BIẾN NẠP PLASMID pGII0229 Trgus cp148 luc VÀO VI KHUẨN Agrobacterium VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO MẪU CÂY Jatropha curcas L.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
BIẾN NẠP PLASMID pGII0229 Trgus cp148 luc VÀO VI
KHUẨN Agrobacterium VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH
CHUYỂN GEN VÀO MẪU CÂY Jatropha curcas L.

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ THU TRANG

Niên khóa:

2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
BIẾN NẠP PLASMID pGII0229 Trgus cp148 luc VÀO VI
KHUẨN Agrobacterium VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

CHUYỂN GEN VÀO MẪU CÂY Jatropha curcas L.

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. BÙI MINH TRÍ

NGUYỄN THỊ THU TRANG

ThS. VÕ THỊ THÚY HUỆ

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Để trƣởng thành và đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, trƣớc tiên con xin gửi
lòng biết ơn sâu sắc đến Ba-Mẹ và hai em đã luôn bên cạnh, động viên, cảm ơn cả đại
Gia đình luôn quan tâm, lo lắng cho con. Gia đình luôn là động lực giúp con vƣợt qua
những khó khăn trong cuộc sống.
Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí đã quan tâm, tận tình chỉ
bảo và cho em những ý tƣởng, định hƣớng đề tài, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em
trong quá trình làm đề tài.
Em cũng xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hƣớng dẫn tận
tình và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu.
Cảm ơn những ngƣời bạn trong nhóm nghiên cứu: Tuấn, Tài, Quyết, Linh, Hiền đã
hỗ trợ tôi trong quá trình làm đề tài.
Cảm ơn những ngƣời bạn thân thiết đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ những niềm vui,
nỗi buồn cùng tôi trong suốt bốn năm đại học.
Cảm ơn tập thể lớp DH08SH đã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh viên

và luôn quan tâm, động viên nhau trong lúc làm đề tài.
Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng đại học Nông Lâm Tp. HCM đã tạo điều kiện
cho em trong bốn năm học tập tại trƣờng. Các Thầy - Cô đã từng dạy dỗ và Quí Thầy Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho em những kiến thức chuyên
ngành bổ ích.
Em rất trân trọng sự giúp đỡ của ban lãnh đạo Viện cùng các Thầy – cô, Anh - Chị
làm việc tại Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi Trƣờng đã tạo điều kiện
cho em hoàn thành đề tài.
Xin cảm ơn dự án SIDA/SAREC về Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ kinh phí thực
hiện đề tài này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 07 năm 2012
Nguyễn Thị Thu Trang

i


TÓM TẮT
Đề tài: “Biến nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn
Agrobacterium và xây dựng quy trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha curcas L.”
đƣợc thực hiện với mục tiêu xác định một kỹ thuật phù hợp để chuyển gen vào cây
Jatropha đạt hiệu quả cao.
Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc mang do Jacobsen thiết kế mang các gen bar
kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA đƣợc ly trích từ vi
khuẩn và biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3580. Vi khuẩn sau khi biến
nạp đã đƣợc sàng lọc trên môi trƣờng có chứa kháng sinh kanamycin và kiểm tra bằng
kỹ thuật PCR khuẩn lạc. Kết quả kiểm tra vi khuẩn cho thấy có sự hiện diện của
plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc và gen mục tiêu trên plasmid chứng tỏ vi khuẩn đạt
yêu cầu để thực hiện việc chuyển gen.
Hạt giống Jatropha của Úc đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển
gen. Mẫu phôi Jatropha đƣợc thu nhận từ hạt đƣợc tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn sau
khi biến nạp. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen nhƣ nguồn mẫu, thời

gian ngâm mẫu, nồng độ acetosyringone đã đƣợc khảo sát với mục đích tìm ra đƣợc
quy trình chuyển gen hiệu quả nhất. Kết quả nhuộm GUS cho thấy tỷ lệ dƣơng tính đối
với thuốc thử X-gluc khá cao, ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 41,67 – 75%.
Nồng độ acetosyringone 100 µM, thời gian ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt
70,87% tuy không phải là nghiệm thức cao nhất nhƣng lại ít ảnh hƣởng đến sức sống
của mẫu. Mẫu phôi tiền nuôi cấy hai ngày cho tỷ lệ biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn
so với mẫu phôi không tiền nuôi cấy (54,17%) và ít ảnh hƣởng đến sức sống của mẫu.
Phƣơng pháp xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha đang nảy mầm với ƣu điểm
không trải qua bƣớc nuôi cấy in vivo đƣợc thực hiện bằng ba cách: tiêm trực tiếp dịch
khuẩn vào hạt, chuyển gen kết hợp với sóng siêu âm, lắc hạt với dịch khuẩn. Kết quả
bƣớc đầu sau khi nhuộm GUS cho thấy tỉ lệ biểu hiện GUS từ 40 – 60%, sau khi sàng
lọc với PPT ở nồng độ 400 mg/l, thu đƣợc 5% cây giả định đƣợc chuyển gen (15 cây).
Quá trình loại bỏ vi khuẩn sau khi lây nhiễm với mẫu chƣa hiệu quả. Các loại
khángsinh cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin không có khả năng loại bỏ vi khuẩn
một cách hữu hiệu dẫn đến tình trạng tái nhiễm.

ii


SUMMARY
The thesis: “Transfomation of plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc into
Agrobacterium tumefaciens and establishment of gene transformation protocol for
Jatropha curcas L.” was performed in order to determining a suitable technique for
gene transfer on Jatropha with high efficiency.
A. tumefaciens harboring a binary vector pGII0229 Trgus cp148 luc carrying βglucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase (nptII) gene and bialaphos
resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV 35S terminator was
provided by Jacobsen. Plasmid was isolated and transformed into A. tumefaciens
strain GV3580. The presence of binary plasmid and bar gene were screened by
clonies selection on LB media supplemented with kanamycin and confirmed by
colony’PCR.

An efficient system for A. tumefaciens mediated transformation of Jatropha
curcas L. was developed in this study. Several factors affecting the transformation
efficiency were optimized, including preculture periods, usage of acetosyringone and
dipping time of explant in Agrobacterium suspension. A genetic transformation
procedure for J.curcas was established via Agrobacterium tumefaciens infection of
embryo explants. Transgenic embryo were confirmed by the GUS assay. The percent
tage of transient GUS expression was higher in 2-day precultured embryo explant
(66,67%) as compared to embryo explant (54,17%) and less impact on the vitality of
explants.
Two-day precultured embryo explants were transformed by co-cultivation with
Agrobacterium. After 2 days of co-cultivation, the transient GUS expression was
showed in all treatments. Results showed that positive rate for X-gluc reagent was high
in all treatments ranged from 41,67 – 75%. Concentration of acetosyringone 100 μM,
co-incubated in Agrobacterium suspension for 30 min resulted transient GUS activity
(70,83%), was found to be the best treatment.
The germinating seeds were injected with A. tumefaciens, followed by sonication,
co-cultivation with shaking, and injection. Compared with transformation of embryo,
that of germinating seeds was simple and repeatable, since it required no prior tissue
iii


culture steps and produced transgenic plants more efficiently. The embryo of the
germinating seed was demonstrated by the detection of β-glucuronidase activity in the
primary transformants. T0 seedlings were screened by PPT selection at 400 mg/l.
About 5% of T0 seedlings examined were found to be transgenic.
The elimination of the bacteria after cocultivation process was not efficient. The
antibiotic cefotaxim, meropenem, ciprofloxacin could not remove bacteria effectively
lead to re-infection.

iv

MỤC LỤC
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................................ii
Mục lục ........................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. ix
Danh sách các bảng ......................................................................................................... x
Danh sách các hình và sơ đồ .......................................................................................... xi
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu .................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Sơ lƣợc về các đặc điểm cây Jatropha ..................................................................... 3
2.1.1. Phân loại ............................................................................................................... 3
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố .......................................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái – đặc tính sinh học ................................................................ 3
2.1.4. Các ƣu điểm sinh học và giá trị cây Jatropha ....................................................... 4
2.1.4.1.Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội ............................................................................ 4
2.1.4.2. Ý nghĩa về mặt môi trƣờng ................................................................................ 5
2.1.4.3.Sử dụng làm phân bón và thức ăn gia súc .......................................................... 5
2.1.4.4. Công dụng trong chữa trị bệnh .......................................................................... 5
2.2. Hiện tƣợng biến nạp ................................................................................................ 5
2.2. Phƣơng pháp biến nạp ở vi khuẩn ........................................................................... 5
2.2.1. Giới thiệu về phƣơng pháp biến nạp .................................................................... 6
2.2.2. Cơ chế biến nạp .................................................................................................... 6
2.2.3. Vai trò của biến nạp .............................................................................................. 6
2.3. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật ....................................... 7
2.3.1. Khái niệm ............................................................................................................. 7

2.3.2. Thành phần gen chuyển nạp ................................................................................. 7
2.3.2.1. Promoter và terminator ...................................................................................... 7
2.3.2.2. Gen thông báo .................................................................................................... 7
v


2.3.2.3. Chỉ thị chọn lọc ................................................................................................. 8
2.3.3. Một số phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật ........................................................ 8
2.3.3.1. Chuyển nạp gen bằng phƣơng pháp PGE .......................................................... 9
2.3.3.2. Chuyển nạp gen bằng phƣơng pháp sử dụng xung điện .................................... 9
2.3.3.3. Chuyển gen bằng phƣơng pháp bắn gen ........................................................... 9
2.3.3.4. Chuyển gen bằng vi tiêm ................................................................................. 10
2.3.3.5. Chuyển gen bằng phƣơng pháp SAAT – chuyển gen gián tiếp sử dụng
Agrobacterium với sự hỗ trợ sóng siêu âm .................................................................. 11
2.3.3.6. Một số phƣơng pháp chuyển gen in vivo ......................................................... 12
2.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và phƣơng pháp chuyển
bằng Agrobacterium ...................................................................................................... 12
2.4.1. Phân loại ............................................................................................................. 12
2.4.2. Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh ......................................................... 12
2.4.3. Ti plasmid ........................................................................................................... 13
2.4.3.1. Vùng T-DNA ................................................................................................... 13
2.4.3.2. Vùng gen vir ..................................................................................................... 14
2.4.4. Cơ chế phân tử của quá trình xâm nhiễm và chuyển gen vào thực vật .............. 14
2.4.5. Acetosyringone và vai trò trong quá trình xâm nhiễm ....................................... 16
2.4.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen ................................................ 16
2.4.6.1. Ảnh hƣởng của vật liệu chuyển gen ................................................................ 17
2.4.6.2. Ảnh hƣởng của dòng vi khuẩn ........................................................................ 17
2.4.6.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ .................................................................................. 18
2.4.6.4. Chất hoạt động bề mặt ..................................................................................... 18
2.4.6.5. Ảnh hƣởng của kháng sinh .............................................................................. 18

2.4.6.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy và mật số vi khuẩn .......................... 19
2.4.6.7. Các yếu tố ảnh hƣởng khác ............................................................................. 20
2.5. Các phƣơng pháp kiểm tra cây chuyển gen ........................................................... 20
2.5.1. Phƣơng pháp thử GUS ........................................................................................ 20
2.5.2. Phƣơng pháp thử khả năng kháng kháng sinh hay thuốc diệt cỏ PPT ............... 20
2.5.3. Sử dụng PCR đánh giá kết quả chuyển gen ở thực vật ...................................... 21
2.5.4. Phƣơng pháp Southern blot xác định các gen ngoại lai trong bộ gen cây ......... 21
2.6. Tình hình nghiên cứu cây chuyển gen tại Việt Nam ............................................. 22
vi


2.7. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về chuyển gen vào cây Jatropha ............. 24
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 29
3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................................ 27
3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................ 27
3.2.1. Giống .................................................................................................................. 27
3.2.2. Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen ............................................................... 27
3.2.3. Hóa chất .............................................................................................................. 28
3.2.4. Thiết bị dùng trong thí nghiệm ........................................................................... 28
3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm ........................................................................................ 28
3.3.1. Khảo sát khả năng diệt khuẩn của 3 loại kháng sinh cefotaxim,
meropenem và ciprofloxacin lên chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101.................. 28
3.3.2. Tạo dòng vi khuẩn mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc ........................... 29
3.3.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pGII0229 Trgus cp148 ............................ 30
3.3.2.2. Chuẩn bị tế bào khả nạp .................................................................................. 31
3.3.2.3. Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ............................................................. 31
3.3.2.4. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid và gen bar trong chủng vi khuẩn GV3580
sau khi biến nạp ............................................................................................................ 31
3.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của PPT đến sự sinh trƣởng của cây Jatropha in vivo ....... 33
3.3.4. Lây nhiễm mẫu Jatropha với vi khuẩn A. tumefaciens ........................................ 33

3.3.4.1. Chuẩn bị vi khuẩn ............................................................................................ 33
3.3.4.2. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào phôi J.curcas ............................................. 33
3.3.4.3. Nhóm thí nghiệm chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm ...................... 35
3.3.5. Xử lý số liệu ....................................................................................................... 36
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 37
4.1. Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của ba loại kháng sinh .............................. 37
4.2. Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang gen bar .................................................. 40
4.2.1. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong vi khuẩn ............................... 40
4.2.2. Kết quả biến nạp plasmid vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 ........... 41
4.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của PPT lên sự sinh trƣởng cây Jatropha in vivo .... 42
4.4. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen vào phôi .... 43
4.4.1. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của mẫu tiền nuôi cấy
và không tiền nuôi cấy lên hiệu quả chuyển gen ......................................................... 44
vii


4.4.2. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian ngâm mẫu và nồng độ
acetosyringone đến hiệu quả chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens ........................ 45
4.5. Kết quả chuyển gen vào hạt Jatropha đang nảy mầm ........................................... 48
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 52
5.1 Kết luận ................................................................................................................... 53
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 55
Phụ lục

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

J. curcas

Jatropha curcas Linn

Bxn

bromoxynil nitrilase

nptII

neomycin phospho transferase

AS

Acetosyringone

PAT

phosphinothricin acetyl transferase

PEG

polyethylene glycol

IBA

Indolebutyric acid

BA

6-benzyl adenin

GA3

Gibberellic acid

NT

Nghiệm thức

BAP

6-benzyl aminopurine

NAA

α-naphthaleneacetic acid

IAA

indole-3-acetic acid

Ti-plasmid

Tumor-inducing plasmid

vir

Virulence

OD

Mật độ quang (Optical density)

PPT

DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid

gusA

β–glucuronidase

X-gluc

5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide

DNA

Deoxiribonucleic Acid

PCR

Polymerase Chain Reaction

bp

base pair

g

gram

mg

miligram

l

lit

ml

mililit

µl

microlit

mM

miliMol

µM

microMol
ix

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR ............................................ 32
Bảng 3.2 Chƣơng trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR ............................................. 32
Bảng 4.1 Kết quả rửa mẫu với ba loại kháng sinh cefotaxim, meropenem và
cyprofloxacin ở các nồng độ và thời gian khác nhau .................................................... 39
Bảng 4.2 Nồng độ plasmid ly trích từ vi khuẩn Agrobacterium chủng EHA101 ........ 42
Bảng 4.3 Kết quả biểu hiện GUS ở mẫu tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy ........... 44
Bảng 4.4 Kết quả nhuộm GUS ở các nghiệm thức chuyển gen ................................... 46
Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm xâm nhiễm vi khuẩn vào hạt Jatropha nảy mầm ......... 49

x


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L. .................................................................................. 3
Hình 2.2 Chuyển gen bằng phƣơng pháp SAAT .......................................................... 11
Hình 2.3 Vi khuẩn A. tumefaciens .............................................................................. 12
Hình 2.4 Cấu trúc của Ti Plasmid ............................................................................... 13
Hình 2.5 Mô hình phân tử quá trình xâm nhiễm của A. tumefaciens ........................... 16
Hình 2.6 Phản ứng tạo màu X-gluc dƣới tác dụng của enzyme β–glucuronidase ....... 20
Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc .............................................................. 27
Hình 3.2 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc ....................... 27
Hình 3.3 Quy trình khử trùng hạt Jatropha ................................................................... 29
Hình 3.4 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 31
Hình 4.1 Kết quả điện di plasmid pGII0229 từ vi khuẩn ........................................... 40
Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 ................................................ 41
Hình 4.3 Kết quả của phản ứng PCR khuẩn lạc khuếch đại gen bar ........................... 42
Hình 4.4 Kết quả thử PPT trên cây Jatropha 3 tuần tuổi ............................................. 43

Hình 4.5 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy và không tiền nuôi cấy ................ 44
Hình 4.6 Mẫu phôi Jatropha đồng nuôi cấy 2 ngày với vi khuẩn ............................... 45
Hình 4.7 Biểu hiện GUS ở mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày ......................................... 47
Hình 4.8 Mẫu phôi Jatropha ở nồng độ acetosyringone và thời gian khác nhau ......... 48
Hình 4.9 Biểu hiện GUS khi tiến hành xâm nhiễm vào hạt ......................................... 50
Hình 4.10 Cây Jatropha sau khi đƣợc sàng lọc với PPT ở nồng độ 400 mg/l ............ 51

xi


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1 . Đặt vấn đề
Bƣớc vào thế kỷ 21, thế giới phải đối diện với hai mối lo lớn là lƣơng thực và
năng lƣợng. Kỹ thuật tạo giống cổ điển kiểu Mendel đòi hỏi nhiều thời gian và phải
trải qua nhiều thế hệ mới có thể chọn lọc đƣợc những tính trạng mong muốn. Công
nghệ biến đổi gene trên cây trồng ra đời cho phép nhanh chóng tạo ra giống mới có
năng suất, chất lƣợng và khả năng chống chịu điều kiện khắc nghiệt bằng cách cùng
lúc đƣa vào những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể sống khác nhau,
không chỉ giữa các loài có họ hàng gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau.
Có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chuyển gen ở thực vật nhƣ: bắn gen, vi
tiêm, phƣơng pháp polyethylene glycol, v.v. mỗi phƣơng pháp có ƣu điểm riêng tùy
vào loại cây. Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen vào thực vật là một
trong những phƣơng pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ khả năng gắn gen
ngoại lai vào tế bào một cách chính xác và ổn định. Vì vậy đây là một phƣơng pháp
đƣợc lựa chọn cho các nghiên cứu cơ bản về thực vật, là kỹ thuật chính để tạo ra cây
chuyển gen trong lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp (Stafford, 2000; Gelvin,
2003). Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển những gen có ý nghĩa kinh tế vào cây
trồng, kỹ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của
gen. Tuy nhiên hiệu quả chuyển gen vào mô thực vật bằng Agrobacterium chịu ảnh
hƣởng bởi nhiều yếu tố, quy trình tái sinh cây chuyển gen rất khó, tốn thời gian, cây

dễ sinh những biến dị bất thƣờng và thƣờng mất khả năng sinh sản (Efendi và ctv,
2000).
Những năm gần đây, nhu cầu năng lƣợng ngày càng tăng, trong khi nguồn năng
lƣợng chính là dầu mỏ đang cạn kiệt dần. Vì vậy cần nghiên cứu phát triển và sớm
đƣa vào khai thác cũng nhƣ sử dụng các nguồn năng lƣợng mới.
Diesel sinh học đƣợc chiết xuất từ hạt cây cọc rào đƣợc xem là một nguồn nhiên
liệu sạch có thể thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt dần. Cây
Jatropha curcas với một số ƣu điểm so với các loài cây cho dầu khác vì có thể chịu
đƣợc điều kiện khắc nghiệt. Việc phát hiện ra cây Jatropha curcas đã tạo ra một bƣớc
tiến lớn trong lĩnh vực năng lƣợng và nhiên liệu mới.
1


Tuy nhiên việc phổ biến và ứng dụng dầu của Jatropha còn thấp do giới hạn về
năng suất dầu chứa trong hạt thấp. Đến nay năng suất hạt của Jatropha vẫn còn là vấn
đề khó khăn, phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác nhau nhƣ môi trƣờng (Openshaw,
2000), đặc điểm phân nhánh của cây (Achten và ctv, 2009), di truyền học (Ginwal và
ctv, 2004), và chăm sóc (Gour, 2006). Sản lƣợng hạt bị hạn chế bởi một số yếu tố môi
trƣờng (abiotic stresses), đặc biệt là lạnh và hạn hán. Vì vậy đòi hỏi cần có các công
cụ di truyền, chọn giống hiệu quả.
Từ những lý do trên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium để chuyển gen vào cây Jatropha là hƣớng đi cần thiết. Đề tài: “Biến
nạp plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc vào vi khuẩn Agrobacterium và xây dựng quy
trình chuyển gen vào mẫu cây Jatropha curcas L.”đƣợc thực hiện nhằm xác định kỹ
thuật phù hợp để chuyển gen vào cây Jatropha đạt hiệu quả cao. Từ nghiên cứu này,
có thể phát triển các nghiên cứu chuyển nạp những gen khác vào cây Jatropha nhằm
cải thiện năng suất, tăng sản lƣợng dầu trong hạt và tăng tính chống chịu của cây
Jatropha curcas L.
1.2. Yêu cầu
-

Biến nạp thành công plasmid pGII0229 cp148 luc vào chủng vi khuẩn A.

tumefaciens GV3580.
-

Lây nhiễm chủng vi khuẩn A. tumefaciens GV3580 đã đƣợc biến nạp plasmid

thành công với mẫu cây cọc rào ( J. curcasL.).
-

Kiểm chứng kết quả chuyển gen vào mô cây Jatropha bằng kỹ thuật nhuộm GUS.

1.3. Nội dung thực hiện
-

Khảo sát khả năng diệt vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA101 của ba loại kháng

sinh cefotaxim, meropenem và ciprofloxacin.
-

Tạo dòng vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc.

-

Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pGII0229 Trgus

cp148 luc vào mẫu phôi và mẫu hạt nảy mầm, khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu
quả biến nạp.
-

Phân tích mẫu đã tiến hành chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm GUS.

-

Khảo sát nồng độ PPT ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của cây Jatropha in vivo.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về các đặc điểm của cây Cọc rào
2.1.1. Phân loại khoa học
Giới

: Plantae

Ngành

: Magnoliophyta

Lớp

: Magnoliopsida

Họ

: Euphorbiaceae

Chi

: Jatropha

Loài

: Jatropha curcas Linn.

Tên tiếng Anh : Physic nut
Tên tiếng Việt : Dầu mè, Cọc rào, Dầu lai
Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L.
(en.wikipedia.org)

2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Cây Jatropha curcas L., thuộc chi Jatropha, họ Thầu dầu. Chi Jatropha là một
chi có khoảng 175 loài cây thân mọng, cây bụi hay cây thân gỗ có nguồn gốc từ tiếng
Hy Lạp, ghép từ hai chữ Iatrós (bác sĩ) và trophé (thức ăn), thể hiện công dụng làm
thuốc của cây này. Curcas là tên gọi thông thƣờng của cây Physic nut ở Malabar, Ấn
Độ. Tên thông dụng ở các nƣớc hiện nay là Jatropha, ở Việt Nam gọi là cây Cọc giậu,
Cọc rào, Bã đậu nam, Dầu mè, v.v.
Jatropha là một loài cây có lịch sử 70 triệu năm, nguồn gốc từ Mexico (nơi duy
nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ. Loài Jatropha dại phân bố nhiều ở vùng
thung lũng á nhiệt đới khô nóng và vùng rừng mƣa nhiệt đới ẩm, thƣờng ở vùng đồi
núi, đất dốc thung lũng có độ cao 700 – 1600 m so với mực nƣớc biển. Sau đó chúng
đƣợc ngƣời Bồ Đào Nha đƣa qua Cape Verde, rồi lan truyền sang châu Phi, châu Á,
sau đó đƣợc trồng ở nhiều nƣớc, trở thành cây bản địa ở khắp các nƣớc nhiệt đới, cận
nhiệt đới trên toàn thế giới (Nguyễn Công Tạn, 2008).
2.1.3. Đặc điểm hình thái – Đặc tính sinh học
Jatropha là cây bụi, gỗ nhỏ, có thể cao đến 5 m. Cành xòe, có nhựa mủ, trên cành
có những vết sẹo. Thân, vỏ, lá có nhựa nhớt, không màu. Lá mọc so le, hình trái xoan,
hơi tròn, chia 5 – 7 thùy nông với chiều dài và rộng khỏang 6 – 15 cm. Phiến lá dạng

3


giấy lụa. Cụm hoa tận cùng có màu vàng. Hoa đơn tính, cùng gốc, đôi khi có hoa
lƣỡng tính. Bộ nhị 10, xếp thành hai vòng riêng biệt, mỗi vòng 5, tạo thành cột đơn
gần nhau. Bộ nhụy có 3 vòi nhụy, dính với nhau ở khoảng 2/3 chiều dài, phần trên rời
nhau và núm nhụy rẽđôi (Dehgan và Webster, 1979). Quả non hình trứng, lúc chín
màu vàng, sau nâu xám, chứa hạt màu đen.
Cây Jatropha ƣa ánh sáng, ƣa khí hậu ấm áp, chịu khô hạn, có thể sống trong môi
trƣờng có lƣợng mƣa trung bình năm 520 - 2000 mm, nhiệt độ bình quân năm 11 – 28
o

C. Cây chịu đƣợc đất xấu, đất sỏi, đất đá vôi bạc màu, v.v.. Cây Jatropha nảy chồi rất

dễ, có thể giâm hom, nếu trồng bằng hạt, cây có rễ chính và 4 rễ ngang, nếu giâm hom
thì không có rễ chính (Nguyễn Công Tạn, 2008).
Cây Jatropha sinh trƣởng nhanh, sau khi trồng 3 năm, cây cao 3 m, sau trồng 1
năm thì cây bắt đầu ra hoa. Thời gian ra quả bình thƣờng là 6 – 20 năm, ít thấy hiện
tƣợng ra quả cách năm. Ra hoa từ tháng 3 đến giữa tháng 4, thời gian ra hoa kéo dài 4
– 5 tháng, chín vào tháng 8 – 9, quả khó rụng.
2.1.4. Các ƣu điểm sinh học và giá trị của cây Jatropha
Jatropha là loài cây mà hiện nay đƣợc các nhà khoa học đánh giá rất cao vì các ƣu
điểm sinh học và giá trị của cây.
2.1.4.1. Ý nghĩa về mặt kinh tế, xã hội
Phát hiện quan trọng nhất từ Jatropha là lấy hạt làm nguyên liệu sản xuất dầu
diesel sinh học (biodiesel). Cây Jatropha có chu kỳ sống lâu có thể lên đến 50 năm,
cho quả, hạt sớm, hàng năm năng suất có thể đạt đến 10 – 12 tấn/ha nếu trồng trên đất
tốt và đầu tƣ cao (chăm sóc, bón phân, tƣới tiêu, v.v.), hàm lƣợng dầu trong hạt cao
trung bình 32 – 35%. Đây là nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học rất tiềm năng để
dần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng bị cạn kiệt. Từ hạt

Jatropha ép ra dầu thô, từ dầu thô tinh luyện đƣợc diesel sinh học và glycerin. Mặc dù
diesel sinh học đƣợc sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: cải dầu, hƣớng dƣơng, dầu
cọ, mỡ động vật, v.v. nhƣng sản xuất từ Jatropha có giá thành rẻ nhất và chất lƣợng
tốt tƣơng đƣơng với dầu diesel hóa thạch truyền thống. Nếu 1 ha Jatropha đạt năng
suất 8 – 10 tấn hạt/ha/năm có thể sản xuất đƣợc 3 tấn diesel sinh học. Loại dầu này sẽ
thay thế đƣợc một phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu đƣợc lƣợng
khí thải gây hiệu ứng nhà kính, là loại dầu cháy hết và có ít lƣu huỳnh, là loại dầu
sạch, thân thiện với môi trƣờng.
4


Jatropha còn tạo ra hiệu ứng xã hội rất lớn. Do trồng ở các vùng miền núi nghèo,
cây Jatropha sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập khả quan cho đồng bào các dân tộc.
Trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chƣa tìm kiếm đƣợc
bất cứ cây gì khả dĩ trồng đƣợc trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trƣờng ổn
định (Thái Xuân Du, 2007).
2.1.4.2. Ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trƣờng
Jatropha là cây lâu năm, phủ đất rất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trƣởng phát triển
đƣợc ở hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, gia súc không ăn.
Vì vậy, cây Jatropha trồng trên các vùng đất dốc sẽ đƣợc coi là cây “lấp đầy” lỗ hổng
sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực bì dày đặc
chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì của đất. Không những vậy, Jatropha còn
có thể trồng ở những vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần
phục hồi hệ sinh thái các vùng này. Vì vậy, cây Jatropha đƣợc đánh giá là “vệ sĩ sinh
thái”, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trƣờng (Nguyễn Công Tạn, 2008).
2.1.4.3. Sử dụng làm phân bón và thức ăn cho gia súc
Hạt Jatropha sau khi ép dầu, hơn 30% là sản phẩm dầu, gần 70% là khô dầu, có
hàm lƣợng protein khoảng 30%, hàm lƣợng N 4,14 – 4,78%, P2O5 0,50 – 0,66%, CaO
0,60 – 0,65%, MgO 0,17 – 0,21% dùng làm phân hữu cơ rất tốt, nếu khử hết độc tố có
thể làm thức ăn gia súc cao đạm (Misra và Misra, 2010).

2.1.4.4. Công dụng trong chữa trị bệnh
Trong thành phần cây Jatropha, đã phân tích đƣợc những hợp chất chủ yếu nhƣ
tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid. Nhiều bộ phận của cây này có thể
chữa bệnh nhƣ lá, vỏ cây, hạt và rễ. Trong cây JCL có một số độc tố, nhất là
phytotoxin (curcin) trong hạt, nếu đƣợc nghiên cứu sâu hơn rất có thể cung cấp cho
chúng ta một loại dƣợc liệu mới (www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn).
2.2.Phƣơng pháp biến nạp ở vi khuẩn
2.2.1. Giới thiệu về phƣơng pháp biến nạp
Biến nạp là phƣơng pháp chuyển gen nhờ sự thu nhận các DNA tự do trong môi
trƣờng xung quanh của thể nhận, đây là phƣơng pháp đơn giản nhất để đƣa DNA tái
tổ hợp vào tế bào vật chủ.
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Ferderrick Griffith mô tả năm 1928, trong
thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lý biến nạp”. Một số vi khuẩn có
5


khả năng hấp thụ DNA một cách tự nhiên. Tuy nhiên, chúng chỉ có thể thực hiện
đƣợc điều đó vào một thời kỳ cụ thể trong chu kỳ sinh trƣởng khi chúng tạo ra một
loại protein đặc biệt gọi là yếu tố khả biến. Ở giai đoạn này, vi khuẩn đƣợc gọi là khả
nạp. Một số loài vi khuẩn không có khả năng thu nhận DNA một cách tự nhiên nhƣng
ta có thể tạo ra tính khả nạp in vitro bằng cách ngâm các tế bào vào dung dịch calcium
chloride lạnh đông. Việc biến nạp đoạn DNA vào tế bào khả nạp đƣợc thực hiện bằng
nhiều kỹ thuật khác nhau nhƣ: Biến nạp bằng sốc nhiệt, bằng vi tiêm, hóa chất hay
bằng xung điện.
2.2.2. Cơ chế của biến nạp
Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc là do trong một giai
đoạn tăng trƣởng nào đó của tế bào, trên bề mặt tế bào có hiện diện những điểm tiếp
nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (compentent factor). Nhân tố này có khả năng
tiếp nhận đoạn ngắn từ môi trƣờng ngoài để đƣa vào trong tế bào vi khuẩn, nhờ đó
xảy ra tái tổ hợp.

Muốn thực hiện đƣợc biến nạp phải có đủ 2 điều kiện là trong môi trƣờng phải có
các đoạn DNA và khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận. Quá trình biến nạp
gồm 5 giai đoạn: Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận, ở đây tế bào nhận có
những vị trí để hấp thụ DNA. Giai đoạn thứ hai là sự xâm nhập của DNA vào tế bào
nhận. Giai đoạn thứ ba là quá trình liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng của
nhiễm sắc thể tế bào nhận. Trong giai đoạn này, DNA biến nạp chịu tác động của các
enzyme giới hạn bị biến đổi và sửa chữa, nếu nó không tìm thấy đƣợc đoạn tƣơng
đồng trên nhiễm sắc thể, nó sẽ nhanh chóng bị phân cắt. Sau khi DNA lạ đã đƣợc liên
kết với đoạn nhiễm sắc thể tƣơng đồng, hiện tƣợng đồng hóa phân tử DNA lạ vào
DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp đƣợc diễn ra. Cuối cùng là sự nhân lên của nhiễm
sắc thể có DNA đƣợc biến nạp.
2.2.3. Vai trò của biến nạp
Biến nạp trong tự nhiên có thể làm gia tăng độc tính. Ngoài ra biến nạp còn đƣợc
sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn
có thêm tính mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống. Đó là cở sở tiến hóa và đa dạng
của vi sinh vật.

6


2.3. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật
2.3.1. Khái niệm
Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào cơ thể sinh vật. Những
thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng
đối với việc chuyển nạp gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền
mới (Uchimiya và ctv, 1989).
2.3.2. Thành phần của gen chuyển nạp
2.3.2.1. Promoter và terminator
Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình
tự thích hợp đi kèm theo nó. Với mỗi promoter cần có các vector tƣơng ứng. Hiện

nay, promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một trong những
promoter mạnh và đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Theo Heldt (1997) promoter này bao
gồm các enhancer có khả năng phiên mã ở mức độ cao.
Terminator giúp đảm bảo gen đƣợc chuyển kết thúc đúng vị trí và không tạo
những protein thể khảm với các protein từ thực vật. Có rất nhiều terminator có tiềm
năng đã đƣợc tìm ra nhƣng terminator nos (đƣợc thu nhận từ gen tổng hợp nopaline
của Ti plasmid trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) vẫn là terminator thông
dụng nhất (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.2.2. Gen thông báo (reporter gene)
Bất cứ phƣơng pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp gen gián tiếp bằng vi
khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen vẫn cần một
phƣơng pháp tin cậy để xác định các tế bào đã nhận gen ngoại lai (Jacobsen, 2007).
Với mục đích đó khi thiết kế plasmid, ngƣời ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông
báo. Những gen thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào
đó rất dễ phát hiện trong cây giúp nhận biết tế bào hoặc thể chuyển gen và cho phép
đo lƣờng mức độ biểu hiện của gen ngoại lai. Gen gusA của vi khuẩn E. coli thƣờng
đƣợc sử dụng làm gen thông báo. Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase.
Enzyme này xúc tác phản ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành
sản phẩm có màu xanh chàm đặc trƣng. Glucuronidae thƣờng dùng là 5–bromo–4–
chloro–3–indolyl glucuronide (X-gluc). Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase
không tồn tại trong thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen
thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh
7


hƣởng của pH môi trƣờng nên thuận tiện cho việc theo dõi. Ngoài ra còn có gen phát
sáng gfp hoặc gen mã hóa cho chloramphenicol acetyltransferase (CAT), gen lux mã
hóa cho luciferase đƣợc lấy từ đom đóm (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.2.3. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)
Sau quá trình chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng các tế bào đã

nhận gen mục tiêu và nuôi cấy trên môi trƣờng tái sinh. Vì vậy tất cả các plasmid đều
phải có ít nhất một gen chọn lọc để giúp quan sát và chọn lọc những cây chuyển gen
thành công. Các gen này thƣờng mã hóa cho một enzyme có khả năng khử độc tính
của chất chọn lọc nhƣ kháng sinh (nptII, hpt…) hoặc thuốc diệt cỏ (bar hay pat) trong
quá trình chuyển hóa. Khi các gen chọn lọc biểu hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục
sinh trƣởng trong môi trƣờng chọn lọc (selective media) thƣờng chứa chất kháng sinh
hay thuốc diệt cỏ. Ngoài ra, chúng còn đƣợc dùng để phân tích bộ gen của cây đƣợc
chyển gen nhằm xác định việc đoạn DNA đƣa vào có hiệu quả hay không.
Các chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay là gen nptII mã hóa enzyme neomycin
phospho transferase II. Enzyme này sẽ xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh
kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này. Một chỉ thị chọn lọc phổ biến khác là gen
hph mã hóa enzyme hygromycin phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng
sinh hygromycin. Gen hph tỏ ra rất thành công trên cây bắp (Walters và ctv, 1992),
cây lúa (Christou và ctv, 1991; Li và ctv, 1993).
Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể đƣợc sử dụng nhƣ gen mục tiêu nhƣng đồng
thời cũng là một chỉ thị chọn lọc. Gen bar mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là thành phần chính
trong thuốc diệt cỏ Basta. Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme phospho mannose
isomerase đã đƣợc sử dụng làm chỉ thị chọn lọc. Gen này hoạt động trên cơ sở phản
ứng huỳnh quang trong môi trƣờng có đƣờng mannose. Điều này đã mở ra một triển
vọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng chất kháng sinh hay hoạt chất diệt
cỏ trong quá trình chọn lọc (Lê Trần Bình, 2008).
2.3.3. Một số phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật
Có nhiều phƣơng pháp đƣợc phát triển để có đƣợc cây trồng chuyển gen. Phƣơng
pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn A. tumefaciens ngày càng đƣợc sử dụng phổ
biến nhờ vào sự cải tiến không ngừng hệ thống Ti–plasmid. Bên cạnh đó còn có các
phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp khác nhƣ phƣơng pháp PEG (polyethylene glycol),
8

phƣơng pháp vi tiêm (microinjection), phƣơng pháp sử dụng xung điện
(electroporation), phƣơng pháp bắn gen (biolistic) và một vài kỹ thuật mới.
2.3.3.1. Chuyển nạp gen bằng phƣơng pháp PEG (polyethylene glycol)
Phƣơng pháp PEG đƣợc sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật.
Phƣơng pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dƣới dạng plasmid DNA dựa trên
nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập
gen lạ vào tế bào. Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi
4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phƣơng pháp PEG,
kết quả là đã thu đƣợc những tế bào trần mang các gen chuyển nạp.
2.3.3.2. Chuyển nạp gen bằng phƣơng pháp sử dụng xung điện (electroporation)
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn
trong một điện trƣờng cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần
chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989). Phƣơng pháp sử dụng xung điện đã đƣợc sử
dụng trong chuyển nạp gen trên cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy còn nhiều
khó khăn chƣa giải quyết đƣợc về mặt kỹ thuật nhƣng cũng đã ghi nhận những trƣờng
hợp chuyển gen thành công trên cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988;
Shimamoto và ctv, 1989), trên cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu
(Guerche và ctv, 1987; trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.3.3.3. Chuyển nạp gen bằng phƣơng pháp bắn gen (biolistic)
Phƣơng pháp bắn gen đƣợc John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein và
ctv, 1987). Đây là phƣơng pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng. Ƣu điểm của
phƣơng pháp này là có thể áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá
mầm, không cần vector hai nguồn (binary vector) và quy trình vận hành tƣơng đối
đơn giản. Hiện nay có 3 loại dụng cụ bắn gen khác nhau:
- Loại 1: là một bộ phận cung cấp năng lƣợng giống nhƣ khẩu súng, gây nổ nhờ một
kim hỏa (Klein và ctv, 1987).
- Loại 2: hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đƣa DNA phủ lên các phân tử bằng
vàng cực mịn (DNA–coated gold particles) (Christou và ctv, 1988).
- Loại 3: hoạt động bằng áp suất của khí từ một xi lanh chứa khí trơ nhƣ helium hoặc
nitrogen. Vận tốc của vi đạn khi bắn bằng dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với loại

1 nhƣng nó tỏ ra rất có hiệu quả trong trƣờng hợp chuyển plasmid DNA vào tế bào
cây trồng (Cao và ctv, 1991).
9


Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004) trong quy trình bắn gen trƣớc tiên
bột vàng hoặc tungsten sẽ đƣợc phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và đƣợc gắn lên
viên đạn plastic. Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng các
hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lƣới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào tế
bào. Mô đƣợc bắn xong sẽ đƣợc chuyển vào môi trƣờng tái sinh có bổ sung các chất
chọn lọc thích hợp. Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 – 7 ngày nuôi cấy còn các
mô không nhận gen sẽ chết trong môi trƣờng chọn lọc.
2.3.3.4. Chuyển nạp gen bằng phƣơng pháp vi tiêm
Vi tiêm (microinjection) là phƣơng pháp tiêm trực tiếp DNA vào nhân của tế bào
phôi bằng cách sử dụng micropipette để tiêm dung dịch DNA lạ vào tế bào trần dƣới
áp lực cao, tạo ra những cây chuyển gen (Neuhaus và ctv, 1987; De la Pẽna và ctv,
1987; trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Phƣơng pháp này đòi
hỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao tác dƣới kính hiển vi và sự khéo
léo, chính xác tiêm một lƣợng rất nhỏ dung dịch DNA.
2.3.3.5. Phƣơng pháp SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated
transformation) – chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với sự
hỗ trợ sóng siêu âm
Phƣơng pháp SAAT là phƣơng pháp biến đổi gen dựa trên phƣơng pháp chuyển
gen gián tiếp nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium. Mô đích sẽ đƣợc xử lý trong một thời
gian ngắn cùng với sự hiện diện của vi khuẩn. Sóng siêu âm sẽ tạo rất nhiều vết
thƣơng nhỏ và đồng đều trên mô cây, cho phép Agrobacterium xâm nhiễm dễ dàng và
do đó sẽ làm gia tăng hiệu quả biến nạp. Đây là phƣơng pháp khá hữu hiệu, đơn giản,
rẻ tiền làm gia tăng hiệu quả biến nạp vào mẫu mô cây có hiệu quả chuyển gen thấp
(Liu và ctv, 2005).
Theo Trick và Finer (1997), các mô xử lý SAAT cho thấy sự tăng mạnh của biểu

hiện GUS so với các mô chỉ ủ khuẩn thông thƣờng. Tùy theo loại mô, thời gian đáp
ứng cũng khác nhau, có thể từ vài giây đến vài trăm giây. Các mô đáp ứng ở diện
rộng với thời gian xử lý SAAT. Vì thế, thời gian xử lý tối ƣu là khi xử lý thời gian
ngắn nhất và cho hiệu quả cao nhất.

10


Hình 2.2 Chuyển gen bằng phƣơng pháp SAAT; A. xử lý mẫu bằng phương pháp SAAT;
B. kết quả nhuộm GUS hạt đầu nành được xử lý bằng SAAT (www.oardc.ohio-state.edu).
Từ năm 1974, Miller và ctv ứng dụng phƣơng pháp chuyển gen SAAT trên mô rễ
cây Vicia faba; đến năm 1990 Joersbo và Brunstedt chuyển vào protoplast của
Nicotiana tabacum và Beta vulgaris, Trick và Finer thực hiện trên cây đậu nành, bắp,
lúa mì vào năm 1997, v.v.. Gần đây, một số nghiên cứu của Zaochang Liu và ctv
(2005) trên hạt Phaseolus vulgaris L., nghiên cứu của Byong-Jin Park và ctv (2005)
trên Raphanus sativus L. đã kết hợp SAAT với phƣơng pháp thấm hút chân không,
tạo điều kiện cho A. tumefaciens xâm nhiễm, làm tăng khả năng biến nạp. Sự kết hợp
giữa hai phƣơng pháp tỏ trên ra rất hữu hiệu, nhất là trên các loại cây khó chuyển nạp
gen (trích dẫn bởi Liu và ctv, 2005).
2.3.3.6. Một số phƣơng pháp chuyển gen in vivo
Phƣơng pháp Floral-dip: Ở phƣơng pháp này, cây chuyển gen đƣợc tạo ra bằng
cách ngâm hoa trực tiếp vào dịch khuẩn A. tumefaciens. Ƣu điểm của phƣơng pháp
này là không cần phải nuôi cấy in vitro, do đó có thể loại trừ nguy cơ biến dị sôma
(Clough và ctv, 1998). Phƣơng pháp này còn thành công trên cây Arabidopsis
thaliana với mô mục tiêu là hạt và hạt phấn của hoa chƣa trƣởng thành (Ye và ctv,
1999; Desfeux và ctv, 2000; trích dẫn bởi Sarma và ctv, 2004).
Phƣơng pháp chuyển gen qua ống phấn: Phƣơng pháp này đƣợc xem là một
phƣơng pháp không trải qua nuôi cấy mô. Chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn
đã đƣợc nhóm Ray Wu, Đại học Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếp
theo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của hai tác giả Trung Quốc Duan và

Chen (1985). Đây là phƣơng pháp sử dụng ống phấn trong việc chuyển vector mang
gen đi cùng tế bào sinh dục đực (tinh tử) kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang gen
ngoại lai vào tế bào noãn. Sau đó, hợp tử nhận đƣợc gen đích sẽ phát triển thành hạt
chuyển gen. Hạt nảy mầm và phát triển thành cây chuyển gen và đƣợc di truyền cho

11


các thế hệ sau. Chuyển gen qua ống phấn tốt nhất thực hiện ngay sau khi quá trình thụ
tinh xảy ra ở noãn, nhƣng tế bào sinh dục cái chƣa kịp phân chia. Sự chuyển gen sẽ
đƣợc thực hiện đối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và sau khi tái sinh cây
sẽ tránh xuất hiện thể khảm. Gen sau khi đƣợc chuyển đƣợc kiểm tra hoạt động của
gen đã chuyển, chọn lọc thể chuyển gen. Sau đó thực hiện giao phấn chéo một vài thế
hệ, kết hợp với chọn lọc tạo các giống chuyển gen có tính ổn định di truyền cao.
Phƣơng pháp chuyển gen vào hạt nảy mầm: Phƣơng pháp xâm nhiễm A.
tumefaciens vào hạt nảy mầm đƣợc thực hiện từ rất sớm trên một số đối tƣợng nhƣ
Arabidopsis thaliana (Feldmann và Mark, 1987), đậu nành (Chee và ctv, 1989), ngô
(Wang và ctv, 2007). Cây chuyển gen thu đƣợc bằng cách này chính là nhờ vi khuẩn
xâm nhiễm vào vùng tế bào chƣa phân hóa nhƣ vùng chồi đỉnh, vùng đốt lá mầm của
hạt đang nảy mầm. Chỉ cần một số tế bào đƣợc chuyển gen, sau đó sẽ phân chia, biệt
hóa thành cây chuyển gen. Hiệu quả chuyển gen sẽ cao hơn khi trên vùng chƣa phân
hóa xuất hiện những vết thƣơng tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhiễm dễ dàng hơn
(Chee và ctv, 1989).
2.4. Vi khuẩn A. tumefaciens và phƣơng pháp chuyển gen bằng Agrobacterium
2.4.1. Phân loại
Giới (Kingdom)

: Bacteria

Ngành (Phylum)

: Proteobacteria

Lớp (Class)

: Alpha Proteobacteria

Bộ (Order)

: Rhizobiales

Họ (Family)

: Rhizobiaceae

Chi (Genus)

: Agrobacterium

Loài (Species)

: A. tumefaciens

2.4.2. Đặc điểm hình thái, di truyền và gây bệnh
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que (rộng 0,6 1,0 µm, dài 1,5 - 3,0 µm) di động, không sinh bào tử, sống tự do trong đất, tăng
trƣởng tối ƣu từ 25 - 28oC. Khi tăng trƣởng trên môi trƣờng có carbohydrate thƣờng
tạo ra lớp nhầy polysaccharide ngoại bào dồi dào.

12