QUY TRÌNH CHẨN đoán BỆNH PHÙ ở lợn DO VI KHUẨN ECOLI

10 TCN 729 – 2006

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
__________________

10TCN

TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 729-2006
QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN
DO VI KHUẨN E. COLI

0


10 TCN 729 – 2006

Hà Nội - 2006

TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 729 – 2006

QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH PHÙ Ở LỢN
DO VI KHUẨN E. COLI
ngày

(Ban hành kèm theo Quyết định số
QĐ/BNN-KHCN
tháng 5 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn)

1. Phạm vi áp dụng:
Áp dụng cho các cán bộ thú y để chẩn đoán bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra
2. Khái niệm bệnh

Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli có yếu tố bám dính F18 và có khả năng sản sinh độc
tố verotoxin 2e gây ra. Khi có stress đặc biệt là khi thay đổi chế độ dinh dưỡng, những chủng
E.coli chủng có nhân tố bám dính Fimbriae 18 (F18) nhân lên trong ruột non và bám vào
thành ruột. Các vi khuẩn này sản sinh độc tố Verotoxin (VT2e), độc tố này được hấp phụ vào
máu và đến các tế bào biểu mô của các vi mạch quản làm cường thẩm thấu qua mạch quản gây
ra phù và các triệu chứng thần kinh điển hình như: Đi lại loạng choạng, xiêu vẹo hay ngã, có
khi co giật.
3. Máy móc - dụng cụ - môi trường - hoá chất - nguyên liệu
3.1 Máy móc và dụng cụ
- Tủ lạnh
- Tủ ấm 370C
- Tủ sấy
- Lò vi sóng
- Nồi hấp ướt
- Cân điện

1


10 TCN 729 2006
- Kinh hin vi phong ai 1000 lõn
- Nụi un cỏch thuy (Water bath)
- B ụ mụ tiu gia suc
- Dung cu thuy tinh: Binh tam giỏc, ng ong, cc co mo, chai thuy tinh, ia lụng, ng
nghim, pipet, lam kinh.

- Cỏc dung cu khỏc: Panh, keo, dao ct, que cõy, ốn cụn, but vit kinh, bụng thõm nc,
bụng khụng thõm nc, khn bụng hoc giõy thõm mờm
- Dung cu o pH
3.2. Hoỏ chõt
- Cụn Ethylic
- Cụn Methylic cụn isomylic
- Xylen
- Natri hydroxyt
- Natri bicarbonat
- Nc cõt
- Dõu soi kinh
- B thuc nhum Gram (xem phu luc 1)
- Thuc th Kovacs (xem phu luc 1)
- Thuc th Voges-Prskauer (xem phu luc 1)
- Methyl red
3.3. Mụi trng v nguyờn liu
- Thach mỏu c ban (Blood agar base)
- Thach MacConkey (hoc thach Brilliant green)
- Mụi trng VP-MR
- Nc peptone
- Mụi trng Cimon Citrate
- Mỏu bo, bờ hoc cu
- B khỏng huyt thanh E.coli chuõn ca ln
- Khỏng nguyờn F18
- Cp mụi (primer) phỏt hin yu t bỏm dinh F18
- Cp mụi (primer) phỏt hin gene vt2e (yu t c lc VT2e)
- Cỏc nguyờn liu cõn thit cho PCR
4. Phng phap chõn oan
S ụ chõn oỏn bnh phu do vi khuõn E. coli
S ụ chõn oan bờnh phu do vi khuõn E. coli

Đặc điểm
dịch tễ

Kiểm tra lâm
sàng
Mổ khám
Kiểm tra bệnh tích

Bệnh phẩm

2


10 TCN 729 2006

Phân lập, giám
định sinh hoá,
KHV
Xác định yếu tố
độc lực F18 và VT2

Định týp huyết
thanh
Kết luận
4.1.c im dch te
- Bnh thng xuõt hin trc v sau khi cai sa.
- Bnh xuõt hin le te, it lõy lan t n ny sang n khỏc v thng trong iờu kin nuụi
dng tt.
- Ln b bnh thng l nhng con phỏt trin nhanh nhõt trong n.
- Ti l cht khoang 65%.

4.2. Triu chng lõm sng
- Mt hoc nhiờu ln b cht t ngt m khụng biu hin triu chng lõm sng.
- Thõn kinh ri loan bao gụm: i lai loang choang, xiờu veo hay nga, co khi co giõt.
- Phu mi mt, mt, phõn bung phu v sng to.
- Th kho, kờu khn khn do thanh quan b phu.
- Ln co biu hin bo n, bo bu. Hin tng ny co the keo di trong nhiờu ngy.
- ia chay, phõn long co khi ton nc hoc lõn cuc mỏu ti.
- Ln thng cht trong vong t 4 gi n 48 gi sau khi co triu chng lõm sng.
4.3. Bnh tich
- Phu di da ton thõn.
- Phu mi mt, kt mac, ng cong ln da dy.
- Co dch nhõy di niờm mac da dy.
- Trn dch mng tim, mng phụi, xoang bung tich nc.
- Mỏu c sõm, phụi viờm, gan sng , tim nhao, hach rut viờm ton b.
4.4.Phng phỏp chõn oỏn trong phong thi nghim
4.4.1. Lõy mõu
- Dung cu lõy mõu: lo thuy tinh, binh tam giỏc hoc tui nilụng vụ trung
- Bnh phõm: Lõy vụ trung ph tang, hach mng treo rut, rut non mụi loai cho vo tng
lo riờng bit õy kin v a ngay vo phong xet nghim cng nhanh cng tt. Nu phong thi
nghim xa, bnh phõm phai c bao quan trong Iờu kin lanh t 2 0C n 80C v gi vờ
phong xet nghim chõm nhõt 48h sau khi lõy mõu.
4.4.2. Nuụi cõy, phõn lõp giỏm nh vi khuõn

3


10 TCN 729 – 2006
4.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập
Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường: Thạch máu, thạch MacConkey (nếu
không có thạch MacConkey thì có thể thay bằng thạch Brilliant green). Nuôi ở 370C trong

điều kiện hiếu khí 24 giờ.
4.4.2.2. Giám định đặc tính sinh hoá
Một số đặc tính sinh hoá đặc trưng của vi khuẩn E.coli
Vi khuẩn

Indol

MR

VP

Citrate

Lactose

E.coli

+

+

-

-

+

Dung
huyết
±

- Trên môi trường thạch MacConkey khuẩn lạc E.coli có màu hồng đậm, nhám, đường
kính 2-4 mm.
- Trên môi trường thạch Brilliant green khuẩn lạc E.coli màu vàng và môi trường trở nên
vàng chanh.
- Thạch máu: E. coli gây bệnh phù thường gây dung huyết thạch máu. Khuẩn lạc màu
trắng xám, tròn, bóng.
- Kiểm tra hình thái vi khuẩn trên kính hiển vi:
Lấy que cấy chấm vào khuẩn lạc nghi ngờ trên thạch máu, hòa vào gịot nước sinh lý trên
phiến kính hoặc lấy một vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn giàn mỏng trên phiến
kính, để khô, rồi cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.
Tiêu bản sau khi đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (Phụ lục 4). Xem tiêu
bản bằng vật kính dầu 100X.
Vi khuẩn bắt mầu đỏ (màu Gram âm), dạng trực khuẩn ngắn, cầu khuẩn hoặc hình bầu
dục, đứng rải rác, không thành chuỗi.
- Sau khi kiểm tra hình thái trên kính hiển vi, cấy khuẩn lạc vào môi trường thạch
McConkey.
- Chọn khuẩn lạc có mầu hồng đậm trên thạch McConkey cấy vào môi trường nước thịt
hay nước peptone để tiếp tục kiểm tra các đặc tính sinh hóa.
- Phản ứng IMViC
IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges-Proskauer (VP) và citrate)
Từ những khuẩn lạc có màu hồng đậm trên thạch MacConkey và gây dung huyết trên
thạch máu, tiến hành làm phản ứng IMViC.
Vi khuẩn E. coli có IMViC= +/ + / -/+ Sinh Indol: cấy khuẩn lạc vào môi trường nước peptone hay môi trường có chứa
tryptophan, nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ. Nhỏ 0,2 ml đến 0,3 ml thuốc thử Kovacs vào
môi trường đã nuôi cấy vi khuẩn, nếu trên bề mặt môi trường có vòng màu đỏ ở là phản ứng
dương tính.
+ VP: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 37 0C sau 24 giờ nhỏ
vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt thuốc thử VP (xem phần phụ lục), đọc kết quả sau 2 giờ
phút, nếu có màu đỏ hồng là dương tính, không biến màu hoặc màu vàng là âm tính.

+ MR: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào môi trường nước VP-MR, nuôi ở 37 0C sau 24 giờ nhỏ
vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 95 0 (xem phần phụ lục),
đọc kết quả sau 5 phút, nếu có màu đỏ là phản ứng dương tính, có màu vàng là âm tính.
+ Citrate: kiểm tra sự sử dụng citrate của vi khuẩn. Cấy khuẩn lạc vào thạch simon citrate
nuôi ở 370C từ 18 giờ đến 24 giờ. Vi khuẩn sử dụng citrate (dương tính) làm môi trường
chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Âm tính khi môi trường giữ nguyên
màu xanh lá cây.

4


10 TCN 729 – 2006
4.4.2.3. Kiểm tra khả năng sản sinh độc tố F18 và VT2e
Kiểm tra yếu tố bám dính F18 bằng phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) hay ngưng
kết nhanh trên phiến kính
- Kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với kháng nguyên F18
+ Để tìm yếu tố bám dính F18, nuôi cấy vi khuẩn E. coli trên môi trường Minca hoặc
+ Lấy khuẩn lạc, hoặc vi khuẩn trong các canh trùng nuôi cấy làm phản ứng ngưng kết
nhanh trên phiến kính với kháng nguyên F18 theo hướng dẫn của nhà sản xuất
- PCR để phát hiện gene f18 sản sinh yếu tố bám dính F18
4.4.2.4. Kiểm tra khả năng sản sinh độc tố Verotxin
- Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng
+ Tiêm 2 chuột nhắt trắng mỗi con 0,2 ml canh trùng nuôi cấy tĩnh (không lắc). Nếu có
độc lực chuột chết sau 24 giờ.
- Dùng phản ứng PCR phát hiện gene vt2e (yếu tố độc lực VT2e - Nếu có điều kiện)

5. Kết luận
Dựa trên đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và kết quả chẩn đoán trong
phòng thí nghiệm:
- Phân lập, giám định đặc tính sinh hoá

- Kiểm tra yếu tố độc lực F18 và VT2e
KT. BỘ TRƯỞNG
THỨ TRƯỞNG

Bùi Bá Bổng

5


10 TCN 729 – 2006

Phụ lục
Phụ lục 1: Nhuộm gram
1. Thuốc nhuộm
a. Dung dịch kết tinh tím
Kết tinh tím
2,5g
Nước cất
1000 ml
b. Dung dịch fuscin mẹ
Fucsin kiềm
1g
Cồn 960 C
10 ml
Axit phenic kết tinh
5g
Nước cất
100ml
Pha loãng dung dịch mẹ theo tỉ lệ 1/10 với nước cất khi nhuộm
c. Dung dịch lugol

Iodua kali
1g
Iodua tinh thể
0,5g
Nước cất
150 ml
d. Cồn axeton
Cồn nguyên chất
3 phần
Axeton
1 phần
2. Cách nhuộm
- Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: 1 phút đến 2 phút
- Rửa nước nhanh, vẩy khô nước
- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút
- Rửa nước nhanh, vẩy khô
- Nhỏ cồn Axeton
- Rửa nước thật nhanh
- Nhỏ dung dịch fucsin loãng: Để 1 phút

6


10 TCN 729 – 2006
- Rửa nước
- Thấm khô. Sấy khô
3. Xem kính bằng vật kính dầu
- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím
- Vi khuẩn gram âm bắt màu đỏ

Phụ lục 2: Thuốc thử Kovacs
a- Paradimetylaminobenzaldehyte
2,5 g
b- Amyl alcohol (cồn amyl)
37,5 ml
c- HCL đặc
12,5 ml
Cách pha: Hoà dung dịch a vào b cho tan hết và để trong tử lạnh âm 4 0C. Thêm 5ml đến
10 ml HCL từ từ hoà đều rồi để tủ lạnh cho lạnh lại tiếp tục đổ HCL cho đủ lượng.
* Thuốc thử không được để quá nóng trong lúc pha chế. Bảo quản trong lọ màu, lạnh.
Dương tính: Vòng thuốc thử có màu đỏ
Âm tính: Vòng thuốc thử có màu vàng

Phụ lục 3: Thuốc thử phản ứng VP
Chế thuốc thử
- Dung dịch 1:
- Dung dịch 1:

Alpha-naphthol

5g

Cồn 96

100 ml

NaOH

40g

Nước cất

100 ml

Tiến hành phản ứng: cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường VP – MR, nuôi cấy ở
370C từ 24 giờ đến 48 giờ, sau đó nhỏ vào môi trường nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch 1 và 2.
Sau 5 phút có màu đỏ hồng là phản ứng dương tính. Không biến màu hoặc màu vàng là phản
ứng âm tính.
Phụ lục 3: Thuốc thử phản ứng MR
Đỏ methyl

0,04g

7


10 TCN 729 – 2006
Cồn 95

60 ml

Nước cất

40 ml

8