KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO THÔ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus) TRÊN MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO THÔ
DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)
TRÊN MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN
GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

:BÙI THỊ NGỌC HÂN

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CAO THÔ
DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (Phyllanthus amarus)
TRÊN MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN
GRAM ÂM VÀ GRAM DƯƠNG

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

BÙI THỊ NGỌC HÂN

BSTY. NGÔ BÁ DUY

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Tất Toàn và BSTY. Ngô Bá Duy – Người thầy
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ từng bước đi của tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực
hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban lãnh đạo Bộ môn Công nghệ sinh học và
Bộ môn Nội Dược – Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng Các hợp chất thiên nhiên – Viện
Công nghệ hóa học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.
Nhân dịp này, tôi cũng xin chân thành cảm ơn ba, mẹ, anh, chị và tất cả bạn bè đã động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn này.

i

TÓM TẮT

Khoa học phát triển, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều nhược điểm và tác dụng
phụ của các loại kháng sinh tổng hợp. Bên cạnh đó, có nhiều loại cây thuốc có tác dụng
dược lý, được sử dụng như các dược liệu. Theo kết quả điều tra của Viện Dược liệu năm
2006, ở Việt Nam có 3.948 loài thực vật và nấm được dùng làm thuốc, có khoảng 185 cây
thuốc có giá trị sử dụng cao. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) được biết đến như
loại cây thuốc có các tác dụng dược lý: hạn chế viêm gan, bảo vệ và phục hồi tế bào gan,
đặc biệt Diệp hạ châu đắng có khả năng kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn. Nghiên
cứu được tiến hành nhằm điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng, định hàm lượng Phyllan –
thin và Hypophyllanthin trong cao thô, từ đó xác định khả năng kháng khuẩn của cao thô
trên các chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương.
Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết lạnh ở nhiệt độ phòng với dung môi Methanol
để điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus), sau đó sử dụng HPLC xác
định hàm lượng Phyllanthin, hàm lượng Hypophyllanthin trong cao thô và xác định MIC,
MBC của cao thô bằng phương pháp pha loãng liên tục trên môi trường MHA và BHI.
Kết quả đã điều chế được cao thô Diệp hạ châu đắng với hiệu suất ở lần chiết 1 và lần
chiết 2 tương ứng 3,70 % và 6,21 %. Ẩm độ cao thô ở lần chiết 1 và lần chiết 2: 13,01 %
và 17,36 %. Kết quả phản ứng HPLC định lượng hàm lượng Phyllanthin và hàm lượng
Hypophyllanthin trong cao thô qua 2 lần chiết: Phyllanthin 0,308 % và 0,446 %, Hypo –
phyllanthin 0,049 % và 0,136 %. Cao thô Diệp hạ châu đắng có hoạt tính kháng khuẩn
trên vi khuẩn Gram âm, Gram dương và ức chế vi khuẩn mạnh ở nồng độ 12,5 mg/ml (ức
chế 100 %) và ức chế yếu ở nồng độ 3,125 mg/ml (< 25 %). Xác định MIC và MBC của
cao thô Diệp hạ châu đắng thu được kết quả: cao thô ức chế Staphylococcus aureus
ATCC ở MIC > 3,125 mg/ml, Bacillus subtilis ATCC, Streptococcus pyogenes ATCC,
Salmonella typhimurium ATCC, Shigella flexerneri ATCC ở MIC 3,125 mg/ml và MBC
12,5 mg/ml.

ii


SUMMARY

“Antibacterial activity of Phyllanthus amarus extracts crude on some Gram negative
and Gram positive using a high-throughput 96 well plate assay”.
First, Phyllanthus amarus was extracted with the methanolic solution. Then, P. amarus
extracts crude were determined the Phyllanthin and Hypophyllanthin substance by HPLC.
Finally, MIC and MBC of P. amarus extracts crude were determined by microtitre plate
method on Gram negative and Gram positive bacteria: Staphylococcus aureus ATCC,
Bacillus subtilis ATCC, Streptococcus pyogenes ATCC, Salmonella typhimurium ATCC,
Shigella flexerneri ATCC.
The result: the performance of Phyllanthus amarus extracts crude of both first and
second extracts were 3,70 %; 6,21 % and the humidity were 13,01 %; 17,36 %,
respectively. Phyllanthin and Hypophyllanthin substance of the two extracts were
Phyllanthin: 0,308 % and 0,446 %; Hypophyllanthin: 0,049 % and 0,136 %. P. amarus
extracts crude obtained antibacterial activity on Gram negative and Gram positive
bacteria. Inhibition of P. amarus extracts crude to the bacterial growth were 100 % at 12,5
mg/ml and >= 25 % at 3,125 mg/ml . The MIC of P. amarus on Bacillus subtilis ATCC,
Streptococcus pyogenes ATCC, Salmonella typhimurium ATCC, Shigella flexerneri
ATCC at 3,125 mg/ml, Staphylococcus aureus ATCC at >3,15 mg/ml and the MBC of
P. amarus to experimental bacteria at 12,5 mg/ml.
Key words: P. amarus extracts crude, antibacterial activity, HPLC, Phyllanthin,
Hypophyllanthin, MIC, MBC.

iii


MỤC LỤC

Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................... i
Tóm tắt ................................................................................................................................. ii
Summary .............................................................................................................................iii
Mục lục ...............................................................................................................................iv
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. vii
Danh sách các bảng .......................................................................................................... viii
Danh sách các hình .............................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu của đề tài......................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về các nhóm vi khuẩn liên quan đến nghiên cứu ............................................ 3
2.1.1. Staphylococcus aureus .............................................................................................. 3
2.1.2. Bacillus subtilis ......................................................................................................... 4
2.1.3. Streptococcus pyogenes ............................................................................................. 4
2.1.4. Salmonella typhimurium ............................................................................................ 5
2.1.5. Shigella flexerneri ..................................................................................................... 5
2.2. Giới thiệu về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ........................................ 6
2.2.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................... 6
2.2.2. Hình thái và phân bố.................................................................................................. 6
iv


2.2.3. Tính chất .................................................................................................................... 7
2.2.4. Thành phần hóa học................................................................................................... 8
2.2.4.1 Phyllanthin ............................................................................................................... 8
2.2.4.2 Hypophyllanthin ...................................................................................................... 9

2.2.5. Tác dụng dược lý ....................................................................................................... 9
2.3. Sơ lược về chiết suất các hợp chất thiên nhiên .......................................................... 11
2.4. Sơ lược về sắc ký ........................................................................................................ 13
2.4.1. Đại cương về sắc ký ................................................................................................ 13
2.4.2. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ..................................................................................... 13
2.5. Sơ lược về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn ........................................... 14
2.5.1. Phương pháp khuếch tán trên thạch ........................................................................ 15
2.5.2. Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng....................................................... 15
2.5.3. Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu....................................... 15
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 16
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 16
3.2. Vật liệu ....................................................................................................................... 16
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm............................................................................................... 16
3.2.2. Hóa chất sử dụng ..................................................................................................... 16
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................................. 16
3.2.4. Vi khuẩn dùng trong thí nghiệm.............................................................................. 17
3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 17
3.3.1. Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus).................................. 17
3.3.2. Định lượng Phyllanthin và Hypophyllanthin trong cao thô bằng HPLC ................ 20
3.3.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng (P.amarus) ............... 21

v


3.3.3.1 Chuẩn độ vi khuẩn ................................................................................................. 21
3.3.3.2 Thử tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng (P.amarus) ................... 22
3.3.3.3 Xác định MIC, MBC của cao thô Diệp hạ châu đắng (P.amarus) ..................... 23
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 26
4.1. Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) ...................................... 26
4.1.1. Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng (P. amarus) ................................. 26

4.1.2. Ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)....................................... 27
4.2. Định lượng Phyllanthin và Hypophyllanthin trong caothô bằng HPLC .................... 28
4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng(P. amarus) .................... 30
4.3.1. Thử tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng (P. amarus) ....................... 30
4.3.2. Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn cao thô ........................... 33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 35
5.1. Kết luận....................................................................................................................... 35
5.2. Kiến nghị .................................................................................................................... 35
Tài liệu tham khảo ............................................................................................................. 36
Phụ lục ............................................................................................................................... 40

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC: American Type Culture Collection
BHI: Brain Heat Infusion Broth
CFU: Clony – forming unit
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
DNA: Deoxyribo Nucleic Acid
HbsAg: Hepatitis B surface antigen
HBV: Hepatitis B Virus
HPLC: High-performance liquid chromatography
MBC: Minimum Bactericidal Concentration – Nồng độ diệt tối thiểu
MHA: Mueller Hinton Agar
MIC: Minimum inhibitory concentration – Nồng độ ức chế tối thiểu
NA: Nutrient Agar
NB: Nutrient Broth
TSA: Tryticase – Soy – Agar

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1 Pha loãng nồng độ cao thô Diệp hạ châu đắng trong môi trường MHA ........... 24
Bảng 3.2 Pha loãng nồng độ cao thô Diệp hạ châu đắng trong môi trường BHI ............. 24
Bảng 4.1 Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng qua hai lần chiết .................... 26
Bảng 4.2 Hàm lượng vật chất khô và ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng qua .................. 27
Bảng 4.3 Hàm lượng Phyllanthin và Hypophyllanthin trong cao thô ............................. 30
Bảng 4.4 Khả năng ức chế của cao thô Diệp hạ châu đắng .............................................. 31
Bảng 4.5 Giá trị MIC, MBC của cao Diệp hạ châu đắng trên môi trường BHI ............... 32

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1 Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) .................................................... 7
Hình 2.3 Cấu trúc của Phyllanthin ...................................................................................... 8
Hình 2.4 Cấu trúc của Hypophyllanthin ............................................................................. 9
Hình 2.5 Sơ đồ mô tả tổng quát các bộ phận của máy HPLC .......................................... 14
Hình 3.1 Sơ đồ qui trình chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng (P. amarus) ................... 19
Hình 3.2 Đường đi của dung môi trong hệ thống sắc ký .................................................. 21
Hình 3.3 Sơ đồ qui trình chuẩn độ vi khuẩn ..................................................................... 22
Hình 3.4 Quy trình xác định MIC cao thô Diệp hạ châu đắng ......................................... 25
Hình 4.1 Sắc ký đồ Phyllanthin và Hypophyllanthin lần chiết 1 ..................................... 28

Hình 4.2 Sắc ký đồ Phyllanthin và Hypophyllanthin lần chiết 2 ..................................... 29
Hình 4.3 B. subtilis ATCC ở MIC 3,125 mg/ml và MBC 12,5 mg/ml ............................ 32
Hình 4.4 S. tyhilurium ATCC ở MIC 3,125 mg/ml và MBC 12,5 mg/ml ........................ 32
Hình 4.5 S. aureus ATCC ở MIC 3,125 mg/ml và MBC 12,5 mg/ml ............................. 33
Hình 4.6 S. pyogenes ở MBC 12,5 mg/ml trên NA .......................................................... 33
Hình 4.7 Đối chứng dương (bên trái) và đối chứng âm (bên phải) .................................. 33

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, ngành bào chế dược phẩm đã góp phần sản xuất ra hơn hàng trăm loại
kháng sinh có mặt trên thị trường đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho người, động vật
(Nguyễn Thị Thanh và Hồ Huỳnh Quang Trí, 1995). Tuy kháng sinh tổng hợp có nhiều
ưu điểm nhưng nhược điểm của kháng sinh tổng hợp cũng không nhỏ như dễ lờn thuốc,
phụ thuộc vào thuốc, nhiều tác dụng phụ không mong muốn khác (Ngô Thế Hùng, 1985).
Bên cạnh đó, sự phát triển của khoa học ngày nay đã giúp các nhà khoa học phát hiện ra
nhiều tác dụng phụ có hại của kháng sinh tổng hợp hóa học. Từ đó, con người muốn trở
lại với tự nhiên, để phát hiện và sử dụng các cây cỏ có nguồn gốc tự nhiên. Hiện nay, xu
hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên đang được ưa chuộng vì
tính an toàn, có thể sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ khi sử dụng thuốc tổng hợp hóa
học: hạn chế hiện tượng lờn thuốc, kháng kháng sinh (Hoàng Hiệp, 2011). Các dược liệu
có công dụng trị liệu như Actiso (Cynara scolymus), Hoàng bá (Phellodendron amurense
Rupr), Vọng cách (Premma integrifolia L.), Nhân trần (Adenosma glutinosum), Diệp hạ
châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.,). Trong đó, cây Diệp hạ châu đắng
(Phyllanthus amarus) chứa nhiều chất chống oxy hóa thuộc nhóm xanthones có tác dụng
ức chế mạnh quá trình peroxyd hóa lipid ở tế bào gan, do đó hạn chế hiện tượng viêm và
hoại tử gan, bảo vệ và phục hồi tế bào gan (Hoàng Hiệp 2011). Ngoài ra, Diệp hạ châu

đắng (Phyllanthus amarus) có tác dụng kháng khuẩn trên nhiều loại vi khuẩn
(Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella flexerneri, Shigella shiga,
Bacillus subtilis,…) (Akinjogunla và ctv, 2010; ETTA và ctv, 2011), chống nhiễm trùng
máu. Từ những vấn đề thực tiễn nêu trên và từ những công dụng của cây Diệp hạ châu
đắng (Phyllanthus amarus), được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ sinh học – Bộ môn
Nội dược, Khoa Chăn nuôi thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, khóa luận
: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
trên một số nhóm vi khuẩn Gram âm và Gram dương” được nghiên cứu và thực hiện.
1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Hiệu chỉnh quy trình chiết suất cao thô Diệp hạ châu đắng (Phylanthus amarus)
Sử dụng HPLC để xác định hàm lượng Phyllathin, Hypophyllathin trong cao thô Diệp
hạ châu đắng
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng
1.3. Nội dung thực hiện
Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
Định hàm lượng Phyllathin và Hypophyllathin trong cao thô bằng HPLC
Thử tính kháng khuẩn, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: Minimum Inhibitory
Concentration) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC: Minimum Bactericidal
Concentration) của cao thô Diệp hạ châu đắng.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Sơ lược về các nhóm vi khuẩn liên quan đến nghiên cứu
2.1.1. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dương, kị khí tuỳ tiện, không di
động, không sinh bào tử và có vỏ nhầy. Theo hội nghị quốc tế về xếp loại Micrococcus thì
giống Staphylococcus bao gồm 3 loài Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
và Staphylococcus saphilophyticus. Staphylococcus aureus nuôi cấy trên môi trường
thạch trong điều kiện kỵ khí, nhiệt độ thích hợp 37 oC, chịu được nhiệt độ từ 4 – 40 oC, ở
môi trường lỏng, sau khi nuôi cấy 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ,
tạo mùi thối và có nhiều hạt lắng xuống đáy. Trong môi trường đặc, S. aureus tạo khuẩn
lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có màu vàng, có thể phát triển tốt ở môi trường tổng
hợp đặc biệt đặc biệt ở môi trường thạch máu hoặc huyết thanh. Staphylococcus
aureus sinh beta hemolysis trong môi trường thạch máu, indol (+), NH3 (+), thủy phân
gelatine (+), đông huyết tương (Wladimir và ctv, 2000; Nguyễn Thị Chính và Trương Thị
Hòa, 2005). Staphylococcus aureus kháng với penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được
men penicillinase, kháng MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus) do tạo ra
một loại protein gắn vào thụ thể hoạt động của methicillin, tỉ lệ S. aureus kháng
methicillin lên trên 50 %. S. aureus kháng thuốc cao với penicillin (89,4 %) (Frank và
Henry, 2009), tertracycline (82,4 %), trimethoprin + sulfamethazin (80,6 %), chloramphe
– nicol (64,8 %), erythomycin (38,4 %) và methicillin (25,9 %). Các chủng
Staphyloccoccus aureus có tỷ lệ đề kháng cao với ampicillin, co-trimoxazol,
erythromycin, lincomycin (từ 50 – 80 %) và những kháng sinh có hoạt lực mạnh như
ceftriazon, ciprofloxacin thì bắt đầu bị vi khuẩn này kháng lại (Nguyễn Bữu Châu, 2007).
Staphylococcus aureus gây bệnh đi kèm với các triệu chứng sốt, nổi ban, nôn ói, tiêu
chảy, hạ huyết áp, tiến triển nhanh suy đa cơ quan, luôn có biểu hiện ở gan với các triệu
chứng vàng da, tăng men gan (Phạm Thị Thu Thủy, 2005).

3


2.1.2. Bacillus subtilis
Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872. Bacillus
subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước 3 – 5 × 0,6 µm, có khả năng sinh bào tử và

là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi. Hệ enzyme của Bacillus subtilis
rất phong phú và đa dạng. Bacillus subtilis được hoạt hóa trên môi trường với thành phần:
NaCl 0,5 %, pepton 1 %, cao nấm 1 %, cao thịt 0,3 %, agar 0,7 %, pH = 7, nhiệt độ 30 –
39 oC, nhưng phát triển tốt ở 37 oC (Trần Thị Ánh Nguyệt, 2010). Các đặc tính sinh hóa
của Bacillus subtilis: hoạt tính catalase, phản ứng Methyl Red (+), phản ứng Voges
Proskauer (+), khử Nitrate (+), phân giải tinh bột (+), có khả năng tiết cellulase, amylase,
và caseinase. Bacillus subtilis được ứng dụng trong việc sử dụng để sản xuất probiotic vì
chúng có thể tiết ra các enzyme ngoại bào giúp cải thiện tiêu hóa, ứng dụng trong xử lý
nước thải, sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống, công nghệ lên men, sinh học phân
tử, y – dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phẩm, thu hồi bạc từ các phế liệu (Ngô
Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2009). Bacillus subtilis có khả năng kháng kanamycin,
phleomycin

(Zofia,

2004),

streptomycin,

ampicillin,

penicillin,

erythromycin,

amoxycillin, bacitracin (Hemalatha và Shanthi, 2010).
2.1.3. Streptococcus pyogenes
Streptococcus pyogenes (vi khuẩn liên cầu nhóm A) thuộc giống Streptococcus, dựa
vào giải mã trình tự protein M, Streptococcus pyogenes phân loại hơn 100 loài.
Streptococcus pyogenes là vi khuẩn Gram dương, không di động, kích thước 0,6 – 1 µm,

vi khuẩn yếm khí tùy nghi, phát triển trong môi trường chứa máu, có khả năng làm tan
huyết, phát triển tốt trong điều kiện môi trường 37 – 39 oC. Streptococcus pyogenes được
nuôi cấy trong môi trường thạch có chứa máu, ủ qua đêm ở 37 oC vi khuẩn phát triển sẽ
làm tan huyết tạo vòng trong suốt xung quanh (Tara, 2010). Streptococcus pyogenes
kháng macrolid, sulfornamid, streptogramin B với tỷ lệ 70 %; clindamycin (58 %) và
erythromycin (56 %) (Nevial, 2009). Streptococcus pyogenes là một trong số các chủng vi
khuẩn gây bệnh trên người: ban đỏ, viêm Amidan, bệnh chốc lở, viêm quầng, sốt thấp
khớp, gây bệnh ở phụ nữ thời kỳ sinh (Tara, 2010).

4


2.1.4. Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium là một trong số các serotype thuộc giống Salmonella.
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, được Salmon và Smith tìm ra năm 1885, lấy tên
Salmon đặt tên cho vi khuẩn. Salmonella typhimurium là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí
tuỳ nghi, có tiêm mao di động, không tạo bào tử, có kích thước khoảng 2 – 3 × 0,4 – 0,6
μm (Võ Thị Hoàng Mi, 2005). Salmonella typhimurium phát triển tốt ở nhiệt độ 6 – 42 oC,
nhiệt độ thích hợp 35 – 37 oC, pH = 6 – 9, thích hợp nhất ở pH = 7,2 và được nuôi cấy dễ
dàng trong môi trường dinh dưỡng đơn giản, đầy đủ chất dinh dưỡng. Salmonella
typhimurium kháng các loại kháng sinh với tỉ lệ cao trên 50 % đối với: tetracycline (84,7
%), sulfonamide (88,1 %), chloramfenicol (83 %), ampicilline (86,4 %), streptomycine
(91,5 %) (Phùng Quốc Chương, 2002; Sisak và ctv, 2006). Salmonella typhimurium gây
các bệnh liên quan đến gan viêm gan cấp tính, gan to nhẹ, Bilirubin tăng nhẹ đến trung
bình (16 % các trường hợp), men gan tăng trong 60 % các trường hợp (Nguyễn Thị
Nguyệt và ctv, 2010).
2.1.5. Shigella flexerneri
Shigella flexerneri thuộc giống Shigella, họ Enterobacteriaceae, dựa vào đặc điểm
kháng nguyên thân O và các đặc tính sinh hóa người ta chia Shigella flexerneri ra làm 4
nhóm chính: A, B, C, D; ngoài ra còn có kháng nguyên K; mỗi nhóm có nhiều kiểu huyết

thanh. Shigella flexerneri có dạng hình que thẳng dài, kích thước từ 1 – 3 µm, không có
lông, không di động, không sinh bào tử, Gram âm, vi khuẩn hiếu kị khí tùy tiện nhưng
phát triển rất tốt trong điều kiện kị khí. Shigella flexerneri được nuôi cấy trong điều kiện
hiếu khí hoặc kị khí, có thể phát triển trong điều kiện nhiệt độ từ 8 – 40 oC, pH = 6 – 8,8
và phát triển tốt nhất trong điều kiện 37 oC, pH = 7 – 8. Shigella flexerneri gây nhiễm
trùng đường ruột dẫn đến viêm gan ứ mật, các biến đổi mô học ở gan bao gồm: thấm
nhiễm tế bào đa nhân ở cửa gan và xung quanh bị hoại tử và ứ mật (Phạm Thị Thu Thủy,
2005). Shigella flexerneri có khả năng kháng nalidixic acid (59,6 %), tetracycline (78%),
ampicillin (74%), cotrimoxazole (71 %), và chloramphenicol (69 %) (Oelia và ctv, 2005).

5


2.2. Giới thiệu về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
2.2.1. Vị trí phân loại
Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Phyllanthus thuộc họ thầu dầu. Tên khoa học:
Phyllanthus amarus. Tên thường gọi: cây chó đẻ, diệp hạ châu, rút đất, cam kiềm, trân
châu thảo, diệp hòe thái, lào nha châu.
Vị trí phân loại:
-

Ngành Thực vật hạt kín (Basal angiosperms)
-

Lớp Hai lá mầm (Paleodicots)
-

Bộ Sơ Ri (Malpighiales)
-

Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae)
-

Chi Phyllanthus
-

Loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn., (Đỗ Tất Lợi, 2004)

2.2.2. Hình thái và phân bố
Cây thảo, sống quanh năm, cao 20 – 30 cm, có thể lên đến 60 – 70 cm, thân nhẵn, có
màu xanh. Lá đơn, mọc so le, xếp thành 2 dãy, mỗi cành giống như một lá kép lông chim
gồm nhiều lá. Phiến lá hình bầu dục đầu tròn có mũi nhọn, màu xanh lục, đậm ở mặt trên,
nhạt ở mặt dưới. Hoa mọc ở kẽ lá, quả nang, hình cầu, hơi dẹt, mọc rủ xuống ở dưới lá,
mùa hoa: tháng 4 – 6, mùa quả: tháng 7 – 9. Chi Phyllanthus L. có nhiều loài phân bố
chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, chi này có khoảng 40 loài, trong
đó đáng chú ý là hai loài P. urinaria và P. amarus có hình dáng gần giống nhau nhưng P.
amarus thân có màu xanh, quả nang nhẵn, có tên gọi là Diệp hạ châu đắng, còn P.
urinaria thân có màu đỏ, quả nang có gai, có tên gọi là diệp hạ châu ngọt hay cây chó đẻ
răng cưa.Cả hai loài này mọc rải rác ở khắp nơi, phân bố khắp các vùng nhiệt đới. Ở Việt
Nam, cây mọc hoang trên đất ẩm, ở khắp các địa phương trừ vùng núi cao, lạnh. Diệp hạ
châu đắng là cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng, thường mọc lẫn trong các bầu cỏ,
ruộng cao, nương rẫy và vườn nhà,... Cây non mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng
nhanh vào mùa hè và tàn lụi vào giữa mùa thu nên cây thường được thu hái vào cuối mùa

6


hè vì trong thời gian này cây đã sinh trưởng, phát triển đầy đủ và chứa lượng hoạt chất
cao nhất (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004).

Hình 2.1 Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus)
(a) Cây Diệp hạ châu đắng, (b) Quả, (c) Thân, (d) Rễ
2.2.3. Tính chất
Vị đắng, tính lạnh, lợi tiểu, tiêu độc, tán ứ, thông huyết và sát trùng (Đỗ Huy Bích và
ctv, 2004). Bộ phận dùng là toàn cây, rửa sạch dùng tươi hay phơi sấy khô.
7


2.2.4. Thành phần hóa học
Theo Đỗ Huy Bích và ctv (2004), Phyllanthus chứa nhiều chất thuộc các nhóm hóa học:
- Triterpen (Stigmasterol, stigmasterol – 3 – 0 – beta glucosid, beta – sitosterol, beta –
sitosterol glucosid, lup – 20 – en – 3 beta – ol), flavonoid (Kaempferol, quercetin, rutin),
tanin (Acid elagic, acid 3, 3’, 4 – tri – methyl elagic, acid galic), phenol, acid hữu cơ
(Acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanoic), lignan (Phyllanthin, Hypophyllanthin)
- Các thành phần khác: N - octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, triaontanol
phylanthurinol acton.
Lá diệp hạ châu đắng chứa chất đắng không có quinin hoặc alkaloid, lá khô chứa các
chất đắng Hypophyllanthin (0,05 %) và Phyllanthin (0,35 %), các chất này gây độc đối
với cá và ếch. Trong cây có niranthin, nirtetralin, phylteralin, quercetin, niruroidin,
isobubialin, epibubialin, isoquercitrin, astragalin, rutin và các acid hữu cơ (ascorbic,
geraniinic, amariinic, phenolic và repandusinic).
2.2.4.1 Phyllanthin
Công thức hóa học: C24H34O6
Trọng lượng phân tử: 418,52316 g/mol

Hình 2.3 Cấu trúc của Phyllanthin
(Vandana và ctv, 2008)

8

Phyllanthin cho tinh thể hình kim khi kết tinh trong dầu hỏa, tan nhiều trong hexan,
etylacetat, methanol, sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F254 Merck, dung môi động
hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H2SO4 10 % trong methanol khi hơ nóng hiện rõ
một vết tròn có màu xanh dương nhạt, Rf = 0,35 (Nguyễn Thanh Hồng và ctv, 2002).
2.2.4.2 Hypophyllanthin
Công thức hóa học: C24H30O7
Trọng lượng phân tử: 430,4908 g/mol

Hình 2.4 Cấu trúc của Hypophyllanthin
(Vandana và ctv, 2008)
Hypophyllanthin kết tinh trong dầu hỏa hoặc hexan được tinh thể hình kim dài, tan
nhiều trong hexan, etylacetat. Sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F254 Merck, dung môi
động hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H2SO4 10 % trong methanol, khi hơ nóng
hiện rõ một vết tròn, có màu xanh dương đậm. Rf = 0,4 (Nguyễn Thanh Hồng và ctv,
2002).
2.2.5. Tác dụng dược lý
Diệp hạ châu đắng đã được chứng minh có rất nhiều tác dụng dược lý. Theo Đỗ Huy
Bích và ctv (2004), Diệp hạ châu đắng có tác dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu
hóa do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ
9


đường huyết (Đỗ Huy Bích và ctv, 2004). Bên cạnh đó, Diệp hạ châu đắng còn được sử
dụng trong điều trị tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa do làm giảm nhu động ruột, có tác dụng
lợi tiểu và điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết
Nước sắc của Diệp hạ châu đắng có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn Gram âm và
Gram dương như Escherichia coli (Akinjogunla và ctv, 2010), Staphylococcus aureus
(ETTA và ctv, 2011) , Salmonella typhi (Flora và Folasade, 2008), Shigella flexerneri,
Shigella shiga, Baccillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. (Adegoke và

ctv, 2010).... Chất kháng khuẩn tan nhiều trong ether dầu hỏa, ether ethylic, methanol
(Nguyễn Thị Hồng và ctv, 2002). Phân đoạn chiết với butanol có hoạt tính bảo vệ gan cao
nhất, liều uống 50 mg/kg P có tác dụng bảo vệ 35 – 85 %, phân đoạn chiết với nước có
tác dụng bảo vệ gan nhẹ 20 – 40 %.
Từ Tích Tổ (2008) cho rằng trong Diệp hạ châu đắng có các thành phần: flavonoid,
alkaloid và các hợp chất phyllanthin, hypophyllathin, niranthin, phylteralin có tác dụng ức
chế mạnh virus gây viêm gan (HBV). Diệp hạ châu đắng ức chế virus viên gan thông qua
việc ức chế enzyme DNA polymerase của HBV từ đó ức chế sự sao chép tế bào của virus
viêm gan, làm cho virus không nhân lên được và bị đào thải do không bám vào được
DNA, làm giảm hoạt độ của HBsAg và anti-HBs, giúp phục hồi enzyme transminase từ
50 – 97 %, Bilirubin trở về bình thường (trích dẫn bởi Trần Thị Nhã Thi, 2011). Bên cạnh
đó, Phyllanthin và Hypophyllanthin còn có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột cống chống
tính độc hại tế bào gây bởi carbon tetrachlorid và galactosamin. Triterpentriacontanol
trong Diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan chống lại tính độc hại tế bào gây bởi
galactosamin. Acid galic chứa trong cây có tác dụng kháng khuẩn yếu nhưng phenolic và
flavonoid có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh hơn (Đỗ Huy Bích và ctv 2004).
Vậy, diệp hạ châu đắng có tác dụng dược lý trên hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu, hệ sinh dục…
nhưng tác động rõ rệt nhất là trên gan. Trong đề tài này, nghiên cứu được tiến hành chủ
yếu dựa trên hoạt tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng để từ đó xác định được
giá trị nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao thô đã điều chế
được.

10


2.3. Sơ lược về chiết suất các hợp chất thiên nhiên
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), chiết suất là phương pháp dùng một dung môi
(đơn hay hỗn hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên
cứu. Phương pháp cổ điển li trích một hợp chất thiên nhiên là dùng một dãy dung môi bắt
đầu từ không phân cực đến phân cực mạnh để li trích, phân đoạn các hợp chất ra khỏi hợp

chất thiên nhiên. Cách li trích thông dụng là li trích nóng bằng máy li trích liên tục hoặc li
trích hồi lưu. Sau mỗi lần li trích với một loại dung môi cần làm khô hợp chất thiên nhiên
rồi mới tiếp tục li trích với loại dung môi tiếp theo. Mỗi phân đoạn li trích, cất thu hồi
dung môi và tiến hành phân tích riêng.
Nguyên tắc chiết suất: phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi,
dụng cụ chiết và cách chiết. Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại
dung môi. Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thể dự
đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn li trích.
Dung môi để chiết suất các hợp chất: tính trung tính, không độc, không quá dễ gây
cháy, hòa tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi tách chiết dung môi đó có thể được loại
bỏ dễ dàng, cần tránh các dung môi độc như benzen hoặc dễ cháy như dietyl eter do có
nhiệt độ sôi thấp. Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như
hydrocacbon (hexan, toluen), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetat (etyl, butyl).
Các dung môi này tương đối rẻ tiền, có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối cao so
với nước.
Các phương pháp chiết suất hợp chất thiên nhiên: có hai phương pháp thường sử dụng
để chiết suất là chiết ở nhiệt độ thường (chiết lạnh) và chiết nóng, mỗi phương pháp chiết
có dung môi và thiết bị chiết khác nhau. Phương pháp chiết lạnh là phương pháp chiết ở
nhiệt độ phòng (27 – 30 oC) trong thời gian 10 – 15 ngày và được áp dụng với đa số dược
liệu. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, không cần máy móc phức tạp và thường
được dùng trong điều chế cao thô do hạn chế được tác dụng của nhiệt độ tới hoạt chất
trong dược liệu. Khác với phương pháp chiết lạnh, phương pháp chiết nóng là phương
pháp chiết ở nhiệt độ 60 – 100 oC trong thời gian 7 – 10 ngày và thường áp dụng cho các

11


dược liệu có cấu tạo rắn chắc, khó chiết xuất và có khả năng chịu nhiệt (Phạm Ngọc Bùng
và Nguyễn Thị Nga, 2004).
Chiết suất hợp chất trong Diệp hạ châu đắng: khi cần chiết lấy toàn bộ hoạt chất trong

Diệp hạ châu đắng thì dạng thuốc điều chế thích hợp là cao thô. Cao thô có đặc điểm là đã
loại bỏ được một phần hoặc hoàn toàn các tạp chất (chất béo, nhựa, protein…) và tỷ lệ
hoạt chất trong cao thô có thể bằng (cao lỏng) hoặc thường cao hơn (cao đặc, cao khô) tỷ
lệ hoạt chất trong Diệp hạ châu đắng (Phạm Ngọc Bùng và ctv, 2004).
2.4. Sơ lược về sắc ký
2.4.1. Đại cương về sắc ký
Sắc ký là phương pháp vật lý dùng để tách hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng
thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối
với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha tĩnh và pha động). Việc tách hai pha nào đó
ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc vào hệ số phân chia. Bất kỳ một hợp
chất nào khi đặt vào một hệ thống gồm có hai pha, lúc đạt đến trạng thái cân bằng hợp
chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ nhất định, tỉ lệ này thay đổi tùy
thuộc vào các tính chất động học của hợp chất và cả hai pha. Cũng tương tự một hỗn hợp
gồm nhiều loại hợp chất khác nhau khi được đặt vào hệ thống có hai pha, mỗi loại hợp
chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với mỗi pha, vì thế sẽ có tương tác mạnh/ yếu khác nhau
đối với pha tĩnh. Kết quả là mỗi loại hợp chất sẽ di chuyển ngang pha tĩnh với vận tốc
khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại hợp chất (Nguyễn Kim Phi
Phụng, 2007).
2.4.2. Sắc ký lỏng cao áp (HPLC- Hight-Performance Liquid Chromatography)
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007): sắc lý lỏng cao áp, hay sắc ký lỏng hiệu quả cao
(HPLC- Hight-Performance Liquid Chromatography). HPLC là chữ viết tắt của bốn chữ
cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight – Performance
Liquid Chromatography) mà trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High
Pressure Liquid Chromatography). HPLC phát triển rất nhanh từ năm 1969. HPLC có khả

12


năng phân tách các hợp chất đặc thù như: các hợp chất cao phân tử và ion, các hợp chất tự
nhiên không bền, các hợp chất kém bền nhiệt, các hợp chất dễ nổ.

Khái niệm: HPLC là một phương pháp phân tách trong đó pha động là chất lỏng, pha
tĩnh là chất rắn được chứa trong một cột, chất rắn này đã được phân chia dưới dạng tiểu
phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi
bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế
hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử).
Các bộ phận của máy HPLC:
Bình chứa dung môi giải ly cột: hệ dung môi giải ly cột được hút ra từ hai bình chứa
dung môi. Bình được làm bằng chất liệu trơ, thường là bằng thủy tinh. Bình luôn luôn có
một cái nắp bảo vệ để chống không cho bụi rơi vào trong bình, nắp có lỗ hở để bình luôn
thông với khí trời. Trong bình, có một ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc ký, ở đầu
này có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn
ở dưới mặt thoáng của chất lỏng. Các nhà sản xuất có những bình chuyên dùng để cho nút
lọc bằng kim loại nói trên lọt vào một lỗ giếng, bảo đảm đầu ống luôn chạm sát đáy bình,
có thể sử dụng đến giọt dung môi cuối cùng trong bình. Trước khi lắp một bình dung môi
vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần không khí đã hoà tan vào dung môi trước đó,
gọi là khử bọt khí (degassing), bởi vì nếu còn lẫn những bọt không khí vào trong luồng
dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt động kém hiệu quả.
Dung môi dùng cho HPLC: máy HPLC thường sử dụng hồn hợp hai loại dung môi, tuy
vậy cũng có những nghiên cứu sử dụng bốn loại dung môi, trong trường hợp này, cần có
thêm thiết bị phụ trợ thích hợp có bán sẵn. Tỉ lệ của mỗi dung môi trong hỗn hợp được
điều khiển bằng hệ thống điều khiển. Máy bơm hút hai dung môi trong hai bình đưa vào
hộp phối trộn. Tất cả các dung môi phải có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn HPLC không
có lẫn bụi bẩn, trước khi gắn vào máy HPLC dung môi phải được khử không khí.
Máy bơm: loại máy bơm của HPLC là loại bơm đặt biệt với áp suất rất cao lên đến
7000 psi (48,3 MPa). Bơm được cấu tạo bằng chất liệu để chịu đựng được dung môi hữu
cơ.

13

Cột sắc kí: cột HPLC được làm bằng thép không gỉ, thường dài 10 – 25 cm và có
đường kính bên trong 2,1 – 4,6 mm cột được nhồi thật chặt bởi những hạt nhỏ.
Bộ phận trích mẫu vào máy: máy HPLC có hệ thống trích mẫu đặc biệt: ống chứa mẫu
giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác
nhau. Mẫu khảo sát được tiêm vào máy nhờ một kim tiêm.
Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC: tăng chiều dài của cột, giảm
đường kính của cột, giảm lưu lượng pha động, pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất.
giảm thể tích bơm mẫu, lựa chọn pha tĩnh sạch hơn, lựa chọn pha động tinh khiết hơn, sử
dụng áp suất ổn định hơn
Van nhiều
cổng

Bình chứa dung
môi

Van 2 cổng

Cột bảo vệ

Hộp trộn
dung môi

Cột sắc ký
Máy bơm
Đầu dò

Hệ thống
điều khiển

Máy in

Hình 2.5 Sơ đồ mô tả tổng quát các bộ phận của máy HPLC
( )
2.5. Sơ lược về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn
Một số phương pháp thường được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của một
số hợp chất như: phương pháp khuếch tán trên thạch (Antibiotic Disc Diffusion Method)
và phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng. Trong đó phương pháp khuếch tán trên
thạch thông dụng hơn (Attur và ctv, 2005)
14