ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN Lactobacillus sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Lactobacillus sp.

Ngành học :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện :

PHẠM VĂN LÂM

Niên khóa :

2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG
VI KHUẨN Lactobacillus sp.

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

PHẠM VĂN LÂM

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM,
ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện thành
công khóa luận.
Xin được tỏ lòng biết ơn đến cô Trương Phước Thiên Hoàng. Người đã tận tình
chỉ bảo và tạo điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này.
Ngàn lần gửi lời biết ơn sâu sắc đến anh Nguyễn Phan Thành. Người đã định
hướng, dìu dắt và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Lời cảm ơn chân thành tới bạn Đỗ Tô Hoa Mai. Người quan tâm, chia sẻ và giúp
đỡ tôi rất rất nhiều trong suốt thời gian tôi làm đề tài.
Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh và sinh học phân tử đã
khuyến khích, ủng hộ và giúp đỡ để tôi thực hiện tốt khóa luận này. Cùng toàn thể lớp
CNSH 34 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Công ơn của cha mẹ đã sinh thành, dưỡng dục và hy sinh tất cả để cho con ăn

học nên người. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bước
qua mọi khó khăn.

Phạm Văn Lâm

i


TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu nhằm tạo được bộ giống Lactobacillus sp. phục vụ cho
sản xuất sữa chua, dưa chua và phomat quy mô nhỏ, xa hơn là quy mô công nghiệp.
Đồng thời cấp thông tin các mẫu vi khuẩn bản địa, đóng góp một phần dữ liệu
Lactobacillus sp cho Genbank, tăng sự hiểu biết về các dòng Lactobacillus có nguồn
gốc ở Việt Nam, giảm sự phụ thuộc nguồn giống vi sinh từ nước ngoài.
Nghiên cứu được tiến hành gồm ba giai đoạn. Giai đoạn một, các mẫu vi khuẩn
thu thập từ các sản phẩm lên men được phân lập và lưu trữ. Giai đoạn hai, mẫu được
định danh Lactobacillus sp. bằng các phản ứng sinh hóa đặc trưng. Giai đoạn ba, các
mẫu vừa định danh bằng các phản ứng sinh hóa được kiểm tra lại bằng phản ứng PCR
với cặp mồi đặc trưng của Lactobacillus sp.
Trong nghiên cứu này, 31 mẫu vi khuẩn đã được phân lập và khảo sát các đặc
điểm sinh hóa. Trong đó, có 24 mẫu vi khuẩn cho phản ứng sinh hóa phù hợp với phản
ứng sinh hóa của chủng Lactobacillus sp. Đồng thời có 3 mẫu vi khuẩn cho kết quả
sản phẩm phản ứng PCR phù hợp với 2 loài Lactobacillus. Với mẫu dưa chua thu thập
từ chợ Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh (kí hiệu là: CSNL) là Lactobacillus
fermentum và 2 mẫu phân lập từ Sữa chua WellYo – Siêu Thị Coop – Mart Suối Tiên
– Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh (kí hiệu là: WY); mẫu dưa chua thu thập từ chợ
Việt Thắng – Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh (kí hiệu là: CS) là Lactobacillus
casei.

ii

SUMMARY
Thesis: “The application of molecular biology techniques in identifying
Lactobacillus sp. strains”.
This study aims to find out the Lactobacillus sp. strains collection to use for
small-scale production, further to an industrial scale. It also provides the informations
about some field bacterial samples, partly contributed the data for Genbank, increased
the knowledge about some Lactobacillus strains derived from Vietnam, reduced the
reliance on foreign microbiological sources.
The study was carried out in three steps. Firstly, the bacterial samples collected
from fermented products were isolated and stored.

Secondly, the samples were

identified by typically biochemical reactions of Lactobacillus sp. Finally, the samples
(just identified by biochemical reactions) were verified by PCR with specific primer
pairs of Lactobacillus sp.
In this study, 31 bacterial samples were isolated and examined biochemical
characteristics. Of these, there were 24 bacterial samples consistent with biochemical
reactions of Lactobacillus sp. Also, there were 3 bacterial samples resulted in PCR
products consistent with 2 species of Lactobacillus. Lactobacillus in pickle sample
collected from Thu Duc market - Ho Chi Minh city (signed as CSNL) was identified
as Lactobacillus fermentum. Lactobacillus species in sample isolated from WellYo
yogurt - Suoi Tien Coop-Mart supermarket - Thu Duc district - Ho Chi Minh city
(signed as WY) and pickle sample collected from Viet Thang market - Thu Duc
district - Ho Chi Minh city (signed as CS) were indentified as Lactobacillus casei.
Keywords: Lactobacillus sp., identification, PCR.

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn........................................................................................................................i
Tóm tắt............................................................................................................................ ii
Summary........................................................................................................................ iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
2.1. Sơ lược về Lactobacillus ..........................................................................................3
2.1.1. Giới thiệu ...............................................................................................................3
2.1.2. Quá trình lên men của vi khuẩn Lactobacillus......................................................4
2.1.3. Sự lên men lactic của vi khuẩn Lactobacillus .......................................................4
2.1.4. Tính kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus......................................................5
2.1.5. Sự phát triển của vi sinh vật ..................................................................................6
2.1.6. Ứng dụng của Lactobacillus..................................................................................7
2.2. Phương pháp sinh học phân tử dùng để định danh vi sinh vật.................................8
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008) ...........................8
2.2.2. Phương pháp điện di..............................................................................................9
2.2.3. Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................................9
2.2.3.1. Khái quát về PCR ...............................................................................................9
2.2.3.2. Nguyên tắc chung của phản ứng PCR................................................................9
2.2.3.3. Các thành phần phản ứng PCR ........................................................................10

2.2.3.4. Các giai đoạn của phản ứng PCR .....................................................................11
2.3. Một số nghiên cứu trên thế giới và trong nước về vi khuẩn Lactobacillus............12
iv


2.3.1 Nghiên cứu trên thế giới.......................................................................................12
2.3.2. Nghiên cứu trong nước........................................................................................13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................14
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................14
3.2. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị và hóa chất ....................................................................14
3.2.1. Mẫu phân lập .......................................................................................................14
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................15
3.2.3. Hóa chất...............................................................................................................15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................17
3.3.1. Phân lập và chọn lọc vi khuẩn.............................................................................17
3.3.1.1. Thu nhận mẫu phân lập ....................................................................................17
3.3.1.2. Phân lập vi khuẩn .............................................................................................17
3.3.1.3. Chọn lọc và làm thuần......................................................................................17
3.3.1.4. Bảo quản giống vi khuẩn..................................................................................17
3.3.2. Dùng các phản ứng sinh hóa để định danh..........................................................18
3.3.2.1. Nhuộm Gram ....................................................................................................18
3.3.2.2. Thử nghiệm catalase.........................................................................................18
3.3.2.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường..............................................................18
3.3.2.4. Thử nghiệm tính di động trong môi trường thạch mềm ...................................18
3.3.2.5. Một số phản ứng sinh hóa khác........................................................................19
3.3.3. Phản ứng PCR .....................................................................................................20
3.3.3.1. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn .................................................................20
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR .................................................................................20
3.3.3.3. Điện di kiểm tra phản ứng PCR .......................................................................22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................23

4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ...............................................................................23
4.2. Kết quả định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa ......................................25
4.2.1. Kết quả nhuộm Gram ..........................................................................................26
4.2.2. Kết quả thử nghiệm catalase................................................................................26
4.2.3. Kết quả thử nghiệm di động trên môi trường thạch mềm ...................................26
4.2.4. Kết quả một số phản ứng sinh hóa khác..............................................................27
4.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. bằng phương pháp PCR .....29
v


4.3.1. Kết quả phản ứng PCR của L. fermentum ...........................................................30
4.3.2. Kết quả phản ứng PCR của L. casei ....................................................................31
4.3.3. Kết quả phản ứng PCR của L. acidophilus..........................................................32
4.3.4. Kết quả phản Multiplex PCR của L. casei và L. acidophilus..............................32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................34
5.1. Kết luận...................................................................................................................34
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................35

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP

Adenosine triphosphate

bp

Base pair

dATP

Deoxyadenosine triphosphate

dCTP

Deoxycytidine triphosphate

dGTP

Deoxyguanosine triphosphate

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

LPS

lipopolysaccharde

PCR

Polymerase chain reaction

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TBE

Tris-borate-EDTA

U

Unit

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu phân lập .....................................................................................14 
Bảng 3.2 Các thiết bị nghiên cứu ..................................................................................15 
Bảng 3.3 Các hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR ...................................................16 
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR định danh L. fermentum...................................20 
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L. fermentum...............................20 
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR định danh L. casei.............................................21 
Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L. casei ......................................21 
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR định danh L. acidophilus .................................21 
Bảng 3.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L. acidophilus ............................22 
Bảng 3.10 Thành phần phản ứng Multiplex PCR ........................................................22 
Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn tổng số trong mẫu phân lập.................................................23 
Bảng 4.2 Một số phản ứng sinh hóa dùng định danh Lactbacillus sp..........................25 
Bảng 4.3 Phản ứng sinh hóa Lactobacillus ...................................................................27 

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Lactobacillus casei dưới kính hiển vi điện tử..................................................1 
Hình 2.2 Các bước trong phản ứng PCR .....................................................................12 
Hình 4.1 Quá trình phân lập mẫu trên môi trường MRS..............................................24 
Hình 4.2 Kết quả nhuộm Gram.....................................................................................26 
Hình 4.7 Hình điện di kết quả phản ứng PCR của L. fermentum ...................................1 
Hình 4.8 Hình điện di kết quả phản ứng PCR của L. casei ...........................................1 
Hình 4.9 Hình điện di kết quả phản ứng PCR của L. acidophilus.................................1 
Hình 4.10 Hình điện di kết quả phản ứng Multiplex PCR . .........................................1 

ix

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bước vào thế kỷ XXI, vấn đề dân số luôn là mối quan tâm hàng đầu do dân số
hiện nay đang ở ngưỡng cao và vẫn đang tăng. Cùng với đó, an ninh lương thực luôn
được ưu tiên quan tâm nhằm ổn định và nâng cao chất lượng sống của người dân.
Để nâng cao năng suất và cải thiện chất lượng lương thực thực phẩm trong nông
nghiệp, cụ thể trong lĩnh vực chăn nuôi gia súc gia cầm, nhiều biện pháp khác nhau đã
được áp dụng như dùng chất kích thích tăng trưởng, thức ăn tổng hợp quy mô công
nghiệp, chất kháng sinh nhằm đạt mục đích cao nhất trong khoảng thời gian ngắn nhất.
Tuy nhiên việc sử dụng thức ăn, đặc biệt dùng chất tăng trọng không đúng liều lượng
có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Mặc khác, chúng còn có thể ảnh
hưởng đến hệ sinh thái xung quanh nếu thải ra ngoài môi trường chất dư thừa này với
liều lượng cao.
Trước sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là xu hướng sử dụng các sản
phẩm thân thiện với môi trường, an toàn với sức khỏe thì việc sử dụng các chế phẩm
sinh học để dần thay thế các chất tổng hợp nhân tạo đang được quan tâm mạnh mẽ.
Trong các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi thì các chế phẩm bổ sung vi khuẩn
Lactobacillus đã được nhiều nghiên cứu chứng minh là có hiệu quả cao trong phòng
trừ nhiều bệnh đường tiêu hóa, cải thiện hấp thu thức ăn trên gia súc gia cầm.
Lactobacillus là trực khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, thường không di động, lên
men được đường Lactose và là vi khuẩn lên men thường gặp ở các sản phẩm lên men
như sữa chua, dưa chua, phomat.
Ở người, vi khuẩn Lactobacillus tồn tại trong hệ tiêu hóa, đặc biệt phát triển
mạnh ở đoạn ruột non. Vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên nhiều loại động vật ở
đoạn ruột già của hệ thống tiêu hóa. Chúng đóng vai trò như vi sinh vật có lợi vì không
gây bệnh, cạnh tranh về thức ăn, môi trường sinh trưởng, tiết nhiều hợp chất tiêu diệt
các vi khuẩn có hại. Ngoài ra còn sản xuất enzyme tiêu hóa, đặc biệt là galactosidase
giúp tiêu hóa sữa, sản xuất vitamin. Các loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng

thích nghi để sinh trưởng ở nhiều điều kiện môi trường khác nhau, sản sinh acid lactic
ở nồng độ cao, từ đó làm giảm pH môi trường dẫn đến ức chế sự phát triển của nhiều
1


vi khuẩn khác. Ngoài ra chúng còn có khả năng kháng khuẩn nhờ sản xuất hydrogen
peroxit, diacetyl, bacteriocin.
Lactobacillus sp. được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, công
nghiệp sản xuất lactic acid, trong chế biến thức ăn. Ngoài ra do chúng sinh acid, sống kỵ
khí, có khả năng phân giải đường sữa lactose nên một số loài được sử dụng làm vi sinh
vật hỗ trợ đường tiêu hóa cho những bệnh nhân không dung nạp lactose, cạnh trạnh với
các vi sinh vật gây bệnh khác như E. coli, Samonella sp. Trong lên men dị hình, ngoài
sinh lactic acid vi khuẩn còn tạo ra một số sản phẩm phụ khác như acetic acid, ethanol,
CO2…, một số tạo ra sản phẩm có mùi thơm được dùng trong chế biến phomat.
Vấn đề đặt ra là phải định danh chính xác chủng Lactobacillus sp. để tạo được bộ
giống phục vụ cho sản xuất các sản phẩm lên men ở nhỏ, xa hơn là quy mô công
nghiệp. Thế nhưng việc định danh loài của vi khuẩn này bằng các phản ứng sinh hóa
gặp nhiều khó khăn do các loài ít có phản ứng khác biệt nhau và phụ thuộc nhiều vào
thành phần môi trường, cũng như điều kiện nuôi cấy. Hiện nay đã xác định trên 100
loài và danh sách các loài mới vẫn đang tiếp tục mở rộng.
Với nhiều ứng dụng thực tế của Lactobacillus sp. cộng với những khó khăn mà
nhà sản xuất đang gặp phải, đồng thời nhằm góp phần nào tạo ra nhiều sản phẩm có
giá trị kinh tế cao và giá thành hạ, đề tài “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong
định danh các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Định danh và tạo bộ giống Lactobacillus sp. nhằm cung cấp thông tin các mẫu vi
khuẩn bản địa, đóng góp một phần dữ liệu cho ngân hàng gen về giống Lactobacillus sp.
, tăng sự hiểu biết về các dòng Lactobacillus sp. có nguồn gốc ở Việt Nam.
1.3. Nội dung thực hiện
Nội dung 1 phân lập các giống vi khuẩn Lactobacillus sp.từ mẫu thu thập

Nội dung 2 dùng các phản ứng sinh hóa để định danh. Bước đầu sơ loại những
mẫu không phải là Lactobacillus sp., đồng thời bước đầu tiến hành định danh
Lactobacillus sp bằng sinh học phân tử.
Nội dung 3 kiểm tra lại mẫu (đã định danh bằng các phản ứng sinh hóa) bằng
phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng của Lactobacillus sp.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về Lactobacillus
2.1.1. Giới thiệu
Phân loại:
Giới : Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp :

Bacilli

Bộ :

Lactobacillales

Họ :

Lactobacillaceae

Hình 2.1 Lactobacillus casei dưới
kính hiển vi điện tử. (enfo.agt.bme.hu)

Giống : Lactobacillus
(Moro, 1900; Hansen và Mocquoc, 1970)

Lactobacillus là trực khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, catalase âm, thường
không di động, lên men glucose đồng hình hoặc dị hình, không làm tan gelatin, vi hiếu
khí hoặc kị khí, không có hoạt tính giảm nitrat. Là vi khuẩn lên men hoàn toàn, môi
trường sinh trưởng đòi hỏi nhiều chất phức tạp như cacbonhydrate, amino acid,
peptide, ester acid béo, muối, acid nucleic và vitamin. Vi khuẩn thường đứng riêng lẻ,
xếp thành chuỗi dài hoặc chuỗi đôi khi quan sát dưới kính hiển vi. Chúng có khả năng
chịu acid, phát triển tốt ở pH 5, bắt đầu bị ức chế khi pH thấp hơn 4. Nhiệt độ phát
triển thích hợp ở 30 - 40oC.
Ở người, vi khuẩn Lactobacillus tồn tại trong hệ tiêu hóa, đặc biệt phát triển
mạnh ở đoạn ruột non. Vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên nhiều loài động vật ở
đoạn ruột già của hệ thống tiêu hóa. Ngoài ra vi khuẩn này còn xuất hiện ở mật độ cao
trong thực phẩm lên men như dưa muối, giá chua… Chúng đóng vai trò như vi sinh
vật có lợi vì không gây bệnh, cạnh tranh về thức ăn, môi trường sinh trưởng, tiết nhiều
hợp chất tiêu diệt các với các vi khuẩn có hại. Ngoài ra còn sản xuất enzyme tiêu hóa,
đặc biệt là galactosidase giúp tiêu hóa sữa, sản xuất vitamin.
Các loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng thích nghi để sinh trưởng ở nhiều
điều kiện môi trường khác nhau, sản sinh acid lactic ở nồng độ cao, từ đó làm giảm pH
môi trường dẫn đến ức chế sự phát triển của nhiều vi khuẩn khác. Ngoài ra chúng còn
có khả năng kháng khuẩn nhờ sản xuất hydrogen peroxit, diacetyl, bacteriocin.
3


Việc định danh đến loài của vi khuẩn này bằng các phản ứng sinh hóa gặp nhiều
khó khăn do các loài ít có phản ứng khác biệt nhau và phụ thuộc nhiều vào thành phần
môi trường, cũng như điều kiện nuôi cấy.
Khuẩn lạc vi khuẩn có dạng thấu kính hoặc hình sao, lồi, nguyên khối, không
màu hoặc trắng ngà, khi khuẩn lạc già có màu nâu nhạt ở giữa, khuẩn lạc trơn láng.

Kích thước khuẩn lạc vào khoảng 2 - 5 mm. (www.umm.edu/altmed/articles/lactobacillus)
2.1.2. Quá trình lên men của vi khuẩn Lactobacillus
Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn lên men hoàn toàn, thuộc nhóm những vi
khuẩn sinh acid lactic. Ở các loài vi khuẩn này có hai kiểu lên men: lên men đồng hình
và lên men dị hình. Giữa hai kiểu lên men này có sự khác biệt nhau về sản phẩm trong
chu trình trao trao đổi chất ở sinh vật. Ở lên men đồng hình, vi khuẩn tạo ra hơn 85%
acid lactic từ glucose, trong khi đó, ở lên men dị hình thì ngoài acid lactic, vi khuẩn
còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác như CO2, ethanol, acid acetic…
Ở quá trình lên men lactic đồng hình, khi tiến hành lên men các dung dịch đường
thì vi khuẩn lactic đồng hình thường tạo ra acid lactic là chủ yếu. Ở những vi khuẩn
lên men lactic đồng hình, chúng có enzyme aldolase và hexose isomerase nhưng thiếu
phosphoketolase. Chúng phân giải glucose theo con đường Embden Meyerhof Parnas
(EMP) để chuyển glucose thành acid pyruvic, sau đó khử trực tiếp các acid pyruvic
thành acid lactic nhờ vào enzyme lactic dehydrogenase. Sản phẩm tạo ra phần lớn là
acid lactic, ngoài ra còn một số sản phẩm phụ khác ở tỉ lệ không đáng kể như acid
acetic, ethanol, glycerin, CO2…
Ở quá trình lên men lactic dị hình, Khi tiến hành lên men các dung dịch đường,
các vi khuẩn lactic dị hình thường tạo ra lượng acid lactic không lớn lắm, khoảng 40%.
Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác như acid acetic (10%),
ethanol (20%), các chất khí như CO2, H2 (20%)… Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình
thường thiếu hai loại enzym quan trọng đó là aldolase và hexose isomerase. Do đó
trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thường được tiến hành theo con
đường hexose monophosphate hay gọi là con đường pentose phosphate (PP) (Tô Minh
Châu, 2000).
2.1.3. Sự lên men lactic của vi khuẩn Lactobacillus
Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học ở điều kiện kỵ khí các hợp chất
đường thành acid lactic nhờ hoạt động của các vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn lactic.
4

Các vi khuẩn này thuộc họ Lactobacteriaccae gồm các giống: Streptococcus,
Leuconostoc, Pediococcus và Lactobacillus. Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus là
một nhóm lớn và có thể dùng làm giống khởi động cho quá trình lên men lactic do
chúng đã được chứng minh không gây hại và là vi khuẩn lên men điển hình.
Các sản phẩm ứng dụng lên men lactic đã được ứng dụng từ lâu như sữa chua,
cải chua, tôm thịt cá lên men chua. Các sản phẩm lên men này giúp bảo quản thực
phẩm được lâu hơn, tăng giá trị dinh dưỡng và tạo mùi vị đặc trưng cho món ăn.
Quá trình lên men dựa trên cơ sở sự phát triển của các vi khuẩn lactic sẽ tổng hợp
acid lactic khiến pH môi trường xung quanh bị giảm, làm ức chế và giúp tiêu diệt các
vi khuẩn lên men thối trong thực phẩm. Mặc khác, các enzyme do vi khuẩn tiết ra
trong quá trình lên men có thể giúp phân giải các hợp chát khó tiêu trong sản phẩm
thành các chất dễ tiêu.
Quá trình lên men lactic tự nhiên gồm ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: vi khuẩn lactic và vi khuẩn tạp nhiễm ngoài tự nhiên cùng phát triển.
Giai đoạn 2: vi khuẩn lactic phát triển nhanh, sinh nhiều acid làm pH môi trường
thấp gây ức chế các vi khuẩn tạp.
Giai đoạn 3: pH môi trường xuống quá thấp gây ức chế chính vi khuẩn lactic.
Trong lên men công nghiệp, như sản xuất sữa chua, chúng ta phải chuẩn bị giống
thuần và cấy vào thực phẩm để giúp sản phẩm lên men theo ý muốn và dễ kiểm soát.
2.1.4. Tính kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus
Bacteriocin là các hợp chất peptide được tiết ra ngoài tế bào có hoạt tính kháng
lại các vi khuẩn khác có họ hàng gần với nó. Loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào
thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó. Ngoài ra, nó không gây ra phản ứng dị
ứng trong con người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzyme như
protease, lipase.
Bacteriocin được tìm thấy đầu tiên bởi Gratia (1925) trong quá trình nghiên cứu
tìm cách tiêu diệt vi khuẩn. Kết quả từ nghiên cứu này đã thúc đẩy những nghiên cứu
về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn. Gratia gọi chất phát hiện
ra lúc đầu tiên là colicin vì nó có khả năng tiêu diệt E. coli.
Bacteriocin sản xuất từ Lactobacillus được xem như các chất bảo quản thực

phẩm an toàn do không gây hại đến sức khỏe con người. Hoạt tính của bacteriocin có
được là nhờ vào khả năng phá hủy màng nguyên sinh của tế bào mục tiêu và thay đổi
5


tính thấm của màng. Tuy nhiên, bacteriocin không phải kháng sinh do chúng là các
protein có tính kháng nguyên, cơ chế diệt khuẩn khác với kháng sinh, phổ kháng
khuẩn hẹp hơn.
Acid hữu cơ sinh ra trong quá trình lên men khuếch tán qua màng vi khuẩn gây
hại, làm giảm pH tế bào chất, phá hủy thế năng màng, làm tăng tính thấm (do tác động
vào LPS của thành tế bào Gram âm) nên có tác dụng diệt khuẩn và tăng tác dụng của
những chất kháng khuẩn khác.
Khí cacbonic sinh ra trong quá trình lên men tạo môi trường yếm khí, giúp ức
chế các vi khuẩn hiếu khí có hại, ngoài ra chúng còn ức chế quá trình decarboxylation
gây tích lũy CO2 ở màng tế bào, từ đó làm thay đổi chức năng thấm qua màng ở vi
khuẩn gây hại. Một số Lactobacillus còn tiết hydrogen peroxit có tác dụng như chất
kháng khuẩn không đặc hiệu. Ngoài ra, do vi khuẩn mang tính kháng nguyên trên thành
tế bào giúp kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào
(Phạm Đình Trúc Linh, 2007).
2.1.5. Sự phát triển của vi sinh vật
Một tế bào vi sinh vật trong điều kiện môi trường thích hợp sẽ liên tục hấp thu
các chất dinh dưỡng và tiến hành trao đổi chất, khi sinh trưởng đạt đến một mức độ
nhất định thì chúng sẽ sinh sản. Với Lactobacillus, vi khuẩn sinh sản theo cách nhân
đôi, điều đó có nghĩa là nếu ban đầu ta cấy một tế bào vào môi trường phù hợp, sau
một khoảng thời gian chúng sẽ nhân đôi thành hai tế bào. Cứ tiếp tục như thế, các tế
bào mới lại sinh trưởng và phân chia thành 4, 8, 16, 32…tế bào.
Nếu vi khuẩn được nuôi cấy kín, chất dinh dưỡng mới không được bổ sung và
chất thải trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật không được loại bỏ thì mật độ vi
khuẩn sẽ không tăng theo cấp số nhân như trên. Trong quá trình nuôi cấy theo dạng
này, sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trải qua bốn giai đoạn như sau:

Pha tiềm phục: khi vi sinh vật được dưa vào một môi trường nuôi cấy mới thì sẽ
không có sự gia tăng ngay lập tức số lượng hay sinh khối tế bào. Mặc dù không có sự
phân chia tế bào, cũng như sự gia tăng sinh khối nhưng thành mới của tế bào bắt đầu
được tổng hợp. Tế bào phải trải qua thời kỳ tiềm phục trước khi bắt đầu phân chia là
do môi trường cần một khoảng thời gian để thích nghi với môi trường mới, tổng hợp
các thành phần cần thiết như enzyme, ribosome, ATP.

6


Pha cấp số (pha log): trong giai đoạn này các vi sinh vật sẽ sinh trưởng và phát
triển ở tốc độ cực đại, do vi sinh vật thích nghi với điều kiện mới nên phân chia cũng
rất nhanh. Vi sinh vật phân chia và nhân đôi trong một khoảng thời gian đều đặn, đồng
nhất về tính chất hóa học, sinh lý.
Pha ổn định: sự tăng trưởng về dân số của vi sinh vật dừng lại. Trong pha ổn
định, tổng số vi sinh vật sống gần như là hằng số, lượng tế bào sinh ra và chết đi đạt sự
cân bằng. Nguyên nhân của tình trạng này là do sự giới hạn về dinh dưỡng cũng như
sự tích tụ của những chất độc hại phát sinh trong quá trình nuôi cấy.
Pha tử vong: lượng tế bào sống giảm rõ rệt do các điều kiện sống bất lợi như sự
tích tụ các chất thải độc hại, môi trường thiếu chất dinh dưỡng. Nếu không cung cấp
thêm chất dinh dưỡng và loại bỏ chất độc hại thì giống có thể sẽ chuyển sang dạng bào
tử hoặc chết hoàn toàn đối với các dạng không sinh bào tử (Vương Thị Việt Hoa,
2006).
Việc hiểu rõ các quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật giúp ta chủ
động và nâng cao hiệu suất lên men. Thường nếu nuôi cấy để lấy sinh khối vi sinh vật,
người ta sẽ tiến hành thu hoạch khi sự phát triển đạt đến cuối pha cấp số, lúc này, gần
như mật độ tế bào là cao nhất. Nếu muốn thu hoạch các hợp chất thứ cấp tiết ra trong
quá trình sinh trưởng, người ta tiến hành thu hoạch ở cuối giai đoạn ổn định. Ở
Lactobacillus, do phần lớn ứng dụng của chúng nằm ở hoạt động sống của tế bào nên
việc thu nhận thường là thu sinh khối.

2.1.6. Ứng dụng của Lactobacillus
Trong công nghiệp: Lactobacillus được sử dụng để lên men thu acid lactic. Acid
lactic chiếm phần lớn trong quá trình lên men nên lượng hợp chất thu được cũng khá
lớn, mặc khác acid tạo ra có vị chua nhẹ, mùi thơm dễ chịu và đặc biệt là có đặc tính
kìm hãm sự phát triển của nhiều vi khuẩn gây hư thực phẩm nên có thể làm gia vị đối
với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để acid hóa
rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra các vi khuẩn có khả năng tiết enzyme mạnh
có thể được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo.
Trong nông nghiệp và môi trường: vi khuẩn Lactobacillus có khả năng hạn chế
sự phát triển của Fusarium, loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm
Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng.

7


Trong chăn nuôi, ứng dụng của giống vi khuẩn này thể hiện rõ nhất trong quá trình
lên men rơm rạ để làm thực phẩm cho gia súc, ngoài ra còn có các chế phẩm sinh học
dạng đông khô có thể trộn trực tiếp vào thức ăn nhằm giúp nâng cao khả năng tiêu hóa
thức ăn của vật nuôi, nâng cao khả năng phòng chống nhiều bệnh đường tiêu hóa gây ra.
Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu, bao gồm
80 chủng vi sinh, trong đó có sự góp phần của vi khuẩn Lactobacillus. Chế phẩm này giúp
cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường.
Trong y dược: vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để phòng và chữa bệnh
đường ruột, dùng cho các bệnh nhân không dung nạp được đường sữa do thiếu enzyme
galactosidase, dùng trong nha khoa, bệnh phụ khoa…
Trong bảo quản và chế biến thực phẩm: vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng để
làm dưa chua, làm chua quả giúp bảo quản thực thực phẩm lâu hơn và ngon hơn. Dùng
lên men sữa chua và phomat, giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.
2.2. Phương pháp sinh học phân tử dùng để định danh vi sinh vật
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA

DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong thao tác cần tránh những tác nhân
cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này. Phương pháp tách chiết
cơ bản gồm ba bước (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008) :
Bước 1: phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường người
ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, CTAB) và proteinase
(proteinase K). hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra
môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol và chloroform, dung dịch
phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan acid
nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acid
nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:
chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu giữ lại.
Bước 3: tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là thu nhận acid nucleic dưới
dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme, mặt khác có
thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Có 2 cách để tủa acid
nucleic: tủa trong ethanol, tủa trong isopropanol.
8


2.2.2. Phương pháp điện di
Thuộc nhóm phân tích định tính và định lượng thô acid nucleic. Phương pháp
này được sử dụng cả trong phân tích định tính và trong việc thu nhận mẫu acid
nucleic. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
acid nucleic. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi
chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường. Hai loại gel được sử dụng trong phương pháp này là gel polyacrylamide và
gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tùy thuộc
vào kích thước trung bình của các đoạn acid nucleic cần phân tách (Hồ Quỳnh Thùy
Dương, 2008).

2.2.3. Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.2.3.1. Khái quát về PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật của sinh học phân tử
cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ bộ gen của cơ thể sinh vật thành
nhiều bản sao trong thời gian ngắn, độ chính xác cao trong máy luân nhiệt.
Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được tiếp tục hoàn thiện
thông qua việc phát hiện và sản xuất được enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi
khuẩn Themophilus aquaticus và một số vi khuẩn khác. Máy PCR ngày càng hoàn thiện
cho phép thay đổi nhanh chóng, chính xác nhiệt độ từng giai đoạn nhân bản DNA. Cho
đến nay, kỹ thuật PCR được coi là phương pháp nền quan trọng của công nghệ di truyền
(Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008).
2.2.3.2. Nguyên tắc chung của phản ứng PCR
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản
của sao chép DNA trong cơ thể như: Đoạn DNA cần nhân bản mở xoắn thành 2
mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu và điều kiện
môi trường thích hợp và enzyme DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi
hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của
những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung
với một đầu của mạch khuôn và DNA sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase.
Nếu cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA,
chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một
9


trình tự DNA xác định, phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo ra các mồi
bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi và mồi ngược (so với chiều phiên
mã của gen) (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008).
2.2.3.3. Các thành phần phản ứng PCR
DNA khuôn (DNA template): phản ứng khuếch đại tối ưu trên DNA tinh sạch

nhưng nhiều kỹ thuật chuẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt trên DNA thu trục tiếp
từ dịch tế bào. Lượng mẫu DNA sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1 g xuống còn
100 ng) với việc sử dụng polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm lượng mẫu
ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không
mong muốn. Ngoài ra PCR còn khuếch đại cả mẫu DNA bảo quản không tốt, đã bị phân
hủy một phần như các vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hóa thạch, tóc, móng tay của
người đã chết.
DNA polymerase: là enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp mạch DNA mới.
Ngày nay, người ta thường dùng nhiều loại DNA polymerase: Taq DNA polymerase,
Pfu DNA polymerase, T4 DNA polymerase, Tth DNA polymerase nhưng phổ biến nhất
là Taq DNA polymerase. Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối nước
nóng Thermophilus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA (92 94oC). Taq DNA polymerase có hoạt tính ở dazy nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR
xảy ra nhanh, chính xác và đặc hiệu.
Mồi và nhiệt độ lai: mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được độ khuếch đại
đặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn mồi là yếu tố quyết định của phương pháp
PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc:
Trình tự của mồi phải được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
“xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ
sung giữa các thành phần khác nhau của một mồi.
Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt quá xa. Thành phần nucleic
của các mồi cân bằng tránh cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Các mồi chọn phải đặc
trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen
(Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008).
Dung dịch đệm (buffer): Thành phần dung dịch đệm phản ứng PCR thường phụ
thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR.

10


MgCl2: nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt

độ tách mạch tạo thành mạch đơn; sự chuyên tính của sản phẩm PCR; hoạt động của
enzyme và tính trung thực của kết quả. Nồng độ MgCl2 có thể trong khoảng 0,5 - 5 mM.
Nồng độ MgCl2 cao sẽ làm phân tử DNA sợi đôi ổn định hơn, ngăn chặn sự biến
tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kỳ. Dư thừa lượng MgCl2 dẫn đến sự bắt cặp
nhầm cho ra sản phẩm không mong muốn. Ngược lại nếu nồng độ MgCl2 thấp sẽ làm
kết quả PCR ít đi. Do đó, cần tối ưu lượng MgCl2 để đảm bảo số lượng cũng như sản
phẩm PCR.
Các deoxynucleotide triphosphate (dNTP): gồm 4 loại: dATP, dTTP, dGTP,
dCTP là những nguyên liệu tham gia tạo mạch DNA mới.
Các chất tăng cường dùng trong phản ứng PCR: các chất biến tính như DMSO,
formamide, glycerol, and betaine được dùng trong phản ứng PCR khi lượng DNA
template lớn, hàm lượng GC cao. Tuy nhiên, khi sử dụng cần kiểm tra độ tương thích
đối với enzyme DNA polymerase. Tăng lượng DMSO trong phản ứng PCR sẽ cần
giảm nhiệt độ bắt mồi xuống. Một số buffer đã có chứa sẵn loading buffer để có thể
điện di ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer này không cao
và sản phẩm sau đó không dùng trực tiếp cho đọc trình tự mà cần phải tinh sạch qua
cột. Đối với các máy luân nhiệt (thermocycler) không có gia nhiệt trên nắp thì nên bổ
sung mineral oil để tránh bay hơi mẫu (thuvienkhoahoc.com).
2.2.3.4. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Bước 1: biến tính
Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao
chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút.
Bước 2: gắn mồi
Nhiệt độ hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn,
thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 - 72oC, tùy thuộc vào Tm của mồi
sử dụng và kéo dài trong 30 giây - 1 phút.
Bước 3: kéo dài - tổng hợp
Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase vốn là polymerase
chịu nhiệt hoạt động tốt nhất. Thời gian kéo dài tùy thuộc vào chiều dài trình tự DNA
cần khuếch đại, thời gian không quá 20 giây đối với DNA khuôn không quá 500

11


nucleotide, 40 giây đối với DNA nhỏ hơn 1200 nucleotide. Thường thời gian kéo dài
từ 30 giây đến nhiều phút.
Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như trên, lặp lại 25 – 50 lần tùy vào mục đích, yêu cầu
nhiên cứu. Tuy nhiên, nếu thời gian kéo dài quá 30 chu kỳ thì khả năng sai sót sẽ tăng
theo. Số lượng bản sao sau n chu kỳ là a 2n ( a là số đoạn khuôn DNA) (Hồ Quỳnh
Thùy Dương, 2008).

Hình 2.2 Các bước trong phản ứng PCR (thuvienkhoahoc.com)
2.3. Một số nghiên cứu trên thế giới và trong nước về vi khuẩn Lactobacillus
2.3.1 Các nghiên cứu nước ngoài về vi khuẩn Lactobacillus
Các nghiên cứu về Lactobacillus ngày càng được tiến hành rộng rãi trên thế giới
và trong nước vì những lợi ích và khả năng ứng dụng thực tế của chúng. Các nghiên
cứu cổ điển chú trọng đến việc phân lập, khảo sát các hoạt tính sinh lý, sinh hóa cũng
như tạo các sản phẩm ứng dụng. Các nghiên cứu khác sử dụng các công cụ mới của
công nghệ sinh học để xác định đến cơ chế tác động của các hợp chất, xác định di
truyền phân tử.
Trên thế giới đã có nhiều đề tài nghiên cứu về vi khuẩn này như Haddadin
(2004) với đề tài “Nghiên cứu động học và phân tích cảm quan đối với vi khuẩn lactic
12


phân lập từ phomai tươi làm từ sữa cừu không qua xử lý nhiệt” nhằm xác định sự hiện
diện của vi khuẩn Lactobacillus ảnh hưởng đến quá trình tạp nhiễm trong sản xuất sữa.
Năm 2010 Sarmiento-Rubiano và ctv so sánh sự đa dạng của Lactobacillus bằng
phân tích di truyền và các hợp chất thứ cấp. Trong khi đó, một nhóm các nhà khoa học
Nhật Bản dẫn đầu là Masahiro Kuratsu (2010) đã tiến hành phân tích các cơ chế trao
đổi chất ở vi khuẩn này. Monique Haarman và Jan Knol sử dụng Realtime PCR để

phân tích nhanh sự hiện diện của Lactobacillus ở trẻ sơ sinh.
Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nước khác trên thế giới đã sản xuất những
chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng
trị bệnh, trong đó có sử dụng Lactobacillus nhằm nâng cao khả năng tiêu hoá của
người và vật nuôi như: Yakult, Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,…
2.3.2. Các nghiên cứu trong nước về vi khuẩn Lactobacillus
Ở trong nước, việc nghiên cứu các đặc điểm và ứng dụng của vi khuẩn này cũng
diễn ra mạnh mẽ. Năm 2009, Trần Thị Thu Hồng thực thực nghiên cứu sử dụng các
chủng vi sinh vật Lactobacillus để bổ sung vào khẩu phần ăn cho lợn con sau cai sữa,
nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sinh trưởng, góp phần nâng cao thu nhập cho người
chăn nuôi.
Trần Hoàng Ngọc Ái và ctv (2007) thực hiện đề tài ứng dụng kỹ thuật sinh học
phân tử dựa trên phân tích dữ liệu trình tự gen rDNA 16S để xác định nhanh các loại
Lactobacillus.
Phạm Đình Trúc Linh (2007) đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn

L.

acidophilus từ chế phẩm Antibio của công ty Han wha pharma Hàn Quốc sản xuất.
Chọn 3 chủng L. acidophilus sinh axít lactic cao nhất đem thử đối kháng với E. coli.
Kết quả L. acidophilus kháng với E. coli rất có ý nghĩa về phương diện thống kê học.
Trần Hạnh Triết, (2005) đã nghiên cứu trên đối tượng là các chủng vi khuẩn L.
sporogenes phân lập từ chế phẩm (Thorne Research, USA). Kết quả nghiên cứu đã
phân lập đuợc vi khuẩn L. sporogenes, đồng thời khảo sát khả năng sinh acid lactic
và sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes .
Hiện nay trong nước đã có nhiều sản phẩm sử dụng Lactobacillus để sản xuất
probiotic, các chế phẩm nâng cao khả năng tiêu hóa như sữa chua Vinamilk, Vibilac,
Lactomin…

13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 12/2011 đến 07/2012 tại Viện nghiên cứu Công nghệ
Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị và hóa chất
3.2.1. Mẫu phân lập
Mẫu phân lập được thu nhận từ các nguồn: cải chua, sữa chua, măng, cà pháo và
sữa tươi. Các mẫu dưa chua lấy từ các quầy hàng bán tự do ở khu vực Thủ Đức và một
số vùng lân cận, mẫu sữa lấy từ các sản phẩm sữa đóng hộp bán ở siêu thị Coop mark
Suối Tiên, Thủ Đức, tp HCM.
Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu phân lập
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16

17
18
19
20
21
22
23
24
25

Mẫu
CPTN
CSNT
CSTR
CSBT
LTIIQ
MST
C1
C2
CPST
CS
CSNL
L4
LT1
LT2
NCTB
Q1
Q2
S2
STQ

LA2
LA4
NCTH
CSST
KTX
BET

Nguồn gốc mẫu phân lập
Dưa chua – Tây Ninh
Dưa chua – Tây Ninh
Dưa chua – Tây Ninh
Dưa chua - Thủ Dầu Một, Bình Dương
Dưa chua - Thủ Dầu Một, Bình Dương
Dưa chua - Thủ Dầu Một, Bình Dương
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM
Dưa chua -Long An
Dưa chua -Long An
Sữa bò tươi-Thủ Đức, TPHCM

Sữa chua - Thủ Đức, TPHCM
Sữa chua - Thủ Đức, TPHCM
Sữa chua Betagen - Thủ Đức TPHCM
14