Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này ( Luận văn thac sí)

-1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
ĐẠI HỌC KHOA HỌC

Nguyễn Ngọc Mai

“Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao
sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá
tính chất của enzyme này”.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-2-

MỞ ĐẦU
Chitin phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, là polysaccharide phổ biến thứ hai
sau cellulose. Nó là một chuỗi polymer chứa các đơn phân là N-acetylglucosamine
đƣợc liên kết bởi liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, không hòa
tan trong nƣớc và các dung môi hữu cơ khác. Chitin là thành phần cấu trúc chính
trong vỏ và lớp biểu bì của động vật chân đốt, giáp xác, các loài côn trùng và trong
thành tế bào của nấm.
Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành các sản phẩm
khác nhau nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose. Chitinase có trong
nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xƣơng
sống, thực vật và động vật có xƣơng sống. Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều trong
các ngành nông nghiệp nhƣ là một tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực
vật, kiểm soát côn trùng. Trong y dƣợc, chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch
bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta đã nghiên cứu
tách chiết chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau nhƣ vi khuẩn, nấm,

động vật, thực vật… nhƣng chỉ có chitinase do vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt là từ
nấm sợi mới có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ và pH.
Hiện nay, đối với việc phòng ngừa côn trùng có hại cho cây trồng thì biện
pháp biến nhất vẫn là sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Việc sử dụng thuốc trừ sâu
hóa học với liều lƣợng ngày càng cao, tần suất nhiều đang ảnh hƣởng nghiêm trọng
đến sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng sinh thái. Với ƣu điểm vƣợt trội về sự thân
thiện với con ngƣời và môi trƣờng thì thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học
đang là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hƣớng phát triển nền nông nghiệp
bền vững. Lecanicillium lecanii là một trong số những chủng nấm
entomopathogenic, mà trƣớc đó đã đƣợc biết đến rộng rãi nhƣ Verticillium lecanii,
nhƣng hiện nay đƣợc hiểu là một dạng anamorphic trong nhóm Trùng thảo. Hầu
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-3hết, entomopathogens đều kí sinh trên cơ thể côn trùng. Tuy nhiên, một số
entomopathogens có thể tồn tại trên cây trồng. Vì vậy, L. lecanii spp. có thể có hai
vật chủ là côn trùng và thực vật. Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp. kí sinh và
gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây, đặc biệt là rệp. Lecanicillium có độc lực
rất mạnh đối với một số loài rệp nhƣ: rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis
gossypii). Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp. rất đƣợc quan tâm trong vấn đề
kiểm soát côn trùng và sâu hại cây.
Từ những vấn đề thực tiễn đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase
từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của
enzyme này”.
Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính
chitinase. Đồng thời, tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase.
Nội dung đề tài:

- Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii bằng cách sử dụng hóa chất
gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím).
- Sàng lọc các chủng nấm kí sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao nhất.
- Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí
sinh côn trùng đột biến sàng lọc.
- Xác định tính chất chitinase.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-4-

Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE
1.1.1. Giới thiệu về chitinase
Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase]
thuộc nhóm glycosyl hydrolase, là enzyme thùy phân chitin thành các đơn phân là
chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside
giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin.
Kí hiệu của chitinase là EC3.2.1.14
Trong đó: 3

→ Hydrolase

2

→ Glycosylase

1

→ Glycosidase

14 → Chitinase
Chitinase còn có các tên gọi khác tùy theo xuất xứ của enzyme là
chitodextrinase,

β-poly-N-acetylglucosamine,

ChiA1

(Bacillus

circulans),

Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98].
Chitinase có thể đƣợc tìm thấy ở những loài có thành phần cấu trúc chứa
chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin nhƣ vi khuẩn,
thực vật [59]. Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá
trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào. Tùy thuộc vào các loài sinh vật khác
nhau mà tổng hợp chitinase với mục đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp chitinase
để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật, chitinase nằm
trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm bằng cách phá vỡ thành tế
bào chứa chitin của nấm [91].

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B

-5Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó.
Chitin [111]
Chitin [(C8H13O5N)n] là một trong những dạng
polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, đƣợc tạo
thành bởi các đơn phân là N-acetylglucosamine liên
kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside. Về mặt
cấu trúc , chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose,
điểm khác biệt duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí
số 2 trên khung carbon của chitin đƣợc thay bằng
nhóm hdroxyl (-OH) ở cellulose [71].

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học
của chitinase

Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen. Nó
không hòa tan trong nƣớc, kiềm loãng hay đặc, rƣợu và hầu hết các dung môi hữu
cơ thông thƣờng. Nó tan axit vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) và một số dung
môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94].
Một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, huyễn thể, giáp xác và
giun tròn, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của lớp vỏ. Ở động vật thủy
sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm khá cao
từ 14 – 35% so với trọng lƣợng khô [10]. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế
bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [85].
Các dẫn xuất của chitinase
Chitinase có thể thủy phân một số dẫn xuất của chitin nhƣ glycol-chitin,
carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl
chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] và không thủy phân một số cơ
chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-6-

1.1.2. Phân loại chitinase
 Dựa vào phản ứng phân cắt
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase,
N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60].
Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một
cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide. Các enzyme này đã đƣợc nghiên cứu
từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại
endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ± 0,2 và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium
virens (M = 41kDa, pI = 78).
Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm
chính là các dimer chitobiose.
N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin
từ một đầu cho sản phẩm chính là các nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin.

Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase [117]

 Dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 và
Glycohydrolase 20 [60].

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B

-7-

Họ Glycohydrolase 18:
Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc
Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn
có chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.
Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8
xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các
đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-anomer [43]. Chúng thủy phân các
liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình
anomeric. Hoạt tính của các chitinase thuộc họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [53].
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm những chitinase từ thực
vật (Arabidosis, dƣa leo, cây họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus,
Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…),
virus và động vật [53].
Họ Glycohydrolase 19:
Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua
(Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)…
ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus
influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông
qua cơ chế nghịch chuyển.
Họ Glycohydrolase 20
Họ

Glycohydrolase

20

bao

gồm

β-N-acetyl-D-Glucosamine

acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và ngƣời.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-8-

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của họ Glycohydrolase 18 (A) và
họ Glycohydrolase 19 (B) [118]

 Dựa vào trình tự amino acid
Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng
điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase
thành 5 nhóm [88]:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối
với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C)
(peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết
enzyme và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc tác.
Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu
đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid
tƣơng tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.
Chúng đƣợc cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài.

Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II
Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 –
47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I,
phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so
với chitinase nhóm I.

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-9Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn
chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở
thực vật bậc cao.
1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase
Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật
và động vật [37], [60], [94].
 Chitinase vi khuẩn
Chitinase đƣợc tìm thấy ở Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas,
Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng
hợp chitinase để phân giải chitin trong môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho
sự sinh trƣởng và phát triển.
Chitinase ở vi khuẩn có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy
nhiên trong các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. ngƣời ta đều cho thêm chitin nhƣ
nguồn cơ chất kích thích làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định
hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết.
 Chitinase nấm
Các loài nấm sợi cũng có khả năng tạo ra chitinase. Các chủng nấm mốc cho
chitinase cao nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia ... và đặc biệt ở
các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus ...

Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về
mặt dinh dƣỡng, nhƣng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình
phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính
của vách tế bào nấm. Chitinase còn giữ vai trò trong hoạt động kí sinh nấm nhằm
đối kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-10 Chitinase thực vật
Những thực vật bậc cao có khả năng sinh chitinase nhƣ thuốc lá, cao su, lúa
mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... Ngoài ra, một số loài tảo biển cũng
là nguồn cung cấp chitinase [41].
Chitinase do thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các loại côn trùng và
nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng [44]. Ngƣời ta đã quan sát thấy chitinase đƣợc
tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên cũng có
tác giả cho rằng chitinase còn có vai trò khác nhƣ tham gia vào quá trình hình thành
phôi [35].
 Chitinase động vật
Ở một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu
hóa của nhiều loài động vật không xƣơng nhƣ ruột khoang, giun tròn, thân mềm,
chân đốt ... có thể thu nhận đƣợc chitinase (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix
aspersa). Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và
dịch dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những
loài chim, thú ăn sâu bọ.
Ngoài ra, chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt
quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ,
lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá

trình biến thái hay lột xác [33].
1.2. NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE
1.2.1. Sơ lƣợc nghiên cứu về chitinase
 Nghiên cứu trên thế giới
So với các enzyme nhƣ protease, amylase… thì chitinase đƣợc nghiên cứu
chậm hơn. Chitinase lần đầu đầu tiên đƣợc mô tả bởi Bernad (1911) về ảnh hƣởng
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-11của nhiệt độ đến chitinase và khả năng kháng nấm ở cây hoa phong lan [7]. Đối với
vi sinh vật, đối tƣợng đƣợc nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn
Streptomyces nhằm thu nhận chitinase ứng dụng trong việc phá vỡ vách tế bào nấm
[23], [42]. Năm 1987, Mark O'Brien và Rita R. Colwell đã tiến hành xác định hoạt
tính chitinase của 101 chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ các nguồn môi trƣờng khác
nhau bằng cách kiểm tra tại chỗ trên giấy lọc với 4-methylumbellifety-N-acetyl-Dglucosamine [84]. Henrissat (1991) dựa trên sự tƣơng đồng về trình tự amino acid ở
vùng xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong
đó chitinase đƣợc chia thành hai họ 18 và 19 [52]. Năm 1993, Henrissat và Bairoch
phân loại thêm những enzyme từ các loài Flavobacterium, endo-Nacetylglucosaminidase. Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [53].
Những năm gần đây, một số nghiên cứu trên chitinase từ nấm ký sinh côn
trùng. Năm 1998, Kang và cộng sự (cs) đã tinh sạch và xác định các đặc tính của
chitinase trên nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae [62]. Năm 2002,
Tikhonov và cs tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính chitinase từ 2 chủng nấm
Verticillium chlamydosporium và V. Suchlasporium [100]. Năm 2003, LI và cs
nghiên cứu việc tăng hoạt tính của β-1,3-glucanse và chitinase trong mô sẹo trên
cây bông bằng salicylic acid và sự tác động của độc tính nấm Verticillium dahliae
[74]. Năm 2005, Duo-Chuan và cs đã tinh sạch và xác định tính chất của chitinase
từ Talaromyces flavus. Laura và cs (2006) tiến hành nghiên cứu sản xuất
oligosaccharides bằng enzyme thủy phân chitin là chitinase từ nấm Lecanicillium

fungicola [36]. Năm 2009, PENG và cs đã nghiên cứu vai trò của protease và
chitinase trong quá trình lây nhiễm côn trùng của nấm Verticillium lecanii [89].
Môi trƣờng thích hợp để sản xuất chitinase từ vi khuẩn hay nấm cũng đƣợc nghiên
cứu rất nhiều trên các loại môi trƣờng lỏng, môi trƣờng xốp… [30], [40], [47], [51],
[65], [92].

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-12 Nghiên cứu trong nước
Nhìn chung những nghiên cứu về chitinase ở trong nƣớc vẫn còn rất hạn chế
cho dù tiềm năng ứng dụng của enzyme này rất là cao. Năm 2003, các tác giả
Nguyễn Thị Hồng Thƣơng, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình
nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme
chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma sp. [14]. Năm 2004, tác giả Đinh
Minh Hiệp đã nghiên cứu quy trình tách chiết chitinase thu nhận từ nấm mật
Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dƣợc
[6]. Trên đối tƣợng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu
quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu
enzyme chitinase có hoạt tính khá cao [11]. Năm 2010, tác giả Nguyễn Đinh Nga
và cs khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận
từ lá cây khoai lang và từ nấm Trichoderma [8]. Năm 2012, Nguyễn Thị Hà đã tối
ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp chitinase
đƣợc phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ [4].
1.2.2. Ứng dụng của chitinase
 Trong nông nghiệp
Chitinase đƣợc sử dụng trong kiểm soát nấm gây bệnh ở thực vật. Nhiều loài
côn trùng, nấm mốc có thể gây ra nhiều loại dịch bệnh gây hại cho cây trồng và vật

nuôi, ảnh hƣởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp. Theo Hirohi Ihui, chitinase
luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin. Khi thực vật
bị nhiễm nấm gây bệnh chứa chitin, các tế bào sẽ bị kích thích sinh ra chitinase và
β-1,3-glucanase xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của
bệnh [54]. Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác
động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac,
phenylalamin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật. Vì
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-13chitin không phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật có xƣơng nên
ngƣời ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các nấm và
côn

trùng

nhƣ

1-(1,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol),

nikkomycin,

polyxin D… Khi áp dụng trên thực vật và động vật, những tác nhân trên có nhiều
ƣu thế trong việc diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kế cho
thực vật hoặc động vật có xƣơng sống. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp.
NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor
rouxii và Rhizopus nigricans [34]. Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính
tƣơng thích của những chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt côn

trùng và thuốc diệt nấm thƣờng đƣợc sử dụng [24]. Chitinase từ Bacillus cereus
YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật nhƣ Fusarium oxyporum, F.
Solani, Penicillium ultimum [32].
Ngoài ra, chitinase còn có vai trò trong kiểm soát côn trùng. Cơ thể của côn
trùng có chứa chitin ở lớp vỏ ngoài và ống tiêu hóa. Phần lớn các nấm gây bệnh
côn trùng nhƣ Metarhizium anisopliae, Nomurae rileyi, Aschersonia aleyrodis,
Verticillium lecanii và một số nấm thuộc bộ Entomophtorales xâm nhập vào cơ thể
sâu bọ, côn trùng dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng .Sau đó
nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì, phá hủy các mô cơ thể, gây chết côn
trùng [15, 84]. Các nhà khoa học đã chứng minh mối liên hệ giữa khả năng tiêu diệt
sâu bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp chitinase của các loài vi nấm này.
 Trong y – dược học
Chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine là chất có tiềm
năng rộng lớn trong y dƣợc. Chitooligosaccharides có lợi ích tiềm năng đối với sản
xuất thuốc cho ngƣời. Trong y học, ngƣời ta sử dụng các oligomer chitohexaose và
chitoheptaose làm tác nhân kháng các khối u ung thƣ [68]. Chitinase thu nhận từ
Vibrio alginolyticus đã đƣợc sử dụng để sản xuất chitopentaose và chitotriose từ cơ
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-14chất chitin huyền phù [82]. Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N-acetyl
glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng dịch enzym thô từ Aeromonas
hydrophila H-2330 [93]. Giữa các enzyme thủy phân chitin có thể kết hợp với nhau
để thu nhận những oligomer có chiều dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo
chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl glucosamindase và
exochitinase; trong khi để tạo N-acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao exochitinase và
N-acetyl glucosamindase. Aloise và cộng sự (1996) nhận thấy khi ủ enzyme
chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy có

sự hình thành các hexamer [101].
Nhiều phƣơng pháp chẩn đoán bệnh nấm nhƣ ELISA, sự ngƣng kết kháng thể,
mẫu dò phân tử… tuy nhiên giá thành cao. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên
cứu sử dụng chitinase trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra.
Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn
trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết
chồi. Do đó có thể dùng phƣơng pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở
xây dựng một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm gây bệnh. Các nhà khoa
học đã đề xuất một phƣơng pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách
sử dụng chitinase đã đƣợc phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên
chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng nhƣ một
mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao đểnhận diện một cách đặc hiệu các
vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh
[57], [71].
Ngoài ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc
bôi ngoài da chứa chất chống nấm bệnh thƣờng xảy ra các nƣớc vùng nhiệt đới bởi
khả năng phân hủy vách tế bào vi nấm của chúng. Các nhà khoa học đề nghị sử
dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác (nhƣ
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B


-15-

amphotericin B, 5-fluorocytosin, các dẫn xuất azol, allylamines-thiocarbamastes,
griseofulvin, bezoic…) nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase. Chitinase
có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lƣợng không gây tác
dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc kết hợp giữa chitinase và laminarinase
đƣợc ghi nhân là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm so với chỉ

dùng chitinase [3], [41].
1.3. NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG LECANICILLIUM LECANII
Lecanicillium lecanii thuộc chủng nấm entomopathogenic. Lecanicillium spp.
có khả năng kí sinh trên hai vật chủ là côn trùng và thực vật [21]. Trong tự nhiên,
nấm này kí sinh và gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây trồng. L. lecanii có phổ
vật chủ rộng gồm côn trùng có cánh, động vật chân đốt, sâu, bƣớm.
Nấm Lecanicillium spp. có thể sợi
màu trắng và bông. Sợi nấm trong suốt ,
có tốc độ tăng trƣởng 29 – 33mm sau 10
ngày, cả ở không khí lẫn trong môi
trƣờng nuôi cấy. Bào tử đính có hình
Hình 1.4: Sợi nấm và bào tử
Lecanicillium lecanii [113]

elip đƣợc bố trí theo hình trụ ở đỉnh,
trong suốt, 4 – 5,6 x 1,6 – 2,4µm [29].

Nấm gây bệnh trên côn trùng dựa trên sự xâm nhập của các bào tử. Bào tử gặp
độ ẩm và nguồn dinh dƣỡng thích hợp sẽ nảy mầm và xâm nhập vào cơ thể côn
trùng thông qua lớp biểu bì bên ngoài, giữa các bộ phận trong cơ thể. Trong quá
trình nảy mầm, bào tử tổng hợp protease, chitinase và lipase giúp các ống mầm
xâm nhập vào lớp biểu bì đồng thời các enzyme hủy hoại hệ thống mô, cơ quan của
côn trùng. Sợi nấm xâm nhập vào khoang máu, lƣu thông qua các chất lỏng của côn
trùng và hình thành khối mô dạng sợi nấm trên cơ thể côn trùng. Do đó,

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B

-16Lecanicillium spp. đƣợc sử dụng trong việc tạo ra thuốc trừ sâu sinh học với một số
loài côn trùng có hại trên cây trồng.
Bào tử nấm Lecanicillium spp. rất đƣợc quan tâm trong vấn đề kiểm soát côn
trùng và sâu bệnh hại cây trồng. Đặc biệt, L. lecanii có độc lực rất mạnh đối với
một số loài rệp nhƣ rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii) [50].
Năm 2001, Kim và cs đã cho ra một sản phẩm thƣơng mại mang tên Vertalec™
đƣợc tạo ra từ bào tử nấm L. lecanii [67]. Vũ Văn Hạnh và các cs đã phân lập
Lecanicillium spp. từ rệp đào, có khả năng diệt rệp bông 100% sau 4 – 5 ngày trong
điều kiện phòng thí nghiệm và trên 78% trong điều kiện nhà kính sau 14 ngày. Các
bào tử của nấm này cũng có khả năng diệt rệp đào hại rau cải, dau diếp, ớt 100%
sau 5 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm [50]. Bên cạnh đó, nấm này
cũng đã đƣợc chứng minh có hoạt tính chống nấm mốc gây bệnh nấm mốc trên
nhiều loại cây trồng [22], [104]. Nấm Lecanicillium spp. cũng kí sinh trên nhiều
loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bƣớm. Năm
2006, North và cs đã thử nghiệm và cho ra kết quả Lecanicillium muscarium diệt
đƣợc khoảng 70% bọ dừa Thripspalmi sau 4 ngày [83]. Lecanicillium spp. đƣợc sử
dụng để tạo chế phẩm diệt bƣớm trắng Mycotal™ [44], [56], [78]. Ngoài ra, loại
nấm này cũng có thể kiểm soát giun tròn nang gây hại đậu tƣơng, nấm mốc gây hại
dƣa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc [75], [103].
Mặc dù tiềm năng kiểm soát công trùng gây hại cây trồng của nấm
Lecanicillium spp. rất lớn nhƣng việc nghiên cứu ứng dụng của nấm này để bảo vệ
cây trồng cũng nhƣ kết quả đạt đƣợc còn rất hạn chế, nhất là ở Việt Nam. Hiệu quả
diệt côn trùng của chế phẩm từ Lecanicillium spp. cũng nhƣ các chế phẩm sinh học
khác còn kém, khối lƣợng chế phẩm diệt côn trùng sinh học đƣợc sử dụng chiếm tỷ
trọng thấp trong tổng khối lƣợng các loại thuốc diệt côn trùng. Do vậy, việc tăng

Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B

-17cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium spp. là
cần thiết.
1.4. ĐỘT BIẾN VÀ CẢI BIỂN CHỦNG
1.4.1. Giới thiệu về đột biến
Đột biến là những thay đổi vật lý trong các gen và nhiễm sắc thể. Chúng có
thể chỉ xảy ra đối với một tế bào đơn lẻ hoặc có thể đƣợc truyền từ một tế bào khác
trong một sinh vật đa bào (tế bào soma đột biến), hoặc có thể đƣợc truyền từ một
thế hệ khác đột biến thông qua giáo tử (mầm dòng đột biến). Đột biến có thể đƣợc
gây ra bởi các yếu tố tự nhiên từ môi trƣờng, từ sự hoạt động hay không hoạt động
của enzyme sửa chữa, và từ những hóa chất (chất gây đột biến) hoặc các bức xạ
năng lƣợng cao. Tỷ lệ đột biến khác nhau giữa các loài sinh vật, giữa các gen, thời
gian và địa điểm. Nó có thể gây ra tác động đáng kể không chỉ đối với cá nhân mà
còn về sự tiến hóa của các loài. Những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể
di truyền cho các đời sau, góp phần thúc đẩy đa dạng sinh học.
Đối với các enzyme sử dụng trong công nghiệp phải đƣợc sản xuất với chi phí
thấp và có thể tái sử dụng và tái sản xuất. Để đạt đƣợc điều này, việc cải thiện
thƣờng đƣợc thực hiện bằng kỹ thuật đột biến. Ngƣời ta có thể tạo đột biến bằng
các chất gây đột biến hóa học nhƣ N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG),
EMS… hoặc bằng cách chiếu xạ vật lý nhƣ tia X, tia γ, tia UV [105].
Sự đột biến các dòng nấm để tạo ra các enzyme công nghiệp khác nhau
(lipase, chitinase, cellulose, glucoamylase…) đã đƣợc sử dụng rộng rãi.
1.4.2. Sự cải biến chủng trên thế giới
Năm 1994, Kuhad và cộng sự đã xử lý chủng nấm Fusarium oxysporum bằng
tia cực tím, chủng đột biến xử lý với NTG đã làm tăng khả năng tổng hợp Cellulase
lên nhiều lần so với chủng tự nhiên [70].
Nguyễn Ngọc Mai

Cao học sinh K4B

Luận án đầy đủ ở file: Luận án Full