Nghiên cứu chọn giống bạch đàn có khả năng chịu mặn để trồng rừng ven biển tt
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (536.61 KB, 28 trang )
V
TRƢỜ
T T
GIÁO DỤC V Đ O TẠO
ĐẠI HỌC LÂM NGHI P
NGUYỄN THẾ
ƢỞNG
NGHIÊN CỨU C Ọ
C
U
ẠC
Đ
C
Ả
ĐỂ TRỒNG RỪNG VEN BIỂN
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾ SĨ LÂ
Chuyên ngành: Lâm sinh
Mã số: 62.62.02.05
Hà Nội, 2017
P
Luận án đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Lâm nghiệp – Xuân Mai – Chƣơng Mỹ - Hà Nội.
gƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Bùi Thế Đồi
2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
Phản biện 1:………………………………………………………………
………………………………………………………………
Phản biện 2: ………………………………………………………………
………………………………………………………………
Phản biện 3: ………………………………………………………………
………………………………………………………………
Luận án sẽ đƣợc bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trƣờng họp tại:
Vào hồi …… giờ, ngày..............tháng.................năm 2017.
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: Thƣ viện Quốc gia và Thƣ viện trƣờng Đại học Lâm
nghiệp
-i-
DANH MỤC CÁC
ÁO ĐÃ C
1. Nguyễn Thế Hƣởng, Bùi Thế Đồi, Nguyễn Thị Hƣờng, Phạm Thành Trang (2016),
Chọn dòng bạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn, Tạp chí Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 11/2016, tr. 65 – 69.
2. Nguyễn Thế Hƣởng, Bùi Thế Đồi, Nguyễn Thị Hƣờng, Hà Bích Hồng (2017), Chọn
dòng bạch đàn mang biến dị soma có khả năng chịu mặn, Tạp chí, Tạp chí Khoa học và
Công nghệ Lâm nghiệp, số 1/2017, tr. 3 – 10.
- ii -
MỤC LỤC
TT
Trang
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Sự cần thiết của luận án...........................................................................................1
2. Mục tiêu của luận án ...............................................................................................1
2.1. Mục tiêu chung .....................................................................................................1
2.2. Mục tiêu cụ thể .....................................................................................................1
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của luận án .......................................................1
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu...........................................................................................1
3.2. Phạm vi nghiên cứu ..............................................................................................1
4 . Những đóng góp mới của luận án ..........................................................................2
4.1. Về phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................2
4.2. Về cơ sở lý luận và khoa học ...............................................................................2
4.2. Về kết quả và kết luận ..........................................................................................3
5. Kết cấu chung của luận án ......................................................................................3
Chƣơng 1 .....................................................................................................................4
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................................................4
Kết quả nghiên cứu tổng quan tài liệu, một số nhận định sau đƣợc rút ra:.................4
Chƣơng 2 .....................................................................................................................5
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................5
2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................5
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................6
2.2.1. Phƣơng pháp luận..............................................................................................6
2.2.2. Tuyển chọn c y trội ...........................................................................................6
2.2.3. Thu hái và bảo quản vật liệu giống ...................................................................6
2.2.4. Chọn d ng ạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn ...............7
2.2.5. G y đột biến nh n tạo và chọn d ng ạch đàn mang đột biến nh n tạo có khả
năng chịu mặn .............................................................................................................8
2.2.6. Đánh giá sự sai khác về đặc điểm sinh trƣởng, hình thái, cấu tạo giải phẫu lá
và di truyền của các d ng ạch đàn đã chọn đƣợc ở giai đoạn vƣờn ƣơm ..............11
2.2.6.1. Đánh giá sự sai khác về sinh trƣởng giữa các d ng ạch đàn đã chọn tạo
đƣợc so với giống gốc ...............................................................................................11
2.2.6.2. Đánh giá sự sai khác về đặc điểm hình thái giữa các d ng ạch đàn chịu
mặn chọn tạo đƣợc so với giống gốc ........................................................................11
2.2.6.2. Đánh giá sự sai khác di truyền bằng kỹ thuật sinh học ph n tử ...................11
2.3. Ph n tích và xử lý số liệu ...................................................................................13
Chƣơng 3 ...................................................................................................................13
- iii -
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................................13
3.1. Tuyển chọn cây trội Bạch đàn ............................................................................13
3.1.1. Kết quả điều tra sơ thám xác định địa điểm chọn lọc cây trội ........................13
3.1.2. Kết quả điều tra đặc điểm lâm phần chọn lọc cây trội ....................................14
3.1.3. Kết quả đánh giá c y trội theo các chỉ tiêu sinh trƣởng ..................................15
3.2. Chọn dòng Bạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn ................15
3.2.1. Khả năng tạo chồi của các d ng ạch đàn trong các môi trƣờng có bổ sung
muối 15
3.2.2. Khả năng ra rễ của các d ng ạch đàn uro trong các môi trƣờng có bổ sung
muối 15
3.3. G y đột biến mô sẹo bằng tia gamma và sàng lọc tái sinh trên môi trƣờng mặn
nhân tạo .....................................................................................................................16
3.3.1. Ảnh hƣởng của liều lƣợng chiếu xạ tia gamma đến hiệu quả tạo d ng đột biến
chịu mặn ....................................................................................................................16
3.3.2. Khả năng ra rễ của các d ng ạch đàn uro mang biến dị soma ở các môi
trƣờng có bổ sung muối ............................................................................................18
3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng Bạch đàn đã chọn, tạo ở giai
đoạn vƣờn ƣơm trong các môi trƣờng có bổ sung muối. ..........................................18
3.5. Sự sai khác về đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu lá và di truyền của các
dòng Bạch đàn có khả năng chịu mặn đã chọn ở vƣờn ƣơm. ...................................18
3.5.1. So sánh sự sai khác về đặc điểm hình thái lá ..................................................18
3.5.2. Đánh giá sự sai khác về cấu tạo giải phẫu lá ..................................................19
3.5.3. Sự sai khác về di truyền ..................................................................................19
KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ .........................................................21
-1-
Ở ĐẦU
1. Sự cần thiết của luận án
Biến đổi khí hậu khiến diện tích đất bị nhiễm mặn ngày một tăng cao. Theo
thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, đến nay đã có nơi bị xâm
mặn vào sâu trong nội đồng tới 90km. Trong khi đó, giải pháp sử dụng đất nhiễm
mặn còn rất hạn chế. Do vậy, nếu có thể chọn – tạo đƣợc giống cây trồng có giá trị
kinh tế nhƣ
ạch đàn hoặc Keo chịu mặn để trồng rừng sản xuất trên những diện
tích đất nhiễm mặn sẽ có ý nghĩa rất lớn về thực tiễn. Từ ý tƣởng đó, đề tài“Nghiên
cứu chọn giống Bạch đàn có khả năng chịu mặn để trồng rừng ven biển” đƣợc tác
giả lựa chọn, thực hiện cho luận án tiến sỹ của bản thân sẽ có ý nghĩa rất lớn về
khoa học cũng nhƣ thực tiễn.
2.
2.1.
ục tiêu của luận án
ục tiêu chung
Chọn, tạo đƣợc một số d ng ạch đàn có khả năng chịu mặn phục vụ trồng
rừng ven biển.
ct uc t
1. Chọn - tạo đƣợc một số d ng ạch đàn có khả năng chịu mặn mang biến
dị tổ hợp và biến dị soma ;
2. Đánh giá đƣợc khả năng chịu mặn, đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu
lá cũng nhƣ khả năng sinh trƣởng của các d ng bạch đàn chịu mặn đã đƣợc chọn
tạo.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của luận án
3.1. Đố tượng ng
n cứu
Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là loài ạch đàn urô (Eucalyptus urophyla).
3
P ạm v ng
n cứu
- Trong nghiên cứu này, chọn lọc c y trội chỉ có ý nghĩa là khoanh vùng cho
việc chọn d ng tế bào có khả năng chịu mặn. Do vậy, việc chọn lọc c y trội có khả
năng chịu mặn dựa trên nhận định rằng các cá thể nếu sinh trƣởng và phát triển tốt
trên vùng đất nhiễm sẽ có khả năng thích ứng chịu mặn tốt hơn so với các c y
khác và khả năng có đƣợc các biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn cao hơn. Do
-2-
đó, tác giả tiến hành chọn lọc c y trội ở những khu vực có đất nhiễm mặn Lộc Hà –
Hà Tĩnh , sử dụng các chỉ tiêu về sinh trƣởng để đánh giá c y trội coi nhƣ khả năng
sinh trƣởng tỷ lệ thuận với khả năng chịu mặn.
- Các thí nghiệm đƣợc bố trí trong ph ng thí nghiệm tại Viện Công nghệ sinh
học L m nghiệp – Đại học L m nghiệp.
- Khả năng chịu mặn cũng nhƣ các đặc điểm hình thái và sinh trƣởng của các
dòng ạch đàn đã chọn – tạo đƣợc đánh giá ở các giai đoạn trong quy trình tạo c y
con ạch đàn bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô – tế bào và ở giai đoạn vƣờn ƣơm.
- Các công thức môi trƣờng, các bƣớc và kỹ thuật trong quá trình tạo c y con
ạch đàn bằng nuôi cấy mô – tế bào đƣợc đề tài kế thừa và có thử nghiệm.
4 . hững đóng góp mới của luận án
4 1 Về p ương p áp ng
n cứu
Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam chọn tạo giống cây trồng với đối
tƣợng là cây lâm nghiệp chịu mặn bằng phƣơng pháp g y đột biến và chọn lọc dòng
tế bào có khả năng chịu mặn kết hợp với công nghệ nuôi cấy mô - tế bào. Theo đó,
luận án là công trình đầu tiên ứng dụng phƣơng pháp g y đột biến thực nghiệm để
chọn tạo giống Bạch đàn có khả năng chịu mặn.
4
Về cơ sở lý luận và k oa ọc
Luận án đƣợc thực hiện và đạt đƣợc những mục tiêu đề ra bằng việc chọn lọc
cây trội, tạo mẫu sạch, g y đột biến và chọn lọc sớm các dòng tế bào có khả năng
chịu mặn bằng phƣơng pháp nuôi c y mô – tế bào. Đ y là một hƣớng đi mới trong
lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng lâm nghiệp có sức chống chịu dựa trên những cơ
sở lý luận và khoa học sau:
- Về mặt di truyền, sinh sản hữu tính là sự kết hợp giữa giao tử đực và giao
tử cái mang bộ nhiễm sắc thể đơn bội n để tạo nên hợp tử mang bộ nhiễm sắc thể
lƣỡng bội 2n. Sự tổ hợp này có tính tự do giữa các giao tử, vì vậy mỗi tổ hợp sẽ
mang một kiểu gen nhất định. Do đó, việc chọn các dòng mang biến dị tái tổ hợp có
các tính trạng, đặc tính theo mục tiêu chọn lọc của con ngƣời là hoàn toàn có cơ sở
khoa học.
-3-
- Đột biến là những biến đổi bên trong kiểu gen của tế bào cơ thể sinh vật.
Khi kiểu gen thay đổi, kiểu hình cũng sẽ thay đổi theo. Dựa trên những nghiên cứu
đi trƣớc, g y đột biến ở giai đoạn mô sẹo sẽ nâng cao hiệu quả g y đột biến. Những
biến đổi này sẽ di truyền tốt cho thế hệ sau. Do đó, g y đột biến mô sẹo bằng tia
gamma với liều lƣợng thích hợp và kết hợp với phƣơng pháp tái sinh sẽ tạo ra
nguồn nguyên liệu chọn lọc phong phú đồng thời có thể chọn lọc sớm các dòng tế
bào mang các tính trạng mong muốn. Từ đó nâng cao hiệu quả trong công tác tạo
giống cây trồng.
Do vậy, những kết quả và kết luận của luận án có ý nghĩa lớn trong bƣớc đầu
tạo hƣớng nghiên cứu chọn – tạo giống cây lâm nghiệp có khả năng chống chịu nói
chung và chịu mặn nói riêng.
4
Về kết quả và kết luận
Luận án đã xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy và nồng độ muối thích hợp để
chọn dòng Bạch đàn uro mang biến dị tổ hợp có khả năng chịu mặn trong điều kiện
nuôi cấy in vitro.
Luận án đã xác định đƣợc loại, tuổi mô sẹo và liều lƣợng chiếu xạ phù hợp
cho việc g y đột biến có lợi (theo mục tiêu chịu mặn đối với cây Bạch đàn uro.
Luận án đã tạo ra đƣợc một số dòng Bạch đàn uro mang biến dị tổ hợp và
biến dị soma có khả năng chịu mặn ở giai đoạn nuôi cấy in vitro và ngoài vƣờn ƣơm
5.
ết cấu chung của luận án
Kết cấu chung của luận án cụ thể nhƣ sau:
- Phần chính đƣợc trình bày trong 106 trang, gồm 3 chƣơng:
+ Chƣơng 1: Mở đầu
+ Chƣơng 2: Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
+ Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
- Các tài liệu đƣợc tham khảo bao gồm 113 tài liệu. Trong đó có 51 tài liệu tiếng
anh và 62 tài liệu tiếng việt.
- 16 bảng biểu đƣợc đánh số theo thứ tự
- 26 hình ảnh đƣợc đánh số theo thứ tự
- 14 phụ lục
-4-
Chƣơng 1
TỔ
QUA VẤ ĐỀ
Ê CỨU
ết quả nghiên cứu tổng quan tài liệu, một số nhận định sau đƣợc rút ra:
Bạch đàn là một trong ít loài cây trồng rừng với năng suất lớn và cho hiệu quả
kinh tế cao không chỉ ở nƣớc ta mà còn ở nhiều nƣớc trên thế giới. Riêng ở Việt
Nam, từ những năm 80 của thế kỷ trƣớc, diện tích rừng trồng Bạch đàn đã chiếm tới
gần ½ tổng diện tích rừng trồng với các loài phổ biến là: E. camaldulensis, E.
tereticornis và E. urophylla. Từ đó đến nay, công tác cải thiện giống Bạch đàn luôn
đƣợc chú trọng. Đơn vị luôn đi đầu trong công tác này là Viện Khoa học Lâm
nghiệp và đã có nhiều thành tựu to lớn, tạo ra đƣợc nhiều dòng Bạch đàn có sức
sinh trƣởng nhanh, đáp ứng khá tốt những yêu cầu của thực tiễn sản xuất.
Trong lĩnh vực cải thiện giống cây rừng nói chung ở nƣớc ta tính đến nay đã
có nhiều thành tựu đáng kể. Hai loài đƣợc chú trọng là Bạch đàn và Keo luôn có
giống đƣợc cải thiện với chất lƣợng cao dựa trên những công nghệ tiên tiến nhƣ lai
giống và nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô - tế bào để tạo giống tốt và cây
con khỏe mạnh. Tuy nhiên, những nghiên cứu này còn khá hạn chế về đối tƣợng và
hƣớng nghiên cứu. Đặc biệt, với hƣớng nghiên cứu về chọn, tạo giống cây rừng có
sức chống chịu mới chỉ có một vài công trình với mục tiêu quan tâm là khả năng
kháng sâu bệnh và chịu hạn mà chƣa có công trình nào cải thiện giống theo hƣớng
chịu mặn.
Ứng phó với biến đổi khí hậu, trong đó vấn đề mặn hóa ngày một tăng lên cả
về diện tích và nồng độ đã trở thành vấn đề cấp bách mang tính toàn cầu. Một trong
những giải pháp đƣợc quan tâm và có tính bền vững là sử dụng những diện tích đó
để trồng những loài cây có khả năng chịu mặn nhằm phát huy hiệu quả kinh tế đồng
thời cải tạo đất. Một số loài cây có khả năng thích ứng với các điều kiện bất lợi của
môi trƣờng sống (mặn, hạn, lạnh,...) bằng việc sản sinh ra một số chất kích thích,
protein giải độc hoặc hooc môn để thích ứng. Trong đó, để có thể chịu đƣợc mặn,
thực vật cần có những thay đổi sâu sắc trong trao đổi chất hoặc các cơ chế thích hợp
theo các hƣớng nhƣ: loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa sinh ra trong môi trƣờng mặn;
-5-
tăng cƣờng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu; kiểm soát sự hấp thụ nƣớc và các
ion Na+, K+, Ca2+; sinh tổng hợp một số protein giúp tăng cƣờng khả năng chịu
mặn.
Những nghiên cứu về chọn tạo giống cây trồng có sức chống chịu với các điều
kiện bất lợi ở Việt Nam và trên thế giới đã triển khai cho thấy:
- Chuyển gen là phƣơng pháp có thể tăng cƣờng khả năng chịu mặn của cây
trồng.
- Bạch đàn là loài c y có khả năng chịu mặn và thông qua sàng lọc, có thể
chọn đƣợc những biến dị tự nhiên cho khả năng chịu mặn cao. Tuy nhiên, theo dõi
và đánh giá khả năng chịu mặn của cây trồng cần đƣợc tiến hành trong thời gian rất
dài. Trong đó, loài E. camaldulensis có thể chịu mặn ở nồng độ 600mM/l trong thời
gian 1 tuần.
- Khả năng chịu mặn của thực vật là tính trạng số lƣợng nên có thể cải thiện
bằng phƣơng pháp chọn giống. Trong đó, chọn lọc tế bào chịu mặn trong quá trình
nuôi cấy mô là một cách để tăng cƣờng khả năng chịu mặn.
Những phƣơng pháp tiên tiến nhƣ chuyển gen, g y đột biến nhân tạo để cải
thiện khả năng chịu mặn của các giống c y lƣơng thực đã đạt đƣợc nhiều thành
công và nhiều giống cây trồng chịu mặn đã đƣợc thƣơng mại hóa. C n đối với cây
lâm nghiệp thì mới chỉ là bƣớc đầu, với một vài nghiên cứu về chuyển gen kháng
mặn (CodA, Mangrin.) vào một số loài Bạch đàn.
Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào kết hợp với g y đột biến chiếu xạ tia gamma
đƣợc chứng minh là phƣơng pháp hiệu quả trong việc tạo biến dị và chọn lọc nhanh
dòng biến dị mang đặc điểm mong muốn và ở Việt Nam đã có nhiều giống cây
nông nghiệp, đặc biệt là lúa chịu mặn đƣợc chọn, tạo theo phƣơng pháp này.
Chƣơng 2
DU
V
ƢƠ
Á
Ê CỨU
2.1. ội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn c y trội
ạch đàn tại vùng đất nhiễm mặn hoặc gần vùng đất
nhiễm mặn theo mục tiêu sinh trƣởng để cung cấp vật liệu nghiên cứu;
-6-
- Nghiên cứu chọn d ng ạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu
mặn từ nguồn hạt giống thu thập đƣợc;
- Nghiên cứu g y đột biến mô sẹo ạch đàn bằng tia gamma và sàng lọc tái
sinh trên môi trƣờng mặn nh n tạo;
- Đánh giá khả năng chịu mặn của các d ng
ạch đàn đã chọn, tạo ở giai
đoạn vƣờn ƣơm;
- Đánh giá sự sai khác về đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu lá và di
truyền của các d ng ạch đàn có khả năng chịu mặn đã đƣợc chọn, tạo ở giai đoạn
vƣờn ƣơm.
2.2. hƣơng pháp nghiên cứu
1 P ương p áp luận
Phƣơng pháp luận của đề tài dựa vào 02 hƣớng sau:
- Nguồn biến dị tái tổ hợp phong phú, sẵn có trong tự nhiên và khả năng
thích nghi với các điều kiện bất lợi của thực vật dẫn đến xuất hiện các biến dị tái tổ
hợp là nguyên liệu cho chọn lọc.
- G y đột biến nhân tạo bằng tia phóng xạ (gamma) có bƣớc sóng ngắn và
nguồn năng lƣợng lớn với liều lƣợng phù hợp sẽ làm biến đổi cấu trúc di truyền
trong tế bào dẫn đến hình thành các biến dị đột biến làm nguyên liệu cho chọn lọc.
Các bƣớc thực hiện đề tài đƣợc mô phỏng tại sơ đồ hình 2.1
u n c ọn c
tr
Chọn lọc cây trội tại vùng đất nhiễm mặn làm nguồn cung cấp vật liệu giống,
tạo nguồn nguyên liệu cho sàng lọc các biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn.
Theo đó, c y trội đƣợc chọn lọc đảm bảo các chỉ tiêu và tiêu chí theo quy phạm
ngành (QPN 15 – 93) và những bổ sung sửa đổi theo Tiêu chuẩn ngành (TC04 –
2006).
3
u á và bảo quản vật l ệu g ống
Vật liệu giống đƣa vào làm vật liệu nghiên cứu cho các bƣớc tiếp theo là hạt
giống từ các cây trội đã chọn lọc đƣợc. Thu hái hạt giống ở thời điểm hạt đã chín
sinh lý (hạt màu vàng nâu – khi quả đã có hiện tƣợng nứt tháng 8 năm 2014 , mỗi
-7-
cây trội thu hái 1,0 kg hạt, dán nhãn theo số hiệu cây trội và để riêng trong suốt quá
trình chế biến, bảo quản hạt giống và sử dụng trong các thí nghiệm sau này.
4
ọn d ng ạc
àn mang b ến d tá t
ợp c k ả n ng c u m n
Sử dụng quy trình nhân nhanh và tạo rễ với các công thức môi trƣờng MS*
Môi trƣờng MS cơ bản có hàm lƣợng Nito giảm đi ½ , môi trƣờng nhân nhanh
(MS* + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 7,0 g/l Agar + 20,0 g/l sucrose), chuẩn pH
= 5,8 và môi trƣờng tạo rễ (½ MS* + 0,3 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA + 20,0 g/l
sucrose + 8,0 g/l Agar là môi trƣờng đã đƣợc nghiên cứu và chứng minh là phù
hợp nhất đối với nuôi cấy mô – tế bào Bạch đàn.
2.2.4.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng Bạch đàn ở giai đoạn tạo chồi
Với mỗi d ng đã đƣợc sàng lọc ở giai đoạn tạo mẫu sạch có khả năng chịu
mặn ở mức 50mM/l NaCl sẽ đƣợc bố trí thí nghiệm với 04 công thức về nồng độ
muối. Các công thức này đƣợc ký hiệu lần lƣợt từ NT0 đến NT3 (bổ sung nồng độ
muối tƣơng ứng lần lƣợt từ 50 mM/l, 75 mM/l, 100 mM/l và 125 mM/l). Mỗi công
thức đƣợc bố trí làm 3 lần lặp với dung lƣợng mỗi công thức là 35 mẫu cấy.
Theo dõi khả năng tạo chồi thông qua các chỉ tiêu: số mẫu tạo chồi, số chồi
trung bình/mẫu, chiều cao chồi để lựa chọn những dòng có tỷ lệ mẫu tạo chồi tốt ở
công thức nồng độ muối cao nhất có thể.
2.2.4.2. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng Bạch đàn ở giai đoạn tạo rễ
Khi các chồi mầm của các dòng Bạch đàn đƣợc lựa chọn trong thí nghiệm về
đánh giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn tạo chồi (có khả năng tạo chồi tốt ở công
thức có nồng độ muối cao nhất đạt kích thƣớc >3 cm, thân mập, khoẻ, có từ 2 – 3
lóng với 2 – 3 cặp lá đƣợc cắt và nhân nhanh ở môi trƣờng có nồng độ muối tƣơng
ứng qua 3 – 4 chu kỳ để đủ số lƣợng mẫu lƣu trữ và vật liệu cho thí nghiệm đánh
giá khả năng chịu mặn ở giai đoạn ra rễ.
Mỗi d ng đƣợc lựa chọn ở thí nghiệm tạo chồi sẽ đƣợc cấy trong môi trƣờng
tạo rễ với nồng độ muối tƣơng ứng theo 3 lần lặp, mỗi lần lặp có dung lƣợng là 30
mẫu.
Theo dõi khả năng ra rễ của chồi mầm sau 4 tuần nuôi cấy qua các chỉ tiêu: số
chồi ra rễ, số rễ/c y, chiều dài rễ và hình thái đầu rễ.
-8-
5
t b ến n
n tạo và c ọn d ng ạc
àn mang
t b ến n
n tạo c
k ả n ng c u m n
2.2.5.1. Tái sinh Bạch đàn thông qua mô sẹo
Trong quá trình bố trí các thí nghiệm đối với các nh n tố, đề tài có sử dụng
môi trƣờng nuôi cấy trong quy trình tái sinh ạch đàn thông qua mô sẹo cụ thể theo
sơ đồ hình 2.1 dƣới đ y Nguyễn Thị Hồng Gấm và cộng sự, 2013).
-9-
Chọn lọc cây trội Bạch đàn
và thu hái vật liệu giống
Hạt Bạch đàn đại trà
Tạo mẫu sạch
Tạo mẫu sạch và sàng lọc sơ bộ
(bổ sung 50mM/l NaCl)
Nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy mô tế bào tạo
mô sẹo (callus)
G y đột biến nhân tạo
bằng tia gama
Sàng lọc các dòng Bạch đàn có khả năng chịu mặn
Các dòng Bạch đàn có khả năng chịu mặn
Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng Bạch đàn chịu mặn ở
phòng thí nghiệm
Đánh giá sinh trƣởng của các dòng Bạch đàn có khả năng chịu mặn
chọn tạo đƣợc so với giống gốc
Đánh giá sự sai khác về hình thái, giải phẫu lá và di truyền giữa
dòng Bạch đàn chịu mặn chọn tạo đƣợc so với giống gốc
Các dòng chịu mặn đáp ứng mục tiêu chọn, tạo
Hình 2.1. Sơ đồ các bước thực hiện đề tài
2.2.5.2. Xử lý phóng xạ đối với mô sẹo và đánh giá khả năng chịu mặn
- 10 -
Vật liệu chiếu xạ: các khối mô sẹo hình thành từ th n mầm, kích thƣớc
khoảng 0,5x0,5cm ở 4 tuần tuổi khỏe mạnh, có màu trắng xốp.
- Mỗi d ng đƣa vào thí nghiệm sẽ đƣợc nh n lên để tạo ra số lƣợng mô sẹo
đủ lớn cho tổ hợp 4 công thức thí nghiệm về liều lƣợng chiếu xạ lần lƣợt là: 10, 20,
30 Gy và công thức đối chứng và 4 công thức sàng lọc trên môi trƣờng tái sinh có
bổ sung các nồng độ muối khác nhau lần lƣợt là 50, 75, 100 và 125 mM/L NaCl).
Mỗi tổ hợp của công thức thí nghiệm sẽ đƣợc bố trí 3 lần lặp.
Phôi hữu tính
Khử trùng cồn 70% - 30’’+ Javen
30% -10’
Cây mầm Bạch đàn
Urô
Cắt đoạn thân mầm 0,5 - 1,0 cm
Cắt riêng hai lá mầm (còn cuống lá)
ôi trƣờng tạo mô sẹo
Thân mầm: MS (N2/2) + 20g/l sucrose + 2,8g/l phytagel+ 100ml/l ND+
0,5 mg/l BAP+ 0,2mg/l NAA
Lá mầm: MS (N2/2) + 20g/l sucrose + 2,8g/l phytagel+ 100ml/l ND+ 1,0
mg/l BAP+ 0,5 mg/l NAA
ôi trƣờng tạo chồi
MS (N2/2) + 20g/l sucrose + 2,8g/l phytagel+ 100ml/l ND+ 0,5 mg/l
BAP+ 0,2 mg/l NAA+ 0,1 mg/l Kinetin
Cây hoàn chỉnh
MS (N2/2) + 20g/l sucrose + 2,8g/l phytagel+ 100ml/l ND + 0,5 mg/l
Hình 2.2. Sơ đồ các bước
BạchIBA
đàn thông qua mô sẹo
NAAtái
+ sinh
0,2 mg/l
2.2.5.3. Đánh giá khả năng ra rễ của chồi trên môi trường chọn lọc chứa các nồng
độ muối NaCl khác nhau
Trong môi trƣờng nh n nhanh, khi các chồi đạt kích thƣớc >2 cm đƣợc cắt
và cấy chuyển lên môi trƣờng tạo rễ có bổ sung muối NaCl nồng độ tƣơng ứng với
- 11 -
nồng độ muối đƣợc chọn lọc ở giai đoạn mô sẹo tái sinh chồi từ 50mM/l đến
125mM/l). Mỗi công thức kiểm nghiệm sẽ đƣợc bố trí 3 lần lặp với dung lƣợng mẫu
cho mỗi lần lặp là 30. Sau 4 tuần, thu thập các chỉ tiêu: số chồi ra rễ, số rễ/ chồi và
chiều dài rễ.
2.2.6 Đán giá sự sa k ác về
lá và d tru ền của các d ng ạc
c
m s n trưởng, ìn t á , cấu tạo g ả p ẫu
àn ã c ọn ược ở g a
oạn vườn ươm
Thí nghiệm đánh giá ở giai đoạn vƣờn ƣơm với số lƣợng mỗi dòng là 30
cây/công thức với 3 lần lặp. Mỗi dòng chịu mặn cùng với giống đối chứng sẽ
đƣợc cấy vào bầu đất có bổ sung nồng độ muối tƣơng đƣơng với nồng độ muối
trong phòng thí nghiệm.
So sánh và đánh giá về sự khác biệt của các dòng chịu mặn chọn, tạo đƣợc
so với giống đối chứng.
6 1 Đán g á sự sa k ác về s n trưởng g ữa các d ng ạc
àn ã c ọn tạo
ược so vớ g ống gốc
Thu thập số liệu của toàn bộ các cây trong các công thức thí nghiệm theo các
chỉ tiêu về: số cây còn lại, đƣờng kích gốc và chiều cao vút ngọn ở 12 tuần tuổi.
Chỉ tiêu đƣờng kính gốc đƣợc xác định bằng thƣớc kẹp Panme
Chỉ tiêu chiều cao vút ngọn đƣợc xác định bằng thƣớc kẻ li
2.2.6.2 Đán g á sự sa k ác về
c
m ìn t á g ữa các d ng ạc
àn c u
m n c ọn tạo ược so vớ g ống gốc
So sánh đặc điểm hình thái lá cây ở giai đoạn 12 tuần tuổi đƣợc thực hiện
theo một số chỉ tiêu nhƣ: kích thƣớc lá (chiều dài cuống lá, chiều dài lá, chiều
rộng lá, chỉ số kích thƣớc, diện tích lá), số lƣợng khí khổng (số lƣợng khí
khổng/cm2, tổng số khí khổng trên toàn bộ lá) ở cả mặt trƣớc và mặt sau lá.
Những chỉ tiêu so sánh đƣợc tiến hành tiến hành thông qua các mẫu của
các dòng với số lƣợng mỗi dòng 30 mẫu để so sánh sự sai khác.
2.2.6.2 Đán g á sự sa k ác d tru ền bằng kỹ t uật s n
- hƣơng pháp tách chiết AD
ọc p
n tử
- 12 -
+ Sử dụng bộ Kit tách chiết ADN thực vật của hãng Norgen Canada để
tách chiết ADN tổng số của các d ng ạch đàn chịu mặn. Các bƣớc tiến hành đƣợc
thực hiện theo đúng hƣớng dẫn sử dụng.
+ Phƣơng pháp điện di: Sau khi tách chiết, ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di
trên gel agarose 1% có bổ sung hóa chất nhuộm axit nucleic “RedSafe” 20.000x của
hãng INtRon. Quan sát các băng vạch ADN bằng đèn UV. ADN tách chiết không bị
đứt gãy và đủ sạch sẽ các băng ADN sáng và rõ nét.
- Phân tích sự sai khác về di truyền bằng chỉ thị RA D
Phản ứng PCR đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Williams & cs 1990 .
Hỗn hợp 20 µl dung dịch phản ứng PCR- RAPD chứa 1 µl ADN khuôn 30 ng/µl ;
10 µl dung dịch PCR Master mix 2X ; 1,0 µl mồi 10 pM/µl ;7,0 µl H2O. Chu kỳ
nhiệt của phản ứng PCR - RAPD: 94oC 5 phút , 35 chu kỳ [90oC (30 giây); 35oC
(30 giây); 72oC 2 phút ] và kết thúc ở 72o C 8 phút . Sản phẩm phản ứng đƣợc
ph n tách bằng điện di trên gel agarose 1,8% có bổ sung chất nhuộm axit nucleic
“RedSafe” 20.000x và quan sát dƣới đèn cực tím.
Sử dụng 20 mồi ngẫu nhiên kí hiệu từ CP01 đến CP20. Kích thƣớc mỗi mồi
là 10 nucleotit để sàng lọc mồi hiệu quả nhất phục vụ cho sự ph n tích sai khác di
truyền giữa các d ng biến dị. Trình tự nucleotit của từng mồi đƣợc thể hiện trong
bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự nucleotit của các mồi sử d ng trong phân tích RAPD
TT
ý hiệu mồi
Trình tự mồi
1
CP01
5’-GGACTGGAGT-3’
2
CP02
5’-TGCTCTGCCC-3’
3
CP03
5’-GGTGACGCAG-3’
4
CP04
5’-TGGGGGACTC-3’
5
CP05
5’-GTAGACCCGT-3’
6
CP06
5’-TTCCCCCGCT-3’
7
CP07
5’-GGACCCTTAC-3’
8
CP08
5’-TGGACCGGTG-3’
- 13 -
9
CP09
5’-AAGCCTCGTC-3’
10
CP10
5’-ACTTCGCCAC-3’
11
CP11
5’-AACCGACGGG-3’
12
CP12
5’-GGGGGTCGTT-3’
13
CP13
5’-TACCACCCCG-3’
14
CP14
5’-GGCGGACTGT-3’
15
CP15
5’-CCAGACCCTG-3’
16
CP16
5’-CAATCGCCGT-3’
17
CP17
5’-TCGGCGATAG-3’
18
CP18
5’-GTCCACACGG-3’
19
CP19
5’-CAGCACCCAC-3’
20
CP20
5’-GGGAAGGACA-3’
Mẫu ph n tích ADN đƣợc thu thập từ lá của mỗi d ng. Mỗi d ng 01 mẫu.
2.3. hân tích và xử lý số liệu
Số liệu thu thập đƣợc từ hiện trƣờng cũng nhƣ các thí nghiệm đƣợc phân tích
và xử lý bằng các tiêu chuẩn thống kê phù hợp với sự hỗ trợ của các phần mềm
Excel và SPSS (Nguyễn Hải Tuất, 2003; Nguyễn Hải Tuất và cs, 2001).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn cây trội Bạch đàn
3.1.1. Kết quả
ều tra sơ t ám xác
n
a
m chọn lọc cây tr i
Từ những thông tin có đƣợc, một số địa phƣơng ở 03 vùng miền trong cả
nƣớc đƣợc sơ thám bao gồm: miền Bắc gồm các tỉnh Quảng Ninh và Hải Phòng;
miền Trung gồm các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Bình; miền Nam gồm các
tỉnh: Tiền Giang, Trà Vinh và Sóc Trăng. Tuy nhiên, chỉ có ở Hà Tĩnh, Bạch đàn
đƣợc ngƣời dân trồng nhiều cùng với Phi lao tại những vị trí gần biển nhất ở các
huyện: Lộc Hà, Nghi Xuân và Thạch Hà. Trong đó, huyện Lộc Hà còn nhiều Bạch
đàn đƣợc trồng ở các xã Ích Hậu, Tân Lộc, An Lộc, Hồng Lộc và Thịnh Lộc.
- 14 -
Kết quả cho thấy, tổng số các lâm phần Bạch đàn ở Lộc Hà là 148 lâm phần
thuộc 05 tiểu khu và 05 xã. Trong đó xã có nhiều lâm phần nhất là xã Hồng Lộc với
103 lâm phần ở tiêu khu 126, xã Ích Hậu có số lƣợng lâm phần ít nhất là 1 lâm phần
ở tiểu khu 126C. Xã Thịnh Lộc có số lâm phần nhiều thứ II với 27 lâm phần ở tiểu
khu 127B. Tổng diện tích Bạch đàn trồng từ những năm 2000 ở 05 xã là 397,59ha.
Tại Thịnh Lộc, phát hiện một vài lâm phần Bạch đàn trên vùng đất nhiễm
mặn đáp ứng tốt những yêu cầu về chọn lọc cây trội theo Tiêu chuẩn ngành và Quy
phạm ngành. Vì vậy, 02 Lâm phần tại xã Thịnh Lộc huyện Lộc Hà tỉnh Hà Tĩnh đã
đƣợc lựa chọn để chọn lọc cây trội Bạch đàn theo mục tiêu đặt ra.
3.1.2. Kết quả
ều tra
c
m lâm phần chọn lọc cây tr i
3.1.2.1. Một số đặc điểm cơ bản của lâm phần
Lâm phần đƣợc lựa chọn nằm trên địa bàn xã Thịnh Lộc, huyện Lộc Hà, tỉnh
Hà Tĩnh thuộc quản lý của UBND xã Thịnh Lộc, nằm ở độ cao 8 – 10m so với mực
nƣớc biển, có địa hình bằng phẳng với độ dốc từ 2 – 3 độ, là những lâm phần Bạch
đàn đều tuổi và đƣợc trồng những năm 2.000 bằng cây con có bầu từ hạt với mật độ
ban đầu 2.300 cây/ha, ít chịu tác động.Khu vực nghiên cứu mang đặc điểm khí hậu
của vùng ven biển miền Trung với một số đặc điểm chính sau: Nhiệt độ bình quân
hàng năm 25oC, nhiệt độ tối cao 40oC, nhiệt độ tối thấp 12oC, lƣợng mƣa bình qu n
hàng năm đạt 2.600mm, đất có đặc điểm là đất cát ven biển nên ít nhiều chịu ảnh
hƣởng bởi sự xâm nhập mặn. Cây bụi, thảm tƣơi đặc trƣng ở khu vực nghiên cứu là
những loài cây chỉ thị đất hơi chua nhƣ sim, mua, thành ngạnh…
3.1.2.2. Đặc điểm một số nhân tố cơ bản của lâm phần
- Nhìn chung, đặc điểm đất đai ở các ô tiêu chuẩn thuộc cả 02 lâm phần là:
hơi chặt, thịt nhẹ, trọng lƣợng của 1 cm3 đất khô kiệt ở trạng thái tự nhiên mức
trung bình (0,98 – 1,27 g/cm3), trọng lƣợng riêng của 1 cm3 khi sếp xít vào nhau
cũng ở mức trung bình (2,42 – 2,48 g/cm3 , đất có độ PH ở mức hơi chua, độ mặn
của đất nằm trong khoảng từ 0,15 – 0,19 mM/l..
- Kết quả kiểm tra thuần nhất ở các ô tiêu chuẩn thuộc mỗi lâm phần cho
thấy có sự thuần nhất. Vì vậy, giá trị trung bình về các chỉ tiêu sinh trƣởng của lâm
- 15 -
phần là trung bình cộng các giá trị của các ô tiêu chuẩn. Theo đó, các chỉ tiêu về
đƣờng kính ngang ngực, chiều cao và thể tích của từng lâm phần cụ thể nhƣ sau:
- Ở lâm phần 01: Đƣờng kính ngang ngực trung bình đạt 25,3 cm, chiều cao
vút ngọn trung bình đạt 13,7 m, chiều cao dƣới cành đạt 9,3 m và thể tích đạt 0,189
m3.
- Ở lâm phần 02: Đƣờng kính ngang ngực trung bình đạt 24,4 cm, chiều cao
vút ngọn trung bình đạt 13,7 m, chiều cao dƣới cành đạt 9,4 m và thể tích đạt 0,182
m3
3.1.3. Kết quả án g á c
tr i theo các chỉ t u s n trưởng
Ở cả lâm phần 01 và lâm phần 02, các cây trội đƣợc lựa chọn đều có các chỉ
tiêu sinh trƣởng vƣợt mức so với ngƣỡng giá trị trung bình + 1,2 lần độ lệch chuẩn
và có độ vƣợt so với giá trị trung bình của lâm phần cụ thể: vƣợt từ 27,3 – 39,9 %
về đƣờng kính; từ 11,4 đến 16,5% về chiều cao vút ngọn; từ 7,8 – 18,6% về chiều
cao dƣới cành và từ 28,4 đến 74,6 % về thể tích.
3.2. Chọn dòng Bạch đàn mang biến dị tái tổ hợp có khả năng chịu mặn
3.2.1.K ả n ng tạo c ồ của các d ng ạc
àn trong các mô trường c b sung
muố
- Ở chỉ tiêu về tỷ lệ chồi tái sinh: có sự khác biệt rất lớn về tỷ lệ này ởtừng
cặp công thức thí nghiệm. Ph n nhóm số liệu theo tiêu chuẩn Duncan với 4 công
thức thí nghiệm cũng cho kết quả hình thành 4 nhóm khác biệt. Theo từng cặp d ng,
có nhiều cặp không có sự khác biệt về tỷ lệ này nhƣng cũng có nhiều cặp có sự khác
biệt rõ ràng và kết quả ph n nhóm về tỷ lệ chồi tái sinh giữa các d ng theo tiêu
chuẩn Duncan cho ra 3 nhóm d ng khác biệt. Trong đó, nhóm d ng có tỷ lệ chồi tái
sinh lớn nhất là nhóm 3, với tỷ lệ chồi tái sinh trung bình ở cả 4 công thức thí
nghiệm đạt từ 60,73% d ng D29 đến 75,25% d ng D23 bao gồm 05 d ng: D29,
D1, D7, D4 và D23.
3
K ả n ng ra rễ của các d ng ạc
àn uro trong các mô trường c b
sung muố
Kết quả cho thấy có 2 dòng là D1 và D7 tiếp tục thích ứng tốt với môi trƣờng
mặn ở nồng độ muối 125mM/l, với tỷ lệ chồi ra rễ đạt trên 60%. Trong khi, các
- 16 -
dòng khác, tỷ lệ chồi ra rễ rất thấp (3,3- 16,7%). Chiều dài rễ ở 2 d ng này cũng lớn
hơn rất nhiều so với các d ng khác, tƣơng ứng là 23mm và 28 mm, trong khi các
d ng khác đạt xấp xỉ 10 mm. Hình thái rễ của 2 d ng trên có đầu rễ trắng và dài
trong khi các d ng khác đầu rễ đen và ngắn. Riêng chỉ tiêu về số rễ trung
bình/câykhông có sự khác biệt nhiều giữa các dòng. Số rễ trung bình/cây đạt từ 1,3
– 3,4 rễ. Cao nhất là dòng D1 và thấp nhất là dòng D23. Ở chỉ tiêu này, d ng D7 đạt
2,0 rễ/cây, trong khi d ng D4 đạt 2,2 rễ/cây.
Kết quả cũng cho thấy có 2 d ng sinh trƣởng và phát triển tốt ở giai đoạn ra
rễ với tỷ lệ chồi ra rễ đạt 60,00 – 66,7 %, số rễ trung bình/cây đạt từ 2,0 – 3,4 rễ,
chiều dài rễ trung bình đạt 23 – 28 mm, rễ có đầu trắng, dài và đều.
3.3.
ây đột biến mô sẹo bằng tia gamma và sàng lọc tái sinh trên môi trƣờng
mặn nhân tạo
3 3 1 Ản
ưởng của l ều lượng c ếu xạ t a gamma ến
ệu quả tạo d ng
t
b ến c u m n
Kết quả ph n tích phƣơng sai về tỷ lể sống, tỷ lệ tái sinh đều cho thấy khả
năng tái sinh chồi của mô sẹo ở các liều chiếu và các công thức môi trƣờng chọn lọc
khác nhau không có sự khác biệt rõ ràng. Trong khi đó, sự khác biệt thể hiện rất rõ
ràng về tỷ lệ sống sót cũng nhƣ tỷ lệ tái sinh của mô sẹo ở các công thức thí nghiệm
với nồng độ muối và liều lƣợng chiếu xạ khác nhau.
3.3.1.1. Tỷ lệ sống của mô sẹo
Ở môi trƣờng chọn lọc 50mM/l, các mô sẹo ạch đàn dù không đƣợc chiếu
xạ vẫn đạt tỷ lệ sống lên tới 64,4 %. Khi liều chiếu tăng từ 10 Gy đến 30 Gy, tỷ lệ
sống của mô sẹo tăng từ 64,4 % 10Gy lên đến 76,7 % ở 20Gy và giảm xuống
37,8 % 30Gy sau 4 tuần theo dõi.
Trong các môi trƣờng chọn lọc có nồng độ muối cao hơn, các dòng ạch đàn
không đƣợc chiếu xạ không c n mô sẹo nào sống sót khi môi trƣờng chọn lọc bổ
sung muối lên đến 100 mM/l.Khi đƣợc chiếu xạ với liều lƣợng 10 Gy, tỷ lệ sống
của các mô sẹo giảm mạnh khi tăng nồng độ muối và đạt 1,1 % ở môi trƣờng chọn
lọc có bổ sung muối với nồng độ 125 mM/l.
- 17 -
- Ở liều lƣợng chiếu 20Gy, tỷ lệ sống của mô sẹo đạt 78,9% và giảm rất
mạnh khi nồng độ muối tăng lên. Tuy nhiên, ở các nồng độ muối 75, 100 và
125mM/l, tỷ lệ sống lại không có sự khác biệt đáng kể với các giá trị lần lƣợt là
17,8; 18,9 và 16,7%.
- Liều lƣợng chiếu xạ tăng lên đến 30 Gy, tỷ lệ sống của mô sẹo giảm mạnh
so với các liều lƣợng chiếu xạ khác và giảm mạnh khi nồng độ muối ở môi trƣờng
chọn lọc >50 mM/l từ 37,8 % ở 50 mM/l xuống c n 14,4 % ở nồng độ 75 và 125
mM/l).
3.3.1.2. Tỷ lệ tái sinh chồi của mô sẹo
Ở môi trƣờng chọn lọc có bổ sung muối với nồng độ 50mM/l, đa số các mô
sẹo sống đều có thể tái sinh với tỷ lệ tái sinh đạt từ 33,3 – 75,6 %. Tuy nhiên, khi
nồng độ muối tăng cao ở các môi trƣờng chọn lọc khác, gần nhƣ các mô sẹo đều
chết, tỷ lệ tái sinh đạt một vài phần trăm. Công thức có tỷ lệ tái sinh cao nhất là
công thức ở môi trƣờng chọn lọc CL02 với liều lƣợng chiếu xạ 10 Gy là cao nhất
đạt 18,9% , tiếp đến là công thức chọn lọc đó với liều lƣợng chiếu xạ 20 Gy đạt tỷ
lệ tái sinh 13,3%, rất nhiều công thức số lƣợng mô sẹo chết hoàn toàn.
- Ở môi trƣờng chọn lọc có nồng độ muối 50mM/l, tỷ lệ mô sẹo tái sinh đạt
đƣợc từ 33,3 – 75,6 %.
- Đối với môi trƣờng chọn lọc có nồng độ muối 75mM/l, các mô sẹo không
đƣợc chiếu xạ đều không có khả năng tái sinh. Tỷ lệ tái sinh cao nhất ở các mô sẹo
đƣợc chiếu xạ với liều lƣợng 10 Gy và 20 Gy, lần lƣợt là 18,9 % và 13,3 %, các mô
sẹo đƣợc chiếu xạ với liều lƣợng 30 Gy có tỷ lệ tái sinh đạt 8,9 %. Số chồi trung
bình trên mỗi mô sẹo không khác biệt nhiều ở các liều lƣợng chiếu xạ khác nhau
đạt từ 6,5 – 8,6 chồi .
- Khi tăng nồng độ muối của môi trƣờng chọn lọc lên 100 mM/l và 125
mM/l, các mô sẹo không đƣợc chiếu xạ hoặc chiếu xạ với liều lƣợng 10 Gy đều
không có khả năng tái sinh. Một vài mô sẹo đƣợc chiếu xạ với liều lƣợng 20Gy và
30Gy có khả năng tái sinh với tỷ lệ đạt từ 1,1 % tới 11,1 %, số chồi trung bình trên
mỗi mô sẹo đạt từ 4,3 – 7,2 chồi.
- 18 -
33
K ả n ng ra rễ của các d ng ạc
àn uro mang b ến d soma ở các mô
trường c b sung muố
Chọn lọc các d ng biến dị soma hình thành sau chiếu xạ mô sẹo trên môi
trƣờng chọn lọc ở các nồng độ muối và các giai đoạn phát triển khác nhau là rất cần
thiết vì đặc điểm chống chịu cơ thể là những biến đổi di truyền và ổn định qua các
thế hệ nhƣng cũng có thể chỉ là những biến đổi tạm thời do tác động của tác nh n
phóng xạ và có thể mất đi trong quá trình sinh trƣởng và phát triển. Do đó, sau khi
chọn lọc đƣợc ở giai đoạn tái sinh chồi, các chồi cần đƣợc tiếp tục đánh giá ở giai
đoạn ra rễ và cây con.
ốn d ng đột biến đƣợc chọn để nghiên cứu giai đoạn ra rễ đƣợc ký hiệu lần
lƣợt từ LH01 đến LH04. Trong bốn d ng nghiên cứu, d ng LH01 có chiều dài rễ
trung bình lớn nhất, tiếp đến là d ng LH04 và cuối cùng là d ng LH03 và LH02. Ở
tất cả các c y trong các công thức thí nghiệm của 04 d ng đều cho thấy hình thái rễ
có đầu rễ trắng và dài.
3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các dòng Bạch đàn đã chọn, tạo ở
giai đoạn vƣờn ƣơm trong các môi trƣờng có bổ sung muối.
- Đối với chỉ tiêu đƣờng kính gốc, các dòng chịu mặn có khả năng sinh
trƣởng khá đều nhau và đạt giá trị trung bình trong khoảng từ 2,7 – 2,8 mm. Trong
khi đó, d ng đối chứng đạt giá trị trung bình là 4,4mm cao hơn các d ng chịu mặn
từ 57,14 – 62,96 %).
- Đối với chỉ tiêu chiều cao vút ngọn, các dòng chịu mặn có khả năng sinh
trƣởng đạt giá trị trung bình trong khoảng từ 29,1 – 30,2 cm. Giá trị này ở d ng đối
chứng là 36,5 cm cao hơn các d ng đối chứng từ 20,86 – 25,43 %).
3.5. Sự sai khác về đặc điểm hình thái, cấu tạo giải phẫu lá và di truyền của các
dòng Bạch đàn có khả năng chịu mặn đã chọnở vƣờn ƣơm.
3.5.1. So sánh sự sai khác về
c
m hình thái lá
Các chỉ tiêu hình thái lá ở tất cả các d ng đều có sự khác biệt rõ ràng so với
d ng đối chứng. Cụ thể nhƣ sau:
- 19 -
- Về chiều dài cuống lá: Các dòng chịu mặn có giá trị trung bình nằm trong
khoảng từ 2,92 – 3,11 cm. Trong khi đó, d ng đối chứng có chiều dài cuống lá
trung bình lớn hơn các d ng chịu mặn khoảng 03 lần (7,99 cm).
- Về chiều rộng lá: Giá trị trung bình về chiều rộng lá ở các dòng chịu mặn
có giá trị nằm trong khoảng từ 2,70 – 2,83 cm, trong khi đó, giá trị trung bình về
chiều rộng lá ở d ng đối chứng là 7,82 cm.
- Về chiều dài lá: Giá trị trung bình của các dòng chịu mặn đạt đƣợc từ 29,80
– 30,94 cm, d ng đối chứng có giá trị trung bình là 35,45 cm.
- Về chỉ số kích thƣớc lá: Các dòng chịu mặn có giá trị trung bình nằm trong
khoảng từ 11,00 – 11,87. Trong khi đó, ở d ng đối chứng, giá trị này đạt đƣợc là
4,55.
- Về diện tích lá: các d ng đối chứng có diện tích lá trung bình đạt đƣợc từ
21,78 – 23,01 cm2, giá trị này ở d ng đối chứng là 27,04 cm2.
35
Đán g á sự sai khác về cấu tạo giải phẫu lá
Nhận xét và thảo luận:
- Về mật độ khí khổng trung bình trên 1 mm2 mặt trên lá, có sự khác biệt rõ
ràng về mật độ khí khổng mặt trên lá ở các dòng chịu mặn so với d ng đối chứng.
Giá trị trung bình đạt đƣợc nằm trong khoảng từ 164,48 – 180,54 khí khổng/mm2.
Trong khi đó, giá trị này ở d ng đối chứng là 205,91 khí khổng/mm2.
- Về mật độ khí khổng trung bình trên 1mm2 mặt dƣới lá, không có sự khác
biệt rõ ràng giữa các dòng chịu mặn so với d ng đối chứng. Giá trị trung bình đạt
đƣợc ở cả các dòng chịu mặn và d ng đối chứng nằm trong khoảng từ 592,33 657,46 khí khổng/1mm2.
3.5.3. Sự sai khác về di truyền
3.5.2.1. Sự sai khác về di truyền giữa các dòng Bạch đàn chọn được từ biến dị tổ
hợp so với đối chứng
Với mồi CP03, sản phẩm PCR-RAPD sau khi điện di xuất hiện tổng số 8
băng, kích thƣớc từ khoảng 550 bp đến gần 4.000 bp. Trong số 8 băng ADN tạo ra,
có tới 6 băng đa hình bảng 3.14 . Nhóm băng chỉ xuất hiện ở hai d ng chịu mặn
D1 và D7 là băng có kích thƣớc khoảng 1.900 bp và 2.800 bp. Nhóm băng ADN chỉ
- 20 -
xuất hiện ở d ng đối chứng mà không cuất hiện ở cả hai d ng chịu mặn là 3 băng
với kích thƣớc lần lƣợt là 1.000 bp, 1.200 bp và 1.700 bp. Ngoài ra, c n một băng
có kích thƣớc khoảng 1.500bp chỉ xuất hiện ở d ng D7 mà không hề xuất hiện ở
d ng chịu mặn D1 hay đối chứng.
Mồi CP07 tạo ra tổng số 10 băng ADN, trong đó cũng có 6 băng đa hình và
chia thành hai nhóm. Cụ thể, nhóm đa hình thứ nhất gồm các băng ADN chỉ xuất
hiện ở hai d ng chịu mặn mà không xuất hiện ở d ng đối chứng, đó là các băng có
kích thƣớc xấp xỉ 850 bp, 1.000 bp, 1.350 bp và 3.300 bp. Nhóm thứ hai gồm những
băng ADN chỉ xuất hiện ở d ng đối chứng và không xuất hiện ở cả hai d ng ạch
đàn chịu mặn, đó là các băng có kích thƣớc 1.250 bp và 2.000 bp.
3.5.2.2. Sự sai khác về di truyền giữa các dòng Bạch đàn chọn được từ kết quả
Có 03 mồi có sự xuất hiện các băng đa hình. Mỗi mồi tạo ra từ hai đến bốn
băng đa hình. Cụ thể: mồi CP05 có tổng số 12 băng trong đó có bốn băng đa hình,
băng có kích thƣớc 300bp chỉ xuất hiện ở d ng LH01 và băng có kích thƣớc 950bp
chỉ xuất hiện ở d ng LH04, c n băng có kích thƣớc 400 bp xuất hiện ở các dòng
LH02, LH03 và cả hai d ng đối chứng, riêng băng có kích thƣớc 1.200 bp xuất hiện
ở tất cả các dòng trừ dòng LH04. Mồi CP13 chỉ cho hai băng đa hình trong tổng số
11 băng tạo ra, một băng có kích thƣớc 450 bp xuất hiện ở cả bốn dòng chịu mặn
mà không có ở hai dòng đối chứng, c n băng có kích thƣớc 820 bp xuất hiện ở dòng
LH01 và LH04 mà hoàn toàn vắng mặt ở các dòng còn lại. Qua đ y, cho thấy việc
sử dụng mồi ngẫu nhiên đem lại hiệu quả đánh giá đa hình giữa các d ng đột biến.
Một kết quả đáng chú ý là với mồi CP11 xuất hiện băng rất rõ nét đặc hiệu cho
dòng LH01 và một băng khác đặc hiệu cho d ng LH04. Đ y là hai d ng thể hiện
khả năng chịu mặn tƣơng đối tốt ở giai đoạn ra rễ.
Mồi CP11 cho thấy sự sai khác di truyền giữa các d ng đột biến chịu mặn và
đối chứng. D ng LH01 xuất hiện một băng ADN tƣơng đối rõ và khác biệt so với
d ng LH02 và đối chứng. Điều tƣơng tự cũng xảy ra đối với hai d ng chịu mặn ở
nồng độ 125mM/l, d ng LH04 cũng xuất hiện một băng ADN rất rõ và ph n biệt so
với d ng LH03 và đối chứng. Trong số bốn d ng đột biến đƣợc chọn lựa, có hai
d ng thể hiện tính kháng mặn tƣơng đối tốt ở giai đoạn ra rễ là d ng LH01 và
