PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN GIỐNG ĐẬU XANH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.14 MB, 87 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA NÔNG HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN GIỐNG ĐẬU XANH
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
NGÀNH
: BẢO VỆ THỰC VẬT
KHÓA
: 2007 – 2011
SINH VIÊN THỰC HIỆN : NGÔ THANH XUÂN
Tp. HỒ CHÍ MINH, tháng 07/2011
ii
PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN GIỐNG ĐẬU XANH
TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
Tác giả
NGÔ THANH XUÂN
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ thực vật
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN:
TS. Lê Đình Đôn
Tp. HỒ CHÍ MINH, tháng 07/2011
iii
LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn
Công ơn sinh thành, dưỡng dục của cha mẹ, sự động viên khích lệ của người
thân trong gia đình trong suốt thời gian qua.
Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Quý thầy cô khoa Nông Học đã tận tình dạy bảo những kiến thức quý báu trong
suốt quá trình học tập.
TS. Lê Đình Đôn, người đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Các bạn sinh viên lớp DH07BVA, DH07BVB, DH07SH và em Nguyễn Thị
Dược đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tp.Hồ Chí Minh, 7 tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Ngô Thanh Xuân
iv
TÓM TẮT
NGÔ THANH XUÂN, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Tháng
8/2011. PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CỐ
ĐỊNH ĐẠM TRÊN GIỐNG ĐẬU XANH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM.
Giáo viên hướng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Trong canh tác, việc sử dụng các chế phẩm sinh học sẽ góp phần quan trọng
trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Đề tài đã thực
hiện thành công việc xây dựng bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi
khuẩn cố định đạm trên đậu xanh đồng thời tiến hành tuyển chọn các chủng vi khuẩn
đã phân lập dựa trên mô hình đã thiết lập.
Nội dung nghiên cứu gồm 3 phần chính là: thứ nhất, phân lập ra các chủng vi
khuẩn cố định đạm trên đậu xanh. Thứ hai, xây dựng bioassay phục vụ cho việc chủng
các chủng vi khuẩn đó lên cây đậu xanh. Thứ ba, tiến hành chủng các chủng vi khuẩn
phân lập được trên giống đậu xanh APN – 208.
Công việc phân lập ta dựa vào sự phát triển của khuẩn lạc trên môi trường yeast
mannitol agar (YMA) cũng như trên hai môi trường chỉ thị là: môi trường YMA +
Congo Red và môi trường YMA + Bromthymol Blue ở nhiệt độ thường sau 36 giờ
phát triển. Sau đó ta tiếp tục chọn lọc thông qua việc nhuộm gram, quan sát hình dạng
vi khuẩn và một số thử nghiệm sinh hóa cơ bản.
Công việc thứ hai là xây dựng bioassay bằng cách trồng đậu xanh trên giấy ăn
thấm nước và được phủ bên ngoài bằng tấm giấy bìa cứng. Những tập giấy này được
dựng đứng bằng cách cố định vào những dây kẽm. Sau đó ta tiến hành thí nghiệm với
các mức khoảng cách trồng giữa các hạt đậu xanh khác nhau. Nhằm chọn ra được một
khoảng cách trồng phù hợp mà cây phát triển bình thường cũng như để khảo sát sự
phát triển của cây trên hệ thống bioassay này. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn
toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, với 4 nghiệm thức (NT) tương ứng với các khoảng cách
giữa các hạt khi gieo là: NT 1: 2 cm, NT 2: 3 cm, NT 3: 4 cm, NT 4: 5 cm.
Công việc thứ 3 được tiến hành trên giống đậu xanh APN – 208, thí nghiệm bố
trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, với 9 nghiệm thức tương ứng với các
v
chủng vi khuẩn gồm: NT1: CBTG 21; NT2: ALĐT 1; NT3: KSST 22; NT4: PTAG 1;
NT5: OMCT 1; NT 6: CTAG 11; NT 7: TCAG 22; NT 8: HNĐT 11; NT9: Đối chứng
không có vi khuẩn. Kết quả là ta đã chọn ra được 8 chủng vi khuẩn là HNĐT 11,
PTAG 1, ALĐT 1, TCAG 22, 0MCT 1, CTAG 11, KSST 22, CBTG 21 trong số 27
chủng đã phân lập và xác định được khoảng cách trồng đậu xanh trong hệ thống là 4
cm. Kết quả sau 27 ngày sau khi chủng trên đậu xanh thì 4 chủng OMCT 1, ALĐT 1,
KSST 22, TCAG 22 có sự phát triển cao nhất.
vi
MỤC LỤC
Trang
Trang tựa..........................................................................................................................ii
Lời cảm tạ ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt ............................................................................................................................ iv
Mục lục ........................................................................................................................... vi
Danh sách các hình và danh sách các bảng ..................................................................... x
Danh sách các phụ lục .................................................................................................... xi
Chương 1 Giới thiệu ...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2 Mục đích và mục tiêu của đề tài ...............................................................................2
1.3 Giới hạn của đề tài ....................................................................................................3
1.4 Ý nghĩa khoa học ......................................................................................................3
1.5 Ý nghĩa thực tiễn .......................................................................................................3
Chương 2 Tổng quan tài liệu ........................................................................................ 4
2.1 Vai trò của đạm (N) đối với thực vật ........................................................................4
2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh .......................................................................................4
2.3 Các nguồn cung cấp N trong đất và quá trình cố định N trên cây đậu xanh ............5
2.4 Vi khuẩn nốt sần và sự hình thành nốt sần ...............................................................7
2.5 Quá trình hình thành nốt sần ...................................................................................11
vii
2.6 Vi khuẩn chi Rhizobium ..........................................................................................13
2.6.1 Lịch sử phát triển ..................................................................................................13
2.6.2 Phân loại ...............................................................................................................13
2.6.3 Đặc điểm ...............................................................................................................14
Chương 3 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu ............................................... 15
3.1 Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................15
3.1.1 Thời gian nghiên cứu ............................................................................................15
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu .............................................................................................15
3.2 Vật liệu thí nghiệm..................................................................................................15
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................15
3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng ..................................................................15
3.2.2.1 Thiết bị và dụng cụ ...........................................................................................15
3.2.2.2 Hoá chất ............................................................................................................16
3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................17
3.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm ..............17
3.3.1.1 Sơ đồ thí nghiệm ..............................................................................................17
3.3.1.2 Quy trình kỹ thuật.............................................................................................18
3.3.1.3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi ..............................................................18
3.3.2 Thí nghiệm 2: Xây dựng bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi
khuẩn trên giống đậu xanh. ...........................................................................................19
3.3.2.1 Hệ thống dùng trong bioassay ..........................................................................19
viii
3.3.2.2 Mô tả thí nghiệm ..............................................................................................19
3.3.2.3 Bố trí thí nghiệm...............................................................................................20
3.3.2.4 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi ..............................................................20
3.3.2.5 Cách lấy mẫu ....................................................................................................20
3.3.2.6 Quy trình kỹ thuật.............................................................................................20
3.3.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm
trên giống đậu xanh APN 208. ......................................................................................21
3.3.3.1 Bố trí thí nghiệm...............................................................................................21
3.3.3.2 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi ..............................................................22
3.3.3.3 Cách lấy mẫu ....................................................................................................22
3.3.3.4 Quy trình kỹ thuật.............................................................................................22
3.4 Xử lý số liệu ............................................................................................................23
Chương 4 Kết quả và thảo luận ................................................................................. 24
4.1 Kết quả ....................................................................................................................24
4.1.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn cố định đạm ..............24
4.1.2 Thí nghiệm 2: Xây dựng bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi
khuẩn trên giống đậu xanh. ...........................................................................................30
4.1.3 Thí nghiệm 3: So sánh, đánh giá và tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm
trên giống đậu xanh APN 208. .....................................................................................37
4.2 Thảo luận.................................................................................................................40
Chương 5 Kết luận và đề nghị .................................................................................... 42
ix
5.1 Kết luận ...................................................................................................................42
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................42
Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 44
Phụ lục ........................................................................................................................... 47
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH, DANH SÁCH CÁC BẢNG
Danh sách các bảng
Bảng 4.1: Số chủng vi khuẩn phân lập được từ nốt sần và nguồn gốc mẫu.................. 24
Bảng 4.2: Mô tả đặc điểm và màu sắc khuẩn lạc của 27 chủng vi khuẩn ..................... 25
Bảng 4.3: Kết quả sau khi nuôi trên môi trường chỉ thị ................................................ 27
Bảng 4.4: Kết quả nhuộm gram và thử sinh hóa ........................................................... 29
Bảng 4.5: Chiều cao cây qua các ngày theo dõi ............................................................ 34
Bảng 4.6: Chiều dài rễ sau 6 ngày gieo ......................................................................... 35
Bảng 4.7: Chiều cao cây qua các lần điều tra ................................................................ 38
Danh sách các hình
Hình 3.1: Hệ thống trồng đậu xanh ............................................................................... 19
Hình 4.1: Hình dạng, màu sắc của một số khuẩn lạc sau 36 giờ ................................... 26
Hình 4.2: Khuần lạc trên môi trường Congo Red và Bromthymol Blue ...................... 28
Hình 4.3: Quá trình gieo hạt .......................................................................................... 30
Hình 4.4: Sự phát triển của cây vào thời điểm 3 ngày sau gieo .................................... 31
Hình 4.5: Sự phát triển của cây vào thời điểm 4 ngày sau gieo .................................... 32
Hình 4.6: Sự phát triển rễ của nghiệm thức 4 qua các lần điều tra ............................... 33
Hình 4.7: Sự phát triển của rễ 5 ngày sau gieo .............................................................. 36
Hình 4.8: Đồ thị về chiều cao cây qua các lần điều tra ................................................. 37
xi
DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Mẫu phân lập ................................................................................................ 47
Phụ lục 2. Môi trường phân lập ..................................................................................... 48
Phụ lục 3. Phương pháp nhuộm gram (Phương pháp Hucker cải tiến .......................... 49
Phụ lục 4. Phương pháp thử một số phản ừng sinh hóa ................................................ 49
Phụ lục 5. Số liệu qua các lần điều tra khi xây dựng mô hình bioassay ....................... 53
Phụ lục 6. Số liệu qua các lần điều tra khi chủng vi khuẩn trong thí nghiệm 3 ............ 63
1
Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Khi canh tác con người luôn tìm mọi cách để nhằm đưa năng suất cây trồng lên
cao nhất bằng nhiều biện pháp khác nhau như cải tiến giống, nâng cao các kỹ thuật
thâm canh, sử dụng phân bón… Trong những biện pháp đó, con người đã lạm dụng
quá mức vào phân bón hóa học, đặc biệt là phân đạm để tăng năng suất.
Vì thế, vấn đề đặt ra là cần phải nghiên cứu sản xuất ra một chế phẩm vi sinh
dùng để thay thế cho việc sử dụng phân đạm hóa học. Ngoài tác dụng nâng cao năng
xuất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản xuất, việc sử dụng
phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền
nông nghiệp bền vững.
Chúng ta đã biết những cây họ Đậu có một khả năng đặc biệt là sản xuất ra nitơ
cho chính bản thân nó thông qua mối quan hệ cộng sinh với một số vi sinh vật đất hay
là vi khuẩn nốt sần. Vi khuẩn này xâm nhập vào tế bào rễ thực vật và bắt đầu hàng loạt
các thay đổi phát triển phức tạp dẫn đến sự tạo thành nốt sần. Các vi khuẩn này được
cây nuôi sống và cố định hay là biến đổi khí nitơ tự do trong bầu khí quyển thành hợp
chất nitơ mà cây có thể sử dụng giúp cho cây sinh trưởng và phát triển.
Tuy nhiên, với số lượng vi khuẩn cố định đạm trong đất còn hạn chế chưa đáp
ứng đủ đối với nhu cầu của cây. Vì vậy, việc phân lập ra những dòng vi khuẩn cố định
đạm là cần thiết và phục vụ cho sự phát triển của nền nông nghiệp nước nhà.
2
Mặc khác, các chủng vi khuẩn khác nhau thì có khả năng cố định đạm khác
nhau và chuyên biệt đối với từng giống Đậu khác nhau. Vì vậy, để tuyển chọn ra được
các chủng vi khuẩn thích hợp thì công việc bước đầu không kém phần quan trọng là
phải xây dựng thành công bioassay (thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc chủng
invitro các chủng vi khuẩn đó trên cây đậu.
Trong các loại cây họ Đậu đó thì cây đậu xanh đóng một vai trò quan trọng
trong đời sống vừa là thức ăn trực tiếp của con người và động vật, cũng như một số
chức năng chữa bệnh hữu hiệu mà nó mang lại.
Xuất phát từ thực tế trên, tôi tiến hành đề tài: “PHÂN LẬP, ĐÁNH GIÁ VÀ
TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TRÊN GIỐNG ĐẬU
XANH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM”.
1.2 Mục đích và mục tiêu của đề tài
1.2.1 Mục đích của đề tài
Xây dựng thành công mô hình bioassay (thí nghiệm sinh học) phục vụ cho việc
chủng invitro các chủng vi khuẩn cố định đạm trên đậu xanh và tiến hành tuyển chọn
các chủng đã phân lập dựa vào mô hình đã thiết lập.
1.2.2 Mục tiêu của đề tài
-
Phân lập, tạo dòng thuần và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn cố định đạm từ
nốt sần của rễ cây đậu xanh.
-
Xây dựng bioassay phục vụ cho việc chủng invitro các chủng vi khuẩn trên đậu
xanh.
-
Đánh giá tuyển chọn các chủng vi khuẩn đã phân lập trên giống đậu xanh APN
– 208 nhờ vào mô hình bioassay.
3
1.3 Giới hạn của đề tài
Đề tài chỉ dừng lại ở việc phân lập, đánh giá và tuyển chọn các chủng vi khuẩn
thích hợp trên giống đậu xanh APN 208 trong phòng thí nghiệm.
Chưa định danh tới loài của các chủng vi khuẩn đã phân lập.
Không khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đó.
1.4
Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài đóng góp một vai trò quan trọng trong việc tuyển chọn ra các
chủng vi khuẩn cố định đạm chuyên biệt cho từng giống.
Xây dựng thành công bioassay không chỉ là nền tảng cho việc tuyển chọn các
chủng vi khuẩn đã phân lập một cách chính xác và thuận tiện mà còn là cơ sở cho các
nghiên cứu tiếp theo trong việc tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn cố định đạm trên
từng vùng khác nhau cũng như trên từng loại đất khác nhau.
1.5 Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài đã thực hiện những bước cơ bản phục vụ cho việc tuyển chọn các chủng
vi khuẩn cố định đạm trong phòng thí nghiệm, có thể ứng dụng trong nông nghiệp làm
chế phẩm vi sinh kích thích sinh trưởng của thực vật hoặc bổ sung vào các vùng đất
bạc màu để nâng cao nguồn đạm trong đất, cải tạo hệ sinh thái đất, góp phần vào việc
phát triển nông nghiệp bền vững.
4
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vai trò của đạm (N) đối với thực vật
Đạm có vai trò rất quan trọng đối với cây trồng, nhu cầu N của hầu hết các loại
cây trồng là rất cao. Trong sản xuất, phân N thường là yếu tố dinh dưỡng giới hạn
năng suất. Cây trồng hấp thụ N để hình thành các Amino acids, amides, amines, các
cấu trúc khung, các hợp chất trung gian như Proteins, chlorophyll, nucleic acids,
proteins/enzymes điều hòa các phản ứng sinh hóa, đây là những chất quan trọng bật
nhất trong việc xây dựng và điều tiết sự phát triển của thực vật.
Đạm là thành phần tổng hợp cấu trúc diệp lục tố. Nó cũng là thành phần của
DNA, RNA.
2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh
2.2.1 Khóa phân loại
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Phân họ: Faboideae
Tông: Phaseoleae
Phân tông: Phaseolinae
Chi: Vigna
Tên khoa học: Vigna radiate
Tên đồng nghĩa: Phaeolus aureus Roxb.
5
2.2.2 Đặc điểm
Đậu xanh hay đỗ xanh có kích thước hạt nhỏ (đường kính khoảng 2–2,5 mm).
Ở Việt Nam đậu xanh là loại đậu thường được sử dụng để làm xôi, làm các loại bánh
khọt, bánh đậu xanh, bánh ngọt, hoặc được ủ cho lên mầm để làm thức ăn (giá đỗ).
Đậu xanh thuộc loại cây thảo mọc đứng. Lá mọc kép 3 chia, có lông hai mặt.
Hoa màu vàng lục mọc ở kẽ lá. Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng số lượng nhiều, có
lông, trong chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng, có
mầm ở giữa.
Một đặc trưng nổi bật của cây đậu xanh: chúng là các loại cây chủ cho nhiều
loài vi khuẩn trên rễ của chúng. Các loại vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn
nốt rễ, có khả năng lấy khí nitơ (N2) trong không khí và chuyển hóa nó thành các dạng
chất mà cây có thể hấp thụ được (NO3- hay NH3). Hoạt động này được gọi là cố định
đạm. Cây đậu với vai trò là cây chủ, còn vi khuẩn nốt rễ với vai trò là nhà cung cấp
nitrat có ích, tạo ra một quan hệ cộng sinh.
2.3 Các nguồn cung cấp N trong đất và quá trình cố định N trên cây đậu xanh
2.3.1 Các nguồn cung cấp N trong đất
-
Quá trình khoáng hóa các chất hữu cơ: qua quá trình này các nguyên tố dinh
dưỡng nằm trong cấu trúc sinh hóa của các chất hữu cơ bị phân giải và chuyển sang
dạng hữu dụng mà cây trồng có thể hấp thụ được, thực hiện do hầu hết các vi sinh vật
đất như vi khuẩn, nấm dị dưỡng.
-
Cố định N sinh học. Gồm cố định sinh học do vi sinh vật cộng sinh và không
cộng sinh.
-
Cố định N trong khí quyển: Sấm sét và cố định công nghiệp.
-
Phân hóa học, phân hữu cơ, chất thải rắn sinh học.
6
2.3.2 Quá trình cố định N trên cây đậu xanh
2.3.2.1 Khái niệm chung về quá trình cố định đạm
Nitơ là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ đối với cây trồng, mà ngay
cả đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ nitơ trong tự nhiên rất lớn, chỉ tính riêng trong
không khí nitơ chiếm khoảng 78,16 % thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí
bao trùm lên một héc ta đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn nitơ, lượng nitơ này có thể
cung cấp cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng.
Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất chứa khoảng 10 – 25.109 tấn nitơ.
Trong các vật trầm tích chứa khoảng 4.105 tỷ tấn nitơ. Nhưng tất cả các nguồn nitơ
trên cây trồng không tự đồng hóa được mà phải nhờ vi sinh vật. Thông qua hoạt động
sống của các loài vi sinh vật, nitơ nằm trong các dạng khác nhau được chuyển hóa
thành dạng dễ tiêu cho cây trồng.
Trong đó, cố định đạm là tiến trình chuyển hóa nitrogen trong khí quyển thành
đạm amôn mà cây có thể hấp thụ dưới tác dụng của nhóm vi sinh vật có hoạt tính
Nitrogenaza.
Trên cây họ Đậu cũng như trên đậu xanh quá trình này được thực hiện nhờ vi
khuẩn thuộc chi Rhizobium, chúng sống trong nốt sần rễ cây họ đậu, có khả năng hút
và chuyển hóa nitơ tự nhiên trong không khí thành N cung cấp cho cây, sau khi cây
chết và bị phân giải, sẽ cung cấp và làm gia tăng lượng N trong đất.
Sự cố định N sinh học có thể xảy ra nhờ các vi khuẩn sống tự do thuộc các chi
như: Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, vi khuẩn lam sống tự do, vi khuẩn lam
cộng sinh trên bèo hoa dâu…nhưng chưa có ý nghĩa trong nông nghiệp. Trong khi đó
vi khuẩn nốt sần trong cây họ Đậu có thể cố định được từ 55 – 144 kg N/ha/vụ.
2.3.2.2 Cơ chế của quá trình cố định đạm
Trong một thời gian dài, cơ chế của quá trình cố định đạm là một bí ẩn đầy hấp
dẫn trong tự nhiên. Trong khi con người phải sử dụng những điều kiện kỹ thuật rất
7
cao, rất tốn kém (400 ÷ 5000C, 200 ÷ 1000 atm với những chất xúc tác rất đắt tiền) để
phá vở mối liên kết 3 của phân tử nitơ để có phân đạm hóa học, bằng cách tổng hợp từ:
NH3 + CO2
xúc tác
CO(NH2)2
Trong khi vi sinh vật với sự giúp đỡ của hoạt tính Nitrogenaza lại phá vở mối
liên kết 3 của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện rất bình thường về
nhiệt độ và áp suất.
Phản ứng khử N2 dưới sự xúc tác của nitrogenaza có thể biểu thị vắn tắt như
sau:
Nitrogenaza
N2 + 6e + 12ATP + H2O
2NH4+ + 12ADP + 12Pi + 4H+
Nitrogenaza được cấu tạo bởi hai phần:
• Fc – protein có trọng lượng phân tử khoảng 6.104.
• Mo – Fc – protein có trọng lượng phân tử khoảng 2,2.105.
2.4 Vi khuẩn nốt sần và sự hình thành nốt sần
2.4.1 Lịch sử phát triển
Năm 1866 hai nhà khoa học Đức là Henrighen và Vinphac (H.Hellriegel và
H.Wilfarth) lần đầu tiên dùng thực nghiệm để chứng minh được rằng cây đậu khác các
thực vật khác ở chỗ là có khả năng sử dụng nitơ trong không khí.
Hai năm sau (1888) nhà khoa học Hà Lan Bâyêrinh (M.W.Beijerinck) đã phân
lập được loại vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ Đậu (đậu
Hòa lan, đậu cove, đậu tằm, đậu lotus…). Ông đặt tên cho loại vi khuẩn này là
Bacillus radicicola. Năm 1889, Frank đề nghị xếp vi khuẩn này vào một chi riêng là
chi Rhizobium (B.Frank, 1889).
8
2.4.2 Đặc điểm
Căn cứ vào tài liệu hiện có thì vi khuẩn nốt sần là loại vi khuẩn gram âm, khi
còn non có tế bào hình que, kích thước vào khoảng 0,5 – 1,2 x 2,0 – thái lỏng. Ngược lại trong điều kiên nhiệt độ <
200C, gelatin sẽ ở trang thái rắn.
-
Phương pháp: môi trường sử dụng là môi trường canh dinh dưỡng có chứa
gelatin. Dùng que cấy thẳng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của các chủng thuần vào
trong ống nghiệm có chứa 8 – 10 ml môi trường theo cách cấy thẳng từ trên xuống, ủ
ở 370C trong 2 – 5 ngày. Thực hiện ủ song song một ống môi trường đối chứng
không chứa vi sinh vật. Đưa ống nghiệm xuống nhiệt độ - 200C trong 15 – 20 phút,
quan sát trạng thái vật lý.
-
Kết quả: thử nghiệm là (+) khi môi trường ở trạng thái lỏng và ngược lại (-) khi
môi trường ở trạng thái rắn.
4.8 Thử khả năng di động
-
Nguyên tắc: vi sinh vật di động nhờ cấu trúc protein gọi là tiên mao. Khà năng
này có thể quan sát được dựa vào sự tăng trưởng và di động của vi sinh vật trong môi
trường thạch mềm.
-
Phương pháp: sử dụng môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar. Dùng que cấy
thẳng cấy sinh khối từ khuẩn lạc của các chủng thuần vào ống nghiệm chứa môi
trường bằng phương pháp đâm sâu vào giữa ống môi trường khoảng 1/3 chiều cao
môi trường,đánh dấu, ủ ở 370C trong 24 giờ, quan sát.
53
-
Kết quả: thử nghiệm là (+) khi vi sinh vật phát triển lan ra vị trí vết cấy và ngược
lại là (-) khi không thấy sự di chuyển.
Phụ lục 5 Số liệu qua các lần điều tra khi xây dựng mô hình bioassy
5.1 Chiều cao trụ hạ diệp 2 ngày sau gieo
a) Bảng số liệu thô
Nghiệm thức
(NT)
Chiều cao trụ hạ diệp
REP 1
REP 2
REP 3
REP 4
1 (2cm)
5,33
5,33
4,87
5,13
2 (3cm)
4,27
4,20
4,10
4,47
3 (4cm)
3,37
3,50
3,63
3,90
4 (5cm)
3,03
3,10
2,90
2,80
54
b) Bảng kết quả xử lý thống kê
Data file: CC2NSG
Function: ANOVA-1
Data case no. 1 to 16
One way ANOVA grouped over variable 1 (NT) with values from 1 to 4.
Variable 2 (CC)
ANALYSIS OF VARIANCE TABLE
Degrees of Sum of
Freedom
Mean
Squares
Square
F-value Prob.
--------------------------------------------------------------------------Between
Within
3
10.642
3.547
12
0.388
0.032
109.852
0.0000
--------------------------------------------------------------------------Total
15
11.029
Coefficient of Variation = 4.50%
Var.
V A R I A B L E No. 2
1
Number
Sum
Average
SD
SE
-----------------------------------------------------------------1
4.00
20.600
5.150
0.19
0.09
2
4.00
17.100
4.275
0.17
0.09
3
4.00
14.400
3.600
0.22
0.09
4
4.00
11.800
2.950
0.13
0.09
-----------------------------------------------------------------Total
16.00
Within
63.900
3.994
0.86
0.21
0.18
Bartlett's test
--------------Chi-square = 0.706
Number of Degrees of Freedom = 3
Approximate significance = 0.938
55
c) Bảng kết quả trắc nghiệm phân hạng
Data File : Keyboard
Function : RANGE
Error Mean Square = 0.03200
Error Degrees of Freedom = 12
No. of observations to calculate a mean = 4
Duncan's Multiple Range Test
LSD value = 0.3864
s_ = 0.08944 at alpha = 0.010
Original Order
Ranked Order
Mean 1 = 5.150 A
Mean 1 = 5.150 A
Mean 2 = 4.280 B
Mean 2 = 4.280 B
Mean 3 = 3.600 C
Mean 3 = 3.600 C
Mean 4 = 2.950
Mean 4 = 2.950
D
D
5.2 Chiều cao trụ hạ diệp 3 ngày sau gieo
a) Bảng số liệu thô
Nghiệm thức
(NT)
Chiều cao trụ hạ diệp
REP 1
REP 2
REP 3
REP 4
1 (2cm)
6,57
6,83
6,73
6,87
2 (3cm)
6,17
5,93
5,80
6,13
3 (4cm)
5,63
4,87
4,90
5,57
4 (5cm)
4,27
3,93
3,77
4,00
56
b) Bảng kết quả xử lý thống kê
Data file: CC3NSG
Function: ANOVA-1
Data case no. 1 to 16
One way ANOVA grouped over variable 1 (NT) with values from 1 to 4.
Variable 2 (CC)
ANALYSIS OF VARIANCE TABLE
Degrees of Sum of
Mean
Freedom
Square
Squares
F-value
Prob.
--------------------------------------------------------------------------Between
Within
3
16.500
5.500
12
0.780
0.065
84.615
0.0000
--------------------------------------------------------------------------Total
15
17.280
Coefficient of Variation = 4.64%
Var.
V A R I A B L E No. 2
1
Number
Sum
Average
SD
SE
-----------------------------------------------------------------1
4.00
27.000
6.750
0.13
0.13
2
4.00
24.000
6.000
0.18
0.13
3
4.00
21.000
5.250
0.40
0.13
4
4.00
16.000
4.000
0.22
0.13
-----------------------------------------------------------------Total 16.00
Within
88.000
5.500
1.07
0.27
0.25
Bartlett's test
--------------Chi-square = 3.790
Number of Degrees of Freedom = 3
Approximate significance = 0.196
57
c) Bảng kết quả trắc nghiệm phân hạng
Data File : Keyboard
Function : RANGE
Error Mean Square = 0.05600
Error Degrees of Freedom = 12
No. of observations to calculate a mean = 4
Duncan's Multiple Range Test
LSD value = 0.5111
s_ = 0.1183
at alpha = 0.010
Original Order
Ranked Order
Mean 1 = 6.750 A
Mean 1 = 6.750 A
Mean 2 = 6.000 B
Mean 2 = 6.000 B
Mean 3 = 5.250 C
Mean 3 = 5.250 C
Mean 4 = 4.000
Mean 4 = 4.000
D
D
5.3 Chiều cao trụ hạ diệp 4 ngày sau gieo
a) Bảng số liệu thô
Nghiệm thức
(NT)
Chiều cao trụ hạ diệp
REP 1
REP 2
REP 3
REP 4
1 (2cm)
6,93
7,17
7,1
7,33
2 (3cm)
6,37
6,33
6,17
6,5
3 (4cm)
5,93
5,37
5,47
5,8
4 (5cm)
4,73
4,37
4,43
4,47
58
b) Bảng kết quả xử lý thống kê
Data file: CC4NSG
Function: ANOVA-1
Data case no. 1 to 16
One way ANOVA grouped over variable 1 (NT) with values from 1 to 4.
Variable 2 (CC)
ANALYSIS OF VARIANCE TABLE
Degrees of Sum of
Freedom
Mean
Squares
Square
F-value
Prob.
--------------------------------------------------------------------------Between
3
14.902
4.967
Within
12
0.367
0.031
162.197
0.0000
--------------------------------------------------------------------------Total
15
15.269
Coefficient of Variation = 2.96%
Var.
V A R I A B L E No. 2
1
Number
Sum
Average
SD
SE
-----------------------------------------------------------------1
4.00
28.500
7.125
0.17
0.09
2
4.00
25.400
6.350
0.13
0.09
3
4.00
22.600
5.650
0.24
0.09
4
4.00
18.000
4.500
0.14
0.09
-----------------------------------------------------------------Total
16.00
Within
94.500
5.906
1.01
0.25
0.17
Bartlett's test
--------------Chi-square = 1.233
Number of Degrees of Freedom = 3
Approximate significance = 0.837
