Vai trò của real-time PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới - Phạm Hùng Vân

Vai trò của real-time PCR
trong chẩn đoán các tác nhân gây
nhiễm khuẩn hô hấp dưới
Phạm Hùng Vân*

*Chủ Tịch Hội Vi Sinh Lâm Sàng TP. HCM
Chủ Tịch Chi Hội SHPT Y Khoa Việt Nam
Trưởng Đơn Vị Vi Sinh – SHPT Lâm Sàng BV. NTP


Quệt MŨI SAU
Phát hiện virus
QUYỆT HỌNG
Không ý nghĩa
ĐÀM hay
BỆNH PHẨM CÓ ĐÀM

CẤY
DNT
Màng não

Máu

DỊCH
MÀNG
PHỔI

Màng phổi

CẤY
MÁU

Thách thức trong cấy đàm
 Phải bắt được vi khuẩn gây bệnh từ
mẫu tạp nhiễm, do vậy phải lấy đúng
bệnh phẩm đàm và phải đánh giá để
chọn đúng vi khuẩn gây bệnh mọc
trên mặt thạch phân lập
 Có nhiều loại là vi khuẩn gây bệnh là
khó mọc, do vậy phải cấy ngay và có
đủ các loại môi trường cần thiết


Lấy đúng bệnh phẩm đàm
 Phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm,
 Phải có phương tiện và phương pháp lấy
đàm khi bệnh nhân không thể khạc
đàm
 Phải lấy đàm ngay khi chẩn đoán và
trước khi dùng kháng sinh
 Phải đánh giá đại thể mẫu đàm rước khi
gửi mẫu đi đến phòng xét nghiệm.



?

?
?

?

Chọn đúng vi khuẩn gây bệnh


Nguyên tắc chọn VK gây bệnh
 Ưu tiên 1: Chọn vi khuẩn phù hợp với
hình ảnh vi khuẩn thấy trong vùng bạch
cầu của phết nhuộm Gram mẫu đàm
 Ưu tiên 2: Chọn vi khuẩn ưu thế (định
lượng hay bán định lượng
Lưu ý: Vi khuẩn có số lượng nhiều nhưng cũng có thể
không phải là vi khuẩn gây bệnh mà chỉ là VK quần cư, vi
khuẩn thường trú hầu họng (Streptococci tiêu huyết )


Song cầu Gram [+] giống
S. pneumoniae

Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống
H. influenzae

Song cầu Gram [-] giống
M. catarrhalis

Trực khuẩn Gram [-] nhỏ giống
H. influenzae


LÝ DO NUÔI CẤY THẤT BẠI

 S. pneumoniae, H. influenzae là chủ yếu
nhưng không dễ nuôi cấy, đòi hỏi các môi
trường phân lập ít có sẵn
 Bệnh phẩm ít được cấy ngay
 Bệnh nhân dùng kháng sinh trước
 Mẫu không tin cậy do lẫn nước bọt (tạp
khuẩn hầu họng)
 Không biết cách đánh giá kết quả nuôi cấy
để chọn đúng VK gây bệnh


Cấy máu

Thách thức trong cấy máu
 Cấy máu là phương tiện tốt nhất xác định tác
nhân vi khuẩn gây viêm phổi (CAP), tuy
nhiên không phải tất cả mọi trường hợp CAP
đều cấy máu [+] (Tối đa chỉ 14-16%)
 Coi chừng ngoại nhiễm trong cấy máu. Kết
quả [+] trong 24 giờ, hay cả 2 chai cấy cùng
[+] một loại VK thường ít khi là ngoại nhiễm.
 Kết quả cấy máu phải kịp thời, muống vậy
phải dùng phương tiện thích hợp và phải có
qui trình trả kết quả nhanh


Phát hiện tác nhân
bằng kỹ thuật miễn dịch
 Phát hiện kháng nguyên hòa tan VK gây
bệnh (S. pneumoniae, L. pneumophila)

trong nước tiểu. Độ nhạy thấp
 Phát hiện kháng nguyên trong mẫu đàm,
quyệt mũi sau bằng ELISA, MDHQ: Phát
hiện tác nhân virus, VKKĐH. Độ nhạy thấp
 Huyết thanh học tìm kháng thể đặc hiệu
phát hiện tác nhân virus, VKKĐH: Nếu là
IgG thì phải huyết thanh kép cách 10
ngày; nếu là IgM thì phải có giá trị cắt và
tùy thuộc chất lượng kit


Phát hiện tác nhân vi sinh gây ARI
GIẢI PHÁP NÀO PHÙ HỢP?

 VI SINH TRUYỀN THỐNG (nuôi cấy)
Không nhạy, không đầy đủ

 HUYẾT THANH (kháng thể đặc hiệu)
Không hữu dụng (IgG), kém đặc hiệu (IgM)

 HOÁ MIỄN DỊCH (kháng nguyên đặc hiệu)
Độ nhạy kém

 REAL-TIME PCR (trình tự NA đặc hiệu)
Độ nhạy cao, đặc hiệu cao


Nguyên tắc PCR

cơ sở của độ nhạy tuyệt vời

ADN đích

4

1 Biến tính (94o C)

1

2

2 Bắt cặp (55-65o C)
3

3 Kéo dài (72o C)

Taq polymerase
n


PCR là ni cấy đoạn gen

cơ sở của độ đặc hiệu khơng khác ni cấy

Nuôi cấy

Đònh danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa học
biểu hiện từ các kiểu gen

PCR

Xác đònh dựa vào kích thước đoạn gen
hay một trình tự đặc hiệu của đoạn gen


Real-time PCR

Chạy PCR đồng thời phát hiện kết quả
Ct curve

Melt curve

Standard
curve


“Streamline” Real-time PCR
CÁC BỆNH PHẨM KHÁC NHAU
(Máu, mô, đàm, mủ, dịch cơ thể)

TÁCH CHIẾT DNA/RNA
NKDNARNAprep-MAGBEAD
Một bộ thuốc thử cho DNA và RNA
Chỉ 5 bước thực hiện
Độ nhạy gấp 100 lần thủ công
Tương thích cho KingFisher

Các thiết bị KingFisher
tách chiết DNA/RNA

REAL-TIME PCR/RTPCR

NKReal-time PCR/RTPCR kit
Chọn lựa tuỳ tác nhân
Chứng nội kiểm soát chất lượng
Cùng một chương trình real-time
Tương thích nhiều máy real-time

Các thiết bị Real-time PCR


PCR so với nuôi cấy
phát hiện các tác nhân vi khuẩn
Nuôi cấy

S. pneumoniae
H. Influenzae
M. catarrhalis

Pos
Neg
Pos
Neg

Pos
5
43
5
62

Pos
Neg

4
8

PCR

Neg
3
201
0
185
6
234

Takahashi et al. BMC Infectious Diseases 2013, 13:296


Tỷ lệ phát hiện tác nhân gây bệnh
ĐỊNH LƯỢNG >105/ml

124 bệnh nhân
VPCĐ nhập viện.
1/14-4/14 tại khoa
hô hấp bv. NTP
64.5%

Trần thị Thanh Vy (2013). Luận văn ThS. vi sinh.


Tác nhân chính gây bệnh

ĐỊNH LƯỢNG CAO NHẤT VÀ >105/ml
Influenzavirus A
1%
B. pertussis
4%

VKKĐH
38%

Parainfluenzavirus 1
1%

Parainfluenzavirus 3
1%
Respiratory Syncitial
Virus
1%

Chlamydia
13%

S. pneumoniae
39%
Mycoplasma
21%

H. influenzae
14%

M. catarrhalis

5%

Trần thị Thanh Vy (2013). Luận văn ThS. vi sinh.


Tỷ lệ phối hợp VK không điển hình
với tác nhân gây bệnh chính là S. pnemoniae và H. influenzae
Nnghiên cứu trên 124 trường hợp
viêm phổi cộng đồng nhập viện tại BV. NTP

45.45
29.03

S. pneumoniae
(N=30)

H. influenzae
(N=11)

Trần thị Thanh Vy (2013). Luận văn ThS. vi sinh.


Real-time PCR so với nuôi cấy
phát hiện tác nhân VK gây HAP
A. baumannii
S. pneumoniae
Mycoplasma

MRSA

PCR [+]

PCR [-]

Cấy [+]

2

0

Cấy [-]

4

0

Cấy [+]

0

0

Cấy [-]

1

0

Cấy [+]

0

0

Cấy [-]

1

0

Cấy [+]

0

0

Cấy [-]

1

0

Đang nghiên cứu với BV NĐ1
N = 26


Tác nhân vi sinh gây viêm phổi
không đáp ứng điều trị ở trẻ nhỏ
N=32
ĐỊNH LƯỢNG >105/ml

kết quả [+]
kết quả [-]

87.5%
Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015)
Luận văn Thạc Sĩ nhi
Thực hiện tại BV. NĐ1


Tác nhân chính gây bệnh

ĐỊNH LƯỢNG CAO NHẤT VÀ >105/ml
Không phát hiện
được tác nhân 12.5%

H. influenzae 6.25%

E. coli 3.13%
K. pneumoniae 6.25%

RSV 3.13%
Para-INF3 Virus 6.25%

B. pertussis 3.13%
M. pneumoniae 9.38%

S. pneumoniae 50%

Xác định tác nhân gây bệnh
ĐỊNH LƯỢNG >105/ml

NO

12.5

KLP

3.13

Eco

3.13

RSV

3.13

BP

3.13

MP

3.13

PNE+pInf3+ADV+Eco

3.13

PNE+pInf3+KLP

3.13

PNE+InfA+KLP

3.13

PNE+pINF3+KLP+Eco

3.13

PNE+pInf3

3.13

PNE+MP

15.63

PNE

34.38

HIN+PSA

3.13

HIN

3.13


So sánh real-time và nuôi cấy
Nuôi cấy

S. pneumoniae
H. influenzae
E. coli

K. pneumoniae
P. aeruginosa

PCR

+

-

+

0

21

-

0

11

+

1

1

-

0

30

+

1

2

-

0

29

+

2

1

-

0

29

+

1

0

-

0

31

Bùi Lê Hữu Bích Vân (2015); Luận văn Thạc Sĩ nhi; Thực hiện tại BV. NĐ1