Xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-time PCR

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP




BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR







Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỮU TRƢỞNG



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 – 2005




ii


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC











BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG

PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR






Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NGUYỄN HỮU TRƢỞNG
Th.S NGUYỄN THÁI THỦY





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 – 2005




iii

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ
môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, nhận xét và giúp đỡ em hoàn thành

khóa luận này.
Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Thái Thủy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất
nhiều, cũng như đã cho em những lời khuyên quý giá để hoàn thành khóa luận. Em xin
gửi đến thầy lời biết ơn chân thành nhất.
Thầy Phương, chị Kim Anh, anh Luân (công ty Bio-Rad) đã giúp đỡ em thực
hành và nắm vững phương pháp Real-Time PCR.
Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Bùi Văn Lệ, anh Vũ, chị Liên, anh Nam cùng
với các anh chị và các bạn đang làm việc tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học
Phân tử (Lab B), trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình
hướng dẫn và dành cho em những tình cảm quý giá trong suốt quá trình thực hiện khóa
luận này.
Con xin gửi lòng tri ân đến Ba, Mẹ, em Thành và những người thân trong gia
đình đã luôn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất.
Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học K27 đã cùng tôi chia
sẻ biết bao buồn vui cũng như đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt những năm
tháng dưới mái trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh.
Xin chân thành cảm ơn bạn Khánh Đan đã luôn động viên, giúp đỡ và dành cho
tôi những tình cảm tốt đẹp nhất.

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người
Sinh viên Nguyễn Hữu Trưởng




iv

TÓM TẮT

Nguyễn Hữu Trƣởng, Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. BƢỚC

ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI
GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn và Th.S Nguyễn Thái Thủy.
Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phòng thí nghiệm Công
nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh.
Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S
bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của
phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp trên thị trường Tp
Hồ Chí Minh và phụ cận.
Đề tài đã có những kết quả sau:
Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen:
- Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp. Quy trình đề nghị:
dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein:
phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol.
- Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị:
Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I.
Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm có promoter 35S cho vạch khuếch
đại có kích thước 123 bp với nhiệt độ nóng chảy 86-86,5oC.
- Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen có kết quả sàng lọc dương tính, dựa
trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dò Taqman.
Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR có khả năng phát hiện và
định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác
một mẫu có tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước.
- Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam có sản phẩm
chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau.

v

SUMMARY

NGUYEN HUU TRUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, VietNam.
Aug 2005.

ESTABLISHING A PROCESS OF GMOs (Genetically Modified Organisms)
QUANTIFICATION BY REAL-TIME PCR METHOD

Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy.

Recently, GMO is a controversial problem in the world. Because its advantages and
disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its
affects to environment and human health. For this purpose, methods for GMOs
detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO
presentation in food and feed need to be developed. So, in this thesis, a process for
GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one
of the most exactly methods for GMO quantification now.
Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S
promoter by Real-Time PCR method. Evaluating quantification ability and efficiency
of method. Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in
Ho Chi Minh City.
Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method:
- Step 1: DNA extraction:
Cell wall destruction solution: CTAB 2%.
Protein denaturalization solution: phenol/chloroform.
DNA precipitation solution: Isopropanol
- Step 2: GM maize screening based on 35S promoter.
Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye.

Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86-
86,5
o
C).
- Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter.
Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman.
Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a
experiment template, exactly quantification a template which percentage
ratio of GMO presentation has known.
- Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO
in its ingredients.
Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been
established and can be applied to many other species.





vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii
TÓM TẮT .................................................................................................................. iv
MỤC LỤC ................................................................................................................. vi
CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................................... xi
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. xii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. xiv
PHẦN I: MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1.Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1

2.Mục đích và yêu cầu .............................................................................................. 2
2.1.Mục đích ...............................................................................................................2
2.2.Yêu cầu .................................................................................................................2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) ......... 3
2. Quá trình tạo sinh vật GMO .................................................................................. 3
2.1.Quá trình cơ bản ...................................................................................................3
2.2.Promoter CaMV 35S ............................................................................................4
3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen ......................................................... 6
3.1.Ứng dụng ..............................................................................................................6
3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] ...................................................... 6
3.1.2. Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17]........................................... 7
3.2.Tác động có lợi của thực vật chuyển gen .............................................................8
4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới ......................................................... 9
4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới ................................................................11
5.Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .................. 12
5.1.Các rủi ro có thể gặp [34] .....................................................................................12
5.2.Tác động có hại ....................................................................................................12
5.2.1. Môi trường .............................................................................................. 13
5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng ....................................................................... 13
5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể ...................................................... 14




vii

5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .....................................................14
6. .. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới .......................................... 16
6.1.Quy định tại châu Âu [33]: ...................................................................................17

6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA ................................................... 18
6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu ..................... 19
6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................... 19
6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen ................................. 19
7. .. Tình hình Việt Nam ............................................................................................... 21
7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen ....................................................21
7.2.Vấn đề thương mại hóa và kiểm soát sinh vật biến đổi gen .................................21
8. .. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen ......................................... 22
8.1.Phương pháp ELISA ............................................................................................23
8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] ....................................................23
8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .....................................................................24
8.3.1. Hóa chất định lượng ............................................................................... 24
8.3.1.1. SYBR Green I ................................................................................ 25
8.3.1.2. Mẫu dò phân hủy (Taqman probe) ................................................. 25
8.3.2. Công cụ phát hiện ................................................................................... 27
8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR ..........................................28
8.4.1. Quan hệ định lượng ................................................................................ 28
8.4.2. Thiết kế thí nghiệm ................................................................................. 29
8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR ............................................................ 30
8.4.4. Tính toán hàm lượng GMO .................................................................... 31
8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen
[9][44]32
8.6.Một số công trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên
promoter 35S. .............................................................................................................34
8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. .............................. 34
8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S .............................................. 35
PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ................................ 36
1.Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 36
2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm ............................................................................... 36

viii

2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm .............................................................................36
2.2.Thời gian thực hiện ...............................................................................................36
3.Tiến trình thí nghiệm: ............................................................................................. 36
4.Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................... 37
5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA ............................................ 38
5.1.Mục tiêu ................................................................................................................38
5.2.Vật liệu .................................................................................................................38
5.3.Phương pháp thực hiện .........................................................................................38
5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích...................................................41
6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................................... 41
6.1.Mục tiêu ................................................................................................................41
6.2.Nguyên tắc ............................................................................................................41
6.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................42
6.4.Trang thiết bị ........................................................................................................42
6.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................43
6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR ..................................... 43
6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại ........................................ 43
6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại............................................................... 44
6.5.4. Phân tích kết quả ..................................................................................... 45
7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen ........ 46
7.1.Mục tiêu ................................................................................................................46
7.2.Nguyên tắc ............................................................................................................46
7.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................46
7.4.Trang thiết bị ........................................................................................................46
7.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................46

7.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 46
7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S ...................................... 47
7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng .......................................................... 48
7.5.2. Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 48
7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix .............................................................. 49
7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix ............................................... 49
7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR .......................... 49




ix

7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển ................................................................. 50
7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm .................................................................. 51
8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR.
..... 54
8.1.Mục tiêu ................................................................................................................54
8.2.Nguyên tắc ............................................................................................................54
8.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................54
8.4.Trang thiết bị ........................................................................................................54
8.5.Hóa chất ................................................................................................................54
8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix ......................................... 55
8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference
calibration DNA standards) ............................................................................... 55
8.6.Phương pháp thực hiện .........................................................................................55
8.6.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 56
8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng .......................................................................... 56
8.6.1.2. Độ chính xác:.................................................................................. 56
8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng ................................................................ 56

8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR ................................................... 57
8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR .......................... 57
8.6.5. Phân tích kết quả ..................................................................................... 58

9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng 58
9.1.Mục tiêu ................................................................................................................58
9.2.Nguyên tắc ............................................................................................................58
9.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................58
9.4.Trang thiết bị và hóa chất .....................................................................................58
9.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................59
9.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 59
9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng ................................................................ 59
9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập ............................ 59
9.5.4. Phân tích kết quả ..................................................................................... 59
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 60




x

1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA ..................................................................... 60
2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................................... 63
2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .......................................................................63
2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green .......65
3.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO .................................... 71
3.1.Xây dựng đường chuẩn: .......................................................................................71
3.2.Đánh giá kết quả định lượng ................................................................................74
4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR
..... 76

4.1.Độ nhạy của phương pháp: ...................................................................................76
4.2.Độ chính xác của phương pháp ............................................................................78
5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR ................. 79
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 85
1.Kết luận ..................................................................................................................... 85
2.Đề nghị ...................................................................................................................... 86
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 87
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 92




xi

CHỮ VIẾT TẮT

35S: 35S promoter
Bp: Base pair
Bt: Bacillus thringensis
CaMV: Cauliflower mosaic virus
CCD: Charged coupled device
C
T
: Threshold cycle
CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates
EC: European Community
ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay
FAO: Food and Agriculture Organization

GMOs: Genetically modified organisms
GMP: Genetically modified plant
N/A: Not available
NTC: No template control
OD: Optical density
PCR : Polymerase chain reaction
QC-PCR : Quantitative competitive PCR
RNA: Ribonucleic acid
SD: Standard Deviation
SDS: Sodium dodecyl sulfate
TAE: Tris,Acetic acid, EDTA
Taq : Thermus aquaticus
Tm : Melting Temperature
Tnos: Terminator nopaline synthetase
U: Unit
UV: Ultra violet




xii

DANH MỤC HÌNH

TRANG
Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17] .............................................................................. 4
Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46] ......................................................................... 5
Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16] ................................................................... 5
Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17] ............................................................. 9
Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu [20] .............................................. 10

Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18] .................................. 10
Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19]........................................... 11
Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] ................................................... 15
Hình 2.9: Không yêu cầu dán nhãn [42] ....................................................................... 19
Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] ....................................................................... 19
Hình 2.11: Quy trình kiểm soát GMO tại châu Âu [13] ............................................... 20
Hình 2.12 : QC-PCR ..................................................................................................... 23
Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] ....................................................... 25
Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman [43] ............................................... 26
Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] ............................................................................. 27
Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] ........................ 28
Hình 2.17: Đường chuẩn cho phản ứng định lượng [14] .............................................. 30
Hình 2.18: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14] ......................................................... 31
Hình 2.19: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMO [44].................. 34
Hình 3.1: Màn hình Melt Curve.................................................................................... 45
Hình 3.2: Màn hình Edit Protocol ................................................................................. 50
Hình 3.3: Màn hình Edit Plate Setup ............................................................................ 51
Hình 3.4: Màn hình View Quantities/Identifiers .......................................................... 51
Hình 3.5: Màn hình View Post-Run Data ..................................................................... 52
Hình 3.6: Màn hình PCR Quantification ...................................................................... 53
Hình 3.7: Màn hình PCR Standard Curve .................................................................... 53
Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích ........................................................ 60
Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm ............................................................... 61
Hình 4.3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phương pháp 1 ............................................... 64
Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng ..................................... 65
Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm .................................... 66
Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng .......................................................... 67
Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm ......................................................... 67
Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp ............................................... 71
Hình 4.9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S ................................... 72

xiii

Hình 4.10: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phương pháp 1 ........................ 73
Hình 4.11: Đồ thị Melt curve của phương pháp SYBR Green I ở thí nghiệm 3 .......... 75
Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy ................................................ 76
Hình 4.13: Đồ thị định lượng p35S của các mẫu thí nghiệm ....................................... 78
Hình 4.14: Đường chuẩn phản ứng định lượng p35S ................................................... 79
Hình 4.15: Đồ thị định lượng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm ....................... 79
Hình 4.16: Đường chuẩn phản ứng định lượng gen tham chiếu................................... 79










xiv

DANH MỤC BẢNG

TRANG
Bảng 2.1: Một số giống bắp được cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) ......... 11
Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen .............. 17

Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm ............................................................................................ 38
Bảng 3.2: Các quy trình ly trích .................................................................................... 39
Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31] .............................. 42
Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 ........................................................................... 42
Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 .................................... 43
Bảng 3.6: Chương trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 ......................................... 43
Bảng 3.7: Phương pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 ........................................ 44
Bảng 3.8: Chương trình nhiệt phân tích Melt curve ..................................................... 44
Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29] ............................................................................................. 47
Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3 .................................. 48
Bảng 3.11: Chương trình nhiệt của 2 phương pháp ...................................................... 49
Bảng 3.12: Lượng lý thuyết (Số lượng phân tử) của hai chuẩn.................................... 55
Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phương pháp Real-Time PCR ....................................... 56
Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4 ....................... 57
Bảng 3.15: Chương trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dò Taqman) ........ 57
Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA ..................................................... 60
Bảng 4.2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu ................................................................. 62
Bảng 4.3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt ................................................................... 63
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 1 ....................................... 64
Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 .... 65
Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc các mẫu thí nghiệm trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 ... 66
Bảng 4.7: Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu thí nghiệm............. 68
Bảng 4.8: So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trong thí nghiệm 2 ................ 69
Bảng 4.9: Chu kỳ phát hiện mẫu chuẩn của 2 phương pháp ........................................ 71
Bảng 4.10: Các thông số xây dựng đường chuẩn ......................................................... 72
Bảng 4.11: Kết quả thu nhận từ 2 phương pháp trong thí nghiệm 3 ............................ 74
Bảng 4.12: Kết quả định lượng mẫu 1 copy ................................................................. 77
Bảng 4.13: Kết quả định lượng mẫu Bt 176 1% ........................................................... 78
Bảng 4.14: Các thông số kết quả của thí nghiệm ......................................................... 80
Bảng 4.15: Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm ................................................. 81

Bảng 4.16: Độ lệch tiêu chuẩn chu kỳ phát hiện của mẫu (C
T
Standard Deviation) .... 81
Bảng 4.17: Kết quả định lượng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại) .............................. 82





1

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Hiện nay, cùng với xu thế hoà nhập vào nền kinh tế thế giới, việc xuất nhập khẩu
các sản phẩm nông sản đã trở nên phổ biến ở nước ta. Điều này giúp cho nguồn thực
phẩm cung cấp trong nước trở nên phong phú hơn, cho phép người dân lựa chọn và sử
dụng nhiều loại thực phẩm mới có chất lượng cao, phẩm chất tốt, góp phần nâng cao
dinh dưỡng trong bữa ăn của người Việt Nam. Bên cạnh đó, nông sản cũng là một mặt
hàng xuất khẩu chính, đem lại nguồn thu ngoại tệ đáng kể cho nước ta trong thời gian
qua. Trong quá trình xuất nhập khẩu các mặt hàng này, các biện pháp quản lý cũng như
các phương pháp giúp xác định nguồn gốc nông sản nhằm đảm bảo các chỉ tiêu an toàn
về sức khỏe và môi trường là rất quan trọng. Điều này xuất phát từ một thực tế là sự
phát triển ngày càng cao của công nghệ sinh học và công nghệ gen cho phép ta có thể
dễ dàng biến đổi, cải tạo vật chất di truyền sinh vật, bổ sung các tính trạng mới theo ý
muốn nhằm mục đích làm cho cây trồng, vật nuôi ngày càng có phẩm chất và chất
lượng tốt hơn. Tuy nhiên việc các sinh vật biến đổi gen (GMOs) này có thể gây ra các
tác động xấu đến môi trường và sức khoẻ người tiêu dùng khi sử dụng chúng hay
không là việc ta không thể nào kiểm soát được. Vì vậy, trên thế giới, đặc biệt là tại
Châu Âu, chính phủ các nước đã triển khai nhiều biện pháp kĩ thuật nhằm phát hiện và

định lượng được những biến đổi trên vật chất di truyền (DNA) cây trồng, vật nuôi do
tác động của các kĩ thuật công nghệ sinh học. Mục đích là kiểm soát và ngăn ngừa các
tác động xấu có thể có của các sản phẩm biến đổi gen đồng thời cho phép người tiêu
dùng lựa chọn sử dụng các nông sản truyền thống (không biến đổi vật chất di truyền)
hay các nông sản đã được biến đổi di truyền. Trong số các kĩ thuật đã được các nước
trên thế giới ứng dụng, có thể nói Real-time PCR là một trong những kĩ thuật cho phép
phát hiện và định lượng được những thay đổi trên DNA sinh vật một cách chính xác
nhất. Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rất rộng rãi trên thế giới và gần như là một
qui trình bắt buộc phải thực hiện trong việc phát hiện và định lượng các sản phẩm
GMO trước khi cấp phép lưu hành trên thị trường, đặc biệt là tại các quốc gia Châu Âu.
Do tác động của các qui định này, các sản phẩm nông nghiệp của nước ta trong tương
lai khi tham gia vào thị trường thế giới, bắt buộc phải trải qua bước kiểm tra GMO




2

trước khi được cấp phép. Thực tế này đòi hỏi nước ta phải sớm xây dựng được một qui
trình kiểm tra, phát hiện và định lượng các sản phẩm GMO xuất nhập khẩu ở nước ta.
Mặc dù đây là một vấn đề còn mới mẻ nhưng thiết nghĩ điều này sẽ rất cần thiết trong
tương lai một khi nước ta hoà nhập vào nền kinh tế toàn cầu, đặc biệt là Tổ chức
Thương mại Thế giới (WTO). Vì lý do đó, được sự cho phép của thầy Lê Đình Đôn và
thầy Nguyễn Thái Thủy, em quyết định chọn đề tài khoá luận tốt nghiệp là: Bước đầu
xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-Time
PCR.

2. Mục đích và yêu cầu
Mục đích
- Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên trình tự promoter

35S.
- Định lượng promoter 35S trên một số sản phẩm bắp và thực phẩm có chứa
bắp hiện diện trên thị trường.

Yêu cầu
- Nắm vững kĩ thuật Real-time PCR: thao tác chính xác, hạn chế sai sót trong
thực hiện.
- Sàng lọc được các mẫu bắp biến đổi gen dựa trên các vạch điện di (123 bp)
có nhiệt độ nóng chảy (86
o
C).
- Tính toán được tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một số mẫu bắp và thực
phẩm chứa bắp lưu hành trên thị trường dựa trên định lượng promoter 35S và
gen tham chiếu.




3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism)
Vào thế kỷ 20, sinh học đã có những bước tiến vượt bậc trong việc nghiên cứu
sinh học phân tử ở mức độ DNA và protein. Các tiến bộ này đã được ứng dụng vào
thực tiễn và phát triển thành một công nghệ mới, đó là công nghệ gen, bao gồm: các kỹ
thuật tái tổ hợp DNA và chuyển nạp gen. Chúng thật sự là những bước đột phá của
nhân loại trong lĩnh vực sinh học hiện đại, mở ra những chân trời mới với những khám
phá và ứng dụng vô tận cho cuộc sống và lợi ích của con người.
Một trong các ứng dụng đó chính là việc tạo ra các sinh vật biến đổi gen (GMO-

genetically modified organism), đặc biệt là cây trồng biến đổi gen (GMP-genetically
modified plant). Với các ưu điểm nổi bật, các giống thực vật này khi ra đời đã góp phần
nâng cao chất lượng và sản lượng lương thực, thực phẩm, một vấn đề cấp bách của
nhân loại.
Hiện nay, trên thế giới có nhiều định nghĩa khác nhau về sinh vật biến đổi gen
(GMO). Tuy nhiên, hầu hết chúng được định nghĩa là những sinh vật mà vật chất di
truyền của chúng đã được biến đổi theo những cách không xảy ra trong tự nhiên như
các quá trình lai chéo hay biến đổi tự nhiên. Đối với thực vật, thuật ngữ này được dùng
để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã được chuyển nạp ổn định những gen
hữu ích mới bằng các kĩ thuật chuyển nạp gen và trong đa số trường hợp các gen này
được biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng (protein) [33].

2. Quá trình tạo sinh vật GMO
Quá trình cơ bản
Sinh vật biến đổi gen là sản phẩm của những tiến bộ khoa học kĩ thuật tiên tiến
nhất của con người trong công nghệ sinh học thực vật. Mặc dù các kĩ thuật tạo ra chúng
khá đa dạng và phức tạp, quá trình vẫn có những bước tiến hành chung để đạt được kết
quả cuối cùng. Để thực hiện quá trình này, những vấn đề quan trọng về cơ chế sinh lý,
sinh hóa, sự điều hòa và biểu hiện gen cũng như những sản phẩm do gen đó tạo ra cần
phải được chú ý và nghiên cứu nhằm đảm bảo cho sự thành công của quá trình.




4



Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17]
Các bước cơ bản bao gồm:

- Ly trích acid nucleic (DNA/RNA)
- Dòng hóa gen
- Thiết kế gen cho quá trình chuyển gen
- Chuyển gen
- Lai backcross
Đây thật sự là một quá trình khá phức tạp và tốn kém. Thời gian cần thiết cho
việc phát triển một giống cây trồng chuyển gen mới phụ thuộc vào gen mong muốn,
giống thực vật, nguồn gen và sự phê chuẩn của cơ quan quản lý. Nó kéo dài khoảng từ
6-15 năm trước khi một dòng lai chuyển gen mới được phép thương mại hóa trên thị
trường [17].

Promoter CaMV 35S
Để tạo cây chuyển gen có hiệu quả cao trong sản xuất và thương mại, việc điều
hòa sự biểu hiện gen hữu ích được chèn vào trong bộ gen của cây trồng rất quan trọng.
Điều này được thực hiện nhờ gắn vào gen hữu ích một promoter và terminator nhằm
điều khiển sự biểu hiện của gen đó. Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều promoter được




5

sử dụng, tuy nhiên trong số đó promoter CaMV 35S được sử dụng nhiều nhất do một số
ưu điểm nổi bật của nó và đây cũng là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài này [16].

Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46]
Vào đầu thập niên 80, GS. Chua và các cộng sự tại trường Đại Học Rockefeller
đã phân lập được một promoter cho phép phiên mã toàn bộ bộ gen của Cauliflower
mosaic virus (CaMV) xâm nhiễm vào củ cải. Promoter này được đặt tên là CaMV 35S
promoter do hệ số lắng của toàn bộ bản sao promoter là 35S. Nó là một promoter cơ

bản (constitutive promoter) được sử dụng rộng rãi nhất cho nhiều ứng dụng. Promoter
35S là một promoter cơ bản rất mạnh, có thể hoạt hóa phiên mã trong mọi loài thực vật
và cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao trong cây hai lá mầm. Tuy nhiên, nó kém hiệu
quả trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc. Sự khác biệt này có lẽ do những
khác biệt về chất lượng, số lượng các yếu tố điều hòa [16].


Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16]
Nhằm khắc phục khuyết điểm này, promoter 35S đã được cải tiến, nâng cao hiệu
quả hoạt động bằng cách thêm vào các trình tự enhancer. Trình tự này dài 162 bp, từ -
208 bp đến -46 bp. Các nghiên cứu cho thấy, hiệu quả hoạt động phiên mã gia tăng từ 3
đến 6 lần trên cây một lá mầm được chuyển nạp nhiều bản sao vùng enhancer [16].




6

Về sự liên quan của promoter 35S trong việc phát hiện GMO, theo GS.TS. Phạm
Thị Anh Thư, tại hội thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển gen” do hội các phòng thí
nghiệm Việt Nam (VINATEST) tổ chức ngày 5/5/2005, cho biết 95% cây chuyển gen
tại châu Âu có mang promoter 35S (p35S) và/hoặc terminator nos (Tnos) kiểm soát
trình tự gen được chuyển vào trong cây chuyển gen. Khi mẫu phân tích có một trong
hai trình tự này thì mẫu đó 95% là có chuyển gen, ngược lại khi kết quả mẫu phân tích
không có cả hai trình tự này thì ta cũng có thể kết luận mẫu 95% không có chuyển gen.
Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác cũng cho thấy, nếu chỉ phát hiện có promoter 35S
thì 70% đó là sản phẩm chuyển gen. Điều này chứng tỏ promoter 35S có thể được sử
dụng làm mục tiêu cho việc phát hiện và định lượng sinh vật biến đổi gen do sự hiện
diện ở mức độ cao của nó. Hiện nay, promoter 35S đang thuộc bản quyền của Đại Học
Rockefeller và công ty Monsanto (Mỹ) [9] [15] [16] [29].

3. Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen
Từ buổi ban đầu, thực vật chuyển gen được tạo ra nhằm phục vụ cho những lợi
ích thiết thực và mục tiêu hết sức đa dạng của con người.

Ứng dụng
Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17]
Các ứng dụng này chủ yếu tập trung vào việc giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng,
tăng năng suất và biến đổi các đặc tính cho phù hợp với quá trình sản xuất thực phẩm.
Mục đích là nâng cao độ an toàn cho các loại thực phẩm mà con người sử dụng đồng
thời tạo ra các loại thực phẩm có chất lượng ngày một tốt hơn. Các ứng dụng chính bao
gồm:
- Chống chịu thuốc diệt cỏ: Tính trạng được ứng dụng phổ biến nhất, giúp
giảm lượng thuốc diệt cỏ sử dụng và tồn dư thuốc trong cây và môi trường
[17].
- Kháng sâu bọ: Cho phép cây trồng kháng sâu bọ bằng cách tạo ra các chất
độc giết chết côn trùng. Được ứng dụng nhiều nhất là các gen tạo độc tố Bt
từ vi khuẩn Bacillus thringensis. Ưu điểm của chúng là không gây ô nhiễm
môi trường, con người và động vật bậc cao [17].




7

- Cây trồng bất thụ đực: Giúp sản xuất các giống nông sản lai năng suất cao
[17].
- Kháng bệnh: Mục tiêu của các giống cây trồng chuyển gen này là ngăn chặn
sự phát sinh bệnh do virus và nấm trên cây trồng [17].
- Ngăn chặn sự chín sớm của trái cây: Kéo dài thời gian tồn trữ và phù hợp

cho sản xuất thực phẩm [17].
- Các đặc tính chất béo được thay đổi: Ứng dụng chủ yếu cho tiêu dùng và chế
biến thực phẩm. Mục tiêu là tăng hàm lượng các loại acid béo không bão hòa
đơn và giảm acid béo không bão hòa đa trong các loaị cây lấy dầu như
canola, đậu nành, hoa hướng dương [17].
- Cố định đạm: Ứng dụng cho các giống thực vật không có khả năng cố định
đạm [17].
- Nâng cao giá trị dinh dưỡng : Mục tiêu là chuyển nạp các gene mã hóa các
protein có chứa hàm lượng cao các amino acid thiết yếu: lysine, tyrosine,
tryptophan vào cây trồng giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của chúng [17].
- Thực phẩm chức năng: Đây là một hướng nghiên cứu tuy còn khá mới mẻ
nhưng đã hứa hẹn thành công rực rỡ trong tương lai. Mục tiêu là chuyển nạp
gene biểu hiện các protein kháng nguyên chống lại một số bệnh như: viêm
gan B, cúm… tạo ra các loại vaccine có thể ăn được (edible vaccine). Một
hướng nghiên cứu khác là chuyển nạp gen sinh tổng hợp các hợp chất thứ
cấp quý như: dược phẩm, chất dẻo. Một ví dụ nổi tiếng của thực phẩm chức
năng đó là gạo vàng (Golden rice). Đây là loại gạo có hàm lượng vitamin A
được tăng cao bằng cách chuyển nạp 3 gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp
carotene. Các nhà khoa học hy vọng gạo vàng sẽ góp phần xoá bỏ các chứng
bệnh mù do thiếu vitamin A gây ra tại các nước đang phát triển [17].

Thực vật không sử dụng làm thực phẩm [17]
- Hoa với nhiều màu sắc và kéo dài thời gian trưng bày.
- Cây trồng kháng các yếu tố môi trường: Bên cạnh cây chuyển gen kháng tác
nhân gây bệnh, các cơ chế kháng các tác nhân gây stress của môi trường
như: chịu lạnh, chịu hạn, chịu muối và các ion kim loại nặng cũng được
nghiên cứu và bước đầu phát triển.

8

- Cây trồng giúp chuyển hóa tại các vùng ô nhiễm.
Như vậy, hiện nay các ứng dụng của thực vật chuyển gen là khá đa dạng và
trong tương lai các ứng dụng này hứa hẹn sẽ được tiếp tục mở rộng hơn nữa [17] [24].

Tác động có lợi của thực vật chuyển gen
Với những ưu điểm nổi bật và ứng dụng khá đa dạng như trên, cây trồng chuyển
gen đã đem lại một số lợi ích đối với nông nghiệp và đời sống con người:
- Lợi ích kinh tế:
Nâng cao hiệu quả lao động: giảm tiền công lao động trong việc phun xịt
các loại thuốc diệt cỏ, trừ sâu và việc cày cấy.
Nâng cao năng suất: giảm được thất thoát do côn trùng và bệnh tật, do đó
làm giảm áp lực cho đất trồng.
Tạo ra các đặc tính biến đổi phù hợp với quá trình sản xuất, ví dụ: cà chua
không bị mềm quá sớm, do đó giảm lượng nước cần trong quá trình sản
xuất thực phẩm.
Làm chủ năng suất: nâng cao độ tinh sạch của hạt giống giúp nâng cao
năng suất.
Cho phép canh tác trên những vùng đất trước đây không thể sử dụng.
- Môi trường:
Giảm dư lượng phân bón nhờ cố định đạm, giảm áp lực đất trồng.
Giảm sử dụng thuốc trừ sâu.
Chỉ thị và chuyển hóa ô nhiễm.
Bảo vệ môi trường sinh thái.
- Sức khỏe con người:
Giảm các tác động độc hại do thuốc trừ sâu gây ra với sức khỏe.
Tạo ra được các loại thực phẩm mới có chất lượng tốt hơn, có khả năng
chữa bệnh phục vụ cho con người.

Nâng cao dinh dưỡng cho con người.
Những tác động có lợi này đã giúp cho cây trồng chuyển gen được sản xuất và
thương mại hóa ngày càng rộng rãi trên thế giới [17] [24].





9


4. Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới
Lịch sử phát triển và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen là một lịch sử phát
triển khá nhanh. Từ một sản phẩm cà chua Flavr Savr biến đổi gen làm chậm quá trình
chín được trồng và thương mại hạn chế tại Mỹ năm 1994, đến nay, cây trồng biến đổi
gen đã được trồng và thương mại hóa tại nhiều quốc gia trên thế giới. Chúng không
ngừng được bổ sung các chủng loại, giống cây mới cũng như những tính trạng, chức
năng hữu ích mới làm phong phú thêm bộ sưu tập cây trồng chuyển gen. Đồng thời,
việc ngày càng nhiều quốc gia trên thế giới cũng như số lượng người nông dân tham gia
trồng trọt cây chuyển gen ngày càng tăng cho thấy một số tác động tích cực do chúng
mang lại.

Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17]
Hiện nay, theo số liệu mới nhất vào năm 2004, diện tích cây chuyển gen trên
toàn thế giới ước đạt 81,0 triệu ha, tăng 13,3 triệu ha so với năm 2003 (67,7 triệu ha).
Như vậy chỉ trong 9 năm, từ năm 1996 đến năm 2004, diện tích cây trồng chuyển gen
đã tăng hơn 47 lần, từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên đến 81,0 triệu ha năm 2004. Trong thời
gian này, tỷ lệ gia tăng diện tích trồng bao giờ cũng ở mức tăng hai chữ số hàng năm,
riêng năm 2004 đã là 20%, cho thấy sự phát triển hết sức nhanh chóng diện tích cây
chuyển gen trên thế giới. Bên cạnh đó, số quốc gia tham gia trồng cũng như số lượng

người nông dân tham gia cũng đã gia tăng hết sức nhanh chóng. Từ những nước khởi
xướng ban đầu là các quốc gia phát triển (Mỹ, Canada) với số lượng người trồng hạn
chế, đến nay số quốc gia tham gia trồng cây chuyển gen đã lên đến 17 nước với 8,25
triệu nông dân (so với 7 triệu vào năm 2003). Con số này có sự góp mặt đông đảo các
quốc gia đang phát triển trên thế giới (11 quốc gia đang phát triển và 6 quốc gia phát
triển). Một con số khác cũng rất đáng chú ý đó là số lượng các quốc gia có diện tích




10

trồng lớn (trên 50.000 ha) cũng đã tăng lên 14 nước, với 9 nước đang phát triển và 5
nước phát triển. Sự tham gia ngày càng đông đảo của các quốc gia đang phát triển
(Trung Quốc, Ấn Độ, Argentina, Brasil và Nam Phi), chiếm đến 34% tổng diện tích
trồng với tỷ lệ tăng hàng năm cao hơn cả các quốc gia phát triển, đã có tác động mạnh
mẽ đến tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới [3][4][21].

Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu [20]
Diện tích cây chuyển gen hiện nay tại các quốc gia trồng lớn như sau:

Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18]




11

Với tỷ lệ gia tăng rất nhanh, trong tương lai, cây trồng biến đổi gen có thể sẽ
chiếm tỷ lệ lớn trong cơ cấu cây trồng hiện đại.

Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19]
Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới

Bảng 2.1: Một số giống bắp đƣợc cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) [41]
Tên giống Đặc tính Công ty
- MON810
- MON863
- NK 603
- GA 21
- NK 603 X MON 810

- GA21 X MON 810
- MON863 X MON603
- Bt176 maize

- Bt 11
- DAS1507

- T25
Kháng côn trùng
Kháng sâu hại
Chống chịu thuốc diệt cỏ
-
Chống chịu thuốc diệt cỏ và
kháng sâu hại
-
-
Bắp chuyển gen Bt và chống

chịu thuốc diệt cỏ
-
Kháng sâu hại và chống chịu
thuốc diệt cỏ
Chống chịu thuốc diệt cỏ
Monsanto
-
-
-
-

-
-
Syngenta

-
Pioneer

Bayer

Theo báo cáo năm 2004 thì hiện nay, diện tích trồng bắp chuyển gen là 19,3
triệu ha, chiếm 23% diện tích cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới. Diện tích trồng