Đặc điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố của ba loài hopea đang bị đe dọa ở việt nam sao hải nam (hopea hainanensis merr chun), sao hòn gai (hopea hongayensis tardieu) và sao mặt quỷ (hopea mollissima c y wu)

Hà Nội, 2014
Mở đầu
Hiện nay, ở Việt Nam, họ Dầu được biết có sáu chi (Anisoptera,
Hopea, Parashorea, Vatica, Dipterocarpus, Shorea), hầu hết là loài bản
địa và đặc hữu. Các loài họ Dầu hiện chỉ còn gặp trong các khu bảo tồn
đã được quy hoạch vì trong những năm qua, do chiến tranh tàn phá,
do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân địa phương khai thác
quá mức mà diện tích rừng nói chung và rừng hỗn giao cây họ Dầu nói
riêng đã bị suy giảm nghiêm trọng.
Trong các loài họ Dầu, Sao hải nam, Sao hòn gai và Sao mặt
quỷ là những loài phân bố hẹp, chỉ có ở Việt Nam và Trung Quốc, Đây
là loài có nhiều giá trị cả về mặt khoa học, giá trị kinh kinh tế cũng
như giá trị y học. Tuy nhiên hiên nay ba loai nay đang đứng trước
nguy cơ tuyệt chủng do mức độ suy giảm nơi sống và viêc khai thác
không hợp lý. Măc du vây , cho đên nay chưa có bất kỳ công trình
nào nghiên cứu riêng về các loài này ở Việt Nam. Cho đến nay, chúng
ta chưa có các số liệu cụ thể, thông tin về di truyền, các yếu tố ảnh
hưởng xấu đến sự tồn tại của ba loài này liên quan đến tác động
của con người cũng chưa được


nghiên cứu, vì thế rất khó để nâng cao hiệu quả của công tác bảo tồn
và phát triển bền vững chúng.
Chính vi v ậy, chúng tôi đề xuất thực hiện nghiên cứu về “Đặc
điểm di truyền, hình thái và hiện trạng phân bố của ba loài Hopea
đang bị đe dọa ở Việt Nam: Sao hải nam (Hopea hainanensis Merr. &
Chun), Sao hòn gai (Hopea hongayensis Tardieu) và Sao mặt quỷ
(Hopea mollissima C.Y.Wu)”như một bước nghiên cứu đầu tiên nhằm
cung cấp thông tin cần thiết cho về di truyền, bổ sung cơ sở dữ liệu
về di truyền của ba loài này ở Việt Nam, đồng thời góp phần phục vụ
công tác bảo tồn và sử dụng bền vững loài của cộng đồng dân cư địa

phương.
Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng cơ sở dữ liệu về di truyền của ba loài Hopea
quý của Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát, điều tra hiện trạng về phân bố, cấu trúc quần thể của
ba loài Sao Hòn gai (Hopea hongayensis Tardieu) tại hai đảo Ba Mùn
và đảo Cái Lim, VQG Bái Tử Long, tỉnh Quảng Ninh, Sao Mặt Quỷ
(Hopea mollissima C.Y.Wu) tại phân khu Khe Rỗ,


khu BTTN Tây Yên Tử, tỉnh Bắc Giang và Sao Hải nam (Hopea
hainanensis Merr. & Chun) tại VQG Bến En, tỉnh Thanh Hóa.
 Xác định các đặc điểm di truyền ba vùng gen lục lạp bao gồm
matK, psbA – trnH và rbcL bằng phân tích trình tự gen.
 Xác định mối quan hệ di truyền của ba loài này với một số loài
họ Dầu khác ở Việt Nam trên cơ sở trình tự ba vùng gen lục lạp nêu
trên.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về di
truyền cho danh lục các loài thực vật quý hiếm đang bị đe dọa
tuyệt chủng ở Việt Nam, góp phần cho công tác bảo tồn nguồn gen,
làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển bền vững ba loài
gỗ quý này của Việt Nam.


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Tổng quan về cây họ Dầu và ba loài nghiên cứu
Họ Dầu (Dipterocarpaceae) bao gồm 17 chi và khoảng 680 loài
chia thành ba phân họ: Dipterocarpoideae gồm 13 chi và khoảng 600

loài ở vùng nhiệt đới châu Á và Malesia; Pakaraimoideae là đặc hữu
vùng cao Guaianan – vùng nhiệt đới Nam Mỹ và Monotoideae với 3
chi và 30 loài ở vùng nhiệt đới Châu Phi và Nam Mỹ. Các chi lớn nhất
trong họ Dầu là Shorea (khoảng 250 loài), Hopea (105 loài),
Dipterocarpus (70 loài) và Vatica (65 loài). Các loài cây họ Dầu đã tạo
nên một họ thực vật độc đáo và nổi tiếng nhất của vùng nhiệt đới.
Hiện nay gỗ của các loài cây họ Dầu đang chiếm thị phần lớn trên thị
trường gỗ thế


giới nên rõ ràng chúng đang đóng một vai trò quan trọng đối với nhiều
nước, nhất là các nước Châu Á mà đặc biệt là các nước Đông Nam
Á. Tuy nhiên, do khai thác quá mức và chuyển đổi mục đích sử
dụng đất mà diện tích rừng nói chung và cây họ Dầu nói riêng đã bị suy
giảm nghiệm trọng.
Có khoảng 45 loài cây họ Dầu với 6 chi được tìm thấy ở Việt
Nam, chúng là những cây rừng phổ biến và đóng vai trò quan trọng về
giá trị sinh thái và kinh tế. Phần lớn các cây họ Dầu ở Việt Nam là
bản địa và đặc hữu. Do giá trị thương mại và nhu cầu của người dân
địa phương, các loài cây họ Dầu bị khai thác quá mức. Hơn nữa, trong
nhiều năm, dưới áp lực tăng trưởng kinh tế nhanh là hậu quả của sự
suy giảm diện tích rừng và tăng mức độ phân cắt của các mảnh rừng
còn lại. Kết quả này làm ảnh hưởng đến nơi sống của cây họ Dầu.
Sao hải nam(Hopea hainanensis Merr. et Chun), Sao hon gai
(Hopea hongayensis Tardieu), Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu)
đều là những loài đặc hữu, có đặc điểm hình thái gần giống nhau, phân
bố rải rác trên khắp Việt Nam. Ba loài đều nằm trong Sách đỏ Việt Nam
và được tổ chức IUCN xếptrong các mức phân hạng khác nhau.

6


Tổng quan về ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong
nghiên cứu phân loại và di truyền thực vật
Phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sử dụng sự sai
kháctrong cấu trúc phân tử để có được các thông tin về sự sai khác di
truyền giữa các loài.Phân loại học phân tử dựa trên nguyên lý mỗi
sinh vật sống đều mang vật chất di truyền là các phân tử DNA(ở một số
virus là RNA),các sinh vật có họ hàng gần gũi sẽ có mức độ tương đồng
cao trong cấu trúc phân tử, ngược lại những sinh vật có họ hàng xa
nhau sẽ cho thấy những đặc điểm cấu trúc khác nhau.Kỹ thuật sinh
học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu
tiến hóa, phân loại và đa dạng di truyền, là công cụ hỗ trợ đắc lực cho
các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết mối
nghi ngờ về phân loại. Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và
đang góp phần đánh giá đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho
việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật
trên thế giới cũng như ở Việt Nam.
Tổng quan về hệ gen lục lạp sử dụng trong nghiên cứu
Trong số các gen lục lạp thì matK là 1 trong những gen tiến hóa
nhanh nhất, có kích thước khoảng 1550bp và mã hóa cho enzyme
maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các in-tron loại



7

hai trong quá trình phiên mã RNA. Do matK tiến hóa nhanh và có mặt
trong hầu hết các loài thực vật nên được sử dụng như một chỉ thị trong
nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa các loài và phát sinh loài ở thực
vật. CBOL (Consortium for the Barcode of Life) đã thử nghiệm matK
trên 550 loài thực vật và thấy rằng hơn 90% mẫu thực vật hạt kín dễ
dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng 1 cặp mồi đơn và kiến
nghị sử dụng matK là một trong những chỉ thị chuẩn cho việc phân
loại thực vật. Ngoài ra,vùng gen lục lạp rbcL, vùng psbA-trnH gần đây
đã trở thành một công cụ phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài
phân tử thực vật ở cấp độ phân loại thấp và phù hợp cho nghiên cứu
DNA. Vùng này có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành
công rất cao
(100% các loài đã được nghiên cứu).
CHƢƠNG II. NỘI DUNG, ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
TT

Địa điểm
thu

Tên khoa học Tên Việt
Nam

mẫu



8

Tọa độ thu
mẫu


21°02’NĐảo
Ba
Mùn,
107°35’E,
Hopea
1
Sao Hòn gai VQG Bái Tử
hongayen
Long, Quảng 120m
Ninh
sis
Đảo
Cái 21°06’NHopea
Lim,
107°33’E, 150m
2
Sao Hòn gai
VQG
Bái
Tử
hongayen
Long, Quảng
sis
Ninh
Hopea
19°35’N3

Sao Hải nam VQG Bến
105°30’E, 100m
hainamensis
En,
Thanh Hóa
o09’NPhân khu Khe 21o
Hopea
21 13’E,
4
Sao Mặt quỷ Rỗ,
khu
BTTN
Tây
mollissi
Yên Tử, Bắc 130m
ma
Giang Bến
VQG
19°35’N5 Hopea odorata Sao Đen
En,
105°30’E, 100m
Thanh Hóa
Dipterocarpus
Khu BTTN Bình 10°28’N6
Dầu Lông
Châu-Phước
107°35’E, 100m
intricatus
Bửu,
Bà Rịa-Vũng Tàu

Dipterocarpus Dầu Song
11°12’NTân Cửu,
7
107°09’E, 129m
dyeri
Nàng
Vĩnh
Cửu, Đồng Nai
Dipterocarpus
10°56’NVQG Bù Gia 106°59’E, 130m
8
Dầu Mít
costatus
Mập, Bình
Phước
Dipterocarpus
VQG York
12°47’N9
Dầu Đồng
Đôn,
107°35’E, 150m
tuberculatus
Buôn Đôn,
Đắk
10
Chò Chỉ
VQG
Cúc 20°19’NParashorea
Phương,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9


chinensis

Bình

105°36’E, 150m

Trình tự mồi sử dụng
Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Vùng
gene

Mồi xuôi

matK

CGA TCT ATT CAT
TCA ATA TTT C

rbcLa

TCT AGC ACA CGA
AAG TCG AAG T

rbcLc

TGA AAA CGT GAA
TTC CCA ACC GTT

trnHpsbA

Mồi ngƣợc

TCT AGC ACA CGA
AAG TCG AAG T
CTT-CGG-CAC-AAA
ATA CGA AAC GAT
CTC TCC A
GCA GCA GCT AGT
TCC GGG CTC CA

Nhiệt
độ bắt
cặp
mồi(0C
50

Độ dài
sản
phẩ
m
PCR
900

56

700

56

700

48
300
GTT ATG CAT GAA
CGC GCA TGG TGG
CGT AAT GCT C
ATT CAC AAT CC
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát thu mẫu
Phương pháp tách chiết DNA tổng số Phương
pháp PCR với mồi nghiên cứu Phương pháp
điện di DNA trên gel agarose Đọc trình tự
Phân tích số liệu
Phân tích mối quan hệ di truyền-xây dựng cây phát sinh chủng loại



10


CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hiện trạng phân bố và đặc điểm hình thái của ba loài Sao
(Hopea) nghiên cứu
3.1.1. Loài Sao hải nam (Hopea hainanensis Merr. et Chun) tại
VQG Bến En-Thanh Hóa
Loài Sao hải nam (hay còn gọi là Sao lá to) ở đây đang bị khai
thác mạnh, chỉ còn gặp rải rác. Tại khu vực này, chúng tôi đã tìm thấy

và thu được mẫu của 19 cá thể Sao hải nam. Các cây Sao hải nam có
kích thước lớn hầu như đã không còn, chỉ còn lại các cây có kích thước
trung bình và nhỏ cùng cây tái sinh
3.1.2. Loài Sao hòn gai (H.hongayensis Tardieu) (synonym H.
chinensis (Merr.) Hand.-Mazz.) tại đảo Ba Mùn và đảo Cái Lim-VQG
Bái Tử Long-Quảng Ninh
Quần thể Sao hòn gai trên đảo Ba Mùn ngoài vùng phân bố
rất tập trung, trong một khu đất rộng khoảng hai hecta có trên hơn
100 cá thể, các cá thể Sao hòn gai ở đây tái sinh rất tốt. Trong
khu quần thể Sao hòn gai hầu như ngoài các cây bụi nhỏ thì không
có loài cây vượt tán nào khác ngoài Sao hòn gai. Chúng tôi tìm
thấy hai quần thể Sao hòn gai trên đảo Ba mùn, cách nhau khoảng
5km, mỗi quần thể phân bố tập trung trong khu đất rộng khoảng 2
-3 ha với khoảng hơn 100 cá thể. Ngoài ra trên đường đi vẫn bắt gặp
một vài cá thể Sao hòn gai nằm rải rác



11


tách biệt với nhóm quần thể trung tâm.
3.1.3 Loài Sao mặt quỷ (Hopea mollissima C.Y.Wu.) tại Khu
BTTN Tây Yên Tử-Bắc Giang
Tổng số 16 cá thể Sao mặt quỷ đã được chúng tôi tìm thấy và
thu mẫu, tất cả các cá thể Sao mặt quỷ được tìm thấy đều là những
cá thể trưởng thành,cao từ 30-40m, mọc ở nơi có độ ẩm cao (gần
suối hoặc vùng có tầng đất thịt dày nhưng thoát nước), chủ yếu ở độ
cao khoảng 300, không nhìn thấy có cây con xung quanh. Giả thiết có
thể là đã có các cây con nhưng sau đó cây con đã bị chết do thiếu

ánh sáng, bởi những nơi có cây Sao mặt quỷ xuất hiện đều là những
nơi đất ẩm, mật độ cây dày đặc, rất ít ánh sánh tự nhiên, hoặc cũng
có thể do rễ cây con không bám được tới đất do lớp lá rụng ở đây khá
dày
Bảng 1. Một số đặc điểm hình thái sai khác giữa loài Sao mặt quỷ
và Sao hòn gai
TT

1

Đặc
điểm

Lá

Sao mặt quỷ
(H.mollissima
C.Y.Wu)
Có nhiều lông hình sao
trên cả 2 mặt lá, mặt
sau nhiều hơn mặt
trước



12

Sao hòn gai (H.hongayensis
Tardieu) (synonym H.
chinensis (Merr.) Hand.Mazz.)

Rất ít hoặc hầu như không
có lông


2

Cuống
lá

Có nhiều vết nứt

Không nứt

3

Hoa

Cuống hoa màu xanh

Cuống hoa màu hồng nhạt

3.2 Đặc điểm di truyền của ba loài Hopea nghiên cứu
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Kết quả điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 1% cho thấy DNA
tổng số thu được khá tốt, DNA không bị gãy (hình 3.7). Kết quả đo OD
cho chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến
2 (chỉ số cho biết dung dịch DNA có độ tinh khiết cao)

Hình 1. Kết quả điện di DNA tổng số chín loài Dầu nghiên cứu
Ghi chú: 1- Sao hải nam; 2- Sao mặt quỷ; 3- Sao hòn gai Ba Mùn;

4- Sao hòn gai Cái Lim; 5- Sao đen; 6- Chò chỉ; 7- Dầu cát; 8- Dầu lông;
9- Dầu mít; 10- Dầu song nàng.



13


3.2.1 Đặc điểm vùng gen matK
Gen matK của ba loài nghiên cứu cùng sáu loài họ Dầu khác
được thu thập trong quá trình thu mẫu đã được khuyếch đại bằng cặp
mồi đặc hiệu matK-F và matK-R. Phản ứng PCR được thực hiện trên
máy PCR system 9700. Kết quả PCR sau đó được điện di kiểm tra trên
gel Agarose 1%.Kết quả điện di kiểm tra cho thấy sản phẩm PCR là
một băng đậm, sắc nét có kích thước khoảng 900bp đúng như dự
kiến, chứng tỏ phản ứng PCR đã được thực hiện tốt, mồi sử dụng có độ
đặc hiệu cao. Để kiểm tra độ chính xác của sản phẩm PCR cũng như
phân tích các đặc điểm phân tử của gen matK, sản phẩm PCR sau đó
được tinh sạch và tiến hành đọc trình tự trên máy ABI 3100, sử dụng
kit Bigdye terminator.Kết quả giải trình tự sau đó được kiểm tra bằng
chức năng Blast của NCBI. Kết quả kiểm tra chứng tỏ các sản phẩm PCR
của chúng tôi thu được chính xác là các đoạn DNA tương ứng với
các vùng gen matK.
Vùng gen matK dài 900 bp của ba loài Hopea nghiên cứu sau khi
cắt bỏ hai đầu còn lại kích thước 843bp được dùng để so sánh sự sai
khác bằng phần mềm Mega 5.0.Kết quả giải trình tự sau đó được
kiểm tra bằng chức năng Blast của NCBI. Kết quả

14


kiểm tra chứng tỏ các sản phẩm PCR của chúng tôi thu được
chính xác là các đoạn DNA tương ứng với các vùng gen matK.
Vùng gen matK dài 900 bp của ba loài Hopea nghiên cứu sau khi
cắt bỏ hai đầu còn lại kích thước 843bp được dùng để so sánh sự sai
khác bằng phần mềm Mega 5.0 Bảng sai khác di truyền giữa ba
loài Hopea nghiên cứu được đưa ra trên cơ sở so sánh trình tự
Nucleotide

đoạn

gen

matK

dài

madagascariensisAB246478được sử

843bp,
dụng

loài
làm

Dầu Monotes
loài ngoài nhóm

(outgroup).Kết quả cho thấy không có sự sai khác nào được tìm thấy
trên đoạn gen matK dài 843 nucleotide ở hai mẫuH. hongayensis thu
tại đảo Cái Lim và đảo Ba Mùn. Khoảng cách di truyền giữa hai loài H.
mollissima và H. hongayensis là rất nhỏ (0,1%).Khoảng cách di truyền
giữaH. hainanensis và H. hongayensislà
0,2%



15


Hình 2. Mối quan hệ di truyền ba loài Hopea trên cơ sở so sánh
trình tự gen matK theo phƣơng pháp NJ
3.2.2 Vùng gen psbA-trnH ba loài Hopea nghiên cứu
Một đoạn gen psbA-trnH có kích thước lý thuyết là
300bpcủa ba loài Hopea và sáu loài Dầu khác ở Việt Nam được khuếch
đại bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu psbA-trnH-F và psbA-trnH-R,
0
0
bắt cặp mồi ở 48 C, kéo dài chuỗi ở 72 Ctrong 30 giây. Kết quả PCR
được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%
(hình 3.12)

Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng gen psbA – trnH trên
gel Agarose 1%
Ghi chú: M: DNA ladder 100bp (Fermentas)
Ghi chú: 1- Sao hải nam; 2- Sao mặt quỷ; 3- Sao hòn gai Ba Mùn;
4- Sao hòn gai Cái Lim; 5- Sao đen; 6- Chò chỉ; 7- Dầu cát; 8- Dầu lông;
9- Dầu mít; 10- Dầu song nàng.

16


Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen psbA-trnH trên
gel agarose 1% cho thấy đã xuất hiện một băng DNA rõ nét có kích
thước khoảng 300bp đúng như dự kiến, chúng tỏ việc khuếch đại gen
psbA-trnH đã thành công. Để kiểm tra tính chính xác của sản phẩm PCR
cũng như phân tích sự sai khác về nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu
trên đoạn gen psbA-trnH, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm
PCR bằng cột sepadex
G50 và đọc trình tự trên máy ABI 3100.
So sánhmức độ sai khác di truyền giữa hai loài H.hongayensis
và H.hainanensis là 0.5%. Không có nucleotide saikhác nào được tìm
thấy giữa hai mẫu Sao Hòn gai thu tại Cái Lim và Ba mùn cũng nhưgiữa
hai loài H.hongayensis vàH.mollissima

Hình 4. Mối quan hệ di truyền của ba loàiHopea dựa trên so sánh
trình tự gen psbA-trnH theo phƣơng pháp NJ



17


3.2.3 Trình tự gen rbcL ba loài Hopea nghiên cứu
Đoạn gen rbcLcó chiều dài 1400bp được cắt thành 2 đoạn
(rbcLa và rbcLc), mỗi đoạn có kích thước 700bp. Phản ứng PCR khuếch
đại hai vùng gen rbcLa và rbcLc của ba loài Hopea nghiên cứu và sáu

loài họ dầu khác ở Việt Namđược tiến hành trên máy PCR system
0
9700, bắt cặp ở 56 C, kéo dài mỗi chuỗi trong 1 phút, phản ứng PCR
được thực hiện trong tổng số 35 chu kỳ. Sản phẩm PCR mỗi đoạn DNA
sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel
Agarose 1% (hình 3.16 a, b)

Hình5a. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcLa
trên gel Agarose1%



18


Hình5b. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR đoạn gen rbcLa
trên gel Agarose1%
So sánhcho thấy mức độ sai khác di truyền giữa các mẫuHopea
thấp, không có sự sai khác giữa hai mẫu H. Hongayensis thu tại Ba
Mùn và Cái Lim

Hình 6. Mối quan hệ di truyền của ba loài Hopea dựa trên so sánh
trình tự gen rbcL theo phƣơng pháp NJ



19


Cùng với ba loài Hopea nghiên cứu (Hopea mollissima C.Y.Wu,

Hopea hongayensis Tardieu, Hopea hainanensis Merr et Chun), sáu loài
họ Dầu khác ở Việt Nam bao gồm Parashorea chinensis Wang Hsie,
Hopea odorata Roxb., Dipterocarpus tuberculatusRoxb., Dipterocarpus
intricatus Dyer, Dipterocarpus dyeri Pierre, Dipterocarpus costatus
C.F.Gaertn. cũng đã được tiến hành đọc trình tự cả ba vùng gen
matK, psbA-trnH và rbcL. Trình tự vùng gen matK và rbcL của chín loài
họ Dầu phổ biến này ở Việt Nam đã được đăng ký trên ngân hàng Gen
(bảng 2)
Bảng 2. Tên loài và số hiệu Genbank trình tự gen rbcL,
matK của chín loài họ Dầu phổ biến ở Việt Nam
STT
1
2
3
4
5
6
7

Số hiệu
Tên
Địa điểm thu mẫu Genban
loài
k gen
Parashorea chinensis VQG Cúc Phương, Ninh KM26714
3
Wang Hsie
Bình
Hopea odorata Roxb. VQG Bến En, Thanh
KM26714

Hóa
4
Hopea mollissima
Khu bảo tồn thiên
KM26714
nhiên
5
C.Y.Wu
Khe
Rỗ,
Bắc
Giang
Hopea hongayensis
Đảo Ba Mùn, VQG Bái KM26714
Tử
6
Tardieu
Long,Bến
Quảng
Hopea hainanensis
VQG
En, Ninh
Thanh
KM26714
Merr
Hóa
7
et Chun
Dipterocarpus
VQG York Đôn, Buôn

KM26714
8
tuberculatus Roxb.
Đôn, Đắk Lắk
Dipterocarpus
Khu BTTN Bình Châu- KM26715
0
intricatus Dyer
Phước Bửu, Bà Rịa-



20

Số hiệu
Genban
k gen
KJ611235
KJ611238
KJ611237
KJ611239
KJ611240
KJ611232
KJ611230


8
9

Dipterocarpus dyeri

Pierre
Dipterocarpus
costatus C.F.Gaertn.

Tàu
Tân Cửu, Vĩnh Cửu,
Đồng
Nai Bù Gia Mập, Bình
VQG
Phước

KM26715 KJ611231
1
KM26715 KJ611241
2

Các vùng gen này sau đó được kết hợp từng cặp với nhau và cùng kết
hợp thành một đoạn DNA dài 2359bp. Các đoạn DNA kết hợp của chín
loài họ Dầu sau đó được tiến hành so sánh để tìm ra vùng gen hiệu quả
nhất trong phân biệt các loài họ Dầu ở Việt Nam.



21


Hình 7. Kết quả so sánh phân loại chín loài họ Dầu ở Việt Nam dựa
trên so sánh từng vùng gen (matK, rbcL, trnH-psbA) và sự kết hợp
của chúng.
Kết quả so sánh phân loại của từng vùng gen và sựa kết hợp

cặp đối của chúng cho thấy vùng gen trnH-psbA không chỉ ra được sự
sai khác nucleotide nào giữa hai loài H. hongayensis và H. mollissima
cũng như hai loài D. intricatus và D. costatus, do vậy sự kết hợp cặp đôi
giữa vùng gen trnH-psbA với các vùng gen khác cũng cho kết quả không
rõ ràng về sự phân loại giữa các loài gần gũi. Trong khi đó, hai vùng
gen matK và rbcL bộc lộ khả năng phân loại tốt hơn. Cả hai vùng gen
này đều chỉ ra được sự sai khác nucleotide giữa các loài, tuy nhiên với
kích thước 900bp và hiệu suất PCR là 100%, vùng gen matK đã chứng
tỏ là hữu hiệu hơn so với vùng gen rbcL dài 1400bp và hiệu suất PCR là
85,7%.



22


Hình8. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài họ Dầu phổ biến ở
Việt Nam dựa trên phân tích trình tự gen matK (A) và trình tự kết
hợp giữa gen matK + rbcL (B)
Tuy vậy, khi xây dựng cây phát sinh chủng loại (NJ) của chín loài
họ dầu phổ biến ở Việt Nam dựa trên trình tự gen matK (hình 3.21A)
và trình tự kết hợp giữa gen matK và gen rbcL (hình
3.21B) cho thấy giá trị boostrap trong mối quan hệ di truyền dựa trên
trình tự kết hợp giữa gen matK và gen rbcL cao hơn hẳn so với giá trị
bootstrap khi chỉ sử dụng một mình gen matK để so sánh. Do vậy
trong ba chỉ thị phân tử matK, rbcL và trnH-psbA


23

thì vùng gen matK là vùng gen hữu hiệu nhất trong phân loại các loài
họ Dầu nhưng để cho kết quả có độ tin cậy cao thì chúng tôi khuyến
khích sự kết hợp phân tích hai vùng gen matK và rbcL
Chỉ thị phân tử (DNA barcoding) là công cụ công nghệ sinh
học chính xác, đáng tin cậy và đã được sử dụng rất nhiều trong
phân loại các loài động thực vật. Việc sử dụng một hay kết hợp nhiều
chỉ thị phân tử để phân loại đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới
quan tâm và tiến hành nghiên cứu. Kress (2007) đã giới thiệu năm chỉ
thị phân tử vùng gen lục lạp bao gồm matK, rbcL, trnH-psbA, rpoCl và
ycf5 là những chỉ thị phân tử tin cậy và hữu hiệu trong phân loại các
loài thực vật cạn. Nhóm nghiên cứu về thực vật thế giới (plant
working group) cũng đã giới thiệu ba chỉ thị phân tử lục lạp hữu hiệu
để phân loại cho nhóm thực vật bậc cao là matK, rbcL và trnH-psbA
(CBOL, 2009), đặc biệt sự kết hợp giữa hai chỉ thị phân tử matK và
rbcL được coi là hữu hiệu cho hầu hết các loài thực vật.
Trong nghiên cứu này của chúng tôi, matK đã chứng tỏ cũng là
chỉ thị phân tử hữu hiệu cho phân loại các loài họ Dầu ở Việt Nam ở
cấp độ loài. Sự kết hơp giữa hai chỉ thị matK và rbcL



24


cũng đã cho một kết quả với độ tin cậy cao (boostrap >76%) ở tất cả
các gốc nhánh.
Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa chín loài họ dầu
phổ biến ở Việt Nam cho thấy chi Parashorea có quan hệ gần gũi với
chi Hopea hơn so với chi Dipterocarpus. Kết quả nghiên cứu này cũng

khẳng định lại kết quả nghiên cứu của Kamiya và cs (1998)



25


Kết luận
- Khảo sát thu mẫu ba loài nghiên cứu nhận thấy số lượng cây
kích thước lớn còn rất ít, hầu như chỉ có cây kích thước trung bình và
nhỏ cùng cây tái sinh. Không tìm thấy cây tái sinh của loài Sao mặt quỷ
tại phân khu Khe Rỗ, khu BTTN Tây Yên Tử, Bắc Giang. Quá trình thu
mẫu cho thấy hai loài Sao mặt quỷ và Sao hòn gai có nhiều đặc điểm
hình thái giống nhau nhưng các chứng minh di truyền cho thấy chúng
là hai loài khác nhau.
- Đưa ra các đặc điểm di truyền ba vùng gen lục lạp matK, rbcL
và psbA – trnH của ba loài nghiên cứu. Kết quả cho thấy không có sự
sai khác nucleotide nào giữa mẫu Sao hòn gai tại đảo Ba Mùn mẫu
Sao hòn gai tại đảo Cái Lim, nhiều khả năng hai quần thể này có
chung nguồn gốc.
- Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa chín loài họ Dầu
phổ biến ở Việt Nam cho thấy chi Parashorea có quan hệ gần gũi với
chi Hopea hơn so với chi Dipterocarpus.
-Việc sử dụng trình tự của cả ba chỉ thị gen lục lạp phổ
biến dùng trong phân loại bao gồm matK, rbcL và trnH-psbA của


26