NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp. VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp.

VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG
PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG
TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO
CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: VÕ ĐỨC TUẤN

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME PHYTASE TỪ Bacillus sp.

VÀ THỬ NGHIỆM ẢNH HƯỞNG CỦA VIỆC BỔ SUNG
PHYTASE TRONG KHẨU PHẦN THỨC ĂN ĐẾN KHẢ NĂNG
TĂNG TRƯỞNG VÀ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG THỨC ĂN CHO
CÁ RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

VÕ ĐỨC TUẤN

ThS. NGUYỄN THỊ THANH TRÚC

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Trước hết con xin chân thành cảm ơn Ba và Mẹ đã sinh ra và dưỡng dục con nên
người. Những người thân yêu trong gia đình là nguồn động viên cho tôi vượt qua mọi
khó khăn.
Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, ban chủ
nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả các quý Thầy Cô trong và ngoài
trường đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong quá trình học tập tại trường.
ThS. Trương Phước Thiên Hoàng và ThS. Nguyễn Thị Thanh Trúc đã tận tình
giúp đỡ, dìu dắt, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

KS. Nguyễn Minh Quang và ThS. Võ Thị Thúy Huệ đã tạo điều kiện và trau dồi
kinh nghiệm cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
KS. Trần Thị Quỳnh Diệp, KS. Trương Thị Ngọc Hân, KS. Nguyễn Trường
Ngọc Tú, các anh chị và các bạn Bộ môn Công nghệ Sinh học luôn động viên giúp đỡ
tôi những lúc khó khăn.
Các bạn Trại thực nghiệm Khoa Thủy Sản cùng toàn thể lớp DH08SH đã tận tình
giúp đở tôi trong suốt thời gian làm thí nghiệm.
Xin chân thành cám ơn
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7/2012

Võ Đức Tuấn

i


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu nhằm thu nhận được enzyme phytase từ các chủng vi khuẩn
Bacillus sp. và thử nghiệm ảnh hưởng việc bổ sung enzyme phytase trong khẩu phần
thức ăn lên khả năng tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và sử dụng phosphor của
cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus).
Thí nghiệm được tiến hành từ 14 chủng vi khuẩn Bacillus sp và 10 chủng
Bacillus subtilis. Dựa vào đường kính vòng phân giải acid phytic và định lượng hoạt
độ enzyme phytase trên môi trường bán rắn đã chọn được chủng Ba58 cho hoạt độ
enzyme phytase cao nhất. Chủng Ba58 sinh tổng hợp phytase tối ưu ở các điều kiện:
mật độ giống 106, thời gian nuôi cấy là 48 giờ, nồng độ Ca2+ là 0,35%, và độ ẩm môi
trường khoảng 60%.
Chế phẩm enzyme thô được bổ sung vào thức ăn cho cá nhằm đánh giá ảnh
hưởng khả năng tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và sử dụng phosphor của cá rô
phi vằn (O.niloticus). 5 khẩu phần thức ăn chứa 27,4% protein thô và 4,2% lipid thô
được bổ sung phytase ở hàm lượng: 750 U/kg, 1000 U/kg, 1250 U/kg và 1500 UI/kg

và đối chứng (không bổ sung phytase). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Sau 12
tuần thí nghiệm, kết quả cho thấy cá cho ăn với thức ăn có bổ sung enzyme phytase
giúp cải thiện trọng lượng, tăng trọng, tốc độ tăng trưởng đặc biệt, hệ số biến đổi thức
ăn và phosphor cá cao hơn so với đối chứng (P < 0,05). Thêm vào đó, việc bổ sung
enzyme phytase làm giảm lượng phosphor thải ra môi trường từ việc nuôi cá rô phi
vằn. Trong đó, bổ sung phytase 1500 U/kg thức ăn mang lại kết quả cao nhất.

ii


ABSTRACT
The study were conducted to acquire phytase from Bacillus sp. strains and the
effects of phytase supplementation in diets on growth, feed efficiency and phosphorus
content of fish (O.niloticus).
Experiment were conducted from 14 strains of Bacillus sp. and 10 strains
Bacillus sbtilis. Based on periphery zone from acid phytic and through quantitative
method activity of phytase enzyme were choise strain Bacillus subtilis Ba58 is highest
capable of synthesizing phytase. Phytase from Ba58 strain biosynthesis optimal with
conditions: the seed density 106, culture time was 48 hours, Ca2+ concentration is
0.35%, and relative humidity around 60%.
Unrefined preparation of phytase were supplemented in diets on growth, feed
utilization and phosphorus content of zebra tilapia (O.niloticus). Experiment includes
five isonitrogenous (27.4% crude protein) and isolipidic (4.2% crude lipid) were
prepared with graded levels of supplemental phytase (750 U/kg, 1000 U/kg, 1250 U/kg
and 1500 U/kg) and controls (no added phytase) in diets. Each treatment was repeated
3 times for 6 weeks. At the end of the experiment, the results show that fish fed with
feed supplemented phytase improved final body weight, weight gain and specific
growth rate and higher phosphor fish compared to controls (P < 0.05). Furthermore,
the addition of phytase reduce the amount of phosphorus discharged from catfish. In
particular, additional 1500 U phytase/kg feed helps the best results.

Keywords: Phytase, Bacillus, phosphor

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
ABSTRACT .................................................................................................................. iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.2. Mục đích đề tài .........................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
2.1. Enzyme phytase ......................................................................................................3
2.1.1. Định nghĩa ...........................................................................................................3
2.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phosphor đầu tiên bị enzyme tác động ..............4
2.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase .......................5
2.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase ...............................................................5
2.1.3.1. Nguồn thực vật.................................................................................................5
2.1.3.2. Nguồn động vật ................................................................................................5
2.1.3.3. Nguồn vi sinh vật ............................................................................................5
2.1.3. Cơ chất đặc hiệu của enzym phytase ................................................................6
2.1.3.1. Acid phytic và muối phytate ..........................................................................6
2.1.3.2. Các cơ chất khác ..............................................................................................7
2.1.4. Các đặc tính lý hóa của enzym phytase ...........................................................8
2.1.4.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử .....................................................................8

2.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase ..............................................9
iv


2.1.4.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase .......................................................9
2.1.4.4. Ảnh hưởng của ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt độ phytase .....10
2.1.4.5. Các điều kiện khác ảnh hưởng đến hoạt độ phytase .................................10
2.1.5. Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy giải acid phytic .................11
2.1.6. Động học của enzyme phytase ........................................................................11
2.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase ........................................................................11
2.1.7.1. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản .....................................................11
2.1.7.2. Trong dinh dưỡng thực phẩm .......................................................................12
2.1.7.3. Trong sản suất bột giấy và công nghiệp giấy .............................................13
2.2. Bacillus và enzyme phytase của Bacillus .........................................................13
2.2.1. Tổng quan về Bacillus ......................................................................................13
2.2.3. Cơ chất đặc hiệu của enzyme phytase từ Bacillus ........................................15
2.2.4. Các đặc tính lý hóa của enzyme phytase từ Bacillus ...................................15
2.2.4.1. Trọng lượng phân tử .....................................................................................15
2.2.4.2. Thành phần acid amin ...................................................................................15
2.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH ........................................................................16
2.2.4.4. Các tác nhân khác ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme phytase .....................16
2.2.5. Vai trò của Ca2+ đối với cấu trúc và chức năng của enzyme phytase ........16
2.2.6. Sản phẩm cuối và động học của sự thuỷ giải acid phytic ...........................17
2.3.1. Phân loại ............................................................................................................19
2.3.2. Nguồn gốc ..........................................................................................................19
2.3.3. Đặc điểm hình thái cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) .........................19
2.3.4. Môi trường sống của cá rô phi vằn .................................................................20
2.3.4.1. Nhiệt độ ..........................................................................................................20
2.3.4.2. Độ mặn ............................................................................................................20
2.3.4.3. Khoảng pH .....................................................................................................20

v


2.3.4.4. Hàm lượng Oxy hòa tan ................................................................................20
2.3.4.5. Hàm lượng NH 3 .............................................................................................21
2.3.5. Dinh dưỡng cho cá rô phi vằn .........................................................................21
2.3.6. Sinh trưởng của cá rô phi vằn ..............................................................................21
2.3.7. Sự sinh sản của cá rô phi vằn ..............................................................................21
2.3.7.1. Thành thục sinh dục..........................................................................................21
2.3.7.2. Chu kỳ sinh sản của cá rô phi vằn ....................................................................22
2.3.7.3. Tập tính sinh sản ...............................................................................................22
2.3.8. Nhu cầu và sự biến dưỡng phosphor ở loài cá ...................................................22
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................24
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................24
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................24
3.2.1. Giống vi sinh vật..................................................................................................24
3.2.2. Các môi trường dùng trong thí nghiệm ...............................................................24
3.2.3. Dụng cụ , thiết bị, hoá chất dung trong thí nghiệm .............................................24
3.2.3.1. Dụng cụ thí nghiệm ..........................................................................................24
3.2.3.2. Thiết bị dùng trong thí nghiệm .........................................................................24
3.2.3.3. Hoá chất dùng trong thí nghiệm .......................................................................25
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................25
3.3.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm ..................................................................................25
3.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của các chủng Bacillus sp. ...................25
3.1.1. Định tính ..............................................................................................................25
3.1.2. Phương pháp khảo sát hoạt độ enzym phytase. ...................................................26
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp phytase .....26
3.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và mật độ giống .........................................26
3.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của ion Ca2+ .....................................................................26
vi

3.3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm ........................................................................27
3.3.6. Thu nhận enzyme phytase từ Bacillus sp. ở quy mô pilot...................................27
3.3.7. Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm phytase thô ............................................27
3.3.9. Khảo ảnh hưởng của enzyme phytase lên hiệu quả tiêu hóa và tăng trọng của cá
rô phi vằn .......................................................................................................................28
3.3.9.1. Thức ăn dung trong thí nghiệm ........................................................................28
3.3.9.2. Bố trí thí nghiệm ...............................................................................................28
3.3.9.3. Phương pháp đánh giá các thông số của môi trường thí nghiệm .....................29
3.3.9.4. Phương pháp thu thập số liệu ...........................................................................29
3.3.9.5. Đánh giá ảnh hưởng của phytase đến tỷ lệ sống và tăng trưởng của cá rô phi 30
3.3.9.6. Đánh giá ảnh hưởng của phytase đến hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô phi 30
4.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase của các chủng Bacillus sp. .....31
4.1.1. Kết quả định tính .................................................................................................31
4.1.2. Kết quả định lượng ..............................................................................................32
4.2. Các yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh enzyme phytase của Ba58 .....................33
4.2.1. Ảnh hưởng của mật độ giống đầu vào và thời gian nuôi cấy ..............................33
4.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm trong môi trường bán rắn ................................................35
4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ trong môi trường bán rắn .....................................35
4.3. Kết quả nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme phytase thô ở quy mô pilot ............36
4.4. Kết quả khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm phytase thô ...................................37
4.5. Kết quả thử nghiệm ................................................................................................38
4.5.1. Các thông số môi trường của thí nghiệm ............................................................38
4.5.1.1. Nhiệt độ nước trong quá trình thí nghiệm ........................................................38
4.5.1.2. Hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình thí nghiệm .........................................39
4.5.1.3. Thông số pH trong quá trình thí nghiệm ..........................................................39
4.5.1.4. Hàm lượng NH3 ................................................................................................40
vii

4.5.2. Thành phần sinh hóa của 5 công thức thức ăn ....................................................40
4.5.3. Tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá thí nghiệm ......................................................41
4.5.4. Hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô thí nghiệm ..................................................43
4.5.5. Lượng phosphor đào thải ra môi trường khí sản xuất 1 kg cá.............................44
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................45
5.1. Kết luận...................................................................................................................45
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................46

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CMC

Carboxyl methyl cellulose

FCR

Food Conversion Ratio

IUBMB

International Union of Biochemistry and Molecular Biology

JCBN

Joint Commission on Biochemistry Nomanclatue

PER

Protein efficiency ratio

SGR

Specific growth rate
WG

Weight Gain

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Trọng lượng phân tử phytase từ các nguồn khác nhau ....................................9
Bảng 2.2 Bảng phân biệt cá đực, cái ............................ Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.1 Thành phần các nguyên liệu dùng trong phối trộn thức ăn cho cá rô phi ......29
Bảng 4.1 Kết quả địn tính phytase.................................................................................33
Bảng 4.2 Biến thiên hoạt độ phytase theo nồng độ Ca2+ ...............................................38
Bảng 4.3 Kết quả thu nhận phytase trên quy mô pilot ..................................................39
Bảng 4.4 Kết quả phân tích thành phần sinh hóa thức ăn .............................................44
Bảng 4.5 Tăng trọng (WG), tốc độ tăng trưởng ngày (SGR) và tỉ lệ sống (SR) ...........44
Bảng 4.6 Hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô thí nghiệm .............................................45

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Phản ứng thủy giải phytate bởi enzym phytase ...............................................3

Hình 2.2 Cấu tạo hóa học của cơ chất bị thủy giải bởi 3- phytase và sản phẩm
của quá trình thủy giải .................................................................................................4
Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của acid phytic ..................................................................7
Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus ..........................................................................................15
Hình 2.5 Sự gắn acid phytic vào trung tâm hoạt động của phyC ..........................16
Hình 2.6 Cấu trúc không gian của phyC ...................................................................18
Hình 2.7 Các con đường thủy giải acid phytic của phytase Bacillus ....................19
Hình 2.8 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) .....................................................20
Hình 3.1 Sơ đồ quá trình thí nghiệm .........................................................................26
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...............................................................................30
Hình 4.1 Vòng phân giải acid phytic ........................................................................34
Hình 4.2 Biến thiên họat độ phytase của 5 chủng khảo sát ....................................35
Hình 4.3 Biến thiên hoạt độ phytase theo mật độ giống và thời gian nuôi cấy ...36
Hình 4.4 Biến thiên hoạt độ phytase theo độ ẩm môi trường bán rắn ...................38
Hình 4.5 Biến thiên hoạt độ phytase theo thời gian bảo quản ...............................40
Hình 4.6 Biến động nhiệt độ nước trong thời gian thí nghiệm ..............................41
Hình 4.7 Biến động DO trong thời gian thí nghiệm ................................................42
Hình 4.8 Biến động pH trong thời gian thí nghiệm .................................................43
Hình 4.9 Cá rô sau khí nghiệm ..................................................................................45
Hình 4.10 Lượng phospho thải ra môi trường khi sản xuất một kg cá..................47

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Để đáp ứng đủ nhu cầu về phosphor cho vật nuôi, trước đây người ta phải bổ
sung bằng những nguồn phosphor vô cơ dễ tiêu (như mono-calcium phosphate,
di-calcium phosphate, mono-sodiumphosphate) vào trong thức ăn hỗn hợp để vật nuôi
sinh trưởng và phát triển. Do đó, có một lượng lớn phosphor được bài tiết theo phân

vật nuôi vào môi trường. Enzym phytase có thể làm tăng hấp thụ phosphor trong cơ
thể vật nuôi thêm 60% và được dùng như là chất bổ sung bắt buộc cho thức ăn chăn
nuôi ở châu Âu, Đông Nam Á, Hàn Quốc, Nhật, Đài Loan để giảm tác hại đến môi
trường do phosphor từ phân vật nuôi thải ra.
Một số nghiên cứu về hiệu quả của phytase trên thủy sản đã đư ợc công bố ở một
số quốc gia trên thế giới. Theo Furuya và ctv (2001), việc sử dụng phytase trong khẩu
phần thức ăn nhằm tăng calcium và phospho r hữu dụng, cải thiện tốc độ tăng trưởng
và tăng hiệu quả sử dụng thức ăn. Việc thực hiện nồng độ phytase từ các vi sinh vật
1000 UI/kg thức ăn mang lại

kết quả trong việc tăng trưởng và sử dụng các chất

khoáng tương tự với việc sử dụng các khẩu phần thức ăn từ thực vật bổ sung với
phosphor vô cơ ( Portz và ctv, 2003; Portz và Liebert, 2004; Liebert và Portz, 2005).
Đối tượng cá rô phi là loài cá đem lại kim ngạch xuất khẩu quan trọng trong ngành
nông nghiệp Việt Nam. Năm 2003, Việt Nam sản xuất được khoảng 30.000 tấn cá rô phi và
một nửa trong số đó xuất khẩu mang về 24 triệu USD. Phấn đấu đến năm 2015 cá rô phi sẽ
trở thành sản phẩm xuất khẩu chủ lực với giá trị đạt từ 200-300 triệu USD. Chi phí sử dụng
thức ăn cho cá rô phi khá cao với FCR (hệ số chuyển đổi thức ăn) khoảng 1,7 – 1,8. Nếu
nguồn thức ăn được bổ sung enzyme phytase vào khẩu phần nhằm cải thiện hiệu quả sử
dụng thức ăn, tăng cường khả năng tiêu hóa cho cá là điều rất cần thiết.
Tuy nhiên, hiệu quả của các nguồn enzyme phytase được
sử dụng cho cá rô phi ở Việt
Nam vẫn chưa được nghiên cứu. Nhận thức được tầm quan trọng của enzyme phytase đối
với ngành nông nghiệp nói chung và ngành nuôi trồng thủy sản nói riêng. Vì vậy đề tài:
“Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme phytase từ các chủng vi khuẩn Bacillus sp. và thử
nghiệm ảnh hưởng của việc bổ sung phytase trong khẩu phần thức ăn đến sự tăng trưởng và
hiệu quả sử dụng thức ăn của cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)” đã được tiến hành.
1

1.2. Mục đích đề tài
Nghiên cứu quy trình thu nhận enzyme phytase từ vi khuẩn Bacillus sp. Khảo sát
hàm lượng enzyme phytase thích hợp vào trong khẩu phần thức ăn cho cá rô phi nhằm
nâng cao hiệu quả kinh tế.
1.3. Nội dung thực hiện
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase từ Bacillus sp. và các yếu tố
ảnh hưởng (mật độ giống, thời gian nuôi cấy, nồng độ Ca2+, độ ẩm) đến khả năng sinh
tổng hợp phytase của Bacillus sp.
Khảo sát hàm lượng enzyme phytase thích hợp đến khả năng tăng trưởng
và hiệu quả sử dụng thức ăn cho cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus).

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme phytase
2.1.1. Định nghĩa
Enzyme phytase (Myo-inositol hexakis phosphate phosphorhdrolase) là một
enzyme đặc biệt xúc tác thủy phân nối phosphomonoester của acid phytic giải
phóng orthophosphate vô cơ hay các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm
phosphate hơn, trong một số trường hợp có thể trở thành myo-inositol tự do.
Phản ứng có thể khái quát như sau: Myo-inositol hexakisphosphate + H2O
= D-myo-inositol 1,2,4,5,6pentakisphosphate + phosphate

Hình 2.1 Phản ứng thủy giải phytate bởi enzyme phytase
(www. faculty.evansville.edu)

3

2.1.2. Phân loại
2.1.2.1. Dựa trên vị trí của nhóm phosphor đầu tiên bị enzyme tác động
Các tổ chức nghiên cứu về sinh hóa như IUBMB (International Union of
Biochemistry and Molecular Biology), JCBN (Joint Commission on Biochemistry
Nomanclatue) đã chia phytase thành 2 loại
E.C.3.1.3.8: tên thông thường là 3-phytase, tên hệ thống là: myoinositolhexakisphosphate-3-phosphorhydrolase. Enzyme loại này thủy giải lien
kết ester tại vị trí thứ 3 của myo-inositolhexakisphosphate thành D-myo-Ins
1,2,4,5,6-pentakisphosphate và orthophosphat. Có công thức phân tử C6H17O21P.
Đây là dạng thường gặp đối với các enzyme phytase có nguồn gốc vi sinh vật.

Hình 2.2 Cấu tạo hóa học của cơ chất bị thủy giải bởi 3-phytase (A)
và sản phẩm của quá trình thủy giải (B)
(www. en.wikipedia.org)

E.C.3.1.3.26: tên thông thường là 6-phytase, tên hệ thống là myoinositolhexakisphosphate-6-phosphorhydrolase. Enzyme loại này thủy giải liên
kết ester tại vị trí thứ 6 của myo-inositolhexakisphosphate, cho sản phẩm là Dmyo-Ins-1,2,3,4,5-pentakisphosphate và orthophosphat. 6-phytase là dạng
thường gặp đối enzyme phytase có nguồn gốc thực vật.

4


2.1.2.2. Dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và đặc trưng thủy phân của phytase
Một số tổ chức nghiên cứu và các nhà khoa học khác như Trung tâm thông
tin sinh học quốc gia Hoa Kỳ (NCBI) và các tác giả Mullaney, Ullah, đã phân
chia enzyme phytase thành 3 nhóm.
Nhóm thứ 1 (EC 3.1.3.2) bao gồm các acid phosphatase hoặc histidin acid
phosphatase (HAPs). Đặc điểm chung có trung tâm hoạt động là RHGXRXP và
quá trình thủy giải phosphomonoester gồm các bước giống nhau.
Nhóm thứ 2 (EC 3.1.3.8) là các β-propeller phytase (BPP), chủ yếu là các enzyme của

Bacillus. Cho đến nay, việc phân lập, xác định các gen điều khiển hoạt động của phyase
thuộc nhóm này chưa đầy đủ. Các nghiên cứu cho thấy, hiện có 2 loại phytase của Bacillus
đã được xác định, đó là phyC do Kerovuo và các cộng sự phát hiện vào năm 1998 và TSphy do Kim và các cộng sự phát hiện năm 1998.
Nhóm thứ 3 (EC 3.1.3.2) bao gồm các purple acid phosphatase (PAP). PAP được
chiết tách từ lá mầm của đậu nành nảy mầm thuộc nhóm enzym này. Người ta đã xác định
được cấu trúc không gian 3 chiều và cơ chế xúc tác của PAP.
2.1.3. Các nguồn thu nhận enzyme phytase
2.1.3.1. Nguồn thực vật
Enzyme phytase được tìm thấy nhiều ở thực vật. Ví dụ như phytase từ ngũ
cốc: lúa mì, bắp vàng, lúa mạch, lúa gạo và từ các loại đậu: đậu nành, đậu xanh
và đậu trắng califoria loại nhỏ. Hoạt độ enzyme phytase cũng đã được xác định
ở cải trắng, khoai tây, rau diếp, rau bina, cỏ và phấn hoa lily.
2.1.3.2. Nguồn động vật
Enzyme phytase được tìm thấy ở ruột của một số động vật, đặc biệt là các
động vật nhai lại. Tuy nhiên, enzyme phytase trong ruột không đóng vai trò quan
trọng việc tiêu hóa các dẫn xuất phytate trong thức ăn (Collum và Hart, 1908).
Craxton và ctv, (1987) đã phân lập và cho thấy biểu hiện hoạt động của enzyme
phytase trên một số nhánh gan của chuột. Một enzyme có chức năng giống
enzyme phytase cũng đã được tìm thấy ở động vật đơn bào Panamecium.
2.1.3.3. Nguồn vi sinh vật
Shieh và Ware (1968) đã tiến hành phân lập từ đất hơn 2000 chủng vi sinh
vật có khả năng tạo enzyme phytase. Hầu hết các chủng được phân lập cho sản
5


phẩm enzyme nội bào. Chỉ có khoảng 30 chủng đã phân lập cho sản phẩm
phytase ngoại bào. Tất cả các enzyme phytase ngoại bào đều là sản phẩm của vi
nấm, 28 chủng thuộc giống Aspergillus, một thuộc giống Penicillium và một
thuộc giống Mucor. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng A.niger tổng hợp
phytase ngoại bào tốt nhất (Vohra và Satyanayarana, 2003).

Các nghiên cứu của Powar và Jaganathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy
Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào. Kim và ctv,
(1998) đã nghiên cứu và chứng minh Bacillus amylolique faciens cũng có khả
năng sinh tổng hợp enzyme phyase. Bên cạnh đó, các chủng như Aerobacter
aerogenes, Pseudomonas sp., Escherichia coli. Enterobacter sp. cũng có khả
năng sinh tổng hợp enzyme phytase nội bào (Trần Thị Thúy, 2010).
2.1.3. Cơ chất đặc hiệu của enzym phytase
2.1.3.1. Acid phytic và muối phytate
Acid phytic (myo-inositol hexakisphosphat) là ester của rượu inositol và
acid phosphoric. Công thức tổng quát là C 6H18O24P6 . Cấu trúc hóa học của acid
phytic rất ổn định, hàm lượng phosphate cao, do đó nó tích điện âm và có khả
năng tồn tại trong phổ pH rộng.

Hình 2.3 Cấu tạo hóa học của acid phytic
(www.en.wikipedia.org)

Acid phytic chiếm từ 1-5% trọng lượng trong ngủ cốc, cây họ đậu, hạt cho
dầu và các loại quả hạch (Ravindran và ctv, 1994). Trong các hạt làm thức ăn
cho động vật, 1/3 là các ion phosphor cá thể tiêu hóa được, trong khi đó 2/3 còn
lại là các phosphor vô cơ tồn tại dưới dạng phytin, một dạng hỗn hợp của muối
6


canxi, magie với acid ionositol hexaphosphoric, được biết như là một dạng muối
của phytate. Ngoài ra trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu dưới dạng muối
phytate với các ion kim loại như kẽm, sắt… Muối phytate là loại hợp chất phức
tạp khó tan, con người và động vật không thể phân giải, do đó không thể hấp thu
được phosphor và các nguyên tố cần thiết cho cơ thể. Trong trường hợp này acid
phytic là nguyên nhân gây nên hiện tượng kháng dưỡng, hầu như không có
enzyme nào có khả năng phân cắt các liên kết phosphodiester trong phân tử acid

phytic, ngoại trừ enzyme phytase (Lynch và ctv, 1998).
Acid phytic và các chất trung gian inositol có liên quan đến sự đáp ứng
glucose trong máu, làm giảm lượng cholesterol và triglyceride (Ogawa và ctv
1979). Acid phytic cũng là nguồn cung cấp thông tin liên quan đến khối u, đến
việc điều trị bệnh Parkinson, bệnh Alzhermer và bệnh đa xơ cứng.
2.1.3.2. Các cơ chất khác
Enzyme phytase có nhiều cơ chất đặc trưng như ADP, ATP, p-nitrophenyl
phosphate, phenyl phosphate, fructose 1,6-bisphosphat, glucose 6-phosphat, α-,
β-glycerophosphat và 3-phosphoglycerat. Các chất này không có cấu trúc tương
tự acid phytic nhưng tất cả đều được thủy giải bởi phytase. Chỉ có một số ít
phytase được nghiên cứu cho thấy tính đặc hiệu cao với acid phytic, đó là
phytase của Bacillus và alkaline phytase được phân lập từ hạt phấn hoa lily
(Qian và ctv, 2011; Barrientos và ctv, 1994).
Dựa trên cơ chất đặc trưng, enzyme phytase có thể được phân chia thành 2
loại là phytase có lượng cơ chất đặc trưng khá rộng và phytase đặc hiệu cao với
acid phytic. Enzyme phytase phù hợp với nhiều cơ chất đặc hiệu thì lại có tính
đặc hiệu thấp với acid phytic. Ngược lại, phytase có lượng cơ chất đặc hiệu thấp
thì cho hoạt độ cao hơn.

7


2.1.4. Các đặc tính lý hóa của enzym phytase
2.1.4.1. Cấu tạo và trọng lượng phân tử
Bảng 2.1 Trọng lượng phân tử của enzyme phytase từ các nguồn khác nhau
Số lượng

Nguồn enzyme
phytase

Trọng
lượng lý
thuyết
(kDa)

Trọng lượng
thực nghiệm
(kDa)

Aspergillus niger

48,423

64,89

1

Xác định bằng siêu ly tâm

48,189

70,38

1

Xác định bằng siêu ly tâm

48,273

70,74

1

Xác định bằng siêu ly tâm

-

38

1

A. terreus
A. fumigatus
Bacillus subtilis

tiểu đơn
vị

(natto)
Bacillus subtilis

Ghi chú

Xác định bằng điện di
trên gel SDS

-

36,5

1

Xác định bằng điện di
trên gel SDS

Bacillus

39,23

44

1

trên gel SDS

amyloliquefaciens
Klebsiella

-

700

1

Xác định bằng điện di
trên gel SDS

aerogenes
K. terigena

Xác định bằng điện di

-

40

1

Xác định bằng điện di
trên gel SDS

E. coli

44,69

42

1

Xác định bằng điện di
trên gel SDS

Enterobacter

27,055

-

-

Bắp

-

76

2

Đậu nành

-

-

cloacae
Xác định bằng điện di
trên gel SDS
59 – 60

1+1

Xác định bằng điện di
trên gel SDS

8


Hầu hết các enzyme phytase trong tự nhiên đều là các enzyme đơn phân tử,
một vài enzym phytase từ thực vật và động vật là những enzyme đa phân.
Phytase được hình thành trong quá trình nảy mầm của hạt bắp được xác định là

một enzym gồm 2 tiểu đơn vị có trọng lượng 38 kDa. Enzyme phytase được
tinh sạch từ ruột của chuột, qua kết quả điện di cho thấy có 2 loại protein có kích
thước 70 và 90 kDa.
Phytase của vi khuẩn hầu hết có trọng lượng phân tử nhỏ hơn phytase của
nấm, phytase của nấm có trọng lượng phân tử khoảng 50 kDa. Trọng lượng và kích
thước phân tử tính toán theo lý thuyết của các protein hoàn chỉnh và số lượng các
tiểu đơn vị của phytase từ nhiều nguồn khác nhau được trình bày trong Bảng 2.1

2.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ phytase
Các nghiên cứu cho thấy enzyme phytase có hoạt tính cao ở nhiệt độ 5070 0 C. Khi nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của Aspergillus fumigatus, A.niger, kết
quả cho thấy phytase từ nguồn này không có khả năng chịu nhiệt ngay cả khi có sự
biến đổi cấu trúc sau khi bị biến tính bởi nhiệt độ. Ở nhiệt độ 50-55 0 C, phytase
A.niger trải qua quá trình biến đổi hình dáng cấu tạo không thuận nghịch và kết
quả là làm giảm 70-80% hoạt độ enzyme. Phytase của A.fumigatus cũng không có
khả năng chịu nhiệt, nhưng có khả năng hồi tính, đảm bảo đầy đủ hoạt độ sau khi bị
biến tính ở 90 0 C (Tomschy và ctv, 2000). Phytase của Bacillus sp.có nhiệt độ tối ưu
tại 70 0 C, cao hơn nhiệt độ tối ưu của phytase nói chung. Enzyme này có tính ổn
nhiệt, hoạt tính giữ 100% khi ủ ở 70 0 C khi có sự hiện diện của CaCl2, hoạt tính
giảm nhanh khi nhiệt độ vượt quá 50 0 C và vắng mặt Ca 2+ (Edward và ctv, 2003).
Các nghiên cứu cho thấy có thể dùng kỹ thuật protein để tăng tính ổn định
nhiệt độ của phytase như thay thế Proline và tạo cầu disulfit hay dùng kỹ thuật sinh
học phân tử để tạo dòng phytase từ những nấm chịu nhiệt như M.thermophlia,
T.thermophilus (Kim và ctv, 1998; Đỗ Thị Ngọc Huyền và ctv, 2007).

2.1.4.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytase
pH tối ưu của các loại enzyme phytase dao động từ 2,2 - 8. Hầu hết phytase
từ vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc, có pH từ 4,5 - 5,6 (Hassouni và ctv, 2001).
Tuy nhiên phytase của A.fumigatus có phổ pH khá rộng, khoảng 80% hoạt độ
của enzyme được biểu hiện ở pH 4,0 - 7,3. Phytase từ thực vật có pH tối ưu từ
4,0 - 7,5. Hai enzyme phytase thực vật có tính kiềm (hạt đậu và hạt phấn hoa

9


lily) có pH op là 8,0. Phytase từ động vật đa số hoạt động ở pH kiềm, từ 7,4 đến
8,7. Để tạo phytase có pH phù hợp với hệ thống tiêu hóa của động vật. Các
nghiên cứu gần đây tiến hành đột biến điểm định hướng một số acid amin làm
thay đổi pH tối ưu của enzyme phytase cho phù hợp với hệ tiêu hóa của các đối
tượng vật nuôi (Tomschy và ctv, 2002; Sheng, 2007).
2.1.4.4. Ảnh hưởng của ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt độ phytase
Các ion kim loại được xem như là các tác nhân ảnh hưởng trược tiếp lên
hoạt độ phytase. Tuy nhiên, rất khó để xác định ảnh hưởng của các kim loại khác
nhau vì sự liên kết trực tiếp với enzyme hoặc các ion kim loại ở dạng phức hợp
chất hòa tan với acid phytic và do đó làm giảm mức độ hoạt động của cơ chất.
Các ion kim loại thường ức chế hoạt tính của enzyme phytase: Ba2+ , Cd 2+ , Co 2+,
Cr3+ , Cu 2+ , Hg 2+ , and Mn 2+ . Theo nghiên cứu của Wyss và ctv (1999), ion Cu2+
được xác định có khả năng làm giảm hoạt độ của enzyme phytase có nguồn gốc
từ E.nidulans và A.terrus. Phytase của A.fumigatus bị ức chế bởi một số ion kim
loại thông thường. Theo nghiên cứu của Yang và ctv (2001), khi thêm các thành
phần EDTA, BaCl,2 CaCl2, CdCl 2 CoCl2 CrCl 3 CuCl 2 và HgCl 2 thì hoạt độ
phytase từ chủng Bacillus sp. KHU-10 so với ban đầu giảm lần lượt là: 94%,
65%, 100%, 40%, 55%, 61% và 57%. Tuy nhiên khi thêm CaCl 2 với nồng độ
1mM thì hoạt độ phytase có thể hồi tính gần như ban đầu. Những chất hóa học
khác có khả năng kìm hãm hoạt độ phytase là flor, molypdat, vanadat…
Vai trò của ion kim loại đối với hoạt độ enzyme phytase phải được xem
xét trên từng loại đối tượng cụ thể. Các nghiên cứu đều cho thấy, ion Ca2+ đóng
vai trò quan trọng đối với hoạt độ và sự ổn định của enzyme phytase. Khi thêm
tác nhân Ca vào phytase của Bacillus, phytase có nguồn gốc từ phấn hoa Typha
latifolia và phytase của một số loài thực vật khác với một lượng thích hợp thì
hoạt độ có thể đạt đến hoạt độ tối ưu. Ngoài Ca2+ , một số ion kim loại khác cũng
có khả năng làm tăng hoạt độ của enzyme như Zn2+ , Fe2+ , Mg 2+.

2.1.4.5. Các điều kiện khác ảnh hưởng đến hoạt độ phytase
Nồng độ cơ chất khoảng 300µM có khả năng ức chế phytase và các enzyme
có chức năng gần giống phytase ở Paramecium. Phytase của Klebsiella sp.,

10


Rhizopus oligosporus bị ức chế ở nồng độ cơ chất cao. Hoạt độ phytase của nấm
bị ức chế ở nồng độ trên 1mM.
Một cơ chất có cấu trúc tương tự cơ chất, myo-inositol hexasulfat, cho thấy
nó có khả năng cạnh tranh hiệu quả, trở thành tác nhân ức chế của phyA và
phyB của A.ficuum.
2.1.5. Vị trí phản ứng, sản phẩm cuối phản ứng thủy giải acid phytic
Acid phytic có 6 nhóm phosphate có thể được giải phóng bằng phytase với
tỷ lệ và trình tự khác nhau. Theo Wyss và ctv (1999), tất cả các enzyme phytase
của nấm đã nghiên cứu đều giải phóng 5 hoặc 6 nhóm phosphate, sản phẩm cuối
là myo-inositol 2-monophosphat và sử dụng một lượng enzyme dư. Trong một số
trường hợp hiếm đã phát hiện sự tồn tại của các myo-inositol hoặc các myoinositol 1-monophosphat ở dạng tự do.
Có một thực tế là các sản phẩm cuối của sự thủy giải acid phytic của hầu
hết các con đường làm giảm acid phytic về cơ bản đều giống nhau. 3-phytase bắt
đầu thủy giải các liên kết ester của phosphate ở vị trí D-3, cho ra D-Ino
(1,2,4,5,6)p5 như là sản phẩm thứ cấp. 6-phytase bắt đầu thủy giải các liên kết
ester ở vị trí L-6 hoặc (D-4) tạo thành L-Ins(1,2,3)P 3 như là sản phẩm cuối cùng.
2.1.6. Động học của enzyme phytase
Cho đến nay, hầu hết các enzyme phytase được nghiên cứu tuân theo động
học Michalelis – Menten, ngoại lệ có phytase của M. thermophila và E. nidulans
hoạt động không theo động học trên. Ở điều kiện tiêu chuẩn, chỉ có một tỷ lệ của
phản ứng từ myo-inositol hexakisphosphat thành pentankisphosphat được xác
định. Ullah và Phylippy (1994) đã xác định các thông số động học của enzyme
phytase A. ficuum và hai acid phosphatase với cơ chất acid phytic hầu hết nằm

trong khoảng từ 23 - 198 UI/mg. Hoạt độ đặc hiệu của enzyme phytase vi khuẩn
có trị số biến thiên trong khoảng 100 lần.
2.1.7. Ứng dụng của enzyme phytase
2.1.7.1. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản
Thức ăn chiếm đến 70% giá thành sản phẩm từ vật nuôi (Rumsey, 1993)
thế nhưng trong thành phần thức ăn cho thủy sản, heo, gia cầm lại thiếu enzyme
thích hợp cho việc phân giải phytin nên vật nuôi khó hấp thu phosphor và lượng
11


phosphor này sẽ được đào thải ra môi trường. Enzyme phytase sẽ bổ sung vào
thành phần thức ăn với một lượng nhỏ nhưng đem lại hai lợi ích: hạ giá thành
sản phẩm thông qua việc tận dụng lượng Ca, P, Fe, protein dễ tiêu... và thải một
lượng phosphor rất thấp vào môi trường (Yohra và Satyariatayana, 2003) và
nhiều thí nghiệm ứng dụng enzyme phytase vào trong thành phần thủy sản đã
chứng minh kết luận này (Robinson và ctv, 1999).
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã và đang nỗ lực tìm cách
làm giảm ô nhiễm từ các chất thải trong chăn nuôi. Trong quá trình nghiên cứu,
các nhà khoa học đã xác định được rằng cần cải thiện khả năng sử dụng các
dưỡng chất trong khẩu phần của vật nuôi để hạn chế tối đa lượng phân thải ra.
Trước đây, do ít quan tâm đến lượng chất dinh dưỡng bị thải ra ngoài nên hậu
quả của việc cho ăn quá nhiều chất dinh dưỡng nhằm tối đa hóa năng suất đã dẫn
đến hậu quả là lượng chất dinh dưỡng thải ra quá nhiều qua phân và nước tiểu
(chủ yếu là hàm lượng protein, phosphor và canxi). Qua những phần trình bày ở
trên, enzyme phytase được bổ sung vào thành phần thức ăn cho vật nuôi để cải
thiện lượng dinh dưỡng hấp thu như phosphor, acid amin, khoáng chất và năng
lượng nhưng nó cũng góp phần bảo vệ môi trường. Tuy nhiên, phytase từ vi sinh
vật nhất là từ vi khuẩn rất khó kiểm soát vì chúng ta chưa giải thích được rõ về
cơ chế tổng hợp phytase đặc biệt là các gene điều khiển sinh tổng hợp phytase
luôn biến đổi (Liu và ctv, 1998). Tùy theo nhóm vi sinh vật, như vi khuẩn cũng

tùy vào mỗi giống và loài, điều kiện môi trường nuôi cấy, cơ chất… sẽ ảnh
hưởng đến năng suất và hoạt tính của phytase (Pandey và ctv, 2001). Như vậy,
nghiên cứu và sản xuất phytase từ vi sinh vật, tối ưu hóa môi trường và điều
kiện sinh tổng hợp phytase tốt nhất cũng như bảo quản hoạt tính enzyme phytase
để thành một sản phẩm thương mại phải còn nhiều bước nghiên cứu nữa.
2.1.7.2. Trong dinh dưỡng thực phẩm
Sự hiện diện enzyme phytase trong thành phần thực vật đã được ứng
dụng nhiều trong đó nấm mốc lên men đậu nành cho sản phẩm đậu nành lên
men, có tên là tempe (Fardiaz và Markakis, 1981) vì phytate liên kết với protein
và protein phân lập từ đậu nành lại giàu phytate. Tuy nhiên, lượng phytase có
sẵn trong thực vật không đủ để đáp ứng cho quá trình lên men. Mặt khác phytase
12