XÂY DỰNG QUY TRÌNH DUPLEX PCR PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH CHUYỂN GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH DUPLEX PCR
PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH CHUYỂN GEN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN HỮU NGHĨA

Niên khóa

: 2008-2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH DUPLEX PCR
PHÁT HIỆN ĐẬU NÀNH CHUYỂN GEN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN HỮU NGHĨA

KS. NGUYỄN PHAN THÀNH

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
TS. Huỳnh Văn Biết đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức quý
báo và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
KS. Nguyễn Phan Thành đã hết lòng giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đề tài.
Thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt
thời gian học tập tại trường.
Các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 34 đã giúp đỡ, động viên em trong suốt quá
trình học tập và làm đề tài.
Xin gửi lời tri ân đến ba mẹ cùng gia đình đã tạo mọi điều kiện cho con đến ngày hôm
nay, dạy dỗ và chăm sác con nên người.

Nguyễn Hữu Nghĩa

i

TÓM TẮT
Hiện nay, phát triển cây trồng chuyển gen trở thành xu thế chung trên thế giới, diện
tích trồng đậu nành chuyển gen cũng ngày càng tăng lên. Lợi ích và nguy cơ từ cây trồng
chuyển gen vẫn chưa được phân định rõ ràng nên nhiều biện pháp kiểm soát an toàn cây
trồng chuyển gen cần được đặt ra nhằm giảm các tác hại của chúng đến sức khỏe con
người và môi trường. Nhằm mục đích xây dựng một phương pháp sàng lọc cây trồng biến
đổi gen, trước hết là đậu nành biến đổi gen, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Xây dựng
quy trình duplex PCR phát hiện đậu nành chuyển gen”.
Đề tài trước tiên so sánh hiệu quả ly trích DNA từ hạt đậu nành giữa các quy trình ly
trích sử dụng CTAB, SDS và bộ kit. Sau đó sử dụng kỹ thuật duplex PCR với hai cặp mồi
phát hiện đoạn promoter 35S (có trong hầu hết các thực vật chuyển gen) và đoạn gen
lectin (có trong tất cả các chủng đậu nành). Thí nghiệm thay đổi các thông số chủ yếu của
một phản ứng PCR để tìm các thông số thích hợp, sau đó kiểm tra độ chính xác của quy
trình thiết lập được.
Thí nghiệm đạt được các kết quả sau: Quy trình ly trích DNA hạt đậu nành sử dụng
CTAB đạt kết quả tốt nhất. Các thông số tối ưu cho phản ứng duplex PCR: nhiệt độ bắt
cặp là 60oC, 45 chu kỳ, nồng độ MgCl2 1,5 µM, nồng độ cặp primer lectin và 35S là 0,1
µM và 0,3 µM. Phản ứng duplex PCR xây dựng được có độ đặc hiệu cao. 10 mẫu hạt đậu
nành được thu thập trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh đã được kháo sát ngẫu nhiên, và
kết quả cho thấy có 01 mẫu hạt đậu nành chuyển gen.

ii


SUMMARY
Nowadays, developing GMO becomes general trend in the world, GMO crops increase
every year especially soybean. Because its advantages and disadvantages cannot be
considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and
human health. In order to establish a method to help screening GMO, firstly in soybean,
the research “Establishing duplex PCR process to determine genetically modified

soybean” was carried out.
Firstly, the research compares the effective of DNA extraction when using CTAB,
SDS and kit. After that, the research use duplex PCR technique with two primers:
one

for

detect

promoter

35S

(present

in

almost

GM

plant)

and

one

for detect lectin gen (present in all type of soybean). The research changes essential
elements in a typical PCR to determine optimize parameters, after all, confirms the
accuration of the established process.

The research has some results:
Soybean DNA extraction using CTAB has the best result.
Optimizing parameter for duplex PCR: annealing temperature is 60oC, 45 circles,
MgCl2 1.5 µM, primers for lectin 0.1 µM each, prime for 35S 0.3 µM each.
Duplex PCR established has high specific.
Ten samples soybean collected from Ho Chi Minh City has analyzed with Duplex
PCR designed. The results show that one sample is detected as GM soybean.
Keyword: GMO, duplex PCR, lectin, 35S

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................i
TÓM TẮT.............................................................................................................................ii
SUMMARY........................................................................................................................ iii
MỤC LỤC ...........................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................. viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................................ix
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu của đề tài........................................................................................................... 1
1.3 Nội dung thực hiện ......................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
2.1 Cây trồng chuyển gen ..................................................................................................... 3
2.1.1 Định nghĩa ................................................................................................................... 3
2.1.2 Các hướng chính trong tạo giống cây trồng chuyển gen ............................................. 3
2.1.2.1 Chuyển gen kháng sâu .............................................................................................. 3

2.1.2.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ .............................................................................. 3
2.1.2.3 Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh ............................................................... 4
2.1.2.4 Chuyển gen cải thiện chất dinh dưỡng cây trồng ..................................................... 4
2.1.3 Một số cây trồng chuyển gen hiện nay ........................................................................ 5
2.1.4 Tình hình cây trồng chuyển gen .................................................................................. 6
2.1.5 Lợi ích từ cây trồng chuyển gen .................................................................................. 7
2.1.6. Nguy cơ từ cây trồng chuyển gen ............................................................................... 7
2.1.6.1 Lo ngại về vấn đề môi trường .................................................................................. 7
2.1.6.2 Lo ngại về sức khỏe con người ................................................................................ 8
iv


2.1.6.3 Lo ngại về kinh tế ..................................................................................................... 8
2.1.7 Dán nhãn thực phẩm biến đổi gen ............................................................................... 8
2.2. Đậu nành và đậu nành chuyển gen ................................................................................ 9
2.2.1 Đậu nành ...................................................................................................................... 9
2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ .................................................................................. 11
2.2.2.1 Trên thế giới ........................................................................................................... 11
2.2.2.2 Trong nước ............................................................................................................. 11
2.2.3 Đậu nành chuyển gen ................................................................................................ 12
2.3. Các phương pháp xác định cây trồng chuyển gen ....................................................... 13
2.3.1 ELISA ........................................................................................................................ 13
2.3.2. PCR........................................................................................................................... 14
2.3.1.1 Nguyên lý ............................................................................................................... 14
2.3.2.2 Các giai đoạn phản ứng .......................................................................................... 14
2.3.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.............................................................. 15
2.3.2.4 Promoter 35S và gen lectin..................................................................................... 17
2.3.3 Realtime PCR ............................................................................................................ 18
2.3.4 Tình hình nghiên cứu các biện pháp phát hiện cây trồng chuyển gen ...................... 19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 20

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ......................................................................... 20
3.2. Vật liệu thí nghiệm ...................................................................................................... 20
3.2.1 Mẫu thí nghiệm.......................................................................................................... 20
3.2.2. Thiết bị và hóa chất thí nghiệm ................................................................................ 21
3.2.2.1 Thiết bị.................................................................................................................... 21
3.2.2.2 Hóa chất .................................................................................................................. 21

v


3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................. 21
3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA ................................................ 21
3.3.1.1 Quy trinh ly trích mẫu với CTAB .......................................................................... 21
3.3.1.2 Quy trình ly trích mẫu với SDS .............................................................................. 22
3.3.1.3 Quy trình ly trích mẫu với Kit DNA Miniprep Kit (Plant) .................................... 22
3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng hoạt động của primer .......................................... 23
3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của MgCl2 và nồng độ primer .......................... 24
3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của phản ứng Duplex PCR ....................... 26
3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát số chu kỳ của phản ứng Duplex PCR ................................. 26
3.3.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tính đặc hiệu của phản ứng Duplex PCR............................ 27
3.3.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát một số mẫu đậu nành bằng phản ứng Duplex PCR ............ 27
3.3.8 Thử nghiệm so sánh với Realtime PCR .................................................................... 27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 29
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA .................................................... 29
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng hoạt động của primer.............................................. 32
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của MgCl2 và nồng độ primer ............................. 33
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của phản ứng Duplex PCR .......................... 34
4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát số chu kỳ của phản ứng Duplex PCR .................................... 36
4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tính đặc hiệu của phản ứng Duplex PCR ............................... 37
4.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát một số mẫu đậu nành bằng phản ứng Duplex PCR ............... 38

4.8 Thí nghiệm 8: Thử nghiệm so sánh với Realtime PCR................................................ 39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 44
5.1 Kết luận......................................................................................................................... 44
5.2 Đề nghị ......................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 45
vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTAB

Cetyl trimethy ammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

GMO

Genetically modified organism

Nos

Nopaline synthase

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

SDS

Sodium dodecyl sulfate

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Địa điểm và thời gian thu thập mẫu đậu nành

20

Bảng 3.2 Đặc điểm cặp primer khuếch đại gen lectin

23

Bảng 3.3 Đặc điểm cặp primer khuếch đại promoter 35S

23

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR

24

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

24

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng duplex PCR

25

Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng duplex PCR

25

Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm 3

26

Bảng 3.9 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR

28

Bảng 4.1 Kết quả sau khi đo OD các mẫu ly trích DNA

31

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Tỉ lệ cây trồng biến đổi gen được đưa vào sản xuất

5

Hình 2.2 Diện tích cây trồng chuyển gen từ năm 1996 đến 2011

6

Hinh 2.3 Cây và hạt đậu nành

10

Hình 2.4 Diện tích các loại cây trồng chuyển gen từ năm 1996 đến 2011

12

Hình 2.5 Cánh đồng đậu nành chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

12

Hình 2.6 Nguyên tắc kỹ thuật PCR

14

Hình 2.7 Trình tự promoter 35S

17

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số

30

Hình 4.2 Sản phẩm PCR với các primer đơn

32

Hình 4.3 Sản phẩm PCR với nồng độ primer 35S-lectin thay đổi theo MgCl2

33

Hình 4.4 Sản phẩm Duplex PCR với nhiệt độ bắt cặp Tm thay đổi

35

Hình 4.5 Sản phẩm duplex PCR với số chu kỳ khếch đại thay đổi

36

Hình 4.6 Kết quả xác định độ đặc hiệu

37

Hình 4.7 Kết quả khuếch đại duplex PCR với các mẫu đậu nành khảo sát

38

Hình 4.8 Thiết lập các đầu đọc huỳnh quang phù hợp với probe

40

Hình 4.9 Kết quả Realtime PCR xác định sự hiện diện của promoter 35S

40

Hình 4.10 Kết quả Realtime PCR xác định sự hiện diện của DNA thực vật

41

Hình 4.11 Kết quả Realtime PCR xác nhận hóa chất bộ kit hoạt động tốt

41

Hình 4.12 Kết quả hoàn tất Real time PCR

42

ix


CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, dân số thế giới đang gia tăng nhanh chóng, vấn đề an ninh lương thực đang
dần trở thành vấn đề cấp thiết. Với sự đột phá của cuộc cách mạng công nghệ sinh học,
nhiều giống cây trồng biến đổi gen mới đã ra đời có năng suất và chất lượng vượt trội
cùng với nhiều phẩm chất ưu việt mà bằng phương pháp lai tạo truyền thống không đạt
được. Các giống lương thực này nếu được trồng rộng rãi sẽ đáp ứng được nhu cầu lương
thực đang dần tăng cao trên thế giới.
Tuy nhiên, đi kèm với nhiều phẩm chất ưu việt, các mối lo ngại về vấn đề an toàn sinh
học đối với môi trường và con người do cây trồng biến đổi gen cũng được đặt ra. Các
nước như Hoa Kỳ, Canada, Úc, New Zealand và nhiều nước Châu Âu đã ban hành các
yêu cầu dán nhãn sản phẩm nhằm thông tin đến người tiêu dùng và kiểm soát việc xuất
nhập khẩu các sản phẩm biến đổi gen.
Tại Việt Nam, ngày 21/06/2010, Chính phủ đã ban hành Nghị định số 69/2010/NĐ-CP

về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của sinh
vật biến đổi gen về dán nhãn sản phẩm. Tuy nhiên việc thực hiện nghị định này còn nhiều
hạn chế, nhiều doanh nghiệp sản xuất – xuất nhập khẩu lương thực vẫn chưa thực hiện
việc thông tin hoặc kiểm tra sản phẩm của mình có thành phần chuyển gen. Một trong
những lý do được đưa ra là cần nhiều thời gian để phân tích và tốn kém về chi phí.
Trên cơ sở những khó khăn đó, nhằm phát triển một quy trình xác định sự hiện diện
của sản phẩm chuyển gen một cách nhanh chóng mà không tốn kém quá nhiều chi phí,
bước đầu là trên đối tượng đậu nành, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy
trình duplex PCR phát hiện đậu nành chuyển gen”.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Nắm vững nguyên lý kỹ thuật các phương pháp thí nghiệm.
Khảo sát quy trình ly trích DNA tối ưu.

1


Xây dựng được quy trình duplex PCR có khả năng phát hiện sự hiện diện promoter
35S trên mẫu đậu nành.
1.3 Nội dung thực hiện
- So sánh các quy trình ly trích DNA từ mẫu tươi.
- Thực hiện phản ứng PCR với một cặp primer.
- Thay đổi các thành phần phản ứng và tìm các thông số thích hợp cho phản ứng
duplex PCR hai cặp primer.
- Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp duplex PCR đã xây dựng.
- So sánh với kỹ thuật Realtime PCR.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cây trồng chuyển gen
2.1.1 Định nghĩa
Cây trồng chuyển gen là cây mang một, hoặc nhiều gen được đưa vào nhân tạo thay vì
thông qua lai tạo. Những gen được đưa vào có thể được phân lập từ những loài thực vật
có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn.
Thực vật được tạo ra bằng cách này được gọi là cây trồng chuyển gen, tuy trên thực tế
tất cả các thực vật đều được chuyển gen từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình
thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong thời gian dài (Lê Trần Bình, 2008).
2.1.2 Các hướng chính trong tạo giống cây trồng chuyển gen
2.1.2.1 Chuyển gen kháng sâu
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sản sinh ra các protein kết tinh gây độc
đối với côn trùng nhưng không gây độc đối với động vật có xương sống. Vi khuẩn này
sản sinh 3 ngoại độc tố α, β, γ toxin và một nội độc tố δ toxin. Nội độc tố δ toxin đóng vai
trò quan trọng nhất, tinh thể protein độc tố δ của vi khuẩn này khi được côn trùng ăn phải
sẽ bị các enzyme protease phân giải thành các đoạn peptide, trong đó có đoạn có khối
lượng khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 12000 acid amin làm hỏng ruột côn trùng.
Năm 1987, các nhà nghiên cứu ở Bỉ đã tách được gen mã hóa cho protein độc tố này.
các gen mã hóa độc tố này nằm trên plasmid của vi khuẩn, được gọi chung là Cry. Từ đó,
gen này được phân lập, giải trình tự, tổng hợp vào vector và chuyển vào cây trồng như
đậu nành, bắp, bông vải...giúp chúng có khả năng chống lại côn trùng gây hại.
2.1.2.2 Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Khi sản xuất nông nghiệp, một trồng những vấn đề lo ngại hàng đầu là sự xâm lấn của
cỏ dại, chúng cạnh tranh dinh dưỡng, diện tích làm cản trở sự phát triển của cây trồng. Để
tiêu diệt cỏ dại, người ta thường sử dụng thuốc diệt cỏ. Vấn đề đặt ra là khi phun thuốc
diệt cỏ thì chỉ diệt cỏ mà không gây hại đến cây trồng, muốn vậy người ta phải tạo ra cây
trồng kháng thuốc diệt cỏ.
3


Hiện nay trên thị trường có nhiều loại thuốc diệt cỏ khác nhau được sử dụng, trong đó

phổ biến là thuốc diệt cỏ glyphosat. Đây là một loại thuốc có tác dụng diệt cỏ tốt, dễ tự
phân hủy và ít gây ô nhiễm môi trường. Cơ chế diệt cỏ là thuốc kìm hãm sự hoạt động của
enzym enol pyruvat sikimat phosphate synthetase (có chức năng chuyển hóa sản phẩm
quang hợp thành acid mang mạch vòng có tên là acid skimic). Khi acid skimic không
được hình thành, quá trình trao đổi chất của cỏ bị rối loạn và làm cho cỏ chết.
Người ta đã tìm được gen mã hóa enzyme này từ vi sinh vật và từ những cây chịu được
thuốc diệt cỏ glyphosat. Từ đó tiến hành phân lập và chuyển gen vào cây trồng, giúp cây
cây trồng có khả năng chống chịu được với thuốc diệt cỏ glyphosat. Nhờ phương pháp
này mà nhiều loại cây trồng kháng thuốc trừ cỏ đã ra đời như đậu nành, bắp, bông vải...
2.1.2.3 Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh
Ngoài sâu bọ, virus cũng là tác nhân gây hại nghiêm trọng cho cây trồng và không thể
dùng các loại thuốc thông thường để phòng trừ được nên việc tạo cây kháng virus là rất
quan trọng. Có nhiều cách tạo cây kháng virus: chuyển gen mã hóa protein vỏ virus,
chuyển gen tạo enzyme phân giải virus hoặc chuyển gen có trình tự đối bản với RNA của
virus... Trong các kỹ thuật trên, kỹ thuật chuyển gen mã hóa vỏ protein của virus vào cây
thường được dùng phổ biến. Khi có mặc gen mã hóa protein vỏ của virus ở trong tế bào
của cây thì sẽ gây hiệu ứng kìm hãm sự tổng hợp protein vỏ của gen tạo vỏ ở virus, từ đó
làm virus không nhân lên được.
Đã có nhiều giống cây trồng chuyển gen có khả năng kháng virus ra đời bằng phương
pháp này như: đu đủ kháng virus gây bệnh đốm vòng, thuốc lá kháng virus khảm dưa
chuột, thuốc lá kháng vi rus khảm alfa, khoai tây kháng virus xoăn lá, cam quít kháng
virus gây tàn lụi tristeza...
2.1.2.4 Chuyển gen cải thiện chất dinh dưỡng cây trồng
Người ta đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa cho protein tạo nhiều acid amin methionin
vào đậu nành và bắp. Kết quả là các cây chuyển gen đã tăng loại protein giàu methionin
lên hơn 8% trong tổng số protein có trong hạt.
Gần đây, một giống lúa nổi tiếng là Golden rice có khả năng tổng hợp chất β-caroten là
chất tiền thân của vitamin A. Trong gạo thông thường không chứa β-caroten nhưng lại
4

chứa các tiền chất của β-caroten, đó là chất geranyl pyrophosphate. Từ đó, người ta đã
chuyển nhóm gen mã hóa cho các enzyme giúp chuyển hóa chất geranyl pyrophosphate
này thành β-caroten, góp phần giúp giải quyết vấn đề thiếu vitamin A cho con người.
Đặc tính nông học
4%
Khác
7%
Tăng chất lượng
sản phẩm
22%
Kháng côn trùng
24%

Kháng nấm
4%

Kháng virus
10%

Kháng thuốc diệt
cỏ
29%

Hình 2.1 Tỉ lệ cây trồng biến đổi gen được đưa vào sản xuất (ISAAA,2010)
2.1.3 Một số cây trồng chuyển gen hiện nay
Đậu nành kháng chất diệt cỏ mang gen tạo ra tính chống chịu chất diệt cỏ, kiểm soát và
giảm vết thương cho cây, nâng cao hiệu quả canh tác do có năng suất cao, sử dụng đất
hiệu quả, tiết kiệm thời gian cho nông dân. Những dòng này vẫn giữ thành phần chất dinh
dưỡng và cách chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc như đậu nành bình thường.

Bắp chịu thuốc diệt cỏ được tạo ra theo kiểu tương tự đậu nành chịu hóa chất diệt cỏ.
Chúng cho phép người ta trồng xen trong vườn cây ăn trái tốt hơn và linh hoạt sử dụng
các hóa chất diệt cỏ để bảo vệ cây trồng. Bắp kháng sâu mang gen Bt có khả năng tổng
hợp nên protein mà khi sâu ăn phải sẽ gây thủng ruột làm chúng không thể tiếp tục ăn và
bị chết trong vòng một vài ngày.
Khoai tây kháng virus cuốn lá khoai tây bằng cách tạo ra vector mang tính lây nhiễm
của virus thực vật vào cây, giống như cách người ta tiêm chủng ngừa bệnh. Bông vải chịu
thuốc diệt cỏ, bông kháng sâu bảo vệ cây kháng ấu trùng sâu cuốn lá và sâu đục thân.
5


Cà chua chín chậm là cây thực phẩm biến đổi gen đầu tiên sản xuất ở các nước phát
triển. Loại cà chua này có thời gian chín dài hơn, hương vị thơm ngon hơn, giúp vận
chuyển và bảo quản dễ dàng hơn.
2.1.4 Tình hình cây trồng chuyển gen

Hình 2.2 Diện tích cây trồng chuyển gen từ năm 1996 đến 2011 (ISAAA, 2012)
Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu tiếp tục tăng mạnh. Trong năm 2011 đã
có thêm 12 triệu ha được đưa vào canh tác, tăng 8% so với năm 2010. Từ khi cây trồng
chuyển gen được đưa vào thương mại hoá năm 1996, nông dân tại 29 nước trên thế giới
đã đưa ra quyết định về việc trồng và tiếp tục trồng lại trên 1,25 tỷ hecta.
Trong năm 2011 cây trồng chuyển gen đã được 29 nước đưa vào canh tác trên diện
tích 160 triệu ha (tăng so với mức 148 triệu ha năm 2010), trong số 29 nước canh tác cây
trồng chuyển gen này có 19 nước đang phát triển và 10 nước công nghiệp. Với diện tích
trồng năm 2011 tăng tới 94 lần so với năm 1996, cây trồng công nghệ sinh học trở thành
cây trồng được đưa vào ứng dụng nhanh nhất trong lịch sử gần đây.
Tại các nước đang phát triển, diện tích trồng cây chuyển gen tăng nhanh gấp đôi và lớn
gấp hai lần so với mức tăng và diện tích trồng ở các nước công nghiệp. Các nước đang
phát triển đứng đầu về diện tích trồng cây trồng chuyển gen là Brazil và Argentina ở châu
Mỹ Latinh, Ấn Độ và Trung Quốc ở châu Á, và Nam Phi trên lục địa châu Phi.

6


Trong năm 2011, Hoa Kỳ tiếp tục là nước có diện tích trồng cây chuyển gen lớn nhất
trên toàn cầu với 69,0 triệu ha, với tỷ lệ áp dụng trung bình ~ 90% trên tất cả các loại cây
trồng công nghệ sinh học chủ chốt. Brazil đứng thứ hai với diện tích trồng 30,3 triệu ha.
Châu Phi trồng 2,5 triệu ha cây trồng chuyển gen, và đang đạt được những tiến bộ trong
khảo nghiệm thực địa theo quy định quản lý đối với các nước mới trồng và cây trồng
chuyển gen. (James, ISAAA, 2012).
Tại Việt Nam, vấn đề trồng cây trồng chuyển gen vẫn đang được thảo luận. Hiện tại,
chỉ có các cơ sở được cấp phép mới được trồng cây chuyển gen, hầu hết phục vụ mục
đích nghiên cứu với diện tích trồng nhỏ.
2.1.5 Lợi ích từ cây trồng chuyển gen
Cây trồng chuyển gen giúp tăng năng suất, cung cấp đủ thực phẩm cho loài người đang
ngày càng gia tăng, đồng thời cho ra đời nhiều loại thực phẩm có nhiều chất dinh dưỡng
hơn, có lợi cho sức khỏe hơn. Các cây trồng chuyển gen có nhiều đặc tính ưu việt mà cây
trồng thông thường không có như tăng thời gian bảo quản thực phẩm, tăng hàm lượng
đường, tinh bột, protein, làm giảm độ chua, tăng chất thơm...Người nông dân có thêm
những giống mới có khả năng chống các tác nhân làm giảm năng suất trên cây trồng như
sâu bọ, côn trùng, virus hay thuốc diệt cỏ (Lê Trần Bình, 2008).
2.1.6. Nguy cơ từ cây trồng chuyển gen
2.1.6.1 Lo ngại về vấn đề môi trường
Vấn đề lo ngại nhất của cây trồng chuyển gen đối với môi trường là cây kháng với côn
trùng có hại thì cũng có thể diệt cả côn trùng có lợi, những chất độc này có thể tác động
tới sinh vật không phải sinh vật cần diệt. Điều lo ngại khác là các gen ngoại lai từ các cây
trồng chuyển gen có thể được chuyển sang các thực vật khác sống gần đó. Ví dụ, cây đậu
nành trồng mang gen kháng thuốc diệt cỏ, các cây đậu nành mọc hoang dại gần đó có thể
được thụ phấn chéo và đậu nành hoang dại sẽ trở nên có khả năng kháng thuốc diệt cỏ.
Theo cách này người ta cho rằng, đến một lúc nào đó sẽ có các siêu cỏ dại mà chúng ta sẽ

không thể diệt được chúng bằng thuốc diệt cỏ.

7


2.1.6.2 Lo ngại về sức khỏe con người
Sản phẩm chuyển gen là protein, do vậy có thể có những thực phẩm do cây chuyển gen
tạo ra mang những chất gây dị ứng cho người sử dụng. Ví dụ, nếu chuyển gen từ cây đậu
vào bông cải chẳng hạn. Một người bị dị ứng với đậu nành khi ăn bông cải chuyển gen sẽ
bị dị ứng. Sự nguy hiểm có thể nghiêm trọng hơn vì không ai nghĩ rằng ăn nhiều bông cải
lại bị dị ứng nguy hiểm đến thế. Nhiều vector chuyển gen mang các gen chỉ thị là các chất
kháng sinh. Các gen này có thể thông qua cây trồng chuyển gen trao đổi với các vi sinh
vật khác nhau, tạo nên các vi sinh vật kháng với các loại kháng sinh và chúng không bị
tiêu diệt bởi kháng sinh nữa.
2.1.6.3 Lo ngại về kinh tế
Giá thành sản xuất của các cây trồng chuyển gen hiện nay là tương đối cao. Các công
ty sản xuất các cây trồng chuyển gen muốn kiếm lợi nhuận cao từ việc tạo ra cây trồng
chuyển gen vì họ đã đầu tư số kinh phí khá lớn để nghiên cứu và phát triển các giống cây
này. Do vậy, những nước nghèo sẽ gặp nhiều khó khăn để mua được các hạt giống từ các
công ty trên vì giá thành quá đắt (Nguyễn Văn Mùi, 2009).
2.1.7 Dán nhãn thực phẩm biến đổi gen
Hiện nay các quy định dán nhãn dựa trên các đặc tính hóa học của sản phẩm mà không
dựa vào quá trình sản xuất ra sản phẩm đó. Ví dụ, các quy định dán nhãn chỉ yêu cầu dán
nhãn các thực phẩm là GM hay là không GM, nếu có sự thay đổi thành phần dinh dưỡng,
hoặc xuất hiện các thành phần mới có độc tính hoặc gây dị ứng (ISAAA,2012).
Tại Canada, chính phủ yêu cầu dán nhãn đặc biệt đối với tất cả thực phẩm có những lo
ngại về an toàn như khả năng gây dị ứng và có phát hiện thấy sự thay đổi về dinh dưỡng,
thành phần. Nhãn phải chỉ rõ bản chất của sự thay đổi này và phải dễ hiểu, đúng sự thật
và không gây hiểu nhầm.
Tại Hoa Kỳ, thực phẩm phải dán nhãn nếu chúng gây ra những mối lo ngại về sức

khỏe, có các cách sử dụng khác nhau, hoặc thay đổi giá trị dinh dưỡng, hoặc khi tên thông
thường không còn đủ để mô tả thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật biến đổi di truyền.
Tại Cộng đồng châu Âu, Anh, thực phẩm có chứa 1%, hoặc hơn thành phần biến đổi di
truyền tạo ra nhờ các kỹ thuật biến đổi di truyền thì bắt buộc phải được dán nhãn, trong
8


khi không có yêu cầu dán nhãn đối với các thành phần có nguồn gốc từ cây trồng biến đổi
di truyền nhưng không chứa DNA, hoặc protein mới. Các sản phẩm tinh sạch cao như
dầu, đường và tinh bột từ bắp, đậu nành và cải dầu biến đổi di truyền không thuộc đối
tượng phải dán nhãn.
Tại Australia, New Zealand, thực phẩm có mang các tính trạng thay đổi như thay đổi
về giá trị dinh dưỡng, hoặc có chứa các DNA, hoặc protein mới tạo ra từ kỹ thuật biến đổi
di truyền bắt buộc phải dán nhãn. Thực phẩm chỉ được phép lẫn tối đa không có chỉ định
là 1% thành phần GM.
Tại Nhật Bản, Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Nhật Bản có trách nhiệm phê
chuẩn các an toàn môi trường, thức ăn chăn nuôi và dán nhãn thực phẩm công nghệ sinh
học. Yêu cầu dán nhãn với các sản phẩm tạo ra từ công nghệ sinh học nếu DNA, hoặc
protein công nghệ sinh học có thể phát hiện nhờ khoa học trong các thực phẩm cuối cùng.
Tại Việt Nam, trong nghị định “Về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu
vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen”, số 69/2010/NĐ-CP của Thủ tướng
chính phủ nước Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam, Chương VIII, điều 43 ghi nhãn đối
với hàng hóa: “Tổ chức, cá nhân lưu thông hàng hóa có chứa sinh vật biến đổi gen, sản
phẩm của sinh vật biến đổi gen trên thị trường với tỷ lệ lớn hơn 5% mỗi thành phần thì
ngoài việc phải tuân thủ các quy định của pháp luật về ghi nhãn hàng hóa còn phải thể
hiện các thông tin liên quan đến sinh vật biến đổi gen trên nhãn hàng hóa.”
2.2. Đậu nành và đậu nành chuyển gen
2.2.1 Đậu nành
Đậu nành, tên khoa học Glycine max (L) là một loại cây trồng đã có từ lâu đời, được
đánh giá cao nhờ vào giá trị kinh tế của nó. Hạt đậu nành có thành phần dinh dưỡng cao,

hàm lượng protein trung bình khoảng từ 38 - 40%, lipit từ 18 - 20%, giàu vitamin và muối
khoáng. Protein của đậu nành có phẩm chất tốt nhất trong số các protein của thực vật.
Hàm lượng protein từ 38 - 40%, cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng
protein có trong các loại đậu nành khác. Hàm lượng của các axit amin có chứa lưu huỳnh
như methionin, cystein... của đỗ tương rất gần với hàm lượng của các chất này có trong
trứng. Protein của đậu nành dễ tiêu hoá và không có các thành phần tạo thành cholesterol.
9


a

b

Hinh 2.3 Cây và quả đậu nành (www.britanica.com)
(a) cây, (b) quả
Hạt đậu nành có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu khác nên được coi là
cây cung cấp dầu thực vật. Lipit của đậu nành chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có
hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm ngon. Trong hạt đậu nành còn có khá nhiều loại vitamin,
đặc biệt là hàm lượng của các vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP,
A,E, K, D, C v.v... và các loại muối khoáng khác.
Đậu nành còn là vị thuốc để chữa bệnh, có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày và
ruột; làm thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, mới ốm dậy
hoặc do lao động quá sức. Các chất lecithin và casein có trong hạt đậu nành còn có thể
dùng riêng hoặc phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng. Bột đậu nành sau khi đã ép lấy dầu, bã
dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm
theo hướng công nghiệp.
Đậu nành còn có khả năng tích luỹ và làm giàu đạm cho đất nhờ vào sự cộng sinh giữa
vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo và bồi dưỡng đất, có khả
năng trồng trên nhiều loại đất khác nhau. Đậu nành là loại cây ngắn ngày, thời gian sinh
trưởng từ 70 - 120 ngày tùy thuộc giống cây trồng.

10


2.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ
2.2.2.1 Trên thế giới
Đậu nành là cây lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất của thế giới, đứng hàng thứ 4
sau cây lúa mì, lúa nước và bắp. Do khả năng thích ứng khá rộng nên nó được trồng ở
khắp năm châu lục, tập trung nhiều nhất là châu Mỹ 73,03%; châu Á 23,15% ... Hàng
năm trên thế giới trồng khoảng 54 - 56 triệu ha đậu nành với sản lượng khoảng 103 – 114
triệu tấn . Các nước trồng diện tích nhiều là Mỹ, Braxin, Trung Quốc, Argentina.
Sản phẩm đậu nành được lưu hành trên thế giới chủ yếu ở dưới ba dạng là hạt, dầu và
bột. Thị trường tiêu thụ nhiều nằm ở các nước như Mỹ, các nước ở Châu Âu, Braxin,
Trung Quốc, Nhật, Ấn Độ...
2.2.2.2 Trong nước
Ở Việt Nam ta, cây đậu nành đã được phát triển rất sớm ngay từ khi nó còn là một cây
hoang dại, sau được thuần hoá và trồng như là một cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao. Vai trò của cây đậu nành ở nước ta hiện nay cũng như những năm tới chủ yếu là
nhằm giải quyết vấn đề đạm cho người và gia súc, thay thế một phần bột cá và thoả mãn
một phần nhu cầu dầu thực vật, sau đó mới đến xuất khẩu.
Mặc dù quy mô sản xuất còn khá nhỏ và nhu cầu tiêu thụ trong nước có xu hướng
giảm, nhưng sản lượng đậu nành nước ta năm 2010 vẫn đạt 297.000 tấn. Nguyên nhân
chính là do sự mở rộng đáng kể về diện tích các cây trồng khác và những nỗ lực nhằm cải
thiện năng suất. Tuy nhiên, sản lượng trên vẫn thấp hơn so với mục tiêu đề ra do chi phí
sản xuất tăng và năng suất đậu nành của nước ta chưa cao.
Theo thống kê năm 2011 của Chính phủ, đậu nành được trồng ở 28 tỉnh trên khắp cả
nước, trong đó 70% ở miền Bắc và 30% ở miền Nam. Khoảng 65% đậu nành nước ta
được trồng ở vùng cao, những nơi đất không cần màu mỡ; và 35% được trồng ở những
vùng đất thấp như khu vực đồng bằng sông Hồng. Đậu nành được trồng ở nhiều địa
phương trên khắp cả nước vào nhiều thời điểm nên có cả vụ xuân, vụ hè và vụ đông.

11


2.2.3 Đậu nành chuyển gen

Hình 2.4 Diện tích các loại cây trồng chuyển gen từ năm 1996 đến 2011(ISAAA,2012)
Trên thế giới, đậu nành chuyển gen được triển khai trồng từ rất sớm. Tại Hoa Kỳ, tính
đến năm 2010 đã có đến 31,6 triệu hecta diện tích đất trồng đậu nành chuyển gen. Tại một
số nước Châu Mỹ Latin như Braxin, Argentina cũng triển khai trồng đậu nành chuyển gen
với quy mô lớn, cung cấp lương thực trong nước cũng như xuất khẩu sang các nước khác
như Trung Quốc. Các chủng đậu nành chuyển gen trên thế giới hầu hết là các chủng
kháng lại thuốc diệt cỏ, côn trùng nên năng suất thu được cao hơn so với các chủng thông
thường.

Hình 2.5 Cánh đồng đậu nành chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ (www.greenpeace.com)
12


Tại Việt Nam, các nhà khoa học đang tiến hành áp dụng công nghệ sinh học vào các
loại đậu nành cao sản mới để tìm ra giống cho năng suất cao với chi phi sản xuất thấp.
Hiện tại, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã phê duyệt 3 loại cây trồng chuyển
gen trên các cánh đồng thí nghiệm là bắp, bông vải và đậu nành. Rất nhiều nông dân quan
tâm tới việc phát triển đậu nành Bt, nhưng cho tới nay chưa có công ty nào áp dụng để
thực hiện khảo nghiệm giống đậu nành Bt vào lúc này.
2.3. Các phương pháp xác định cây trồng chuyển gen
Hiện nay, có 2 phương pháp xác định cây trồng chuyển gen: dựa vào protein (kỹ thuật
ELISA) và dựa vào gen chuyển (PCR, Realtime PCR).
2.3.1 ELISA
Phương pháp ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) có rất nhiều dạng mà đặc

điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó
kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng,
enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra
phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết
được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp này được thiết kế
cho việc phát hiện và định lượng peptide, protein, antibody, hormone. Kĩ thuật này khá
nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất
thấp.
Thuận lợi của phương pháp này là có khả năng phân tích dựa vào đường chuẩn. Kỹ
thuật ELISA có thể cho phép định lượng sự hiện diện sản phẩm biến đổi gen với tỷ lệ từ
0,3% đến 5%, tuy nhiên khuyết điểm lớn nhất của nó là kĩ thuật này chỉ áp dụng được cho
các mẫu sản phẩm thô, chưa chế biến do protein có thể bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy
nhiên, khi dùng để phân tích trên mẫu thực phẩm thì phương pháp này không thích hợp
do hầu hết chúng đều trải qua quá trình chế biến với nhiệt độ cao trong thời gian khá dài
nhằm diệt khuẩn và giữ chất lượng sản phẩm. Chính điều này đã hạn chế khá lớn phạm vi
áp dụng của kĩ thuật ELISA (Nguyễn Hữu Trưởng, 2005).

13


2.3.2. PCR
2.3.1.1 Nguyên lý
Kỹ thuật này sử dụng các đoạn DNA ngắn (primer) có khả năng bắt cặp bổ sung với
một đầu của gen cần xác định, khi có sự hiện diện của DNA polymerase và các thành
phần cần thiết, enzyme này sẽ khuếch đại trình tự nằm giữa các primer. Thật vậy, nếu ta
cung cấp hai primer chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ
chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2001). Từ đó, nếu
thiết kế được các primer đặc hiệu với gen chuyển thì sau phản ứng PCR, ta có thể biết
được mẫu phân tích có chứa gen chuyển hay không thông qua việc xác nhận sự hiện của
sản phẩm PCR bằng kỹ thuật điện di. Kỹ thuật PCR thích hợp để phát hiện thực phẩm

biến đổi gen do DNA có độ bền vững cao, có thể tồn tại qua quá trình chế biến thực phẩm
khắc nghiệt, giúp cho việc xác định trở nên dễ dàng hơn so với kỹ thuật ELISA.
2.3.2.2 Các giai đoạn phản ứng

Hình 2.6 Nguyên tắc kỹ thuật PCR (www.biorad.com)
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn biến tính: Trong dung dịch phản ứng chứa các thành phần cần thiết cho sự sao
chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử,
thường là ở 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
14