đoạn 15-28 ngày tuổi ở thí nghiệm 3 ........ 125
Hình 4.32. Bệnh tích gà trong thí nghiệm gây nhiễm E. coli ............................ 126
Hình 4.33. Khuẩn lạc E. coli trên môi trường Mac Conkey và EMB ............... 126
Hình 4.34. Test sinh hóa vi khuẩn E. coli .......................................................... 127
xiii


Hình 4.35. Kết quả giải trình tự vi khuẩn E. coli phân lập từ gan gà bệnh ....... 128
Hình 4.36. Tăng trọng và FCR ở giai đoạn 29-56 ngày tuổi ở thí nghiệm 3..... 129
Hình 4.37. Kết quả đăng ký trình tự gen B. subtilis VL28 trên ngân hàng gen
NCBI…………………………………………………………………………..131

xiv


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
APC
ATCC

BAU
CE
CFU
CLSI

DSM
FCR
HE
MHA
MIC
NA
PBS
PCR
SC
TCA
TSB

Viết đầy đủ (tiếng Anh)

Tiếng Việt

Antigen presenting cells

Tế bào trình diện kháng nguyên
(tế bào đuôi gai hay đại thực bào)
American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ
Bacterial Amylase Units
Đơn vị hoạt lực amylase của vi khuẩn
Competitive exclusion
Loại trừ cạnh tranh

Colony-forming unit
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
Clinical and Laboratory
Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và
Standards Institute
Xét nghiệm
Difco sporulation Medium
Môi trường bào tử hóa
Feed conversion ratio
Hệ số chuyển hóa thức ăn
Hematoxylin- eosin
Thuốc nhuộm tiêu bản mô
Mueller Hinton agar
Môi trường làm kháng sinh đồ
Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
Nutrient agar
Thạch dinh dưỡng
Phosphate buffered saline
Muối đệm phosphate
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Secretory component
Thành phần kích thích tiết
immunoglobulin
Trichloroacetic acid
Hóa chất dùng cho phản ứng kết
tủa protein
Tryptone Soya Broth
Môi trường dinh dưỡng

xv


CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 . Tính cấp thiết của đề tài
Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những
thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng
làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét. Một trong những vấn đề
cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để phòng
bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Việc này đã làm gia tăng các
dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả sử
dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người. Do vậy, nhiều
nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh trong chăn
nuôi. Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều
giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic - những vi sinh vật
sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng cường sức khỏe nói
chung cho người và động vật. Bacillus subtilis là một vi khuẩn rất phổ biến trong
tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng như nhiều loài động vật và
có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và hóa học. Do vậy, từ lâu vi khuẩn
này được chọn nghiên cứu để làm probiotic cho người và vật nuôi theo mô hình
công nghiệp. Tuy nhiên, B. subtilis rất đa dạng về các đặc tính sinh học nên
không phải tất cả các chủng đều có thể sử dụng làm probiotic và mỗi chủng
probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử dụng cho một đối tượng nhất định.
Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh
nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải
pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất, hiệu
quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi
khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên.
1.2. Mục tiêu
- Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL có

các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease,
lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), khả năng bám
dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột
(S. enterica, E. coli).
- Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được trong
phòng bệnh đường ruột ở gà do E. coli và S. enterica gây ra.
1


1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
- Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất và
phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần Thơ, Hậu
Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang.
1.4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B. subtilis
bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng bằng
sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S. enterica và E. coli gây ra.
- Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B. subtilis bản địa từ phân
và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B. subtilis VL28
có thể sử dụng làm probiotic trên gà.
- Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B. subtilis VL28
10 CFU/g với liều 5 g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa quá
trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với
S. enterica và E. coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số
chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng.
7

- Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của
B. subtilis VL28 với mã số truy cập KY346980.

(có thể truy cập trên trang web />- Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một
cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế.
1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic
phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên
cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống
bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao cho
người chăn nuôi. Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng sinh làm
chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi. Góp phần tạo được
nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

2


CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về probiotic
2.1.1. Lịch sử probiotic
Nghiên cứu về probiotic bắt đầu được chú ý vào năm 1900 khi Tisser quan
sát và thấy phân của những đứa trẻ tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc
hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh (Schillinger et al., 1996). Sau đó năm
1907, Metchnikoff đã chứng minh việc sử dụng Lactobacillus sẽ hạn chế các nội
độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe
của những người Cô-dắc (Caucasians) ở Bulgaria là họ sống rất khỏe mạnh và
tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất
lớn các sản phẩm sữa lên men (Metchnikoff E., 1907). Có thể nói Tisser và
Metchikoff là những người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về
probiotic.
Năm 1930, Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ em khỏe
mạnh (Cartwright, 2003). Cùng năm đó các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng
minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường

xuyên. Các nhà khoa học đại học Harvard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột
đóng vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp
một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản
xuất được. Khái niệm chung về probiotic xuất hiện ở Châu Âu vào những năm
đầu của thập niên 80, ở Châu Á, nhiều năm sau các sản phẩm từ sữa lên men mới
được du nhập vào và bắt đầu có khái niệm về probiotic (Cartwright, 2003).
Cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ
sinh học, các nghiên cứu về probiotic ngày càng được mở rộng. Ngày nay
probiotic đã được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm và chăn nuôi.
2.1.2. Các định nghĩa về probiotic
Năm 1965, Lilley và Stillwell lần đầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic để
mô tả những chất tiết ra từ vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển của vi
sinh vật khác (Grover and Luthra, 2011).
Trải qua lịch sử định nghĩa probiotic ngày càng cụ thể hơn, như:
“Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mà chúng tác động có lợi cho sự cân
bằng vi sinh vật đường ruột của động vật” (Marteau et al., 2002).
3


“Probiotic là các chủng vi sinh vật sống bổ sung tạo ảnh hưởng có lợi lên
vật chủ bằng cách thay đổi các nhân tố liên quan đến vật chủ hay quần thể vi sinh
vật bao quanh, tăng cường việc sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng
cường khả năng phản ứng của vật chủ với bệnh, tăng cường chất lượng môi
trường xung quanh vật chủ” (Verschuere et al., 2000).
“Probiotic là lượng vi sinh vật sống xác định với số lượng thích hợp được
chuẩn bị trong các sản phẩm, có tác dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật ruột và
có tác dụng tốt đến sức khỏe vật chủ." (Schrezenmeir and de Vrese, 2001).
"Probiotic, đó là những vi sinh vật sống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng
thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ". (FAO/WHO, 2002). Đây là định nghĩa
được chấp nhận nhiều hơn cả, nó được cho là phản ánh khá đầy đủ bản chất của

probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học.
2.1.3. Xu hƣớng sử dụng probiotic
Theo khảo sát của hiệp hội lương thực và thực phẩm (International Food
Information Council - IFIC), số người biết đến và sử dụng probiotic ngày càng
tăng qua các năm. Mức tăng trưởng về thị trường probiotic từ năm 2009 đến 2014
là 12,6%. Năm 2004, số người biết đến probiotic ít hơn 10%, nhưng năm 2011 thì
hơn 81% người tiêu dùng biết và sử dụng probiotic (Hình 2.1). Theo dự báo của
IFIC, sản lượng probiotic toàn cầu dự báo đạt 31,1 tỉ USD vào năm 2015, nhưng
thực tế đạt 41 tỉ USD (Monica Feldman, 2016), cho thấy thị trường probiotic rất
tiềm năng, luôn phát triển ngoài mong đợi.

Tỉ USD

Tỉ lệ người biết và sử dụng probiotic

Dự báo mức tăng trưởng probiotic

Hình 2.1. Biểu đồ về sự tăng trưởng trong sử dụng probiotic (IFIC, 2011)

4


2.1.4. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic
Probiotic khi được đưa vào cơ thể sẽ có nhiều tác động tích cực không chỉ
với hệ tiêu hóa mà còn trên nhiều hệ cơ quan khác (Patterson and Burkholder,
2003). Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả Kabir (2009); Otutumi
et al. (2012) đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với động vật thể
hiện ở các khía cạnh sau:
2.1.4.1. Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây
bệnh.

- Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn: bao gồm bacteriocin, acid hữu
cơ, và hydrogen peroxide.
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein, được ribosome
tổng hợp nên các peptide hoặc protein. Chất này có ở cả vi khuẩn Gram âm và
Gram dương nhằm ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác. Cơ chế tác động của
bacteriocin rất đa dạng, nó có thể làm biến đổi các enzyme, ức chế sự sản sinh
bào tử, xâm nhập vào tế bào làm mất lực đẩy proton, làm giảm thế năng của màng
nguyên sinh chất và thay đổi pH nội bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ.
Acid hữu cơ được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acid acetic, lactic,
propionic, … làm pH môi trường hạ thấp, ảnh hưởng đến pH nội bào của vi
khuẩn gây bệnh, do đó có tác dụng ức chế sự phát triển của chúng.
Tính chất kháng khuẩn của hydrogen peroxide chủ yếu thông qua việc tạo ra
các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc superoxide và các gốc
hydroxyl tự do.
- Cạnh tranh vị trí gắn kết
Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật
cư trú trong ruột. Các vi khuẩn probiotic có mặt trong hệ tiêu hóa có khả năng
ngăn chặn khả năng bám dính của vi khuẩn gây bệnh, do đó làm giảm lượng chất
độc của chúng tiết ra trên biểu mô ruột. Một số trường hợp, vi khuẩn probiotic có
thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn này
đã bám chặt trên tế bào biểu mô (Czerucka and Rampal, 2002).
- Cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng
Probiotic còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh
vật gây bệnh. Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dưỡng để phát triển.
Chẳng hạn sự phát triển của probiotic sử dụng đường đơn (glucose, fructose) sẽ
5


làm giảm sự phát triển của Clostridium difficile (cũng sử dụng đường đơn) (Peter,
2006). Các sinh vật probiotic còn tạo ra những cản trở không gian ảnh hưởng đến

sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh (Otutumi et al., 2012).
2.1.4.2. Tác động trên mô biểu bì ruột
Một số chủng probiotic có khả năng tiết ra một số chất giúp đẩy mạnh sự
liên kết giữa những tế bào biểu mô, hoặc có khả năng làm giảm độ thẩm thấu vào
màng nhầy, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật. Một số chủng có khả năng sinh
tổng hợp chất nhầy, đây cũng là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân
gây bệnh do chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh.
2.1.4.3. Tăng cƣờng khả năng miễn dịch
Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật, giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ
thống miễn dịch có mối tương quan đặc thù. Probiotic tác động đồng thời lên cả
hệ miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu của cơ thể. Với hệ miễn dịch không đặc
hiệu, probiotic giúp giảm thiểu sự di chuyển của các vi khuẩn và chất lạ (kháng
nguyên) từ ruột xâm nhập vào mạch máu (Dugas et al., 1999). Nhờ đó giúp giảm
nhiễm khuẩn và dị ứng đối với các kháng nguyên trong thực phẩm. Đối với hệ
miễn dịch đặc hiệu, tác động của probiotic tương đối phức tạp hơn. Nhiều nghiên
cứu đã được tiến hành, và một số cơ chế tác động của probiotic lên hệ miễn dịch
đã được phát hiện (Lee and Salminen, 2009). Tuy nhiên cơ chế tác động của
probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết
đầy đủ.
2.1.4.4. Tác động đến vi khuẩn đƣờng ruột
Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột.
Probiotic có thể làm giảm pH trong hệ tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản
trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi khuẩn gây bệnh và thay đổi cấu trúc quần
thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ. Đồng thời tăng sự
dung nạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu
những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng vi khuẩn có lợi, giảm vi
khuẩn gây hại (Soccol et al., 2010).
2.1.4.5. Tổng hợp vitamin
Các vi khuẩn probiotic có khả năng sinh các loại vitamin nhóm B (folic
acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K (Chaucheyras6

Durand and Durand, 2010). Theo các nghiên cứu, Lactobacillus brevis có khả
năng tổng hợp vitamin D và vitamin K; Bacillus longum tổng hợp vitamin B;
Bacillus bifidum và Lactobacillus acidophillus tổng hợp được các vitamin B như
niacin, folic acid, biotin, B6 và vitamin K.
2.1.4.6. Một số tác động khác
- Tác động chống ung thư: Probiotic giúp gắn kết và phân hủy các chất gây
ung thư, sản xuất ra những hợp chất kháng ung thư, điều hòa những enzyme tiền
chất gây ung thư (Holm, 2003).
- Tác động chống dị ứng: Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn
là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn
vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch. Qua các nghiên cứu, người ta
thấy rằng ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và
Clostridia ít hơn so với ở những người thường bị dị ứng (Soccol et al., 2010).
- Làm tăng khả năng dung nạp của cơ thể với lactose, giúp tránh khỏi tình
trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose
(Soccol et al., 2010).
- Làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh. Vi khuẩn đường ruột
chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở
việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột.

7


Ngăn chặn
mầm bệnh bên
ngoài (tiêu chảy
do kháng sinh)

Chống lại sự tấn công
của vi khuẩn gây bệnh

Kiểm soát rối
loạn tiêu hóa

Cân bằng vi sinh
trong ruột

Ngăn chặn
mầm bệnh bên
ngoài
(tiêu chảy)

Cung cấp SCFA và
vitamin đến tế bào biểu
mô ruột

Cân bằng đáp
ứng miễn dịch

Probiotic

Giảm rủi ro
ung thƣ ruột

Làm giảm phản
ứng sinh độc tố/ đột
biến trong ruột

Kiểm soát các
bệnh viêm
nhiễm đƣờng
ruột

Điều hòa
miễn dịch

Khử và tiết
muối mật

Hiệu quả
chuyển hóa

Thủy phân
Lactose

Giảm triệu
chứng dị ứng
thức ăn

Tăng cƣờng
hệ miễn dịch
tự nhiên

Giảm
cholesterol

Cải thiện
khả năng

dung nạp
lactose

SCFA: short chain fatty acids: acid béo mạch ngắn: có tác dụng hạ pH trong đường tiêu
hóa, ức chế vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn lên men thối.

Hình 2.2. Sơ đồ tổng hợp về vai trò và cơ chế của probiotic đối với sức khỏe
2.1.5. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm
Cơ chế tác động của probiotic lên hệ thống miễn dịch ở niêm mạc gia cầm
chưa được biết đến một cách rõ ràng. Tuy nhiên, tác dụng điều hòa miễn dịch của

8


probiotic là điều không thể phủ nhận (Erickson and Hubbard, 2000; Everlon,
2012).
Theo Erickson and Hubbard (2000) và Loddi et al. (2003), các giống vi
khuẩn probiotic như Lactobacillus và Bifidobacterium có liên quan trực tiếp đến
khả năng gia tăng miễn dịch ở gia cầm, chủ yếu là trong các bệnh đường tiêu hóa.
Tuy nhiên, các giống vi khuẩn khác cũng có ảnh hưởng tích cực lên sự điều hòa
miễn dịch (Hong et al., 2005).

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả tác động qua lại giữa các vi khuẩn probiotic
và niêm mạc ruột (Everlon, 2012).
Vi khuẩn probiotic ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột, và tăng cường
chức năng làm rào cản. Theo Hình 2.3, hoạt động kháng khuẩn của probiotic bao
gồm:
(1) Sản xuất các kháng khuẩn sinh học (bacteriocins và defencins).
(2) Ức chế cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh.
(3) Ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh hoặc chuyển vị.

(4) Giảm pH trong lòng ruột.
(5) Tăng cường sản xuất chất nhầy.
Cơ chế điều hòa miễn dịch xảy ra theo hai cách: (a) Từ vi sinh vật, các vi
khuẩn probiotic cư trú nơi thành ruột và số lượng các vi khuẩn được nhân lên.
(b) Từ kháng nguyên, tạo bởi các sinh vật chết được hấp thụ, từ đó kích thích hệ
thống miễn dịch (Havenaar and Spanhaak, 1994). Theo Loddi (2003), các kháng
9


nguyên (lipopolysaccharides và peptidoglycans) được tạo ra liên tục trong lòng
ruột. Quá trình này tăng lên khi xảy ra viêm nhiễm, các thành phần này mang tính
thiết yếu trong sự phát triển và duy trì các phản ứng miễn dịch (Loddi, 2003).
Probiotic tạo ra những thay đổi ở biểu mô ruột bằng cách: làm giảm pH của
ruột, tiết ra các peptide kháng khuẩn ức chế vi khuẩn xâm nhập và ngăn chặn sự
bám dính vào tế bào biểu mô. Điều này có nghĩa là chúng cải thiện chức năng rào
cản ở ruột, gia tăng tổng hợp cytokine (TNF-α, IFN-γ, IL-10 và IL-12) (Arvola et
al., 1999), kích thích IgA tiết ra trong niêm mạc ruột, giải phóng mucin (Gupta
and Garg, 2009). Mucin là lớp glycoprotein khi tiếp xúc với nước sẽ tạo thành
một màng bôi trơn và bảo vệ các tế bào biểu mô ruột chống lại tác nhân gây bệnh,
chúng thành lập một rào cản vật lý giữa các tế bào biểu mô và các thành phần
trong lòng ruột, giúp giữ vi khuẩn an toàn trong ruột (Mattar et al., 2002). Trong
ruột, probiotic tương tác với các tế bào hấp thu ở nhung mao, tế bào hình ly, tế
bào M (Microfold cells) từ các lympho bào. Những tương tác này dẫn đến tăng số
lượng IgA, thêm vào đó là việc tiết IgM và IgA, đặc biệt quan trọng đối với khả
năng miễn dịch của niêm mạc ruột, góp phần tạo rào cản chống lại mầm bệnh
(Szajewska et al., 2001). Khả năng lấn át mầm bệnh trong cơ chế điều hòa đáp
ứng miễn dịch đã được quan sát thông qua sự gia tăng của nhu động ruột (Gupta
and Garg, 2009), gia tăng quần thể tế bào lympho trong biểu mô ruột (Dalloul et
al., 2003), loại bỏ các tác nhân gây bệnh (Patterson and Burkholder, 2003), ổn
định hệ vi sinh vật đường ruột và gia tăng chiều cao vi nhung ruột (Salzman et

al., 2003). Thêm vào đó, các nhóm vi khuẩn phát triển một mạng lưới để khóa các
vị trí liên kết của các tác nhân gây bệnh đường ruột.
Vi khuẩn probiotic có khả năng sản xuất ra một loại chất có khả năng “loại
trừ” các vi sinh vật cạnh tranh khác, cơ chế này được biết đến như là cơ chế loại
trừ cạnh tranh, chúng cạnh tranh vị trí bám dính vào màng tế bào hình ly, các tế
bào nội tiết và các tế bào hấp thu ở nhung mao trong niêm mạc ruột, cơ chế này
tạo nên hệ thống hàng rào vật lý toàn vẹn, giúp ngăn ngừa tác nhân gây bệnh
đường ruột. Cơ chế đã được mô tả bởi Revolledo et al. (2006) (Hình 2.4). Cũng
theo cơ chế này, tác dụng đối kháng thông qua một số chất được tiết ra nhằm ức
chế sự tăng trưởng và phát triển của vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như
bacteriocin, acid hữu cơ và hydrogen peroxide (Patterson and Burkholder, 2003;
Mazmanian et al., 2008). Những lợi ích khác từ việc sử dụng các vi khuẩn
probiotic đó là: tăng hoạt động enzyme thúc đẩy quá trình hấp thu và dinh dưỡng;
ức chế các enzyme gây bệnh ung thư (Gill, 2003).
10


Hình 2.4. Sự tương tác giữa các sản phẩm loại trừ cạnh tranh, probiotic hoặc chất kích
thích miễn dịch, và khả năng miễn dịch đường ruột ở gia cầm (Revolledo et al., 2006).
SIgA = IgA phân tiết (secretory IgA) ; CE = loại trừ cạnh tranh (competitive exclusion) ; IEC =
tế bào biểu mô ruột (intestinal epithelial cells); IEL = lympho bào trong biểu mô ruột (intestinal
intraepithelial lymphocyte) ; LPL = lympho bào đệm niêm mạc (hoạt hóa lympho bào T) (lamina
propria lymphocytes); tế bào đuôi gai hay đại thực bào = tế bào trình diện kháng nguyên (APCantigen-presenting cells); LB = lympho bào B; LT = lympho bào T; Tế bào M = tế bào cần cho
việc vận chuyển các kháng nguyên từ lumen ruột đi vào các mô bạch huyết ruột; SC = thành
phần kích thích tiết IgA (secretory component); endocytosis = nhập bào (xâm nhập tế bào bằng
cách hình thành túi trên màng tế bào, sau đó túi này lộn ngược vào trong tế bào phóng thích chất
xâm nhập vào bên trong tế bào); transcytosis = chất trung gian trên màng tế bào.

Theo Revolledo et al. (2006), cơ chế được đề xuất như sau (Hình 2.4):
Hấp thu kháng nguyên:

- Lympho bào trong biểu mô ruột (IEL) nhận diện kháng nguyên một cách
trực tiếp, tín hiệu được gửi đến lympho bào T (LT).
- Khi kháng nguyên được mang đi trong các tế bào M bằng chất trung gian
trên màng tế bào (transcytosis), có 2 cơ chế có thể hoạt hóa các đáp ứng miễn
dịch: a) Kháng nguyên được mang đi trực tiếp bằng đại thực bào hoặc tế bào đuôi
11


gai. b) Kháng nguyên kích hoạt các tế bào B, quá trình này hoạt hóa lympho T
trong đệm niêm mạc.
- Các tế bào trong biểu mô (IEC) sử dụng quá trình nhập bào (endocytosis)
để hấp thu kháng nguyên. IEC có thể hoạt động như một tế bào đại diện kháng
nguyên (APC) và xử lý kháng nguyên, kháng nguyên đại diện cho lympho T
trong đệm niêm mạc.
Sự sản xuất SIgA: Lympho bào T (LT - LPL) được kích hoạt sản xuất
cytokin (chất trung gian điều hòa các tế bào trong cơ thể), kích thích lympho B
hoạt động, và cuối cùng là các tương bào, sản xuất IgA. Các IgA được gắn thành
phần kích thích tiết tế bào trong biểu mô (IEC) và tự biến đổi chúng thành IEC;
cuối cùng SIgA được hình thành và phát huy hiệu quả bảo vệ bề mặt.
2.1.6. Các chủng vi khuẩn thƣờng dùng làm probiotic
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ
yếu thuộc Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và
Streptococcus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư
trú trong ruột. Một số chủng tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus,
L. casei, L. rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum. Bên
cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii, S. cerevisiae
cũng được xem là probiotic (Vuyst et al., 2004). Tuy nhiên, các nghiên cứu cho
thấy vi khuẩn lactic bị diệt khi gặp nhiệt độ cao và tác động của muối mật
(Fernandes et al., 1988). Bên cạnh đó, các vi khuẩn này không chịu được các điều
kiện khắc nghiệt của quá trình sản xuất như sấy khô, tạo hạt, … làm cho tuổi thọ

của sản phẩm ngắn. Để bảo đảm hiệu quả của sản phẩm, một số nhà sản xuất tiên
tiến đã sử dụng công nghệ vi bao (Cell Biotech) trong quá trình sản xuất, đưa đến
giá thành sản phẩm cao. Trong khi đó, các vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus có thể
chịu đựng được nhiệt độ đến 100oC trong vài phút (Teo et al., 2003), tồn tại trong
muối mật 0,5% (Teo et al., 2006), bền vững trong điều kiện bảo quản thông
thường và trong quá trình sản xuất sấy khô, tạo hạt, … nên rất phù hợp để tạo sản
phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn vật nuôi.
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy B. subtilis có khả năng cạnh tranh mạnh
với các vi khuẩn gây bệnh (La Ragione and Woodward, 2003), thân thiện với
nhóm vi khuẩn lên men lactic, là nhóm được xem là có lợi cho sức khỏe động vật
(Knarreborg et al., 2008). Ngoài ra do B. subtilis có khả năng hình thành bào tử,
tồn tại lâu dài trong điều kiện tự nhiên mà không mất hoạt tính nên sản phẩm
12


probiotic sẽ rất thuận lợi khi lưu hành và bảo quản (La Ragione et al., 2008).
Chính vì lẽ đó B. subtilis đã được ưu tiên sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi ở
nhiều quốc gia.
2.1.7. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic
2.1.7.1. Về mặt sản xuất
- Có thể nhân lên nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn
giản và giá thành thấp.
- Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc vi hiếu khí.
- Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà
không mất số lượng đáng kể.
- Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng.
- Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến
thực phẩm bao gồm các quá trình nhiệt độ cao trên 45 oC cũng như chịu đựng
được nồng độ cồn và muối cao.
- Có thể tồn tại được trong quá trình lưu trữ trong khoảng thời gian dài mà

không bị giảm mật số.
2.1.7.2. Về mặt sử dụng cho vật nuôi
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật, tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho
quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh trong đường
tiêu hóa vật chủ. Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí
nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn
probiotic (FAO/WHO, 2002).
Theo FAO (2002) các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu
chuẩn chủ yếu sau:
- Có tính định danh chính xác thuộc loài nào.
- Không mang các gen kháng kháng sinh.
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa của vật chủ.
- Có khả năng cạnh tranh thức ăn với các vi sinh vật có hại.
- Không sinh chất độc và không gây bệnh cho vật chủ.
- Có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài.

13


- Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà cơ thể vật
chủ có thể sử dụng.
- Chịu được pH thấp ở dạ dày và nồng độ muối mật cao ở ruột non.
- Khả năng chịu được các dịch tiêu hóa.
- Khả năng cư trú trong ruột.
2.1.8. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic
Đánh giá độ an toàn phải tính đến bản chất của vi khuẩn được sử dụng,
phương pháp điều trị, mức độ phơi nhiễm, trạng thái sức khoẻ của động vật sử
dụng và các chức năng sinh lý mà probiotic được hướng tới.
Đối với nghiên cứu phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn
nuôi cần bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia

súc, gia cầm (Arturo et al., 2006). Điều này cho thấy yêu cầu an toàn đối với
chủng vi sinh vật được tuyển chọn làm probiotic dù dùng trong chăn nuôi cũng
cần xem xét các yếu tố tác động đến vật nuôi, con người và môi trường.
- Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm từ 1-3 tháng, kiểm tra các
chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các bệnh tiêu hóa, bệnh nhiễm
khuẩn và các phản ứng phụ (Arturo et al., 2006).
- Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người
và động vật, không mang gen lạ. Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có
nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi, đất) là các chủng được
khuyến cáo sử dụng.
- Tổ chức FAO (2002) hướng dẫn với việc tuyển chọn các chủng probiotic,
ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì các chủng này phải được cụ
thể hóa các thông tin về nguồn gốc chủng, tên phân loại đến chi và loài. Đối với
vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu Âu đã lập một Ủy ban khoa học về
dinh dưỡng động vật (Scientific committee for animal nutrition, SCAN) đưa ra
những qui định đánh giá an toàn đối với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn
đề này qua các điều luật và kỹ thuật online (SCAN, 2000).
Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần
được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo tàng
vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất phải theo tiêu chuẩn GMP
(Good Manufacturing Practices).
14


2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis
2.2.1. Đặc điểm chung của giống Bacillus
Theo Online Textbook of Bacteriology (Todar, 2015), Wikipedia và
Microbewiki Bacillus được phân loại như sau:
Bảng 2.1: Bậc phân loại của Bacillus subtilis
Tiếng Việt

Giới
Ngành
Lớp
Bộ
Họ
Chi/giống
Loài

Latin
Regnum
Divisio
Classis
Ordo
Familia
Genus
Species

Tiếng Anh
Kingdom
Division
Class
Order
Family
Genus
Species

Bậc phân loại
Bacteria
Firmicutes
Bacilli

Bacillales
Bacillaceae
Bacillus
Bacillus subtilis

Hiện nay đã xác định được 226 loài Bacillus có mặt rộng rãi trong tự nhiên
(Euzéby, 1997) đặc biệt trong đất, không khí, nước, trên cơ thể thực vật và động
vật, bụi cỏ khô và rơm rạ. Hầu hết là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu
khí, tạo nội bào tử, các tế bào tồn tại riêng lẻ hay dính nhau thành chuỗi ngắn. Nội
bào tử được mô tả đầu tiên bởi Cohen (1872) khi nghiên cứu về B. subtilis và sau
đó là Robert Koch trong các nghiên cứu về các loài vi khuẩn gây bệnh như
B. anthracis vào năm 1876. Sự tạo thành nội bào tử sau đó được chấp nhận như là
một đặc tính căn bản để phân loại và xác định các thành viên của chi. Tuy nhiên,
cũng có một số loài Bacillus không tạo bào tử như B. thermoamylovorans,
B. halodenitrificans, một số khác bắt màu Gram âm hay Gram dương yếu như
B. thermosphaericus, B. horti, B. oleronius, B. azotoformans (Yumoto et al.,
1998). Thêm vào đó, khi phân loại dựa vào giải trình tự rRNA/DNA, dạng vi
khuẩn không tạo bào tử, kỵ khí bắt buộc cũng thuộc nhóm Bacillus như
B. infernus (Boone et al., 1995).
Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hay vuông, kích thước từ
0,5-1,2 x 2,5-10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có
nội bào tử thì bào tử hình trụ, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Tùy theo loài,
bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối, và túi bào tử phồng hoặc không
phồng. Trong một số điều kiện đặc biệt (có HCO3- trong bình kỵ khí hoặc môi
trường CO2), B. subtilis, B. licheniformis B. megaterium và B. anthracis, tạo ra
một vỏ polypeptide (poly-γ-D-glutamic acid) nhìn thấy được khi nhuộm tế bào
với polychrome methylene blue. Trừ B. anthracis và B. mycoides, hầu hết các loài
15