KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN Pseudomonas SINH LIPASE TRONG MỘT SỐ NGUỒN NƢỚC THẢI CHỨA LIPID

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN Pseudomonas
SINH LIPASE TRONG MỘT SỐ NGUỒN
NƢỚC THẢI CHỨA LIPID

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

ĐẶNG THỊ THANH TUYỀN

Niên khóa:

2008 - 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN VI KHUẨN Pseudomonas
SINH LIPASE TRONG MỘT SỐ NGUỒN

NƢỚC THẢI CHỨA LIPID

Hƣớng dẫn khoa học
ThS. TRẦN NGỌC HÙNG

Sinh viên thực hiện
ĐẶNG THỊ THANH TUYỀN

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN


Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng
dạy đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt bốn năm qua.


Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

ThS. Trần Ngọc Hùng đã tận tình hƣớng dẫn và chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức
quý báu trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Ban Giám đốc cùng các anh chị trong phòng thí nghiệm Công ty TNHH Gia
Tƣờng đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp


Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè, tập thể lớp Công nghệ sinh học 34

đã luôn ở bên tôi, chia sẽ và động viên trong suốt thời gian qua.


Con thành kính ghi ơn cha mẹ và tất cả những ngƣời thân trong gia đình

luôn là nguồn động viên và khích lệ to lớn cho con trong thời gian học tập.

Sinh viên
Đặng Thị Thanh Tuyền

i


TÓM TẮT
Đề tài: “Khảo sát sự hiện diện vi khuẩn Pseudomonas sinh lipase trong một số
nguồn nƣớc thải chứa lipid” nhằm mục đích thu thập các chủng vi sinh vật sinh lipase
có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp tìm ra nguồn thu nhận lipase có hoạt tính cao, từ
đó có những ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp và xử lý môi trƣờng.
Từ 2 mẫu nƣớc thải lò giết mổ gia súc, 1 mẫu nƣớc thải nhà máy chế biến cá và 2
mẫu nƣớc thải từ kênh dẫn nƣớc thải sinh hoạt, tiến hành làm giàu và dùng để phân lập
các chủng vi khuẩn mục tiêu có khả năng phân giải mỡ trên các môi trƣờng đặc trƣng
nhƣ môi trƣờng Seliber và môi trƣờng Ran chứa cơ chất là mỡ bò nhƣ nguồn carbon
duy nhất, kết hợp với việc kiểm tra đặc tính hình thái, sinh hóa đặc trƣng cho chủng
Pseudomonas nhằm thu đƣợc các chủng có đặc tính sinh hóa tƣơng tự Pseudomonas.
Kết quả đã thu đƣợc 21 trong tổng số 48 chủng có đặc tính sinh hóa tƣơng tự
Pseudomonas. Bao gồm 9 chủng thu đƣợc từ 2 nguồn nƣớc thải lò mổ; 5 chủng từ
nƣớc thải nhà máy chế biến cá da trơn và 7 chủng thu đƣợc từ 2 nguồn nƣớc thải kênh
rạch tự nhiên. Trong số đó, có 11 chủng đƣợc phân lập trên môi trƣờng Ran và 10

chủng đƣợc phân lập trên môi trƣờng Seliber. Cuối cùng tiến hành định tính khả năng
sinh lipase của các chủng Pseudomonas thu đƣợc trên môi trƣờng LB chứa Tween 80.
Trong đó, nhận thấy có 16 chủng có khả năng sinh lipase khi nuôi cấy trên môi trƣờng
LB chứa Tween 80 1%. Trong đó, các chủng S3, S8, R7 và R8 đƣợc phân lập từ các
mẫu nƣớc thải lò giết mổ gia súc cho thấy vòng phân giải Tween 80 lớn nhất sau 7
ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.

ii


SUMMARY
The study entitled: “Survey of the presence of Pseudomonas producing lipase
biosynthesis in some wastewater containing lipid” was carried out at Gia Tuong
limited liability
company C2 area, D block, Tsunami industrial park, Binh Duong province to collect
of microorganisms producing lipase have important implications in helping to find
sources of receiving highly active lipase, which have applications in many fields of
industry and environmental treatment.
Two wastewater samples from cattle slaughterhouses, one from fish processing
plant and two wastewater samples from sewage canals, were enriched for isolation of
strains of bacteria on Seliber medium and Ran medium containing beef fat substances
such as sole carbon source, combined with checking morphological features with
characteristics similar biochemical Pseudomonas.
Twenty one out of 48 strains with biochemical characteristics similar to
Pseudomonas were obtained, which were 9 strains from two sources slaughterhouse
wastewater, 5 strains from wastewater fish processing plant and 7 strains obtained
from two sources of natural sewage canals. Eleven of these isolated strains, were
isolated on Ran medium and 10 strains were isolated on Seliber medium. Finally
qualitate of capacity of lipase biosynthesis of Pseudomonas was performed using LB
medium containing 1% Tween 80. By which, 16 strains were found. In particular,

strains S3, S8, R7 and R8 were isolated from slaughterhouse wastewater samples
showed the biggest diameter resolution of Tween 80 after 7 days of culture at room
temperature.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
TÓM TẮT KHÓA LUẬN .............................................................................................. ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài .....................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Vi khuẩn Pseudomonas ............................................................................................3
2.1.1. Lịch sử phát hiện. ..................................................................................................3
2.1.2. Phân loại ...............................................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas..........................................................................4
2.1.3.1. Hình thái .............................................................................................................4
2.1.3.2. Sinh lý .................................................................................................................4
2.1.3.3. Sinh hóa ..............................................................................................................5
2.1.4. Cách phân lập Pseudomonas .................................................................................6
2.1.5. Tác hại của Pseudomonas .....................................................................................7
2.1.5.1 Đối với thực vật ...................................................................................................7
2.1.5.2 Đối với động vật ..................................................................................................8

2.1.5.3 Đối với con ngƣời ................................................................................................8
2.1.6. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas ..................................................................8
2.1.7. Cơ chế tổng hợp lipase của Pseudomonas ............................................................9
2.2. Enzyme lipase .........................................................................................................10
2.2.1. Giới thiệu enzyme lipase .....................................................................................10
2.2.2. Nguồn thu nhận lipase .........................................................................................11
2.2.3. Tính chất đặc hiệu của lipase từ vi sinh vật.........................................................11
2.2.4. Ứng dụng của lipase ............................................................................................12
2.3. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .................................................................13
2.3.1 Trong nƣớc ...........................................................................................................13
2.3.1 Một số nghiên cứu ngoài nƣớc .............................................................................13
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...............................................................13
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................13
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................13
3.2.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm .................................................................................13
3.2.2 Vi sinh vật đối chứng...........................................................................................14
iv


3.2.3 Thiết bị, hóa chất và môi trƣờng .........................................................................13
3.2.3.1. Thiết bị và dụng cụ ...........................................................................................13
3.2.3.2. Hóa chất ...........................................................................................................13
3.2.3.3. Môi trƣờng ........................................................................................................13
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................14
3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ...........................................................................................14
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải lipid ...............................14
3.3.3 Phƣơng pháp kiểm tra sinh hóa của chủng Pseudomonas ...................................15
3.3.4 Phƣơng pháp định tính khả năng sinh lipase trên môi trƣờng Tween 80. ............17
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................19
4.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật phân giải lipid ...........................................19

4.2 Kết quả kiểm tra sinh hóa ........................................................................................20
4.4 Kết quả định tính lại khả năng sinh lipase ...............................................................26
4.5 Một số hình ảnh trong quá trình thí nghiệm ............................................................30
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................27
5.1 Kết luận...................................................................................................................27
5.2 Đề nghị ...................................................................................................................27
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................28
PHỤ LỤC ......................................................................................................................28

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS

Acquired Immune Deficiency Syndrome

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic Acid

G+C

Guanine + Cytosine

H2 O2

Hydrogen peroxide

KIA

Kligler Iron Agar

LB

Luria Bertani

MR

Methyl Red

NA

Nutrient Agar

O/F

Oxydation/fermention

RNA

Ribonucleic Acid

TTC

Triphenyl Tetrazolium Chloride

UV

Ultra Violet

KIA

Kriglers Iron Agar

USA

United States of America

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Ứng dụng của lipase trong công nghiệp ..................................................... 12
Bảng 3.1 Một số thử nghiệm riêng sau khi xác định Pseudomonas .......................... 17
Bảng 4.1 Đặc tính các khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng Seliber .......................... 19
Bảng 4.2 Đặc tính các khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng Ran ............................... 20
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra sinh hóa các chủng phân lập
trên môi trƣờng Seliber ............................................................................................... 22
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra sinh hóa các chủng phân lập
trên môi trƣờng Ran.................................................................................................... 22
Bảng 4.5 Một số thử nghiệm sinh hóa khác trên
các chủng Pseudomonas phân lập .............................................................................. 25
Bảng 4.6 Khả năng sinh tổng hợp lipase của các chủng Pseudomonas
trên môi trƣờng LB có chứa 1% Tween 80 ................................................................ 28

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 2.1 Sự thủy phân hoặc tổng hợp cơ chất triacylglycerol
xúc tác bởi enzyme lipase ............................................................................................. 11
Hình 4.1 Kết quả kiểm tra sinh hóa ............................................................................. 23
Hình 4.2 Kết quả thử nghiệm riêng ............................................................................. 25
Hình 4.3 Kết quả định tính trên Tween 80 .................................................................. 27
Sơ đồ 3.1 Phƣơng pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải lipid ...................... 16
Sơ đồ 3.2 Các bƣớc xác định Pseudomonas bằng các thử nghiệm sinh hóa ............... 17

viii


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Môi trƣờng nƣớc ở nhiều đô thị, khu công nghiệp và làng nghề ngày càng bị ô
nhiễm nặng bởi nguồn nƣớc thải sản xuất và sinh hoạt. Nƣớc thải là một hệ dị thể
phức tạp, bao gồm rất nhiều chất tồn tại dƣới các trạng thái khác nhau: protein,
hydratcarbon, mỡ, rác thải rắn, các vi sinh vật, các cặn lơ lửng không hòa tan, các chất
vô cơ độc hại… Mỗi thành phần gây nên những khó khăn khác nhau trong việc xử lý
nƣớc thải. Trong đó, nguồn nƣớc thải giàu lipid từ các cơ sở chế biến thủy sản, nhà
mày chế biến dầu thực vật, nhà hàng, quán ăn… đang là mối quan tâm không nhỏ
trong công tác bảo vệ môi trƣờng nƣớc, xử lý nƣớc thải.
Bản chất lipid không hòa tan trong nƣớc, điều này đã gây không ít khó khăn
trong quá trình xử lý nƣớc thải. Phƣơng pháp hóa học dựa trên cơ sở các phản ứng hóa
học diễn ra giữa chất ô nhiễm và hóa chất thêm vào, để biến đổi tạo thành các chất

khác dƣới dạng cặn bã hoặc chất hòa tan nhƣng không gây độc cho môi trƣờng. Mặc
dù phƣơng pháp hóa học cho hiệu quả xử lý cao, thƣờng đƣợc sử dụng trong hệ thống
xử lý nƣớc khép kín. Nhƣng chi phí vận hành cao và không thích hợp cho các hệ
thống xử lý quy mô lớn.
Trong khi đó, phƣơng pháp sinh học dựa trên cơ sở sử dụng khả năng hoạt động
của các vi sinh vật có ích để phân hủy các chất hữu cơ, các loại lipid trong nƣớc thải
đang thu hút đƣợc nhiều sự quan tâm. Phƣơng pháp này khả dụng nhất không chỉ đối
với quy mô xử lý công nghiệp mà còn có ý nghĩa đối với quá trình làm sạch tự nhiên
của nƣớc (www.vea.gov.vn)
Từ thực tế này việc nghiên cứu ra những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải
mạnh mẽ nguồn lipid phế thải nhờ hệ enzyme lipase đang là hƣớng đi chung của
nhiều nhà khoa học trên thế giới. Pseudomonas là một trong những loài thích hợp nhất
nhờ khả năng phân giải nhiều cơ chất và sinh tổng hợp lipase mạnh của nhiều chủng
Pseudomonas khác nhau. Việc tiến hành đề tài: Khảo sát sự hiện diện vi khuẩn
Pseudomonas sinh lipase trong một số nguồn nƣớc thải chứa lipid có ý nghĩa quan
trọng trong việc phát hiện thu thập các chủng Pseudomonas sinh lipase.

1


1.2 Yêu cầu của đề tài
Phân lập một số chủng Pseudomonas sp. trong một số nguồn nƣớc thải chứa
lipid.
Đánh giá khả năng sinh lipase của các chủng Pseudomonas trên môi trƣờng
thạch có chứa Tween 80.
1.3 Nội dung thực hiện
Phân lập các chủng vi sinh sinh tổng hợp lipase trên môi trƣờng Ran và môi
trƣờng Seliber chứa cơ chất là mỡ bò.
Kiểm tra sinh hóa các chủng phân lập đã đƣợc làm thuần nhằm xác định các
chủng Pseudomonas.

Định tính khả năng sinh tổng hợp lipase của các chủng Pseudomonas trên môi
trƣờng LB bổ sung Tween 80 1%.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas bao gồm các loài của một chi có khả năng sử dụng nhiều loại hợp
chất vô cơ và hữu cơ dƣới điều kiện môi trƣờng sống thay đổi. Do đó, chúng tồn tại
khắp mọi nơi trong hệ sinh thái đất và nƣớc và đóng vai trò quan trọng trong các
tƣơng tác với thực vật, động vật. Tuy nhiên, một số chủng cũng là mầm bệnh đối với
con ngƣời (theo Palleroni, 1992; Schroth và cs, 1992, trích dẫn bởi Moore và ctv,
2006). Các chi Pseudomonas đƣợc biết rộng rãi nhờ khả năng trao đổi chất linh hoạt
và thông tin di truyền linh hoạt. Nói chung, các loài Pseudomonas phát triển nhanh
nhờ vào khả năng chuyển hóa một số lƣợng lớn các loại cơ chất, bao gồm cả các chất
hữu cơ độc hại, chẳng hạn nhƣ hydrocarbon thơm và chất béo. Một vài chủng đã đƣợc
xác định tạo ra hợp chất chuyển hóa có tác dụng kích thích sự phát triển cây trồng
hoặc ngăn chặn các loài gây hại cây trồng (Moore và ctv, 2006).
2.1.1. Lịch sử phát hiện vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas hiện diện phổ biến trong đất, nƣớc, thực vật và động vật nên
chúng đƣợc nghiên cứu từ rất sớm trong lịch sử vi sinh vật (Pierre Cornelis, 2008).
Pseudomonas là tên xuất phát từ tiếng Hy Lạp và tiếng Latin và tạm dịch là "đơn vị
giả" (pseudos theo tiếng Hy Lạp nghĩa là sai và monas là cụm từ tiếng Latin nghĩa là
duy nhất). Từ "Monas” đã đƣợc sử dụng trong những ngày đầu của Vi sinh vật học để
mô tả các sinh vật đơn bào. Tên “pseudomonas” lần đầu tiên đƣợc sử dụng bởi nhà
khoa học Đan Mạch, Otto Fredrich Muller, vào năm 1786 để chia nhỏ một nhóm vi
khuẩn đã đƣợc phân loại nhƣ phẩy khuẩn (tại thời điểm một cụm từ nhƣ vậy gọi là “vi
khuẩn chuyển động lắc”). Sau này, hành động “lắc” đƣợc coi là dấu hiệu của sự di
động (www.zimbio.com).

Walter Migula là ngƣời đầu tiên đề xuất chi Pseudomonas vào năm 1894 để định
nghĩa tất cả vi khuẩn Gram âm, hình que và có tiên mao ở đỉnh. Bởi vì định nghĩa này
quá rộng, các vi sinh vật không có quan hệ đều cho vào một chi tại thời điểm năm
1894. Khi phƣơng pháp phân tử phát triển bao gồm giải trình tự và so sánh rRNA 16S
từ tất cả những vi sinh vật này, các nhà khoa học đã có thể chuyển những vi sinh vật

3


đƣợc phân loại ban đầu vào chi Pseudomonas vào trong những chi khác.
Trong năm 2000, trình tự bộ gen đầu tiên của Pseudomonas (P. aeruginosa) đã
đƣợc xác định. Gần đây, trình tự của các chủng khác đã đƣợc xác định, bao gồm cả các
chủng P. aeruginosa PAO1 (2000), P. putida KT2440 (2002), P. fluorescens Pf -5
(2005), P. syringae pathovar tomato DC3000 (2003), P. syringae B728a syringae
pathovar (2005), P. syringae 1448A pathovar phaseolica (2005), P. fluorescens PfO-1
và P. entomophila L48 (Pierre Cornelis, 2008)
2.1.2. Phân loại vi khuẩn Pseudomonas
Theo Bergey (2005), Pseudomonas có vị trí phân loại nhƣ sau:
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Gamma Proteobacteria

Bộ:

Pseudomonadales

Họ:

Pseudomonadaceae

Chi:

Pseudomonas

Loài:

Pseudomonas spp.

2.1.3. Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas
2.1.3.1. Hình thái vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là trực khuẩn gram âm, không sinh nội bào tử, có hình que hơi
cong hoặc thẳng, đƣờng kính tế bào thƣờng nhỏ hơn 1 µm, chiều dài 1,5 - 5 µm
(Pierre Cornelis, 2008), đứng riêng rẽ, đứng thành đôi hoặc thành từng chuỗi ngắn, di
động nhờ một hoặc nhiều tiêm mao mọc ở đỉnh, hiếm khi không di động. Hình dạng
tế bào không biến đổi theo tuổi. Chỉ trong những ống giống rất già mới có thể có
những tế bào có hình dạng thoái hóa (Nguyễn Lân Dũng, 1974). Các loài khác nhau
đƣợc phân biệt nhờ kiểm tra sinh hóa và lai DNA.
Hàm lƣợng % (G + C) của DNA là 58 - 69%. Tế bào của nhiều loài dung giải
một cách dễ dàng trong dung dịch EDTA, điều này thƣờng liên quan đến hàm lƣợng
phosphoric cao của lớp màng ngoài. Nhiều loài Pseudomonas sản xuất hạt poly-βhydroxybutyrate (PHB), đặc biệt khi phát triển dƣới điều kiện nitrogen giới hạn
(Moore và ctv, 2006).

4


2.1.3.2. Sinh lý vi khuẩn Pseudomonas
Pseudomonas là vi sinh vật chuyển hóa hóa năng hữu cơ, linh hoạt về dinh
dƣỡng, nhu cầu dinh dƣỡng rất đơn giản, có thể phát triển trong môi trƣờng nghèo
dinh dƣỡng nhƣ nƣớc cất, không lên men, không quang hợp hoặc cố định nitrogen.
Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 28 - 30oC, một số loài có thể sống ở nhiệt độ cao tới
42oC. phát triển tối ƣu ở pH trung tính, độ ẩm vừa phải. Về bản chất, bất cứ môi
trƣờng sống nào có khoảng nhiệt độ 4,0 – 42oC, pH từ 4 - 8 và chứa hợp chất hữu cơ
đơn giản hoặc phức tạp đều có khả năng là môi trƣờng sống phù hợp cho
Pseudomonas (Moore và ctv, 2006).
Pseudomonas hiếu khí bắt buộc nhƣng một số chủng có khả năng sử dụng
nitrate thay vì oxy nhƣ một chất nhận điện tử cuối cùng trong hô hấp tế bào. Trong tự
nhiên, các loài Pseudomonas tồn tại bằng cách hoại sinh hoặc ký sinh trên thực vật.
Thƣờng chúng không phù hợp với môi trƣờng kị khí, và chúng không thể cƣ trú với
môi trƣờng sống có nhiệt độ quá cao và quá acid. Một số chủng Pseudomonas
thƣờng đề kháng kháng sinh, thuốc tẩy, kim loại nặng và dung môi hữu cơ (Moore và
ctv, 2006).
Tính đặc trƣng của nhiều đại diện thuộc giống Pseudomonas là sinh ra sắc tố
huỳnh quang đƣợc quan sát dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 254 nm, nhất là sau khi phát
triển dƣới nồng độ sắt bị giới hạn. Một vài sắc tố và dẫn xuất của chúng hoạt động
nhƣ chất mang sắt. Ở một số loài sắc tố khuếch tán vào môi trƣờng, nhuộm môi
trƣờng thành các màu tƣơng ứng. Việc hình thành sắc tố phụ thuộc vào thành phần
và pH của môi trƣờng. Sắc tố đƣợc tiết ra bởi Pseudomonas gồm có pyocyanin, sắc
tố màu xanh không huỳnh quang đặc trƣng cho vi khuẩn P. aeruginosa; fluorescin
hay pyoverdin (sắc tố màu xanh - vàng) hiện diện chủ yếu ở các loài Pseudomonas;
pyorubin (sắc tố nâu đỏ), oxychlororaphin (sắc tố màu cam), chlororaphin (sắc tố
xanh lá), oxychlororaphin (sắc tố cam)… (Moore và ctv, 2006).
2.1.3.3. Sinh hóa vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas có khả năng oxy hóa nhƣng không lên men đƣờng, không sinh
hơi trong môi trƣờng lỏng có chứa các nguồn carbohydrate. Chúng phát triển tốt
trong môi trƣờng peptone, hầu hết các loài phát triển trên môi trƣờng xác định trong

5


đó glucose hoặc galactose là nguồn carbon duy nhất và ammonium phosphate là
nguồn nitrogen duy nhất. Acid đƣợc tạo thành từ glucose và galactose trong môi
trƣờng peptone, nhƣng acid không hình thành từ manitol và glycerol (trừ P.
taetrolens và P. synxantha). Thông thƣờng citrate đƣợc sử dụng nhƣ nguồn carbon
duy nhất. Arginine dihydrolase có thể đƣợc tạo thành, ornithine decarboxylase thì
không đƣợc tạo thành (trừ P. synxantha). Pseudomonas không tạo indol, tinh bột
không bị phân giải (ngoại trừ P. stutzeri), acetoin không tạo thành, và không sử dụng
cellulose và pectin, phenylalanine âm tính, không nhạy cảm với kháng sinh, tạo
ammonia từ peptone, phát triển trên môi trƣờng 10 đến 40% muối mật và trên môi
trƣờng 3 đến 5% NaCl. Pseudomonas có hệ enzyme catalase là enzyme hiện diện
trong hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kị khí có hệ thống cytochrom có khả năng
phân giải H2O2 (trừ P. pavonacea), oxidase dƣơng tính (trừ P. iodinum, P. synxantha
và P. syringae). Ngoài ra một số chủng còn có khả năng tổng hợp các enzyme ngoại
bào thủy giải gelatin, các sắc tố có thể đƣợc hình thành bao gồm xanh lá, xanh lá xanh da trời, vàng, cam, nâu sáng và tối hoặc vàng - xanh huỳnh quang, sắc tố hầu
nhƣ đƣợc hòa tan vào môi trƣờng và đƣợc quan sát dƣới đèn huỳnh quang (Lysenko,
1961).
2.1.4. Cách phân lập vi khuẩn Pseudomonas
Các loài Pseudomonas có nhu cầu dinh dƣỡng đơn giản và đƣợc phân lập
nhanh từ nhiều loại môi trƣờng. Trong phòng thí nghiệm, chúng phát triển tốt trong
môi trƣờng chứa một vài dung dịch hữu cơ, tại pH trung tính và nhiệt độ trong
khoảng ấm. Các loài Pseudomonas có xu hƣớng phát triển tƣơng đối nhanh, thƣờng
phát triển nhanh hơn những loài trong chi khác. Hầu hết các loài Pseudomonas thích
môi trƣờng giàu dinh dƣỡng, ví dụ nhƣ canh hoặc thạch dinh dƣỡng, canh hoặc thạch

đậu nành trypsine và môi trƣờng dinh dƣỡng khác chứa các aminoacid. Tuy nhiên,
với nồng độ aminoacid khác nhau trong môi trƣờng có thể thu đƣợc số lƣợng và sự
đa dạng của các loài Pseudomonas khác nhau. Các loài Pseudomonas hoại sinh có
thể đƣợc phân lập bằng cách cấy lên môi trƣờng dinh dƣỡng hoặc thạch đậu nành
trypsine. Các loài Pseudomonas khử nitơ thì đƣợc phân lập trên môi trƣờng chứa
nitrate (NO3), dƣới điều kiện kị khí, tại 30 – 40oC (Moore và ctv, 2006).

6


Hầu hết các loài Pseudomonas phát triển trên môi trƣờng sinh hóa xác định mà
không cần phải thêm các yếu tố tăng trƣởng. Môi trƣờng đƣợc mô tả bởi Palleroni và
Douderoff (1972), giúp vi sinh vật tự dƣỡng và dị dƣỡng phát triển nhanh, dùng nuôi
cấy Pseudomonas rất tốt. Các loài Pseudomonas cũng phát triển tốt trên môi trƣờng
khoáng dùng để phân lập Arthrobacter và trên môi trƣờng khoáng R2A cho sự phát
triển thiếu dinh dƣỡng. Thông thƣờng, các loài Pseudomonas phát triển tốt đƣợc quan
sát trên môi trƣờng có hợp chất hữu cơ từ 0,1 - 1,0% (w/v) nhƣ nguồn carbon và
năng lƣợng (Aagot và ctv, 2001; trích dẫn bởi Moore và ctv, 2006).
Môi trƣờng nuôi cấy mà đƣợc dùng để làm giàu chọn lọc cho các loài
Pseudomonas có thể thiếu sắt, nhằm phát hiện các loài Pseudomonas sinh huỳnh
quang. Sự phát huỳnh quang là do tăng sản phẩm sắc tố siderophore ra ngoài môi
trƣờng. Môi trƣờng khác có chất kháng sinh, chẳng hạn penicillin G, novobiocin và
cycloheximide không ức chế đƣợc Pseudomonas sinh huỳnh quang (Sands và Rovira,
1970; trích dẫn bởi Moore và ctv, 2006).
Môi trƣờng chọn lọc sử dụng một cách rộng rãi cho việc phát hiện và phân lập
các loài Pseudomonas sinh huỳnh quang là môi trƣờng King’ A và King’ B chứa
muối của magie và kali làm tăng sắc tố pyocyanin và pyoverdin. Môi trƣờng Gould
S1 chứa sodium lauroyl sarcosine, hiệu quả cho việc ngăn chặn sự phát triển của vi
khuẩn gram dƣơng. Kháng sinh trinmethoprim có trong môi trƣờng sẽ giúp hạn chế
đƣợc vi khuẩn Pseudomonas không sinh huỳnh quang. Những môi trƣờng chọn lọc

khác hỗ trợ sự phát triển của Pseudomonas bao gồm pseudosel agar, cetrimide agar,
pseudomonas isolation agar và pseudomonas agar F chứa cetyltrimethylammonium
bromide (cetrimide hoặc CTAB), 2,4,4-trichloro-2-hydroxydiphenyl ether (Irgasan),
hoặc các thành phần tƣơng tự, mặc dù trên môi trƣờng chọn lọc mạnh thì số lƣợng và
sự đa dạng của các loài Pseudomonas sẽ thấp hơn. Sử dụng cetrimide có thể ức chế
sự phát triển đồng thời của quần thể vi sinh và giảm tới mức tối thiểu sự phát triển
của P. aeruginosa. Sắc tố của P. aeruginosa không bị ức chế khi phát triển trên môi
trƣờng này. Việc thêm vào nalidixic acid sẽ giúp việc ức chế quần thể vi sinh tốt hơn
(Goto và Enomoto, 1970; trích dẫn bởi Moore và ctv, 2006).

7


Việc lựa chọn môi trƣờng chọn lọc hay thông thƣờng để phân lập Pseudomonas
dựa trên mẫu đƣợc phân tích. Môi trƣờng chọn lọc thì đƣợc khuyến cáo dùng cho mẫu
đất, nƣớc và chất hữu cơ mà chứa nhiều vi sinh vật khác, trong khi đó môi trƣờng
thông thƣờng sẽ tốt hơn khi muốn phân lập đƣợc số lƣợng lớn và nhiều loài từ các
nguồn thể hiện áp lực chọn lọc mạnh (Moore và ctv, 2006).
2.1.5. Tác hại của Pseudomonas
2.1.5.1 Tác hại của Pseudomonas đối với thực vật
Bệnh héo xanh vi khuẩn do Pseudomonas solanacearum đƣợc Ervin Smith phát
hiện đầu tiên trên cây họ cà ở Mỹ vào năm 1896. Cho đến nay, bệnh phổ biến rất rộng
ở hầu hết các nƣớc ở châu Á, Phi, Mỹ và Úc. Bệnh bắt đầu xuất hiện ở châu Âu (Bỉ,
Thụy Điển…) gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở các nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới
có khí hậu nóng ẩm. Bệnh gây hại trên 278 loài cây thuộc trên 44 họ thực vật khác
nhau, trong đó, đáng chú ý nhất là các cây có ý nghĩa kinh tế cao nhƣ cà chua, khoai
tây, thuốc lá, ớt, cà, lạc, vừng, hồ tiêu, đậu tƣơng, dâu tằm, chuối… Bệnh gây thiệt hại
kinh tế lớn, giảm năng suất từ 5 - 100% tuỳ theo loài cây, giống cây, vùng địa lý và
nhiều yếu tố khác (www.vast.ac.vn).
2.1.5.2 Tác hại của Pseudomonas đối với động vật

Pseudomonas fluorescens, P. anguilliseptica và P. chlororaphis gây bệnh đốm
đỏ trên cá. Pseudomonas spp. gây nhiễm khuẩn huyết thƣờng xâm nhập vào cơ thể cá
qua các thƣơng tổn ở mang, da, vẩy (www.nhanonglamgiau.com). Ở ngựa, P.
aeruginosa gây sẩy thai, nhiễm trùng giác mạc và túi yết hầu; ở gia súc gây sẩy thai,
viêm vú, nhiễm trùng sinh dục; ở chó và mèo P. aeruginosa gây ra viêm tuyến tiền
liệt, viêm bàng quang, viêm da, nhiễm trùng tai, nhiễm trùng huyết, viêm màng trong
tim; ở cừu gây bệnh "lông xanh" và viêm da; ở gà gây bệnh nhiễm trùng đƣờng hô
hấp và nhiễm trùng huyết; ở chồn gây xuất huyết phổi (www.gopetsamerica.com).
2.1.5.3 Tác hại của Pseudomonas đối với con ngƣời
Pseudomonas sp. đặc biệt là P. aeruginosa là tác nhân gây nhiễm trùng cơ hội.
Chúng gây nhiễm trùng đƣờng tiểu, hô hấp, viêm da, nhiễm trùng mô mềm, viêm tai
ngoài, viêm màng não khi bệnh nhân bị chọc dò tủy sống, viêm xoang, viêm mắt,
viêm đƣờng ruột (có thể gây tiêu chảy trầm trọng ở trẻ em) hay có thể gây nhiễm

8


trùng huyết và bệnh rất trầm trọng ở ngƣời trong tình trạng suy giảm miễn dịch nhƣ
bệnh nhân bị phỏng nặng, AIDS hay bệnh ung thƣ. Nguy hiểm hơn cả là khả năng đa
kháng kháng sinh. Nhiều nghiên cứu cho thấy Pseudomonas còn mang plasmid kháng
kháng sinh và các yếu tố di truyền này có thể đƣợc lan truyền trong quần thể thông
quan hiện tƣợng tải nạp và giao nạp, tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới
(www. ihph.org).
2.1.6. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas
Một số Pseudomonas có thể chuyển hóa các chất ô nhiễm hóa học trong môi
trƣờng, và có thể đƣợc sử dụng để xử lý sinh học nhƣ P. alcaligenes có thể phân hủy
các hydrocacbon thơm đa vòng, P. mendocina , có khả năng phân hủy toluene, P.
pseudoalcaligenes có thể phân hủy cyanide nhƣ là một nguồn nitrogen và P.
resinovorans có thể phân hủy cacbazol (vi.wikipedia.org).
Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp do các chủng vi khuẩn Pseudomonas

denitrificans. Các chủng đột biến sản sinh một lƣợng sản phẩm lớn hơn rất nhiều so
với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn nhiều lần khối lƣợng khô của nó.
Pseudomonas denitrificans sinh ra vitamin B12 gấp 100000 lần nhu cầu của nó.
Protease ngoại bào đƣợc tiết ra từ Pseudomonas marinoglutinosa có thể đƣợc cố
định trong canxi alginat để thực hiện các phản ứng liên tục thu đƣợc sản lƣợng cao
trong các phản ứng thủy phân thịt cá (vi.wikipedia.org).
Sử dụng tính đối kháng của các chủng Pseudomonas để tiêu diệt nấm bệnh cây
trồng. Ví dụ các chủng Pseudomonas sinh huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã đƣợc phân
lập và chọn lọc theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân gây bệnh khô
vằn cây lúa. Sử dụng tính đối kháng của P. fluorescens, P. aeruginosa và P. putida để
chống lại vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo rũ cây (vi.wikipedia.org).
Vi khuẩn Pseudomonas spp. đặc biệt P. stutzeri là một trong những dòng vi
khuẩn sống trong vùng rễ cây, có khả năng cố định đạm cung cấp cho cây lúa và kích
thích sự phát triển của cây lúa tƣơng tự vi khuẩn nội sinh (Cao Ngọc Điệp, 2005).
2.1.7. Sinh tổng hợp lipase của Pseudomonas
Việc tạo ra lipase đòi hỏi nguồn carbon và nitrogen theo bất kỳ con đƣờng lên
men nào. Hầu hết các nghiên cứu về việc tạo lipase không sử dụng đƣờng đơn nhƣ

9


nguồn carbon. Thƣờng sử dụng cơ chất lipid nhƣ nguồn carbon duy nhất hơn. Cơ chất
cảm ứng nhƣ dầu thực vật, Tween 20, Tween 80, hexadecane và chất nhân tạo giống
nhƣ tributyrin và tripalmitin đều đƣợc sử sụng. Hàm lƣợng lipase tăng khi mối quan
hệ phần trăm của C18: n ester acid béo tƣơng ứng trong dầu thực vật tăng. Thông
thƣờng hoạt tính lipase nội và ngoại bào tăng khi nồng độ lipid tăng, mặc dầu sự vƣợt
quá mức độ trong môi trƣờng nuôi cấy có thể gây độc. Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp
lipase thay đổi trong vi sinh vật khác nhau (Marie Zarevúcka, 2012)
2.2. Enzyme lipase
2.2.1. Giới thiệu enzyme lipase

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là nhóm enzyme xúc tác
thủy phân triacylglycerol tại vị trí mặt phân cách pha dầu – nƣớc giải phóng glycerol
và acid béo tự do. Lipase có ý nghĩa sinh học to lớn, hiện diện trong vi sinh vật, thực
vật và động vật. Bên cạnh lipase còn có khả năng xúc tác cho nhiều phản ứng khác
bao gồm phản ứng tổng hợp este, chuyển ester (gồm có rƣợu hóa và thủy phân
glycogen), phản ứng trao đổi ester (gồm có acid hóa và trao đổi ester) và phản ứng
amin hóa (Ece Yapaşan, 2008)

Triacylglyce
Nƣớc
Glycerol
Acid béo
rol
Hình 2.1 Sự thủy phân hoặc tổng hợp cơ chất triacylglycerol xúc tác bởi
enzyme lipase ( Sharma và ctv, 2001).
Do có vai trò quan trọng nên lipase luôn là một đối tƣợng cần đƣợc nghiên cứu
sâu. Trọng tâm nghiên cứu là xác định đặc điểm cấu trúc, làm sáng tỏ cơ chế hoạt
động, động học, đọc trình tự và tạo dòng gen (Ece Yapaşan, 2008).

10


2.2.2. Nguồn thu nhận enzyme lipase
Vì lipase cần thiết cho chức năng sinh lý của vi sinh vật, chúng phổ biến và có
thể đƣợc tìm thấy trong nhiều nguồn nhƣ thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên,
chúng đƣợc tìm thấy nhiều ở vi khuẩn, nấm mốc và nấm men.
Lipase có vai trò to lớn trong thế giới thực vật, nhƣng kiến thức về lipase thực
vật vẫn bị giới hạn so với lipase động vật và lipase vi sinh vật. Cho đến giờ các loại
lipase đã đƣợc nghiên cứu ở thực vật đƣợc tìm thấy đều có màng bao và có thể đƣợc
kiểm tra trong khi vẫn gắn với lớp màng. Lipase từ bắp, cây cải dầu và cây thầu dầu

đều đã đƣợc hòa tan và tinh sạch hoàn toàn hoặc ít nhất về bản chất là sạch.
Có 3 nhóm enzyme lipase có thể đƣợc phân biệt ở động vật: lipase tiết vào
đƣờng tiêu hóa bởi các bộ phận chuyên biệt, lipase từ mô và lipase từ sữa. Một vài mô
và cơ quan của động vật, chẳng hạn tim, óc, cơ, động mạch, cật, lá lách, phổi, gan, mô
mỡ và huyết thanh chứa lipase.
Lipase ngoại bào của vi sinh vật thƣờng ổn đinh hơn lipase động vật và thực
vật. Nói chung, lipase ƣa nhiệt đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp vì chúng ổn
định và chống lại sự biến tính bởi hóa chất. Thêm vào đó, đa số lipase có giá trị đều
thu nhận từ nguồn ƣa nhiệt trung bình và có hoạt tính tối đa từ 35 đến 400C. Mới đây,
các chủng vi sinh vật, chẳng hạn Geobacillus sp. T1, Bacillus sp. RSJ-1, Bacillus
thermoleovorans ID-1, Bacillus sp chủng A30-1, Bacillus sp. chủng 398, Bacillus
spp., Pseudomonas cepacia và Pseudomonas sp. đã đƣợc báo cáo là lipase ổn định
nhiệt. Bên cạnh, enzyme ƣa nhiệt trung bình đang đƣợc khai thác để trở thành nguồn
enzyme ổn định nhƣ enzyme ƣa nhiệt (Ghost và ctv, 1996; trích dẫn bởi Salleh và ctv,
2006)
2.2.3. Tính chất đặc hiệu của lipase từ vi sinh vật
Dựa vào tính đặc hiệu, lipase vi sinh vật có thể đƣợc phân thành ba nhóm.
Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc
acyl trên mạch triglyceride, ví dụ nhƣ lipase từ Candida cylindracea và
Staphylococcus aureus. Nhóm thứ hai đƣợc xem là quan trọng nhất bao gồm những
enzyme xúc tác đặc hiệu vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol, trong đó thông dụng là
lipase từ Aspergillus niger, Rhizopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi.

11


Cuối cùng là nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số acid béo
nhất định, ví dụ lipase từ Geotrichum candidum chỉ thủy phân acid béo mạch dài hoặc
acid béo không no dạng cis-9 (Van camp và ctv, 1998)
2.2.4. Ứng dụng của enzyme lipase

Lipase đƣợc sử dụng rộng rãi trong quá trình chế biến dầu và chất béo, thực
phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp hóa chất và dƣợc phẩm, sản xuất giấy và các loại mỹ
phẩm. Ngoài ra, lipase còn đƣợc sử dụng để thúc đẩy phản ứng phân hủy chất thải là
chất béo (fatty waste) và loại nhựa tổng hợp dùng chế tạo sơn (polyurethane). Một số
những ứng dụng quan trọng của lipase đƣợc tổng hợp trong bảng 2.1. Hầu hết lipase
đƣợc dùng trong công nghiệp đƣợc thu nhận từ vi khuẩn và nấm (Sharma, 2001). Một
vài lipase vi sinh vật có giá trị thƣơng mại nhƣ nấm C. rugosa, C. antarctica, T.
lanuginosus, R. miehei và vi khuẩn Burkholderia cepacia, P. alcaligenes, P.
mendocina, Ch. viscosum (Jaeger và Reetz, 1998)
Bảng 2.1 Ứng dụng của lipase trong công nghiệp
Ngành công nghiệp
Chất tẩy rửa
Sữa và thực phẩm
từ sữa
Bánh kẹo

Phản ứng
Thủy phân chất béo
Thủy phân chất béo sữa,
làm chín phô mai, thay đổi
thành phần bơ sữa
Cải thiện mùi vị

Thức uống
Nƣớc sốt
Thực phẩm dinh dƣỡng
Thịt cá
Dầu và chất béo

Tăng cƣờng hƣơng vị

Cải thiện chất lƣợng
Chuyển hóa ester
Cải thiện mùi vị
Chuyển hóa ester, thủy
phân

Hóa chất

Mỹ phẩm

Đối kháng chọn lọc,tổng
hợp
Chuyển hóa ester, thủy
phân
Tổng hợp

Thuộc da
Giấy
Chất làm trắng

Thủy phân
Thủy phân
Thủy phân

Dƣợc phẩm

(Vulfson, 1994)

12

Sản phẩm hoặc ứng dụng
Loại vết dầu mỡ trên vải
Tăng cƣờng hợp chất tạo
hƣơng vị cho sữa, phô
mai và bơ
Kéo dài thời gian bảo
quản
Thức uống
Mayonnaise, nƣớc sốt
Thực phẩm dinh dƣỡng
Sản phẩm thịt cá, loại mỡ
Bơ ca cao, margarine,
acid béo, glycerol, mono
và diglyceride
Các khối kết tinh, hóa
chất
Các lipid đặc trƣng, chất
hỗ trợ tiêu hóa
Chất nhũ hóa, chất tạo
ẩm
Sản phẩm thuộc da
Giấy chất lƣợng cao
Loại bỏ chất béo


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện tại chi nhánh Công ty TNHH Gia Tƣờng Khu C2, lô D, khu
công nghiệp Sóng Thần, tỉnh Bình Dƣơng từ ngày 30/01/2012 đến ngày 10/07/2012.
3.2. Vật liệu

3.2.1 Nguồn gốc mẫu thí nghiệm
Mẫu nƣớc thải đƣợc thu thập từ 5 địa điểm khác nhau
Mẫu 1: nƣớc thải lò mổ tại Đồng Nai
Mẫu 2: nƣớc thải lò mổ tại huyện Bình Chánh, Tp.Hồ Chí Minh
Mẫu 3: nƣớc thải nhà máy chế biến dầu cá da trơn tại Tp. Long Xuyên, An Giang
Mẫu 4: nƣớc thải tại đƣờng số 6, khu công nghiệp Sóng Thần, Bình Dƣơng
Mẫu 5: nƣớc thải tại đƣờng 17, quận Thủ Đức, Tp.Hồ Chí Minh
3.2.2. Vi sinh vật đối chứng
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Azotobacter (do
công ty TNHH Gia Tƣờng tỉnh Bình Dƣơng cung cấp)
Pseudomonas stutzeri ATCC 17588, Pseudomonas fluorescens ATCC 13525,
Pseudomonas putida ATCC 49128 (cung cấp bởi Microbiologics® Inc)
3.2.3. Thiết bị, hóa chất và môi trƣờng
3.2.3.1. Thiết bị và dụng cụ
Các dụng cụ thông thƣờng của phòng thí nghiệm sinh hóa vi sinh nhƣ đĩa petri, Pipet,
kính hiển vi, phiến kính và lá kính, đèn UV, kẹp, máy đo pH.
3.2.3.2. Hóa chất
Thuốc thử Kovac’s, thuốc thử oxidase (Công ty Nam Khoa, Tp. Hồ Chí Minh)
Thuốc nhuộm Gram, thuốc thử catalase, thuốc thử MR (tại PTN công ty Gia Tƣờng
tỉnh Bình Dƣơng)
3.2.3.3. Môi trƣờng
Xem chi tiết thành phần môi trƣờng ở phụ lục 1
Môi trƣờng Seliber: phân lập chủng vi sinh vật phân giải lipid
Môi trƣờng Ran: phân lập chủng vi sinh vật phân giải lipid

13


Môi trƣờng King B: làm thuần các chủng vi sinh vật phân lập
Môi trƣờng NA: cấy giống chuẩn

Môi trƣờng Simmon citrate agar: phát hiện enzyme citratase
Môi trƣờng KIA: phát hiện sinh gas
Môi trƣờng canh tryptone: sinh indole
Môi trƣờng gelatin: phát hiện enzyme gelatinase
Môi trƣờng O/F: phát hiện khả năng oxi hóa hoặc lên men glucose
Môi trƣờng MR: phát hiện các sản phẩm acid từ quá trình chuyển hóa glucose
Môi trƣờng Urea: phát hiện enzyme urease
Môi trƣờng phenol red lactose broth: khả năng lên men lactose
Môi trƣờng NA bổ sung TTC: thử nghiệm tính di động
Môi trƣờng LB với Tween 80 kiểm tra hoạt tính lipase
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu đƣợc lấy vào trong các dụng cụ lấy mẫu, không đƣợc lấy đầy chai mà phải
chừa một khoảng không trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu đƣợc trộn đều bằng
cách lắc trƣớc khi phân tích. Sau khi lấy đầy mẫu phải nút kín miệng chai ngay.
Cầm chai lấy mẫu trong tay gần vị trí đáy chai, đƣa cổ chai hƣớng xuống dƣới và
đƣa sâu vào dƣới mặt nƣớc. Xoay nhẹ để cổ chai hơi nghiêng lên bề mặt nƣớc và
miệng chai hƣớng về phía dòng chảy. Trong trƣờng hợp không có dòng chảy xoay
chai theo hƣớng nằm ngang và đẩy chai di chuyển về phía theo hƣớng miệng chai.
Tránh chai lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đáy hồ chứa.
Nhanh chóng đƣa tới phòng thí nghiệm phân tích, trong trƣờng hợp mẫu không
thể vận chuyển ngay tới phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành bảo quản lạnh trong quá
trình vận chuyển (Nguyễn Tiến Dũng, 2007)
3.3.2 Phƣơng pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải lipid
Môi trƣờng phân lập
Môi trƣờng Seliber đƣợc bổ sung 0,5 % mỡ nƣớc và thêm vài giọt bromothymol
blue 0,01% trong cồn.
Môi trƣờng Ran thêm ít mỡ bò đã khử trùng

14

Cách tiến hành
Lấy mẫu nƣớc tiến hành tăng sinh trong môi trƣờng Seliber lỏng có bổ sung mỡ
heo. Tiến hành pha loãng mẫu tới nồng độ 10-5, trải dịch pha loãng lên môi trƣờng
Seliber và môi trƣờng Ran với nguồn carbon duy nhất là mỡ động vật (Nguyễn Lân
Dũng, 1974).
Chọn những khuẩn lạc có khả năng mọc trên 2 môi trƣờng trên, tiến hành cấy
phân lập và làm thuần trên môi trƣờng King’ B.

Nƣớc thải

Tăng sinh trên môi trƣờng Seliber lỏng
48giờ, ở 37oC
Phân lập trên môi trƣờng Seliber

Phân lập trên môi trƣờng Ran

Chọn lọc các khuẩn lạc riêng rẽ trên các môi trƣờng
Làm thuần
Môi trƣờng King’B
Giữ giống
Môi trƣờng King’B
Sơ đồ 3.1 Phƣơng pháp phân lập các chủng vi sinh vật phân giải lipid
3.3.3. Phƣơng pháp kiểm tra sinh hóa của chủng Pseudomonas
Pseudomonas có đặc tính sinh hóa đa dạng, điều đó gây khó khăn nhiều cho
việc nhận diện các chủng băng kiểm tra sinh hóa. Dựa theo phƣơng pháp nhận diện
các chủng Pseudomonas của Bergey (1994) và Glover-Lakomia và Fong (1999). Quy

15