TẠO DÒNG GEN ORF2 MÃ HÓA PROTEIN CAPSID CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG GEN ORF2 MÃ HÓA PROTEIN CAPSID CỦA
PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHẠM THANH HỒNG

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG GEN ORF2 MÃ HÓA PROTEIN CAPSID CỦA
PORCINE CIRCOVIRUS TYPE II (PCV2)

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

PHẠM THANH HỒNG

KS. VÕ KHÁNH HƢNG

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ đã sinh thành, nuôi
dưỡng, dạy dỗ, ủng hộ tinh thần và luôn luôn bên con.
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều
kiện cho em học tập tại trường
Ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận
tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và KS. Võ Khánh Hưng đã tận tình dạy bảo, hướng
dẫn và động viên em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Các thầy cô và anh chị ở Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em thực tập
tốt nghiệp.
Gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp DH08SH đã động viên và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập tại trường và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012
Phạm Thanh Hồng

i


TÓM TẮT
Porcine circovirus type II (PCV2) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng còi
cọc trên heo sau cai sữa (PMWS). Bộ gen của PCV2 có 2 khung đọc mở lớn ORF1 và
ORF2. Trình tự gen ORF2 giữa các chủng trên thế giới có tính tương đồng rất cao
(96 – 100 %), đồng thời gen ORF2 mã hóa protein capsid – protein cấu trúc duy nhất
của PCV2. Do đó đề tài “Tạo dòng gen mã hóa protein capsid của Porcine circovirus
type II (PCV2)” được thực hiện nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong
việc kiểm soát PCV2 một cách hiệu quả.
Gen ORF2 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và được chèn vào vector
pGEM-T Easy. Hóa biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α. Sàng lọc và
thu nhận dòng E. coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp.
Một số kết quả đạt được như sau: khuếch đại gen ORF2 của virus PCV2, thu
nhận được dòng vi khuẩn E. coli DH5α chứa plasmid có trình tự gen ORF2 mã hóa
protein capsid của PCV2. Xác định được trình tự gen ORF2 của PCV2 tại Việt Nam.

ii


SUMMARY
Thesis tilte: “Molecular cloning of ORF2 gene encoding capsid protein of
Porcine circovirus type II (PCV2)”
Porcine circovirus type II (PCV2) plays a crucial role in the pathogenesis of

Post weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in swine. The genome of
PCV2 consists of two major open reading frames: ORF1 and ORF2. Sequence
comparison of ORF2 gene among PCV2 isolates in the world shows a high identity
(96 – 100 %), while ORF2 gene encodes capsid protein, the only structural protein of
PCV2. This study was done to create the basis for further researches to control this
virus effectively.
The ORF2 gene was amplified by PCR and inserted into pGEM-T Easy vector.
Then, recombinant vectors were transformed into E. coli DH5α by chemical
transformation. Finally, the isolation of E. coli DH5α clone containing the recombinant
vectors was performed by using antibiotic and X-Gal selections.
Some achievements: the ORF2 gene of PCV2 was amplified and sequenced.
The E. coli DH5α clone containing the recombinant vectors was obtained. The
sequence of ORF2 gene in Vietnam was also determined.
Keywords: Porcine circovirus, E. coli, ORF2 gene, clone.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ......................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..............................................................................................x
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................1

1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................1
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................2
2.1. Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa ....................................................................2
2.2. Dịch tễ học của hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa ...........................................2
2.3. Triệu chứng và bệnh tích của PMWS.......................................................................3
2.3.1. Triệu chứng của PMWS ........................................................................................3
2.3.2. Bệnh tích của PMWS ............................................................................................4
2.4. Virus gây hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa PMWS ........................................4
2.5. Cấu trúc bộ gen của Porcine circovirus type II........................................................5
2.6. Protein vỏ capsid của PCV2 .....................................................................................7
2.7. Một số nghiên cứu về gen ORF2 của PCV2 ............................................................8
2.8. Kỹ thuật và vật liệu sử dụng trong tạo dòng ..........................................................10
2.8.1. Kỹ thuật tạo dòng ................................................................................................10
2.8.2. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật tạo dòng ............................................10
2.8.2.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction Enzyme – RE) .............................................11
2.8.2.2. Enzyme nối .......................................................................................................11
2.8.3. Enzyme DNA polymerase ...................................................................................12
2.8.4. Vector plasmid sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng ................................................12
iv


2.8.5. Vi khuẩn E. coli sử dụng trong tạo dòng .............................................................13
2.8.6. Phương pháp biến nạp .........................................................................................14
2.8.6.1. Biến nạp tự nhiên ..............................................................................................14
2.8.6.2. Phương pháp hóa biến nạp ...............................................................................14
2.8.6.3. Biến nạp bằng phương pháp xung điện ............................................................15
2.8.7. Kỹ thuật PCR.......................................................................................................15
2.8.8. Giải trình tự DNA tự động ..................................................................................15
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ...................................................................16

3.2. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................16
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................16
3.2.2. Hóa chất và môi trường .......................................................................................16
3.2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................16
3.2.2.3. Vật liệu sinh học ...............................................................................................18
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................19
3.3.1. Khuếch đại gen ORF2 từ PCV2 chủng thực địa .................................................19
3.3.1.1. Tách chiết DNA PCV2 chủng thực địa ............................................................19
3.3.1.2. Khuếch đại gen ORF2 bằng phản ứng PCR .....................................................20
3.3.1.3. Phân tích và giải trình tự gen ORF2 .................................................................21
3.3.2. Tạo dòng gen ORF2 vào vi khuẩn E. coli DH5α ................................................21
3.3.2.1. Tinh sạch sản phẩm PCR ..................................................................................21
3.3.2.2. Nối sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy .................................................21
3.3.2.3. Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α .............................................................22
3.3.2.4. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α khả nạp ...........................22
3.3.2.5. Chọn lọc các dòng tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp ......................23
3.3.3. Thu nhận gen biểu hiện đoạn 301 đến 450 của ORF2 ........................................24
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................26
4.1. Kết quả ....................................................................................................................26
4.1.1. Khuếch đại gen ORF2 từ PCV2 chủng thực địa .................................................26
4.1.2. Phân tích kết quả giải trình tự .............................................................................26
4.1.3. Tạo dòng gen ORF2 vào vi khuẩn E. coli DH5α ................................................28

v


4.1.4. Thu nhận gen biểu hiện đoạn 301 đến 450 của ORF2 ........................................30
4.2. Thảo luận ................................................................................................................31
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................33
5.1. Kết luận...................................................................................................................33

5.2. Kiến nghị ................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................34
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ampr

Gen kháng ampicilline

ctv

cộng tác viên

dATP

3’-deoxyadenine-5’-triphosphate

dCTP

3’-deoxycytosine-5’-triphosphate

ddNTP

Dideoxy nucleoside triphosphate

dGTP

3’-deoxyguanine-5’-triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

3’-deoxynucleotide-5’-triphosphate

dTTP

3’-deoxythyamine-5’-triphosphate

E. coli

Escherichia coli

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

IFA

Indirect immunofluorescence assay

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactoside

IPMA

Immunoperoxidase Monolayer Assay

kb

Kilobase pair

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

MCS

Multiple cloning site

NLS

Nuclear localization signal

OD

Optical density

ORF

Open reading frame

PCR

Polymerase chain reaction

PCV

Porcine circovirus

PCV1

Porcine circovirus type I

PCV2

Porcine circovirus type II

PDNS

Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome

PPV

Porcine parvovirus

PRV

Pseudorabies virus

PK-15

Pig kidney-15
vii


PMWS

Post-weaning-multisystemic-wasting-syndrome

PRDC

Porcine respiratory disease complex

PRRS

Porcine respiratory and reproductive syndrome

RE

Restriction Enzyme

SOC

Super Optimal broth with Catabolite repression

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris borate EDTA

Tm

Melting temperature

UV

Ultraviolet

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Trình tự mồi khuếch đại gen ORF2 ...............................................................20
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen ORF2........................................20
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen ORF2 ............................20
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy ...........21
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc ...........................................................23
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi ORF2 CF, ORF2 CR ...............24
Bảng 3.7 Trình tự mồi khuếch đại gen biểu hiện ..........................................................25
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen biểu hiện...................................25
Bảng 3.9 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen biểu hiện .......................25

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Heo bị hội chứng còi cọc sau cai sữa (PMWS) ...............................................3
Hình 2.2 Cấu trúc của Porcine Circovirus .....................................................................4
Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PCV2 ...............................................................................6
Hình 2.4 Protein capsid (PC) của PCV2.. .......................................................................7
Hình 2.5 Các bước cơ bản trong tạo dòng gen .............................................................10
Hình 2.6 Cấu tạo của pUC19 ........................................................................................13
Hình 3.1 Vector tạo dòng pGEM–T Easy.....................................................................18
Hình 4.1 Sản phẩm ORF2 được khuếch đại bằng phản ứng PCR. ...............................26
Hình 4.2 Kết quả BLAST vùng giải trình tự trên NCBI ..............................................27
Hình 4.3 Đĩa đối chứng E. coli DH5α không chứa vector ...........................................28
Hình 4.4 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli DH5α .........................28
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc......................................................29
Hình 4.6 Kết quả PCR khuếch đại gen ORF2 trên pGEM-T Easy – ORF2 .................30
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR dùng trong biểu hiện ....................................31

x


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, các nhà chăn nuôi heo ở nước ta gặp rất nhiều khó
khăn trong việc phòng và chữa bệnh trên heo. Một trong những dịch bệnh mới xuất
hiện gây tổn thất kinh tế nặng nề là hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa
(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS). Nguyên nhân gây ra hội
chứng PMWS là do Porcine circovirus type 2 – PCV2 (Allan và ctv, 1999). Bộ gen
của PCV2 có 6 khung đọc mở, trong đó có hai khung đọc mở lớn nhất là: ORF1 và
ORF2. Gen ORF2 mã hóa protein capsid có kích thước khoảng 28 kDa, là protein cấu
trúc duy nhất, có tính kháng nguyên mạnh kích thích sự hình thành kháng thể

(Nawagitgul và ctv, 2000). Đồng thời trình tự gen ORF2 giữa các chủng PCV2 phân
lập ở nhiều nơi trên thế giới có độ tương đồng rất cao (96 – 100 %).
Đề tài: “Tạo dòng gen ORF2 mã hóa protein vỏ capsid của PCV2 gây hội
chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (PMWS)” được thực hiện nhằm phục vụ cho các
nghiên cứu tiếp theo như là đối chứng dương trong các kỹ thuật chẩn đoán PCV2
(PCR, LAMP, Realtime PCR), hay nguyên liệu cho nghiên cứu tạo dòng biểu hiện
protein capsid. Góp phần vào việc chẩn đoán và kiểm soát virus một cách hiệu quả.
1.2. Mục tiêu đề tài
Tạo dòng gen ORF2 mã hóa protein vỏ capsid của Porcine circovirus type II
vào tế bào E. coli DH5α.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Thu nhận gen ORF2 của PCV2 chủng thực địa.
Tạo dòng gen ORF2 của PCV2 vào vector pGEM-T Easy, biến nạp vào tế bào
E. coli DH5α.
Bước đầu nghiên cứu tạo dòng biểu hiện protein capsid của PCV2.

1


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa
Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (Post – Weaning Multisystemic Wasting
Syndrome – PMWS) là một bệnh truyền nhiễm do virus gây ra trên heo sau cai sữa.
PMWS được phát hiện lần đầu tiên ở phía Tây Canada vào năm 1991 (Clark, 1997;
Harding, 1997). PMWS xuất hiện và gây thiệt hại rất lớn ở nhiều nơi như Canada, Mỹ,
châu Âu, châu Á.
Hội chứng PMWS gây chết chủ yếu heo ở lứa tuổi từ 5 đến 12 tuần tuổi
(Harding, 1997). Dấu hiệu bệnh tích điển hình khi heo bị nhiễm bệnh như: heo kém
vận động, ốm, giảm cân, lông thô, hạch bạch huyết sưng, đặc biệt là hạch giữa 2 chân
sau, tiêu chảy (30 %), thở khó do viêm phổi kẽ.

PMWS thường hay kết hợp với virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp
trên heo (PRRSV), virus cúm heo, Parvovirus trên heo, Haemophilus parasuis,…(Cao
và ctv, 2005; Ellis và ctv, 2004). Một số nghiên cứu còn cho thấy việc nhiễm PCV2
cũng liên quan đến hội chứng viêm da thận (PDNS – porcine dermatitis and
nephropathy syndrome), hội chứng hô hấp phức tạp trên heo (PRDC – porcine
respiratory disease complex) (Gresham và ctv, 2000).
PMWS gây thiệt hại kinh tế và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe đàn heo trong
ngành chăn nuôi của nhiều quốc gia (Chae, 2004). Nhưng những hiểu biết về bệnh vẫn
còn hạn chế, vì thế các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu và tìm cách khống chế
căn bệnh này.
2.2. Dịch tễ học của hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa
Hội chứng PMWS do PCV2 gây ra thường tác động trên heo 3 tuần tuổi và rõ
ràng hơn từ 4 – 6 tuần tuổi trở đi. Heo con có hàm lượng kháng thể mẹ truyền cao
thường không nhiễm bệnh (Lâm Thị Thu Hương và ctv, 2005).
PCV2 hiện diện nhiều ở hạch bạch huyết và hạch lympho, ngoài ra virus cũng
được tìm thấy trong phân, nước tiểu, máu, xoang mũi heo con cũng như trong tinh dịch
của heo đực. Tỷ lệ heo nhiễm bệnh trong đàn biến thiên từ 5 – 50 % và tỷ lệ tử vong từ
5 – 80 % trong số những heo bệnh.

2


PCV2 có thể lây truyền qua các đường hô hấp, máu, nhau thai và cơ quan sinh
dục. Bệnh chủ yếu lây từ heo bệnh sang heo khỏe qua phân, tiếp xúc trực tiếp như mật
độ chăn nuôi cao, hoặc thông qua dụng cụ, động vật trung gian mang mầm bệnh như
chim, chuột,… Sự phân bố bệnh trong đàn bị nhiễm PMWS cũng thay đổi, một số heo
trong đàn nhiễm và chết trong khi một số vẫn khỏe mạnh và phát triển bình thường.

Hình 2.1 Heo bị hội chứng còi cọc sau cai sữa (PMWS)
(www.octagon-services.co.uk)

2.3. Triệu chứng và bệnh tích của PMWS
2.3.1. Triệu chứng của PMWS
Heo mắc hội chứng PMWS thường có diễn biến chậm. Những dấu hiệu lâm
sàng có thể kéo dài nhiều tháng cụ thể là heo đang phát triển bình thường rồi sau đó
gầy ốm một cách nhanh chóng. Heo có biểu hiện giảm cân, khó thở, hoàng đản, tiêu
chảy và những bệnh học thường thấy là viêm phổi kẽ, hạch lympho sưng, viêm gan và
thận (Ellis và Harding, 1998). Một số heo có triệu chứng ho, sốt, triệu chứng thần kinh
và chết đột ngột đôi khi cũng xuất hiện.
PMWS nếu kết hợp với hội chứng viêm da và thận ở heo (Porcine Dermatitis
and Nephropathy Syndrome – PDNS) sẽ tăng tỷ lệ gây chết trên đàn heo bệnh. Bệnh
biểu hiện qua viêm vành tai, viêm da phía sau đùi, viêm da toàn thân (giống triệu
chứng viêm da tiết dịch do nhiễm Staphylococcus), bệnh có thể kéo dài nhiều tháng
trong đàn và lây lan. Hiệu quả điều trị không cao do chưa có thuốc đặc trị.

3


2.3.2. Bệnh tích của PMWS
Bệnh tích PMWS chủ yếu là tổn thương mô bạch huyết và mô phổi. Lách sưng
lớn nhưng không sung huyết. Hạch lâm ba màng treo ruột viêm sưng, ruột viêm, xuất
huyết. Thận viêm, sưng có những điểm trắng trên bề mặt. Phổi dai, viêm phổi kẽ. Phù
nề, ứ dịch ở các mô, cơ quan trong xoang ngực, xoang bụng.
Ngoài ra bệnh tích của PMWS còn có đặc điểm là tổn thương ở mô lympho, sự
suy giảm tế bào lympho ở các cơ quan lympho như hạch lympho, hạch hạnh nhân,
mảng Peyer’s, lá lách, tuyến ức. Thể vùi trong bào tương và lympho bào hoại tử cũng
hiện diện ở mảng Peyer’s và hạch hạnh nhân. Tế bào mô xơ hóa xuất hiện ở phổi, sự
xâm nhiễm của tế bào viêm gây viêm phế quản cấp tính. Trên gan, các tế bào mô gan
hoại tử cùng với sự xâm nhiễm mô lympho vào vùng cửa gan. Sự phân bố và mức độ
bệnh tích tại các cơ quan khác nhau tùy thuộc vào từng giai đoạn bệnh (Lâm Thị Thu
Hương và ctv, 2005).

2.4. Virus gây hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa PMWS
Virus gây hội chứng PMWS là một DNA virus chuỗi đơn dạng vòng, kích
thước 1,76 kb (Tischer và ctv, 1982) thuộc họ Circoviridae (Lukert và ctv, 1995),
thường được gọi là Porcine circovirus (PCV). Circovirus là những virus nhỏ nhất lây
nhiễm sang động vật có vú được công nhận. Virus không có vỏ bọc, hình khối 20 mặt,
được hình thành bởi 60 tiểu đơn vị, kích thước vào khoảng 17 nm (Tischer và ctv,
1982), đường kính 15 – 24 nm. (Ellis và ctv, 1998). Khi nghiên cứu về PCV, người ta
nhận thấy có đến 2 loại PCV: PCV1 và PCV2.

Hình 2.2 Cấu trúc của Porcine circovirus
(www.viralzone.expasy.org).
PCV1 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973, nhiễm phổ biến trên các đàn
heo trên thế giới hay trong môi trường nuôi cấy tế bào thận heo PK-15 (Allan và ctv,
4


1995; Tischer và ctv, 1982) . Một lượng kháng thể huyết thanh chống PCV1 đã được
phát hiện từ những heo bị bệnh còi. Tuy nhiên khi tiến hành thử nghiệm trên heo mới
sinh thì không gây triệu chứng bệnh lâm sàng và PCV1 không gây bệnh trên heo
(Tischer và ctv, 1986).
PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1991 trên đàn heo phía Tây Canada,
kháng thể chống PCV2 đã được phát hiện trong huyết thanh. Từ những nghiên cứu cho
thấy PCV2 khi gây nhiễm trên heo, heo có một số biểu hiện tổn thương đặc trưng của
bệnh PMWS. Như vậy PCV2 là tác nhân gây ra hội chứng PMWS (Allan và ctv, 1998;
Chae, 2004). PCV2 là nhân tố sơ khởi nhưng không phải là duy nhất gây ra PMWS mà
nguyên nhân gây bệnh là do sự nhiễm thứ cấp của một số virus và vi khuẩn như
Porcine parvovirus, PRRSV, Mycoplasma hyopneumonia. Ngoài ra, PCV2 cũng có
thể được phát hiện ngay ở trên heo khỏe, do đó việc chẩn đoán PMWS cần phải đảm
bảo 3 yêu cầu: các dấu hiệu bệnh lâm sàng, bệnh tích vi thể và PCV2 hiện diện trong
mẫu bệnh phẩm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

2.5. Cấu trúc bộ gen của Porcine circovirus type II
Bộ gen của PCV2 có kích thước là 1767 – 1768 bp (Mahe và ctv, 2000) và
PCV1 có kích thước là 1759 bp (Meehan và ctv, 1998). Bộ gen của 2 loại PCV gồm có
2 khung đọc mở lớn nhất: ORF1 và ORF2, trong đó trình tự nucleotide tương đồng về
gen ORF1 giữa 2 loài là khoảng 86 % (Lekcharoensuk và ctv), và gen ORF2 là khoảng
67 % (Mozorov và ctv, 1998).
Bộ gen PCV2 có cấu trúc steem-loop và các trình tự nonanucleotide motif gần
giống nhau. Đây là vùng được xem là cần thiết cho sự nhân lên của virus. PCV tái bản
thông qua dạng mạch kép trung gian (double-stranded replication form) (Meehan và
ctv, 1998). Các phân lập của PCV2 có nhiều kiểu gen khác nhau và được xếp vào 4
nhóm: PCV2a, PCV2b, PCV2c và PCV2d (Guo và ctv, 2010).

5


Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PCV2 (www.virology.com).
Gen ORF1 của PCV2 có kích thước là 942 bp, ORF1 mã hóa cho protein liên
quan đến sự nhân lên của virus, sản phẩm protein mã hóa có kích thước 35,7 kDa
(Mankezt và ctv, 1998). Gen ORF1 còn được gọi là rep gene.
Gen ORF2 của PCV2 có kích thước khoảng 702 bp, mã hóa protein vỏ capsid,
còn được gọi là protein cap, kích thước 30 kDa (Hamel và ctv, 1998; Nawagitgul và
ctv, 2000). Khi giải mã trình tự gen ORF2 của vỏ capsid virus, những phân lập gen
ORF2 ở các nơi trên thế giới có độ tương đồng rất cao (Larochelle và ctv, 2002;
Kamstrup và ctv, 2004). Mặc dù có một số khác biệt về gen ORF2 nhưng vùng gen mã
hóa đầu N cuối (N-terminal region) của ORF2 gần như không thay đổi ở tất cả các
phân lập virus trên thế giới (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Theo các nghiên cứu, protein
cap kích thích sự hình thành kháng thể trung hòa có trong huyết thanh (Nawagitgul và
ctv, 2000). Do đó protein cap là một protein triển vọng trong việc phát triển vaccine tái
tổ hợp (Blanchard và ctv, 2003; Kamstrup và ctv, 2004) hay kháng nguyên trong các
phản ứng huyết thanh học (Nawagitgul và ctv, 2002; Blanchard và ctv, 2003; Liu và

ctv, 2004; Shang và ctv, 2008).
Ngoài ra, gen ORF3 của PCV2 cũng được nghiên cứu gần đây. Gen ORF3 có
kích thước 315 bp, mã hóa protein có kích thước 11,8 kDa (Liu và ctv, 2005 ). Gen
ORF3 không cần thiết trong sự tái bản của virus nhưng có vai trò trong sự lan truyền

6


của PCV2. Gen ORF3 liên quan đến hiện tượng apoptosis và là tác nhân virus gây
bệnh trên chuột (Liu và ctv, 2005).
2.6. Protein vỏ capsid của PCV2
Protein vỏ capsid của PCV2 được mã hóa bởi gen ORF2. Đây là protein cấu
trúc duy nhất của PCV2 (Nawagitgul và ctv, 2000). Protein vỏ capsid có hình khối cầu
20 mặt, được hình thành bởi 60 protein tiểu đơn vị (Crowther và ctv, 2003).

Hình 2.4 Protein capsid (PC) của PCV2.
(a) Cấu trúc của một PC, (b) Lớp vỏ capsid gồm
60 tiểu đơn vị (Benjamin và ctv, 2011).

Protein capsid của PCV2 được biểu hiện thành công ở nhiều tế bào chủ
prokaryote như E. coli, Lactococcus lactis. Và một số tế bào eukaryote như tế bào
động vật có vú, tế bào côn trùng. Protein capsid có vùng nuclear localization signal
(NLS), gồm 41 amino acid tại đầu N-terminus. Vùng NLS chứa nhiều codon hiếm
(30 %) điều này gây ra khó khăn trong nghiên cứu biểu hiện protein capsid ở tế bào
prokaryote (Lou và ctv, 2010).
Protein capsid có tính miễn dịch, tạo kháng thể trung hòa trong huyết thanh.
Theo nghiên cứu của Lekcharoensuk và ctv, 2004 về bản đồ epitope của protein capsid
được chia thành 6 vùng. Đầu N-terminal gồm 46 amino acid không có chức năng
chính trong việc hình thành epitope. Vùng này chứa nhiều các amino acid thiết yếu
(Hamel và ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998) do đó có thể liên quan đến sự hình thành

lớp vỏ bên trong của virus, hay sự tương tác giữa các sợi DNA mang điện tích âm khi
7


virus lắp ráp. Điều này giống với một số báo cáo về nhiều loại virus khối cầu 20 mặt
(Rossman và ctv, 1989). Tuy nhiên đầu N-terminal không hẳn là không có tính miễn
dịch vì một epitope dạng thẳng (peptide tổng hợp amino acid từ 25 đến 43) được tìm
thấy (Mahe và ctv, 2000). Chuỗi amino acid tiếp theo của protein capsid bao gồm 187
amino acid (từ amino acid 47 đến đầu C-terminal) quan trọng trong việc hình thành
lớp vỏ capsid của virus. Phản ứng giữa kháng thể đa dòng và các đoạn peptide tổng
hợp đã chỉ ra rằng có 4 epitope có tính miễn dịch mạnh nằm trong vùng này, gồm các
đoạn từ amino acid 65 đến 87, 113 đến 127, 117 đến 131 và 157 đến 183. Ngoài ra,
một vài amino acid nằm ở đầu C-terminal của protein capsid PCV2 tạo nên một
epitope (193 – 207) nằm ở bề mặt virus. Qua nghiên cứu của Lekcharoensuk và ctv,
epitope này phản ứng với một số kháng thể đơn dòng.
2.7. Một số nghiên cứu về gen ORF2 của PCV2
PCV2 được biết tới như là một trong những virus nhỏ nhất xâm nhiễm vào tế
bào động vật có vú (Tischer và ctv, 1982). Dịch bệnh PMWS do PCV2 gây nên ngày
càng diễn biến phức tạp, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo. Do đó việc chẩn
đoán sớm và phòng ngừa PCV2 ngày càng cấp thiết. Các nghiên cứu về PCV2 tập
trung chủ yếu vào biểu hiện protein capsid – protein cấu trúc duy nhất. Qua các nghiên
cứu protein capsid tái tổ hợp được đánh giá có độ nhạy và đặc hiệu cao trong các xét
nghiệm miễn dịch, đồng thời có thể phát triển thành vaccine thế hệ mới – vaccine tiểu
đơn vị, góp phần ngăn ngừa dịch bệnh nguy hiểm này.
Năm 2000, Nawagitgul và ctv tạo dòng toàn bộ gen ORF2 có kích thước 702bp
trong plasmid pKSII+. Để tạo vector biểu hiện pPSP.PCV.ORF2 có nguồn gốc từ
Baculovirus. Gen ORF2 được chèn trong vector pFastbac, vector chuyển được biến
nạp vào tế bào E. coli DH10Bac có mang vector Baculovirus (bacmid), nhanh chóng
biến đổi thành vector tái tổ hợp pPSP.PCV.ORF2. Vector bacmid tái tổ hợp trong tế
bào E. coli DH10Bac được sàng lọc, tách chiết, tinh sạch và chuyển vào tế bào Sf9.

Protein được biểu hiện dưới sự điểu khiển của promoter polyhedrin có kích thước là
30 kDa. Kiểm tra sự hiện diện của protein capsid bằng phương pháp Western blot.
Năm 2004, nghiên cứu của Liu và ctv phát triển kỹ thuật ELISA chẩn đoán
PCV2, với kháng nguyên là protein capsid tái tổ hợp được biểu hiện nhờ hệ thống
vector biểu hiện Baculovirus. Protein capsid tái tổ hợp (rC protein) được biểu hiện

8


cùng với protein dung hợp nhờ chuỗi peptide C-terminal (histidine), rC protein được
tinh sạch và sử dụng như là kháng nguyên trong kỹ thuật miễn dịch ELISA. Để đánh
giá hiệu quả, rC protein được thử nghiệm với các mẫu PCV2 dương và âm tính, đồng
thời so sánh rcELISA với kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp (IPMA). Kết quả thí
nghiệm cả hai phương pháp với các mẫu PCV2 dương tính và âm tính, độ tương đồng
của hai phương pháp là 89,2 %. Kỹ thuật rcELISA có độ đặc hiệu là 88,5 %, độ nhạy
là 89,4 % khi phát hiện kháng thể PCV2 có trong huyết thanh. Kỹ thuật rcELISA cho
kết quả không gây phản ứng chéo với kháng thể của PCV1, PRRSV và PPV.
Năm 2006, Wang và ctv nghiên cứu biểu hiện protein vỏ capsid của PCV2 với
Adenovirus tái tổ hợp. Đoạn ORF2 được khuếch đại có kích thước là 570 bp chèn vào
vector chuyển pShuttle-CMV tạo thành vector tái tổ hợp pShuttle-CMV-ORF2. Xử lý
vector pShuttle-CMV-ORF2 với enzyme PmeI thu nhận đoạn ORF2 sẽ được chèn vào
tế bào E. coli BJ5183 có chứa plasmid pAdEasy-1, tạo thành plasmid tái tổ hợp
pAd-ORF2. Plasmid tái tổ hợp pAd-ORF2 được gài vào bộ gen Adenovirus thẳng.
Adenovirus tái tổ hợp được gây nhiễm vào các giếng tế bào một lớp. Phát hiện protein
capsid bằng kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp.
Năm 2007, Wu và ctv đã thành công trong nghiên cứu biểu hiện 6 chuỗi
polypeptide (protein cap tiểu đơn vị) trong tế bào E. coli BL21. Độ nhạy và độ đặc
hiệu của các protein tái tổ hợp được thử nghiệm bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kết
quả thu được khi thử nghiệm trên các mẫu PCV2 dương tính và âm tính, cả 6 chuỗi
polypeptide đều cho độ đặc hiệu cao (100 %). Kết quả trong nghiên cứu này cũng cho

thấy, chuỗi N-terminal có độ nhạy thấp nhưng lại cao hơn chuỗi C-terminal. Trong đó
chuỗi polypeptide từ vị trí 101 – 150 và vị trí 151 – 200 cho tính miễn dịch có độ nhạy
cao. Do đó kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng các đoạn polypeptide này như là kháng
nguyên có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, ứng dụng trong chẩn đoán nhanh PCV2.
Nghiên cứu của Jin và ctv, 2007 cho thấy vaccine tái tổ hợp Pseudorabies virus
(PRV) có hiệu quả chống lại được cả PCV2 và PRV. Để làm được điều này, toàn bộ
khung đọc mở ORF2 được cài vào genome của PRV thông qua plasmid chuyển. Kiểm
tra sự biểu hiện của protein cap trong virus tái tổ hợp bằng kỹ thuật Western blot, miễn
dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA). Virus tái tổ hợp được thử nghiệm trên heo 4 tuần
tuổi. Đánh giá tính miễn dịch của virus tái tổ hợp bằng kỹ thuật ELISA, trung hòa

9


virus PRV, sự gia tăng của các tế bào lympho đáp ứng lại các thụ thể trên protein
capsid của ORF2.
2.8. Kỹ thuật và vật liệu sử dụng trong tạo dòng
2.8.1. Kỹ thuật tạo dòng
Tạo dòng là quá trình chuyển một gen từ vị trí ban đầu vốn có trong tự nhiên
sang một vectơ tái bản tự động. Nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn gen mục tiêu,
thu nhận dòng tế bào biểu hiện gen mục tiêu. Các bước cơ bản của quá trình tạo dòng:
thu nhận và xử lý gen mục tiêu, tiếp theo chọn và xử lý vector phù hợp. Cắt gen mục
tiêu và vector bằng enzyme cắt giới hạn. Nối gen mục tiêu vào vector tạo vector tái tổ
hợp bằng enzyme nối. Biến nạp vector tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ phù hợp và sau
đó tiến hành sàng lọc chọn ra dòng tế bào mang vector tái tổ hợp (Brown, 2010).

Hình 2.5 Các bước cơ bản trong tạo dòng gen (Brown, 2010).
2.8.2. Các enzyme chủ yếu dùng trong kỹ thuật tạo dòng
10

2.8.2.1. Enzyme cắt giới hạn (Restriction Enzyme – RE)
Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage sẽ bị phá hủy. Tuy nhiên có một
số loài vi khuẩn không bị phá hủy, do trong tế bào vi khuẩn có loại enzyme có khả
năng cắt DNA phage thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith lần đầu tiên
tách được loại enzyme này từ vi khuẩn Haemophilus influenzae được gọi tên là HindII.
Các loại enzyme này là một phần trong hàng rào tự nhiên của vi khuẩn chống lại sự
xâm nhiễm DNA ngoại lai, và được gọi là enzyme cắt giới hạn. Enzyme cắt giới hạn
liên kết với enzyme methylase. Sự methyl hóa giúp DNA thoát khỏi enzyme giới hạn,
điều này giúp cho tế bào không phá hủy DNA của chính nó.
Có 3 loại enzyme cắt giới hạn: loại I, II và III. Chúng là các nuclease, và vì
chúng cắt tại một vị trí nằm bên trong sợi DNA (chứ không phân hủy DNA từ hai đầu)
nên gọi là endonuclease. Enzyme cắt giới hạn loại I và III cắt bên ngoài trình tự nhận
biết. Chỉ có enzyme giới hạn loại II cắt tại vị trí trình tự cắt giới hạn. Do đó chúng
được sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử.
Mỗi endonuclease loại II có trình tự cắt riêng biệt, có thể nhận biết một trình tự
đặc thù các cặp bazơ trên DNA. Đoạn nhận biết phổ biến nhất có chiều dài 4, 5 hoặc 6
nucleotide. Trình tự nhận biết giống nhau trên cả 2 mạch, được gọi là palindrome. Có
2 kiểu cắt của enzyme giới hạn là kiểu cắt tạo đầu bằng (blunt ends) và đầu sole (đầu
dính – cohesive ends). Enzyme giới hạn cắt đầu sole tạo đầu dính. Sau khi cắt chúng
có thể tự nối với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Chính vì vậy chúng được sử dụng
nhiều trong kỹ thuật tạo dòng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997).
Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện về nhiệt độ
và dung dịch đệm thích hợp. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng
tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme – cơ chất.
2.8.2.2. Enzyme nối
DNA ligase là một enzyme quan trọng trong tế bào vì chức năng của nó là sửa
chữa các mối liên kết phosphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc do hậu quả
của việc sao chép hoặc tái tổ hợp DNA. Trong kỹ thuật di truyền, nó được sử dụng để
hàn gắn những chỗ gián đoạn trong chuỗi đường – phosphat, những gián đoạn này

thường diễn ra khi DNA tái tổ hợp được hình thành bằng cách nối các phân tử DNA từ
những nguồn khác nhau. Vì vậy được coi là chất keo phân tử được sử dụng để kết dính

11


các đoạn DNA với nhau. Chức năng này là hết sức quan trọng đối với sự thành công
của nhiều thí nghiệm và vì vậy DNA ligase là enzyme chủ chốt trong kỹ thuật di
truyền (Trịnh Đình Đạt, 2007)
Có 3 loại enzyme nối thường dùng trong công nghệ di truyền. Enzyme E. coli
DNA ligase được tách chiết từ vi khuẩn E. coli, xúc tác phản ứng nối hai đoạn trình tự
DNA có đầu sole. Enzyme T4 DNA ligase, được tách chiết từ các tế bào E. coli bị
nhiễm phage T4, có chức năng giống như E. coli DNA ligase nhưng lại có khả năng
nối 2 đoạn trình tự DNA có đầu bằng và là enzyme nối được ưa chuộng nhất hiện nay.
Enzyme T4 RNA ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E. coli, có khả năng nối hai
trình tự RNA bằng các liên kết phosphodiester (Trịnh Đình Đạt, 2007).
2.8.3. Enzyme DNA polymerase
Các enzyme polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các acid nucleic (DNA
hoặc RNA) được sử dụng nhiều trong công nghệ di truyền. Chúng tổng hợp acid
nucleic bằng cách nối các nucleotide với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa theo mạch
khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều 5’ – 3’ và sự khởi đầu
cần có đầu 3’-OH tự do. Một trong những enzyme thông dụng được sử dụng nhiều
trong kỹ thuật chuỗi trùng hợp (kỹ thuật PCR) là Taq DNA polymerase, được tách
chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Taq DNA polymerase có khả
năng tăng cường sự bắt cặp tạo cDNA (complementary DNA) nhưng không hoạt động
được trên các phân tử RNA. Enzyme Taq thường gắn thêm đuôi A (adenine) sau mỗi
chu kỳ tổng hợp (PCR), giúp dễ dàng nối vào các vector có đầu T (thymine) (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 1997).
2.8.4. Vector plasmid sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng
Nhiều loại plasmid được tìm thấy trong tự nhiên trong các vi khuẩn và trong

một số nấm men. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng, tương đối nhỏ so với
nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ, kích thước 2 – 5 kb. Các plasmid tồn tại chủ yếu ở
trạng thái ngoài nhiễm sắc thể, chúng có khả năng sao chép độc lập, không phụ thuộc
vào sự sao chép . Mặc dù các plasmid nói chung có thể bỏ qua (chúng không cần thiết
cho quá trình sinh trưởng và phân chia của tế bào) nhưng chúng truyền các tính trạng
(chẳng hạn: tính bền vững với kháng sinh) cho sinh vật chủ, do vậy giúp cho việc lựa
chọn dễ dàng trong những điều kiện xác định. Có nhiều loại plasmid khác nhau. Tùy

12


theo chức năng và có các gen trên đó, người ta chia thành nhiều loại khác nhau như
plasmid giới tính (F), plasmid kháng chất kháng sinh (R), plasmid có gen mã hóa chất
colcicine giết các vi khuẩn (col). Một cách phân loại khác dựa theo phương thức
truyền sang vật nhận, được chia thành hai nhóm: tiếp hợp và không tiếp hợp. Các
plasmid tiếp hợp có thể tự truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua quá
trình tiếp hợp. Đòi hỏi plasmid chứa đoạn đặc thù tra (transfer) và đoạn mob
(mobilising). Các plasmid không tiếp hợp thì không tự truyền đi được để vào vật nhận.
Plasmid không tiếp hợp thường nhỏ, sao chép một cách thoải mái và tồn tại trong tế
bào với số bản sao lớn hơn so với plasmid tiếp hợp (Lê Đình Lương, 2003).
Plasmid được sử dụng làm vector trong tạo dòng có các thành phần cơ bản
gồm: marker chọn lọc, thường là gen kháng kháng sinh, điểm khởi đầu tái bản (ori),
trình tự gồm các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn (Multiple cloning site –
MCS) để gắn các đoạn chèn.

Hình 2.6 Cấu tạo của pUC19 (Lê Đình Lương và Quyền Đình Thi, 2004).
2.8.5. Vi khuẩn E. coli sử dụng trong tạo dòng
E. coli là vi khuẩn được sử dụng phổ biến trong tạo dòng do đặc tính di truyền,
sinh học phân tử, sinh hóa và sinh lý của vi khuẩn đã được nghiên cứu rất nhiều.
E. coli đáp ứng các yêu cầu của tế bào chủ lý tưởng trong kỹ thuật di truyền đó là dễ

nuôi cấy, dễ giữ và nhân giống, lại chấp nhận được nhiều loại vector.
E. coli là vi khuẩn Gram âm có một nhiễm sắc thể riêng lẻ nằm trong một cấu
trúc gọi là vùng nhân. Kích thước bộ gen vào khoảng 4x106 cặp bazơ. Các quá trình
biểu hiện gen (phiên mã và dịch mã) đi đôi với nhau, sinh ra sợi mRNA được tổng hợp
13