Tuyển chọn chủng bacillus subtilis ứng dụng trong phòng và trị bệnh đường tiêu hóa trên gà tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Bệnh lý học & Chữa bệnh vật nuôi
Mã ngành: 62 64 01 02

LÊ THỊ HẢI YẾN

TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS
ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH
ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ

Cần Thơ - 2018



CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN

Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại:…………………………………., Trường Đại học Cần Thơ
Vào lúc …. giờ …. ngày …… tháng …..năm ……….

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam.


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015. Phân lập vi khuẩn Bacillus
subtilis ứng dụng làm probiotic từ đất và phân gà tại TP. Cần Thơ. Tạp
chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 55-62
2. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2015. Khảo sát đặc tính prbiotic của
một số chủng Bacillus phân lập tại một số trại gà thành phố Cần Thơ.
Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc Chăn nuôi – Thú y 2015.
ISBN 978-604-60-2019-6. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 485-491
3. Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2016. Isolation and identification of
Bacillus subtilis isolated from soil and feces on chicken farms in the
Mekong delta, Vietnam. Proceedings of The 19th Federation of Asian
Veterinary Associations Congress, Ho Chi Minh city, September 6-9th,
2016. Vietnam National University-Ho Chi Minh city Press, page 143147
4. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2016. Khảo sát đặc tính probiotic các
chủng vi khuẩn phân lập tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. ISSN
1859-2333. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ số 2, trang 2632
5. Lê Thị Hải Yến và Nguyễn Đức Hiền, 2017. Khảo sát khả năng chịu acid dạ
dày - muối mật và khả năng bám dính của hai chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis AG27 và VL28. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc
Chăn nuôi – Thú y 2017. ISBN 978-604-60-2492-7. Nhà xuất bản Nông
Nghiệp, trang 341-346
6. Le Thi Hai Yen and Nguyen Duc Hien, 2017. Isolation and characterization
of probiotic Bacillus subtilis VL28 on chicken farms in Vietnam.
Proceedings of 33rd World Veterinary Congress, Incheon – Korea,
August 27-31, 2016.
7. Le,T.H.Y. and Nguyen,D.H., 2017. Bacillus subtilis strain VL28 16S

ribosomal RNA gene, partial sequence. GenBank: KY346980.1
/>


CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 . Tính cấp thiết của đề tài
Sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi gà công nghiệp trong những
thập niên gần đây đã mang lại nhiều lợi ích kinh tế - xã hội to lớn, nhưng cũng
làm nảy sinh nhiều vấn đề cần được quan tâm xem xét. Một trong những vấn
đề cần quan tâm giải quyết là việc sử dụng rộng rãi các chất kháng sinh để
phòng bệnh và kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi. Việc này đã làm gia
tăng các dòng vi khuẩn kháng thuốc trong tự nhiên, có ảnh hưởng rất lớn tới
hiệu quả sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh viêm nhiễm trên người. Do
vậy, nhiều nước tiên tiến đã quyết định hạn chế việc sử dụng các chất kháng
sinh trong chăn nuôi. Để thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, các nhà khoa học
đã đưa ra nhiều giải pháp khác nhau trong đó có biện pháp sử dụng probiotic những vi sinh vật sống hữu ích cho hoạt động tiêu hóa và có tác dụng tăng
cường sức khỏe nói chung cho người và động vật. Bacillus subtilis là một vi
khuẩn rất phổ biến trong tự nhiên, hầu như không có độc tính trên người cũng
như nhiều loài động vật và có sức đề kháng cao với nhiều tác nhân vật lý và
hóa học. Do vậy, từ lâu vi khuẩn này được chọn nghiên cứu để làm probiotic
cho người và vật nuôi theo mô hình công nghiệp. Tuy nhiên, B. subtilis rất đa
dạng về các đặc tính sinh học nên không phải tất cả các chủng đều có thể sử
dụng làm probiotic và mỗi chủng probiotic chỉ phù hợp và có hiệu quả khi sử
dụng cho một đối tượng nhất định.
Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh
nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện nhằm nghiên cứu tìm giải
pháp mới thay thế sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nâng cao năng suất,
hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp và giảm bớt nguy cơ lan rộng các
dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh trong tự nhiên.
1.2. Mục tiêu:

1. Phân lập được ít nhất 01 chủng Bacillus subtilis tại một số tỉnh ĐBSCL
có các đặc tính probiotic như: khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase,
protease, lipase); chịu được tác động của dịch tiêu hóa (dịch vị, muối mật), có
khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và đối kháng với một số vi khuẩn gây
bệnh đường ruột (Salmonella, E. coli).
- Xác định được liều dùng hiệu quả của chủng probiotic phân lập được
trong phòng bệnh đường ruột ở gà do E. coli và S. enterica gây ra.

1


1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis.
- Phạm vi nghiên cứu: Các chủng Bacillus subtilis được phân lập từ đất
và phân gà ở 7 tỉnh thành thuộc Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Cần
Thơ, Hậu Giang, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Kiên Giang.
1.4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên chọn lọc được chủng B. subtilis
bản địa có hiệu quả trong phòng bệnh đường tiêu hóa trên gà tại vùng Đồng
bằng sông Cửu Long, đặc biệt là bệnh do S. enterica và E. coli gây ra.
- Đã phân lập và giám định chính xác 21 chủng B. subtilis bản địa từ phân
và đất chuồng gà ở khu vực ĐBSCL và tuyển chọn được chủng B. subtilis
VL28 có thể sử dụng làm probiotic trên gà.
- Đã chứng minh bằng thực nghiệm việc bổ sung chủng B. subtilis VL28
10 CFU/g với liều 5g/kg thức ăn có khả năng thay thế kháng sinh ngăn ngừa
quá trình nhiễm trùng đường ruột ở đàn gà được gây nhiễm thực nghiệm với
S. enterica và E. coli, đồng thời làm tăng mức tăng trưởng cũng như giảm hệ số
chuyển hóa thức ăn so với gà đối chứng.
7

- Đã được ngân hàng gen NCBI công nhận trình tự gen 16S rRNA của
B. subtilis VL 28 với mã số truy cập KY346980.
(có thể truy cập trên trang web
/>- Là công trình nghiên cứu, phân lập, tuyển chọn vi khuẩn probiotic một
cách hệ thống theo tiêu chuẩn Quốc tế.
1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Chọn lọc được chủng B. subtilis bản địa có tiềm năng dùng làm probiotic
phù hợp với điều kiện chăn nuôi tại Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả nghiên
cứu của đề tài dùng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm probiotic, phòng chống
bệnh đường ruột gia cầm, làm tăng năng suất chăn nuôi đem lại lợi nhuận cao
cho người chăn nuôi. Tạo cơ sở khoa học để đề xuất hạn chế sử dụng kháng
sinh làm chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh trong chăn nuôi. Góp phần
tạo được nguồn thịt gia cầm sạch, không tồn dư kháng sinh, bảo vệ sức khỏe
cộng đồng.

2


Chƣơng III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện với 3 nội dung:
3.1. Nội dung 1: Phân lập các chủng B. subtilis
- Phân lập B. subtilis bằng phương pháp truyền thống: dựa vào đặc điểm
khuẩn lạc và quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi, nhuộm Gram và thử
phản ứng sinh hóa.
- Định danh chính xác đến loài bằng kit API 50 CHB.
- Giám định chính xác giống và loài các chủng Bacillus tuyển chọn bằng
phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA.
Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu đất: Đất được lấy ở tầng mặt, độ sâu từ 4-5 cm. Mẫu gộp được lấy từ
5 vị trí khác nhau của 1 trại gà.

Mẫu phân: Lấy phân tươi trên nền chuồng. Mẫu gộp được lấy từ 5 vị trí
khác nhau trong chuồng gà (4 mẫu ở 4 góc và 1 mẫu ở trung tâm).
Lượng đất và phân lấy mỗi lần từ 30-50 g. Mẫu được đựng trong túi nilon
(polypropylen) đã được khử trùng. Sau khi lấy mẫu, tiến hành ghi nhãn địa
điểm và thời gian lấy, sau đó tất cả các mẫu được bảo quản bằng thùng trữ lạnh
và đưa về phòng thí nghiệm.
Số lƣợng mẫu
Chọn mẫu theo phương pháp định ngạch (phi ngẫu nhiên), mỗi địa phương
20 mẫu (10 mẫu đất + 10 mẫu phân). Tổng cộng: 140 mẫu/ 7 tỉnh, thành phố
ĐBSCL
Chuẩn bị mẫu
Cân 10 g mẫu + 90 mL nước muối sinh lý vô trùng cho vào bình tam
giác, lắc đều. Gia nhiệt ở 80ºC trong 20-25 phút để chọn những vi khuẩn có
khả năng là Bacillus spp. (Eman, 2013).
Phân lập vi khuẩn
Sau khi gia nhiệt, mẫu được tiến hành pha loãng và trải đĩa trên môi
trường TSA, ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Kết thúc thời gian ủ, chọn các khuẩn lạc
riêng rẽ, khác biệt nhau và tiến hành cấy phân lập, kết hợp với quan sát, ghi
nhận hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi để thu được chủng vi khuẩn thuần.

3


Tiến hành giám định các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B. subtilis theo
phương pháp của Cowan and Steel (2004) với một số cải tiến. Các phản ứng
sinh hóa bao gồm: lecithinase (-), catalase (+), VP (+), amylase (+), khả năng
phát triển ở 50oC và celluslase (+) được thực hiện lần lượt theo trình tự để sàng
lọc sơ bộ được nhóm vi khuẩn thuộc loài B. subtilis. Các chủng đạt yêu cầu,
sau đó sẽ được định danh bằng bộ kit API 50 CHB, chủng nào có kết quả là
B. subtilis sẽ được giải trình tự gen 16S RNA để khẳng định lại.

Sau khi ly trích DNA của các chủng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR
với cặp mồi phổ biến mã hóa cho đoạn gen 16S rRNA (Saminathan and
Narayanan, 2015) có trình tự như sau:
27F: (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')
1492R: (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'27F)
Qui trình phân lập và giám định vi khuẩn B. subtilis được trình bày tóm
tắt theo sơ đồ sau:
Chủng vi khuẩn thuần
↓
Test Lecithinase: (-)
↓
Test Catalase: (+)
↓
Test VP: (+)
↓
Test Amylase: (+)
↓
Khả năng phát triển ở 50ºC
↓
Test Cellulase: (+)
↓
API CH50B
↓
Giải trình tự gen 16S rRNA
Hình 3.1. Sơ đồ sàng lọc, định danh vi khuẩn B. subtilis
3.2. Nội dung 2: Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic
Gồm 7 chỉ tiêu như sau:
3.2.1. Tính chịu nhiệt. Tính chịu nhiệt của vi khuẩn được khảo sát theo
phương pháp của Barbosa et al. (2000) có cải tiến. Cấy chủng vi khuẩn cần

4


kiểm tra trên đĩa thạch TSA và ủ ở 50oC, 55oC và 60oC trong 24 giờ. Kết thúc
thời gian ủ, kiểm tra khả năng sống của vi khuẩn.
3.2.2. Khả năng nhạy kháng sinh (9 loại kháng sinh đang được dùng phổ
biến trên gia cầm: erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin,
doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin).
Tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn được xác định bằng phương pháp
đĩa khuếch tán kháng sinh theo hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và
xét nghiệm (Clinical and Laboratoty Standards Institude - CLSI, 2015)
(Wayne, 2015).
3.2.3. Khả năng sinh enzyme tiêu hóa (amylase, protease, lipase): Thực
hiện định tính và định lượng các chủng vi khuẩn khảo sát, sau đó chọn những
chủng có khả năng sinh cả 3 loại enzyme.
3.2.4. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh
Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp vạch thẳng vuông góc:
Khảo sát trên môi trường Starch agar (SA). Các bước tiến hành theo phương
pháp của Sertaç et al. (2014): cấy vi khuẩn B. subtilis dọc theo một đường
thẳng trên đĩa thạch SA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, tiến hành cấy vi khuẩn gây
bệnh (S. enterica, E.coli) theo các vạch ngang vuông góc với vạch vi khuẩn đã
mọc, tiếp tục ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khả năng kháng khuẩn được xác định
bằng cách đo khoảng cách vùng kháng khuẩn theo đơn vị mm dựa theo Hutt et
al. (2006).
Thử nghiệm khả năng đối kháng theo phương pháp đối kháng trực tiếp:
Thực hiện theo phương pháp của Moore et al. (2013): Vi khuẩn gây bệnh và
B. subtilis được hoạt hóa trong môi trường TSB và ủ ở nhiệt độ thích hợp trong
24 giờ. Huyền phù vi khuẩn B. subtilis được điều chỉnh sao cho mật số đạt 105,
106 và 107 CFU/mL tương ứng với nồng độ vi khuẩn gây bệnh để tiến hành thử
khả năng đối kháng. Bơm 100 µL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa

thạch và dùng que tran trải đều; sau đó, bơm 10 µL dịch vi khuẩn B. subtilis
tương ứng với các nồng độ khảo sát lên những vị trí xác định trên bề mặt thạch,
và đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khả năng đối kháng được đo bằng đường kính
vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh theo đơn vị mm. Đánh giá khả năng đối kháng
theo Sumathi and Reetha (2012).

5


3.2.5. Khả năng chịu acid và muối mật. Thực hiện theo phương pháp của
Corcoran et al. (2005) và Dunne (2001). Vi khuẩn B. subtilis được cấy ria trên
môi trường DSM, ủ từ 24 - 48 giờ ở 30ºC. Sau đó, tạo huyền phù sinh khối vi
khuẩn trong dung dịch đệm PBS pH 7,2, pha loãng để đạt mật số vi khuẩn
trong dịch huyền phù là 107 CFU/mL. Sau đó chủng 1 mL dịch huyền phù vào
9 mL dung dịch dạ dày mô phỏng gồm Glucose (3,5 g/L), NaCl (2,05 g/L),
KH2PO4 (0,6 g/L), CaCl2 (0,11 g/L), và KCl (0,37 g/L) được chuẩn độ về các
pH 2, 3, 4, 5 bằng dung dịch HCl 1M và lọc bằng màng lọc 0,2 μm. Sau đó
Pepsin (13,3 mg/L) và dịch mật (0,05 g/L) được cho vào dịch gốc trước khi tiến
hành thí nghiệm. Trộn đều và ủ dịch hỗn hợp ở 37ºC trong máy lắc 90 phút,
đồng thời tiến hành kiểm tra mật số vi khuẩn ở các thời điểm 0; 10; 30; 60, 90
phút. Tính tỉ lệ phần trăm sống sót của vi khuẩn B. subtilis.
3.2.6. Khả năng bám dính
- Khả năng bám dính cùng một chủng (tự bám dính): xác định theo phương
pháp của Del Re et al. (2003) và Kos et al. (2003). Hoạt hóa chủng vi khuẩn
cần kiểm tra trên môi trường TSA, ủ ở 37oC trong 24 giờ, sa+u đó cấy vi khuẩn
vào 100 mL TSB, nuôi ở 37oC trong 18 giờ. Sinh khối tế bào thu được sau khi
nuôi cấy được rửa 2 lần và tái huyền phù trong đệm Phosphate buffered saline
(PBS) sao cho nồng độ vi khuẩn đạt khoảng 108 CFU/mL (so độ đục Mc Farlan
0,5%). Sau đó 4 mL dịch huyền phù tế bào được trộn đều trong 10 giây. Khả
năng bám dính của các tế bào trong cùng một chủng được xác định trong 5 giờ

ở nhiệt độ phòng. Sau mỗi giờ, lấy 0,1 mL dịch nổi phía trên cho vào 1 ống
nghiệm khác chứa 3,9 mL PBS và xác định mật độ quang của dung dịch ở bước
sóng 600 nm (OD600). Kết quả được tính theo công thức sau:
Khả năng tự bám dính (%) = (Ao - At)/Ao × 100
Trong đó:Ao: OD600 của dung dịch tế bào ở thời điểm t = 0 giờ
At: OD600 dung dịch tế bào ở các thời điểm t = 1, 2, 3, 4 và 5 giờ
- Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau: xác định theo
mô tả của Kos et al. (2003) và Anwar et al. (2014). Phương pháp chuẩn bị mẫu
tương tự như phương pháp thử nghiệm khả năng tự bám dính, tuy nhiên sử
dụng vi khuẩn phân lập được lần lượt với hai chủng vi khuẩn thử nghiệm là
E. coli và S. enterica. Khả năng bám dính giữa các chủng vi sinh vật khác nhau
được tính toán theo công thức:

6


Khả năng bám dính giữa các chủng khác nhau (%)
= [(Ax + Ay)/2 - A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100
Trong đó: Ax là OD600 của chủng vi khuẩn x ở ống đối chứng
Ay là OD600 của chủng vi khuẩn y ở ống đối chứng
A(x+y) là OD600 của hỗn hợp 2 chủng vi khuẩn x và y
- Khả năng bám dính với biểu mô ruột. Tiến hành theo phương pháp của
Piatek et al. (2012): Chủng vi khuẩn B. subtilis được tăng sinh bậc 2 trong
20 mL dung dịch NB, ủ ở 37oC trong 24 giờ, và được điều chỉnh với mật số
108 CFU/mL. Mẫu biểu mô ruột gà được cắt thành những đoạn ngắn khoảng
1cm, và nhúng vào dung dịch đệm PBS trong 30 phút ở 4oC. Sau đó, mẫu được
ngâm trong dung dịch vi khuẩn cần kiểm tra, tiếp tục ủ ở 37 oC, trong 30 phút.
Dung dịch vi khuẩn được loại bỏ, mẫu được cố định trong formalin, và tiến
hành làm tiêu bản mô.
3.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đƣờng ruột gà

Thực hiện theo phương pháp của Cartman et al. (2008): gà con 1 ngày tuổi
được cho uống bào tử B. subtilis liều 0,1 mL canh khuẩn chứa 1x109 CFU/mL.
Sau đó, vào các mốc thời gian 24, 48, 72, 96 và 120 giờ, chọn 3 gà ngẫu nhiên,
mổ và thu mẫu ở hồi tràng, manh tràng và ruột già. Tiến hành rửa mẫu, xử lý
nhiệt ở 80oC, trong 20 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và các vi khuẩn khác.
Sau đó, tiến hành trải mẫu kiểm tra mật số vi khuẩn B. subtilis ở các mốc thời
gian như trên. Giá trị trung bình được tính theo số lượng bào tử/g ruột non,
manh tràng và ruột già.
3.3. Nội dung 3: Thử nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic
chứa B. subtilis trên gà
3.3.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu trong 3 thí nghiệm là chủng B. subtilis được phân lập
và tuyển chọn trong đề tài.
Gà thí nghiệm: là gà 1 ngày tuổi, thuộc giống gà ta Greenfeed GF168 nuôi
tại công ty chăn nuôi Vemedim.
Thức ăn và các qui trình tiêm chủng vaccine thực hiện theo qui trình của
công ty chăn nuôi.

7


3.3.2. Chuồng trại thí nghiệm
Gà được nuôi trên chuồng lồng, đáy lồng và vách được làm bằng khung
kẽm kích thước 0,6 x 1 x 2 m. Diện tích mỗi ô chuồng là 2m2 ngăn làm 2 ngăn,
mỗi ngăn là 15 con. Máng ăn và máng uống được bố trí riêng cho mỗi ngăn
chuồng
3.3.3. Thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B. subtilis hiệu quả
Mục đích: đánh giá tính an toàn và xác định liều hiệu quả của sản phẩm đối
với gà.
Bố trí thí nghiệm:

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm
thức, trong đó có 3 nghiệm thức tương ứng với 3 liều bổ sung B. subtilis và 1
nghiệm thức đối chứng không bổ sung B. subtilis. Mỗi nghiệm thức gồm 30 gà
và lặp lại 3 lần.
Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Chỉ tiêu theo dõi

Nghiệm thức
NT1
NT2
NT3
ĐC
Tuổi gà thí nghiệm, ngày
1
1
1
1
B. subtilis bổ sung, CFU/g (*)
107
106
5x105
Lượng bổ sung, g/kg thức ăn
5
5
5
Số ngày chuẩn bị thí nghiệm
7
7
7
7

Số ngày thí nghiệm
60
60
60
60
Ghi chú: (*): Liều tham khảo từ thí nghiệm của Knap et al. (2011) và Teo et al. (2006)

Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm
Lượng thức ăn đưa vào: xác định bằng cách cân tổng lượng thức ăn cho ăn
và thức ăn thừa hàng ngày của từng lô trong thời gian thí nghiệm.
Số gà chết: ghi nhận số gà chết hàng ngày và tổng kết mỗi 2 tuần.
Tăng trọng: gà được cân khối lượng khi bắt đầu thí nghiệm, sau đó mỗi 2
tuần cân một lần đến khi kết thúc thí nghiệm, tính khối lượng chung cho cả lô.
Tăng khối lượng toàn kỳ (g) = Khối lượng cuối kỳ (g) - Khối lượng đầu kỳ (g).
Tăng khối lượng bình quân (g/ngày) =
Hệ số chuyển hóa thức ăn

Tăng khối lượng toàn kỳ
Số ngày thí nghiệm

Tổng lượng thức ăn đưa vào (g)
Tổng tăng trọng của gà (g)

=

8


3.3.4.2. Thí nghiệm 2
Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà

khi gây nhiễm với S. enterica.
Bố trí thí nghiệm: gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên theo phương pháp của Knap et al. (2011): 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC
âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình
nuôi. Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố
trí như sau:
NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời
gian thí nghiệm.
NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu
từ ngày gây nhiễm.
NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu
từ ngày gây nhiễm.
Gây nhiễm S. enterica cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+)
vào ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần.
Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2
Chỉ tiêu theo dõi
Tuổi gà thí nghiệm, ngày
Tuổi gây nhiễm, ngày
S. enterica gây nhiễm(1), CFU/mL
B. subtilis bổ sung(2), g/kg thức ăn
Oxtetracycline, mg/kg thức ăn (3)
Enrofloxacine, mg/kg thức ăn (4)
Số ngày thí nghiệm

NT1
1
18
7,5x104
5
60

Nghiệm thức
NT2
NT3
ĐC (+)
1
1
1
18
18
18
7,5x104
7,5x104 7,5x104
50
15
60
60
60

ĐC (-)
1
60

(1)

S. enterica phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Knap et al., 2011).
Liều B. subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (10 7CFU/g)
(3), (4)
Liều oxtetracycline và enrofloxacine thí nghiệm tham khảo từ Pattison, 2008
(2)

Chỉ tiêu khảo sát:
- Mổ khảo sát gà (5 gà/nghiệm thức) ở 21 và 42 ngày tuổi, ghi nhận
bệnh tích, thu mẫu bệnh phẩm ở gan và lách, trữ lạnh và chuyển về phòng thí
nghiệm kiểm tra vi khuẩn gây bệnh.
- Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức.
- Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn
kỳ, hệ số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1.

9


3.3.4.3. Thí nghiệm 3:
Mục đích: Đánh giá khả năng bảo vệ của probiotic so với kháng sinh ở gà
gây nhiễm với E. coli.
Bố trí thí nghiệm: gồm 5 nghiệm thức bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu
nhiên theo phương pháp của Teo and Tan (2006): 2 nghiệm thức đối chứng (ĐC
âm, ĐC dương) cho ăn khẩu phần ăn bình thường của trại trong suốt quá trình
nuôi. Các nghiệm thức thí nghiệm (bổ sung probiotic hoặc kháng sinh) được bố
trí như sau:
NT1: Bổ sung B. subtilis 5g/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong suốt thời
gian thí nghiệm.
NT2: Bổ sung oxytetracycline 50 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu
từ ngày gây nhiễm.
NT3: Bổ sung enrofloxacine 15 mg/kg thức ăn, liên tục 5 ngày bắt đầu
từ ngày gây nhiễm.
Gây nhiễm E. coli cho các nghiệm thức NT1, NT2, NT3, và ĐC (+) vào
ngày thứ 18, mỗi nghiệm thức gồm 30 gà và lặp lại 3 lần.
Bảng 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3
Chỉ tiêu theo dõi

Tuổi gà thí nghiệm, ngày
Tuổi gây nhiễm, ngày
E. coli gây nhiễm(1), CFU/mL
B. subtilis bổ sung(2), g/kg thức ăn
Oxtetracyclin, mg/kg thức ăn (3)
Enrofloxacin, mg/kg thức ăn (4)
Số ngày bổ sung
Số ngày thí nghiệm

NT1
1
18
5x106
5
60
60

Nghiệm thức
NT2
NT3 ĐC (+)
1
1
1
18
18
18
5x106
5x106 5x106
50
5

60

15
5
60

60

ĐC (-)
1
60

(1)

E. coli phân lập từ gà bệnh, gây nhiễm qua đường uống 0,5ml/con (Teo and Tan,2006).
Liều B. subtilis hữu dụng được chọn ở thí nghiệm 1 (10 7CFU/g)
(3), (4)
Liều oxtetracycline và enrofloxacine thí nghiệm tham khảo từ Pattison (2008).
(2)

Chỉ tiêu khảo sát:
- Mổ khảo sát gà (5 gà/nghiệm thức) ở 21 và 42 ngày tuổi, ghi nhận bệnh
tích, thu mẫu bệnh phẩm ở gan và lách, trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm
kiểm tra vi khuẩn gây bệnh.
- Ghi nhận các biểu hiện bệnh lý của gà, tỉ lệ chết ở các nghiệm thức.
- Các chỉ tiêu lượng thức ăn đưa vào, tăng trọng, tăng khối lượng toàn kỳ,
hệ số chuyển hóa thức ăn ghi nhận giống thí nghiệm 1.

10

3.4. Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được xử lý sơ bộ trên bảng tính
Microsoft Excel 2010, sau đó phân tích phương sai (ANOVA) theo mô hình
tuyến tính tổng quát (General Linear Model) trên phần mềm Minitab 16.1.
Chƣơng IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn B. subtilis
4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp.
Từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân tại các trại gà ở 7 tỉnh thành, mẫu được xử lí
nhiệt, pha loãng, cấy tran và ủ ở 30ºC trong 24 giờ, kết thúc thời gian ủ, dựa
vào hình dạng khuẩn lạc, tiến hành chọn riêng từng dòng vi khuẩn và cấy
chuyển nhiều lần cho đến khi thuần. Kết quả thu được tổng cộng 296 chủng vi
khuẩn có hình que, gram dương và có khả năng sinh bào tử khi quan sát sau 48
giờ. Các khuẩn lạc của 296 chủng được tách ròng bằng phương pháp cấy ria và
trữ trong dung dịch NB (nutrient broth) có chứa 16% glycerol, bảo quản trong
tủ âm sâu 86oC.
4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp.
4.1.2.1. Định danh bằng các phản ứng sinh hóa
Từ 296 chủng, tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa theo trình tự: âm tính
với lecithinase, dương tính với catalase, VP, amylase, cellulase và có khả năng
phát triển ở 50oC (Cowan and Steel, 2003). Các phân lập vi khuẩn không đạt
yêu cầu sẽ được loại bỏ dần, cuối cùng, các chủng vi khuẩn tương đồng với 6
đặc điểm sinh hóa của B. subtilis sẽ được định danh bằng bộ kit API CH50B.
Kết quả kiểm tra sinh hóa được trình bày ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa
Chỉ tiêu
Số lượng chủng
Kết quả
Dương tính
Âm tính
Lecithinase

296
66
230
Catalase
230
230
0
VP
230
169
61
Amylase
169
91
78
Phát triển ở 50ºC
91
49
42
Cellulase
49
29
20
Theo qui trình chọn lọc, phản ứng sinh hóa đầu tiên được thực hiện là
lecithinase, đây là chỉ tiêu quan trọng giúp loại bỏ các loài Bacillus có độc tính.
Kết quả kiểm tra cho thấy 66/296 chủng dương tính với lecithinase, 66 chủng
này sẽ loại bỏ, không kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa tiếp theo. Tiếp tục thực

11

hiện phản ứng sinh hóa thứ 2 (catalase) với 230 chủng còn lại, tất cả đều cho
kết quả dương tính nghĩa là các chủng này có thể phát triển trong điều kiện hiếu
khí. Tiếp theo là phản ứng VP, vì B. subtilis dương tính với phản ứng này nên
thực hiện phản ứng VP sẽ giúp loại bớt các chủng không phải B. subtilis, kết
quả có 169/230 chủng dương tính, 61 chủng âm tính sẽ loại bỏ. Phản ứng sinh
hóa thứ 4 là amylase. Kết quả có 78 chủng âm tính, và 91 chủng dương tính.
Kết quả khảo sát cho thấy có 49/91 chủng có khả năng phát triển ở 50oC. Cuối
cùng, phản ứng cellulase được tiến hành nhằm xác định khả năng thủy phân
cellulose của vi khuẩn. Trong 49 chủng khảo sát, có 29 chủng dương tính với
cellulase, 29 chủng vi khuẩn này sẽ được tiếp tục định danh bằng bộ kit API
CH50B để xác định loài.
4.1.2.2. Định danh bằng bộ kit API CH50B
Sau khi tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh hóa, có 29 chủng đã thỏa đặc
tính của B. subtilis. Trong 29 chủng định danh bằng kit API, có 23 chủng được
xác định là B. subtilis/B. amyloliquefaciens với phần trăm chính xác từ 90,7%
- 99,9%; 6 chủng còn lại thuộc loài B. licheniformis. 23 chủng này sẽ tiến hành
giải trình tự gen để xác định chính xác đến loài B. subtilis.
4.1.2.3. Định danh bằng PCR và giải trình tự gen 16S rRNA
Kết quả điện di sản phẩm PCR của 23 chủng vi khuẩn cho thấy đã
khuếch đại thành công đoạn gen với kích thước 1500bp (Hình 4.4).
M

ST10 DT11 DT26 DT29 DT30 KG12 KG22 KG29 KG36

C

1500 bp

M CT11 AG07 AG17 AG19 AG60 VL16 ST06 ST08

C

1500 bp

M

VL05 VL28 VL41 KG09 AG27 AG49

C

Hình 4.4. Sản phẩm PCR của các chủng vi
khuẩn B. subtilis trong nghiên cứu
(M: thang chuẩn 100bp; ST10, DT11,…:
sản phẩm PCR của 23 chủng VK khảo sát;
C: đối chứng âm)

1500 bp

Giải trình tự gen 16S rRNA
Sau khi giải trình tự và xử lý bằng phần mềm BLAST so sánh kết quả
trên NCBI, kết quả cho thấy có 21 trong 23 chủng được xác định là B. subtilis
với mức độ tương đồng cao (99%-100%), 2 chủng còn lại là
B. amyloliquefaciens.

12


Tóm lại, từ 296 chủng vi khuẩn phân lập, sau khi tiến hành các bước chọn
lọc kiểm tra các phản ứng sinh hóa, và định danh bằng bộ kit API, cuối cùng

ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA, có 21 chủng vi khuẩn được xác
định là B. subtilis. 21 chủng B. subtilis này sẽ thực hiện các bước tuyển chọn
probiotic để chọn ra chủng tối ưu có khả năng phòng bệnh đường tiêu hóa trên
gà.
4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic
4.2.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao
Theo Sottnik (2002) gia cầm có thân nhiệt khoảng 41,5oC, cao hơn các
loài động vật hữu nhũ, do đó, ứng viên probiotic sử dụng trong chăn nuôi gia
cầm phải có khả năng phát triển cao hơn nhiệt độ bình thường (30-37oC).
Bảng 4.6. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis
Chủng VK
KG36, AG19, VL05
AG07, AG27, AG49, AG60,
VL16, VL28, VL41, ST08,
DT30, KG09, KG12, KG22
CT 11, AG17, ST06, ST10,
DT29, KG29
Tổng cộng

Số lƣợng
chủng
3

50oC
+

Nhiệt độ khảo sát
55oC
60oC
+

+

12

+

+

-

6

+

-

-

21

21

15

3

Ghi chú :
+ có khả năng sống được trong môi trường ở nhiệt độ khảo sát
- không có khả năng sống được trong môi trường ở nhiệt độ khảo sát

Kết quả trình bày ở Bảng 4.6 cho thấy tất cả 21 chủng vi khuẩn đều có
thể phát triển ở mốc nhiệt độ 50oC. Vậy 21 chủng B. subtilis phân lập đều có
khả năng chịu nhiệt, hoàn toàn có thể đáp ứng khi được dung nạp vào cơ thể
gia cầm. Như vậy ở chỉ tiêu chịu nhiệt thì 21 chủng B. subtilis khảo sát đều có
thể chọn làm probiotic.
4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh
Khả năng nhạy kháng sinh của vi khuẩn probiotic được xem là một trong
những tiêu chí quan trọng trong tiêu chuẩn chọn lọc vi khuẩn probiotic
(Hummel et al., 2007), theo Gueimonde et al. (2013), nếu vi khuẩn probiotic
còn nhạy với kháng sinh thì sẽ an toàn về mặt sinh học, vì không chứa plasmid
hoặc các gen kháng kháng sinh.

13


Hình 4.6. Mức độ mẫn cảm kháng sinh của 21 chủng vi khuẩn B. subtilis
Một điều đáng ghi nhận là có đến 95% chủng B. subtilis trong khảo sát
này kháng với kháng sinh colistin, điều này có thể là do colistin là kháng sinh
được sử dụng rất phổ biến trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa.

Hình 4.7. Kết quả
kháng sinh đồ của
chủng B. subtilis
AG27 và VL28

Qua khảo sát 21 chủng B. subtilis phân lập được chúng tôi nhận thấy trên
50% các chủng còn nhạy với nhiều kháng sinh và cả 21 chủng đều nhạy với
nhiều kháng sinh hơn so với 2 chủng đối chứng. Kết quả này cho thấy về chỉ
tiêu nhạy với kháng sinh thì cả 21 chủng B. subtilis khảo sát đều có khả năng
chọn làm probiotic.

4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
4.2.3.1. Khả năng sinh enzyme amylase, protease và lipase
Kết quả khảo sát khả năng sinh 3 loại enzyme được trình bày ở Bảng 4.7.
Bảng 4.7: Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis
Vi khuẩn
Amylase
Protease
Lipase
ĐC1
+
+
ĐC2
+
+
AG27, AG60, VL05, VL28, VL41,
+
+
+
DT29, KG09, KG12, KG22, KG36
CT11, AG07, AG17, AG19, AG49,
VL16, ST06, ST08, ST10, DT30,
+
+
KG29
Ghi chú (+) : Có khả năng sinh enzyme, (-): không có khả năng sinh enzyme

14


Theo Parsons (2004) các enzyme ngoại bào như amylase, protease, và

lipase đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa thức ăn, giúp thức ăn được
hấp thu dễ dàng. Do đó, để trở thành một probiotic thì chủng B. subtilis phải có
khả năng sinh được nhiều loại enzyme. Kết quả cho thấy trong 21 chủng
B. subtilis khảo sát chỉ có 10 chủng (AG27, AG60, VL05, VL28, VL41, DT29,
KG09, KG12, KG22, KG36) có khả năng sinh cả 3 loại enzyme, 10 chủng này
sẽ tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh.
4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh
4.2.4.1. Khả năng đối kháng của B. subtilis với 4 loài vi khuẩn gây
bệnh theo phƣơng pháp kẻ vạch vuông góc
Kết quả ở Bảng 4.9 cho thấy 10 chủng B. subtilis thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn ở những mức độ khác nhau.
Bảng 4.9: Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phương
pháp kẻ vạch vuông góc
Vi khuẩn
ĐC1
ĐC2
AG27
AG60
VL05
VL28
VL41
KG12
KG22
KG09
KG36
DT29
SEM
P
a,b,c,d

E. coli
5,47c
6,10c
8,00b
6,00c
6,00c
10,00a
6,00c
4,00d
6,00c
0,184
0,00

Khoảng cách kháng khuẩn (mm)
S. enterica
Staphylococcus
Streptococcus
6,27c
7,00bc
7,00bc
6,23c
12,00a
10,00a
10,00b
c
bc
6,00
7,00
4,00d
b

b
10,00
8,00
6,00c
a
a
13,00
10,00
12,00a
b
a
10,00
10,00
9,00b
10,00a
4,00d
6,00c
6,00c
b
10,00
9,00b
6,00c
8,00b
0,275
0,281
0,167
0,00
0,00
0,00

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

Từ kết quả đối kháng theo phương pháp kẻ vạch vuông góc, 4 chủng vi
khuẩn B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 thể hiện được hoạt tính đối
kháng với cả 4 vi khuẩn bệnh, là các chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh sẽ
tiếp tục khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đối kháng trực tiếp
để kiểm tra và so sánh hoạt tính đối kháng ở các nồng độ vi khuẩn khác nhau.
4.2.4.2. Khả năng đối kháng của B. subtilis với E. coli và S.enterica
theo phƣơng pháp đối kháng trực tiếp

15


Đối với E. coli.
Kết quả đối kháng trực tiếp của 4 chủng B. subtilis (AG27, AG60, VL05
và VL28) đối với E. coli ở các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL, 107
CFU/mL được trình bày qua Bảng 4.10.
Kết quả cho thấy cả 4 chủng AG27, AG60, VL05, và VL28 đều thể hiện
hoạt tính đối kháng với E. coli ở tất cả các nồng độ 105 CFU/mL, 106 CFU/mL
và 107 CFU/mL. Điều này cho thấy cả 4 chủng B. subtilis đều có tiềm năng
trong việc phòng và điều trị bệnh do E. coli cho gia cầm.
Bảng 4.10: Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và
VL28 đối với E. coli
Vi khuẩn phân lập
Đƣờng kính đối kháng (mm)
Nồng độ
Nồng độ E.coli
Nồng độ E. coli
Nồng độ E. coli
Chủng

(CFU/ mL)
(105 CFU/mL)
(106 CFU/mL)
(107 CFU/mL)
bc
a
AG27
14,43
14,00
12,07b
c
c
AG60
14,20
11,00
10,33c
105
a
b
VL05
15,53
13,00
10,27c
ab
a
VL28
15,27
14,00
13,50a
SEM

0,204
0,166
0,214
P
0,005
0,00
0,00
AG27
16,57a
16,00b
12,30b
AG60
15,23b
12,00d
12,57b
106
a
c
VL05
16,57
14,00
11,23c
VL28
17,43a
17,00a
16,83a
SEM
0,251
0,180
0,178

P
0,002
0,00
0,00
AG27
18,57ab
16,00b
14,23bc
AG60
17,40b
14,00c
13,57c
107
VL05
19,07ab
16,00b
15,17b
VL28
20,20a
19,00a
17,17a
SEM
0,449
0,194
0,301
P
0,014
0,00
0,00
a,b,c,d

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

Đối với S. enterica.
Bảng 4.11: Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và
VL28 đối với S. enterica
Vi khuẩn phân lập
Nồng độ
(CFU/ mL)
10

5

Chủng
AG27
AG60
VL05
VL28

Đƣờng kính đối kháng (mm)
Nồng độ
Nồng độ
Nồng độ
S. enterica
S. enterica
S. enterica
(105 CFU/mL)
(106 CFU/mL) (107CFU/mL)
a
20,23
20,00a

15,50a
a
b
19,33
16,00
12,30b
a
b
19,17
15,00
11,03b
a
a
20,17
19,00
16,83a

16


SEM
P
AG27
AG60
VL05
VL28
SEM
P
AG27
AG60

VL05
VL28
SEM
P

106

107

a,b,c,d

0,331
0,109
22,83a
20,50a
21,17a
22,2a
0,676
0,143
25,33a
21,57b
23,17ab
25,83a
0,702
0,009

0,255
0,00
21,00a
17,00b

18,00b
20,00a
0,303
0,00
25,00a
21,00b
20,00b
24,00a
0,338
0,00

0,302
0,00
16,50b
13,90c
12,93c
18,50a
0,352
0,000
17,67b
15,50c
14,33c
20,17a
0,323
0,00

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

Bảng 4.11 cho thấy cả 4 chủng B. subtilis đều thể hiện hiệu quả đối
kháng trên S. enterica, trong đó AG27 và VL28 thể hiện hiệu quả đối kháng

vượt trội hơn ở tất cả các nồng độ khảo sát.
4.2.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật
Ở gà, pH dạ dày (dạ dày tuyến và mề) dao động trong khoảng từ 2,5-3,5
(Gauthier, 2002). Với mật số ban đầu của vi khuẩn B. subtilis được điều chỉnh
về 4,5x106 CFU/mL, chúng tôi khảo sát khả năng chịu từ pH 4, 3, và pH 2
trong dịch dạ dày mô phỏng và muối mật. Sau đây là kết quả khảo sát ở pH 2
Bảng 4.16: Kết quả khảo sát acid-muối mật ở pH 2
Chủng
vi
khuẩn
ĐC1
ĐC2
AG27
AG60
VL05
VL 28
SEM
P
a,b,c,d

0 phút
log
CFU/mL
d

0,00
4,76c
5,43b
0,00d
0,00d

6,62a
0,027
0,00

%
72
82
99

Lƣợng vi khuẩn và % sống tại các thời điểm
10 phút
30 phút
60 phút
log
CFU/mL
d

0,00
4,69c
5,39b
0,00d
0,00d
6,58a
0,017
0,00

%
70
81
99

log
CFU/mL
d

0,00
4,58c
5,31b
0,00d
0,00d
6,54a
0,035
0,00

%
69
80
98

log
%
CFU/mL
d

0,00
4,24c
5,21b
0,00d
0,00d
6,48a

0,062
0,00

64
78
97

90 phút
log
CFU/mL
d

0,00
3,67c
5,19b
0,00d
0,00d
6,46a
0,037
0,00

%
55
78
97

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)
ĐC1: chủng đối chứng B. subtilis (ATCC ® 19659™)
ĐC2: chủng đối chứng (sản phẩm trên thị trường)

Bảng 4.16 cho thấy AG60, VL05 và ĐC1 hoàn toàn không thể chịu được
pH 2, ngay từ thời điểm 0 phút, mật số của AG60, VL05 và ĐC1 đã giảm về 0.
Trong khi đó, AG27 và VL28 có khả năng chịu đựng khá cao, VL28 vẫn duy

17


trì tỉ lệ sống gần như không giảm trong suốt 90 phút khảo sát (ở 0 phút là 99%
và sau 90 phút là 97%), còn AG27 ở thời điểm 0 phút là 82%, và giảm còn
78% ở thời điểm 90 phút. Hai chủng vi khuẩn này thực sự là các ứng viên tiềm
năng, sẽ tiếp tục được kiểm tra các chỉ tiêu probiotic tiếp theo.
4.2.6. Khả năng bám dính
4.2.6.1. Khả năng tự bám dính
Kết quả cho thấy tỉ lệ bám dính giữa các chủng B. subtilis có xu hướng
tăng dần đều theo thời gian. Sau 5 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, mức độ bám dính
của các chủng gần như tăng gấp đôi so với thời điểm 1 giờ (Bảng 4.17).
Bảng 4.17: Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính
Chủng vi
khuẩn
ĐC1
ĐC2
AG27
VL28
SEM
P
a,b

Vi khuẩn bám dính tại các thời điểm (%)
1 giờ
2 giờ

3 giờ
4 giờ
43,9a
62,5a
66,4
72,2
30,2ab
57,8ab
65,0
66,1
24,3b
62,1a
63,3
69,8
36,8ab
40,9b
61,9
74,5
3,51
4.02
2,11
2,13
0,021
0,016
0,508
0,106

5 giờ
73,8ab
76,7ab

70,2b
82,0a
2,13
0,024

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

4.2.6.2. Khả năng bám dính với vi khuẩn gây bệnh
Kết quả trình bày ở Bảng 4.18 cho thấy cả 4 chủng AG27, VL28, và 2
chủng đối chứng đều có khả năng gắn kết với vi khuẩn E. coli và S. enterica.
Tuy nhiên, tỉ lệ phần trăm bám dính của VL28 cao hơn so với AG27 và 2
chủng đối chứng.
Bảng 4.18. Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E. coli và S. enterica
Thời
gian
0 giờ

5 giờ

a,b,c,d

chủng VK
ĐC 1
ĐC 2
AG 27
VL28
SEM
P
ĐC 1
ĐC 2

AG 27
VL28
SEM
P

Tỉ lệ bám dính với vi khuẩn gây bệnh
(%)
E. coli
S. enterica
8,60b
25,75a
b
10,14
12,62c
c
4,76
16,15bc
a
24,82
20,79ab
0,627
1,37
0,00
0,00
26,30c
59,51b
41,35b
46,14c
c
19,33

36,40d
a
60,98
65,64a
2,56
1,22
0,000
0,001

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 cột thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

18


4.2.6.3. Khả năng bám dính với biểu mô ruột
Khả năng bám dính của 2 chủng AG27, và VL28 được quan sát qua tiêu bản
vi thể biểu mô ruột gà thí nghiệm, nhuộm HE. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển
vi quang học ở độ phóng đại 400 và 1000 lần được trình bày ở Hình 4.21.

Hình 4.21. Khả năng bám dính của 2 chủng VL28 (bên trái) và AG27 (bên phải)
trong biểu mô ruột (400X và 1000X)

Kết quả cho thấy cả 2 chủng B. subtilis đều có khả năng bám dính với
màng tế bào biểu mô ruột. Sau khi kiểm tra 3 đặc tính bám dính của 2 chủng
VL28 và AG27 nhận thấy cả 2 đều có khả năng tự bám dính cao, có khả năng
bám dính với tế bào biểu mô ruột gà, tuy nhiên khả năng kết dính của AG27
đối với vi khuẩn gây bệnh là rất thấp, vì thế dù AG27 đã được ghi nhận mang
nhiều đặc điểm probiotic có lợi, nhưng khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh
khi được dung nạp vào hệ tiêu hóa có thể kém hơn. Do đó chúng tôi chỉ chọn
chủng VL28 để khảo sát khả năng sống trong đường ruột gà.

4.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đƣờng ruột gà
Kết quả khảo sát khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà được
thể hiện thông qua mật số bào tử B. subtilis VL28 và phần trăm bào tử hiện
diện được ghi nhận qua các mốc thời gian theo Bảng 4.19.
Bảng 4.19. Khả năng sống của B. subtilis VL28 trong đường ruột gà
Lƣợng vi khuẩn và % hiện diện tại các thời điểm
24 giờ
48 giờ
72 giờ
96 giờ
120 giờ
Mẫu
log
%
log
%
log
%
log
%
log %
CFU/g
CFU/g
CFU/g
CFU/g
CFU/g
4,40
49 3,96
44
3,28

36
2,85 32 2,59 29
Ruột non
48 3,61
40
3,1
34
2,8
31
2,5 28
Manh Tràng 4,32
3,94
44 3,32
37
3,07 34
2,69 30 2,26 25
Ruột già
Ghi chú: Liều B. subtilis VL28 cho uống ban đầu 109CFU/ml, mỗi gà 1ml.

19


Kết quả ở Bảng 4.19 cho thấy bào tử vi khuẩn B. subtilis VL28 có thể tồn
tại trong đường tiêu hóa của gà, với mật số giảm dần theo thời gian.
Tóm lại, qua quá trình phân lập, tuyển chọn đã xác định chính xác 21
chủng B. subtilis. Sau đó thực hiện khảo sát 7 đặc tính probiotic của 21 chủng
B. subtilis này, chúng tôi đã chọn được chủng B. subtilis VL28 là chủng còn
nhạy với nhiều kháng sinh, có khả năng chịu nhiệt, có cả 3 loại enzyme
amylase, protease và lipase với hoạt tính cao. Hơn nữa, chủng này có khả năng
đối kháng cao với E. coli và S. enterica, chịu được acid dạ dày và muối mật,

có tính bám dính cao và sống được trong đường tiêu hóa gia cầm. Chúng tôi
tiến hành thử nghiệm trên gà để có thể xác định được liều sử dụng hiệu quả
cũng như khả năng phòng bệnh đường tiêu hóa của chủng B. subtilis VL28.
4.3. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà
4.3.1. Kết quả thí nghiệm 1: Xác định liều sử dụng B. subtilis
Thí nghiệm 1 với 4 nghiệm thức lần lượt là NT1 bổ sung B. subtilis VL28
vào thức ăn với liều 107 CFU/g (5 g/kg thức ăn), NT2 với liều 106 CFU/g
(5g/kg thức ăn), NT3 với liều 5x105 CFU/g (5 g/kg thức ăn), ĐC là nghiệm
thức đối chứng sử dụng thức ăn của trại. Kết quả theo dõi tăng trọng, lượng
thức ăn tiêu thụ và hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) của gà qua 8 tuần thí
nghiệm được trình bày qua Bảng 4.20.
Bảng 4.20: Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR gà qua 8 tuần thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Giai đoạn 1- 28 ngày
KL đầu kỳ, g/con
KL lúc 28 ngày, g/con
Tăng trọng, g/con
Thức ăn sử dụng, g/con
FCR
Giai đoạn 29-56 ngày
KL lúc 56 ngày, g/con
Tăng trọng, g/con
Thức ăn sử dụng, g/con
FCR
Giai đoạn 1-56 ngày
Tăng trọng, g/con
Thức ăn sử dụng, g/con
FCR
a,b,c,d

Nghiệm thức
NT2
NT3

SEM

P

69,43
69,55 69,57
69,50
423,63 392,35 381,77 369,2
354,20a 322,80b 312,20c 299,70d
653,70 671,20 669,60 695,00
1,85c
2,08b 2,14b
2,32a

0,09
1,09
1,14
9,39
0,03

0,000
0,000
0,000
0,079
0,000

1061,7
638,1a
1721b
2,69b

970,5 962,0
582,6b 556,3c
1776b 1745b
3,05a 3,14a

938,0
590,8b
1944a
3,29a

5,24
4,844
34,80
0,02

0,000
0,000
0,007
0,001

992,2a
2370c
2,39c

900,9b 868,5c

2587b 2548bc
2,87b 2,94b

892,5b
2851a
3,19a

5,245
45,83
0,054

0,000
0,001
0,001

NT1

ĐC

các giá trị mang số mũ khác nhau trong cùng 1 hàng thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.01)

KL : khối lượng

20