XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ KỸ THUẬT REALTIME PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN HELICOBACTER PYLORI GÂY VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ KỸ THUẬT
REALTIME PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN HELICOBACTER
PYLORI GÂY VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG

Ngành học :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: ĐẶNG VĂN PHÁT
Niên khóa :

2007 - 2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ KỸ THUẬT
REALTIME PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN HELICOBACTER
PYLORI GÂY VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

ĐẶNG VĂN PHÁT

Tháng 7/2011
2


LỜI CẢM ƠN
Con xin biết ơn cha mẹ đã nuôi nấng, dạy dỗ, động viên và tạo mọi điều kiện
trong suốt thời gian con học tập.
Em xin cảm ơn các thầy cô của trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh – Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những
kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinh nghiệm quý báu
trong những năm học tại trường.
Con xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ, bác sĩ Phạm Hùng Vân đã nhiệt tình hướng
dẫn và truyền đạt kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Em xin cám ơn chị Ngọc, chị Trang, cùng các anh chị phòng R&D, phòng QC,
phòng vi sinh đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin cám ơn các bạn lớp DH07SH đã luôn chia sẻ, động viên tôi
trong suốt thời gian học tập.
Đặng Văn Phát

iii

TÓM TẮT
Viêm loét dạ dày tá tràng là một trong những bệnh phổ biến nhất trong cộng đồng
dân cư nước ta, và cũng là bệnh thường gặp nhất trong các lọai bệnh đường tiêu hóa.
Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi nhưng người lớn chiêm tỷ lệ cao hơn trẻ em. Theo tổ chức y tế
thế giới (WHO) thì vi khuẩn H. pylori thuộc nhóm I trong những tác nhân gây bệnh.
Người ta ước tính có hơn 50% dân số đã bị nhiễm H. pylori, chủ yếu ở các nước đang
phát triển với tần số nhiễm rất cao từ 50 - 90%. Việt Nam cũng là nước có tỷ lệ nhiễm
H. pylori cao vào khoảng hơn 70% ở người lớn. Việc điều trị tiệt trừ H. pylori giúp chữa
lành bệnh và giảm tỷ lệ tái phát. Vì vậy việc phát hiện sớm sự hiện diện của H. pylori để
điều trị tiệt trừ và đúng cách là điều cần thiết. Do vậy chúng tôi đã: “Xây dựng quy trình
và đánh giá kỹ thuật Realtime PCR trong việc phát hiện vi khuẩn Helicobacter pylori
gây bệnh viêm loét dạ dày tá tràng” nhằm phát hiện vi khuẩn sớm hơn chính xác hơn.
Chúng tôi đã sử dụng bộ kit, chứng chuẩn, các mẫu bệnh phẩm để xây dựng quy
trình. Kết quả cho thấy quy trình có độ nhạy cao. Đánh giá kết quả phát hiện của mix
Realtime PCR bằng cách so sánh với kết quả PCR cũng cho kết quả tương đồng cao.
Áp dụng quy trình trên 15 mẫu sinh thiết mô dạ dày, kết quả cho thấy có 12 mẫu
dương tính. Vì vậy bộ mix Realtime PCR dùng phát hiện H. pylori là hoàn toàn có thể
ứng dụng được.

iv


SUMMARY
Gastroduodenal ulcer is one of the most popular disease in our country , and it’s
also the most common type in gastroenteritis. This disease occurs in all ages, however
the proportion of adults who get sick is higher than children. According to the world
health organization WHO, the Helicobacter pylori bacteria is mean reason for this
disease. It is estimated that over 50% of the population has been infected with H.
pylori, mainly in developing countries with high infection frequencies from 50 - 90%.

Among them, Vietnam is also a country with high H. pylori infection rate which is
more than 70% adults get this bacteria. The treatment eliminate H. pylori can help heal
and reduce recurrence rates. So early detection of the presence of H. pylori for the
treatment and eradication of properly is essential. Thus, we have constructed the
process and evaluation the Realtime PCR technique for earlier and more accurately
detecting Helicobacter pylori bacteria that causes stomach ulcer duodenum.
We have used the kit, certified standard samples to build process. The results
showed that highly sensitive prosess. Comparision between the qualitative PCR result
and the quantitative Realtime PCR result showed the highly similinity. Applying the
above process on the 15 gastric biopsy samples, the results showed 12 positive
samples. So the Realtime PCR mix for detection H. pylori is fully applicable.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn

iii

Tóm tắt

iv

Summary

v

Mục lục

vi

Danh sách chữ viết tắt

ix

Danh sách các bảng

x

Danh sách các hình

x

Chương 1 MỞ ĐẦU

1

1.1. Đặt vần đề

1

1.2. Yêu cầu

2

1.3. Nội dung thực hiện

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1. Dạ dày - tá tràng

3

2.1.1. Dạ dày, tá tràng là gì

3

2.1.2. Những bệnh lí thường gặp ở dạ dày

4

2.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố gây ra bệnh loét dạ dày - tá tràng

5

2.1.4. Triệu chứng của bệnh loét dạ dày - tá tràng

6

2.1.5. Các biến chứng của bệnh loét dạ dày - tá tràng

7

2.2. Vi khuẩn Helicobacter pylori

7

2.2.1. Lịch sử

7

2.2.2. Đặc điểm chung

7

2.2.3. Đặc điểm về tuýp di truyền

9

2.2.4. Dịch tể học

10

2.2.5. Thành phần - cấu tạo

11

2.2.5.1. Tính di động

11

2.2.5.2. Men urease

11

2.2.5.3. Yếu tố chống tăng sinh

12

2.2.5.4. Sự kết dính hồng cầu

12
vi


2.2.5.5. Các adhesion giúp thu giữ sắt

12

2.2.5.6. Phospholipase và protease

12

2.2.5.7. VacA (vacuolating cytoxin VacA) Độc tố không bào

12

2.2.5.8. CagA gen (cytotoxine associated gen A)

12

2.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm Helicobacter pylori

14

2.3.1. Các thử nghiệm không xâm hại (noninvasive test)

14

2.3.1.1. Nghiệm pháp thở 13C và 14C (UREA BREATH TEST = UBT)

14

2.3.1.2. Chẩn đoán huyết thanh

14

2.3.1.3. Test huyết thanh phát hiện kháng thể kháng CagA

15

2.3.1.4. Tìm kháng thể kháng H. pylori trong nước tiểu

15

2.3.1.5. Immunoblot

15

2.3.1.6. Phát hiện kháng nguyên trong phân – HpSA

15

2.3.2. Các thử nghiệm ít xâm hại qua nội soi dạ dày tá tràng (invasive test)

15

2.3.2.1. Thử nghiệm urease

15

2.3.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn

16

2.3.2.3. Chẩn đoán mô bệnh học

16

2.3.2.4. Phản ứng chuỗi Polymerase - PCR

16

2.4. Kĩ thuật Realtime PCR

17

2.4.1. Realtime PCR là gì

17

2.4.2. Các vấn đề kĩ thuật cơ bản

17

2.4.2.1. Biểu đồ khuếch đại

17

2.4.2.2. Những tiêu chuẩn của một phản ứng PCR định lượng tối ưu

18

2.4.3. Các thành phần của phản ứng Realtime PCR

19

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

20

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

20

3.2. Vật liệu nghiên cứu

20

3.2.1. Mẫu

20

3.2.2. Hóa chất

20

3.2.2.1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA

20

3.2.2.2. Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

20

3.2.2.3. Hóa chất cho phản ứng Realtime PCR

21

3.2.3. Dụng cụ thiết bị

22
vii


3.3. Phương pháp nghiên cứu

22

3.3.1. Phương pháp xác định và đánh giá độ nhạy của kỹ thuật Realtime PCR 22
3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA

23

3.3.3. So sánh kĩ thuật Realtime PCR với PCR trong việc phát hiện H. pylori

23

3.3.3.1. Phương pháp phát hiện H. pylori bằng kĩ thuật Realtime PCR

24

3.3.3.2. Phương pháp phát hiện H. pylori bằng kĩ thuật PCR

25

3.3.3.3. So sánh kết quả thu được của 2 phương pháp

27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

28

4.1. Kết quả khảo sát độ nhạy của qui trình

28

4.2. Kết quả của phản ứng Realtime PCR chạy trên mẫu bệnh phẩm

29

4.3. Kết quả chạy phản ứng PCR trên các mẫu bệnh phẩm

30

4.4. Đánh giá kết quả thu được ở cả 2 phương pháp

31

4.5. Thảo luận

32

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ

34

5.1. Kết luận

34

5.2. Đề nghị

34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

35

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

Bp

: base - pair

DD

: Dạ dày

DNA

: Desoxyribonucleic acid

dNTP

: deoxynucleotide triphosphate

EDTA

: Etylen Diamino Tetra Acetic

kDa

: kilo Dalton

Kp

: kilo base - pair

H. pylori

: Helicobacter pylori

PCR

: Polymerase Chain Reaction

TBE

: Tris – borate EDTA

TE

: Tris – EDTA

TT

: Tá tràng

TQ

: taqman
: Hemo β-globulin

HBG

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 3.1 Thành phần của Realtime PCR mix để phát hiện H. pylori

21

Bảng 3.2 Thành phần của HBG TQ mix, nhằm khuếch đại gen β-globulin

22

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ nhạy chứng chuẩn

28

Bảng 4.2 Kết quả phản ứng Realtime PCR trên mẫu thực nghiệm

30

Bảng 4.3 Kết quả so sánh giữa Realtime PCR và PCR

32

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1 Sơ đồ phân bố của vi khuẩn H .pylori trên thế giới

1

Hình 2.1 Cấu tạo dạ dày

3

Hình 2.2 Hình ảnh ổ loét bên trong dạ dày

4

Hình 2.3 Hiện tượng trào ngược axit dạ dày, thực quản

5

Hình 2.4 Hiện tượng ung thư dạ dày giai đoạn đầu phát hiện nhờ nội soi

5

Hình 2.5 Vi khuẩn Helicobacter pylori dạng xoắn

8

Hình 2.6 Vi khuẩn Helicobacter pylori dạng hình cầu

9

Hình 2.7 Tiểu đảo sinh bệnh cagPAI

10

Hình 2.8 Thành phần cấu tạo của vi khuẩn H. pylori

11

Hình 2.9 Sơ đồ cơ chế gây tổn thương dạ dày của vi khuẩn

13

Hình 2.10 Cơ chế phát hiện H. pylori bằng CLO test

16

Hình 2.11 Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại

18

Sơ đồ 3.1 Các bước thực hiện so sánh kĩ thuật Realtime PCR và PCR

24

Hình 4.1 Kết quả khảo sát độ nhạy của chứng chuẩn

28

Hình 4.2 Biểu đồ chuẩn của mẫu chuẩn và dãy pha loãng

29

Hình 4.3 Hình điện di các mẫu DNA genome của bệnh nhân

31

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Viêm loét dạ dày - tá tràng là một trong những bệnh gặp khá phổ biến trong
cộng đồng dân cư nước ta. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi nhưng tỷ lệ người lớn bị nhiễm
cao hơn trẻ em. Năm 1983, hai nhà khoa học người Australia (Warren và Marshall)
thành công trong việc nuôi cấy, phân lập để xác định được loại vi khuẩn gây viêm loét
dạ dày - tá tràng và công bố cho toàn thế giới. Đó là loại vi khuẩn được đặt tên là
Helicobacter pylori (viết tắt là H. pylori). Tổ chức Y tế thế giới đã công nhận và xếp
H. pylori là tác nhân quan trọng hàng đầu, hay là nhóm 1 các tác nhân gây ung thư dạ
dày. Nguy cơ mắc viêm loét dạ dày - tá tràng ở người nhiễm H. pylori tăng gấp 3 – 10
lần so với người không nhiễm. Khoảng 10 – 25% người nhiễm H. pylori sẽ xuất hiện
viêm loét dạ dày - tá tràng. Y văn nước ngoài cho thấy 70 – 95% loét tá tràng và 30 –
70% loét dạ dày có liên quan đến H. pylori. Việt Nam là nước có tỉ lệ nhiễm H. pylori
cao. Các nghiên cứu trong nước có tỷ lệ tương ứng khoảng 80% và 60%. Việc điều trị
tiệt trừ H. pylori giúp chữa lành bệnh và giảm tỷ lệ tái phát. Vì vậy việc xây dựng
thành công quy trình Realtime - PCR để phát hiện Helicobacter pylori là rất cần thiết,
giúp cho việc chuẩn đoán sớm và điều trị thành công bệnh viêm loét dạ dày - tá tràng.

Hình 1.1 Sơ đồ phân bố của vi khuẩn H. pylori trên thế giới.
1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Xây dựng và tối ưu hóa quy trình Realtime PCR để phát hiện vi khuẩn Helicobacter
pylori
Chạy thử nghiệm trên các mẫu mô dạ dày nhằm phát hiện sự hiện diện của vi
khuẩn.

So sánh hiệu quả phát hiện giữa kỹ thuật Realtime PCR và kỹ thuật PCR
1.3. Nội dung thực hiện
Nội dung 1: Kiểm tra độ nhạy của quy trình trên mẫu chứng chuẩn, thực hiện pha
loãng mẫu chuẩn để kiểm tra độ nhạy của quy trình.
Nội dung 2: Ly trích các mẫu của bệnh nhân, thực hiện chạy phản ứng Realtime
PCR theo quy trình.
Nội dung 3: Từ các dịch DNA genome của bệnh nhân thực hiện phản ứng PCR
để so sánh kết quả giữa 2 phản ứng PCR và Realtime PCR.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Dạ dày - tá tràng (DD - TT)
2.1.1. Dạ dày, tá tràng là gì
Dạ dày là một tạng rỗng nằm ở vùng giữa bụng trên rốn, từ chuyên môn gọi là
vùng thượng vị. Chức năng chính của dạ dày là tích trữ thức ăn, nghiền trộn thức ăn và
tiết vào đó một số dịch tiêu hóa rồi đưa thức ăn xuống ruột non, để biến đổi thành các
chất dinh dưỡng và được hấp thu vào máu đi nuôi cơ thể.
Tá tràng là đoạn đầu của ruột non nhận thức ăn từ dạ dày đi xuống. Có dạng
cong chữ U (ở người, dài khoảng 30 cm), qua các ống dẫn nhận dịch tiêu hoá tiết ra từ
gan, mật và tụy.

Hình 2.1 Cấu tạo dạ dày
( />3


2.1.2. Những bệnh lí thường gặp ở dạ dày
Thông thường chúng ta hay gặp những bệnh lý sau đây của DD:
•

Viêm DD là những tổn thương ở niêm mạc DD do viêm. H. pylori giữ vai trò

trong 90% viêm dạ dày mạn tính
•

Loét DD: có sự hiện diện của tổn thương loét trên niêm mạc DD thường là

do sự mất cân bằng giữa yếu tố bảo vệ và phá hủy ở DD, vai trò của H. pylori được
xác định trong 70% trường hợp. Người bị nhiễm H. pylori có nguy cơ tiến triển đến
loét tăng gấp 10 lần so với người không nhiễm
•

Trào ngược DD thực quản: là hiện tượng trào ngược những chất dịch từ DD

lên thực quản, có khi lên tận miệng người bệnh, hậu quả gây viêm loét thực quản thậm
chí có thể gây hẹp lòng thực quản.
•

Ung thư DD là nguyên nhân gây chết bởi ung thư đứng hàng thứ 2 trên thế

giới. H. pylori được xem như yếu tố làm tăng nguy cơ ung thư gấp 3 - 6 lần. Theo các
nghiên cứu gần đây H. pylori có vai trò trong sự phát triển bệnh thành u ác tính MALT
(mucosa associated lymphoid tissue).

Hình 2.2 Hình ảnh ổ loét bên trong dạ dày
( />mglink=uploads/News/pic/1163732126.nv.jpg)
4

Hình 2.3 Hiện tượng trào ngược axit dạ dày, thực quản
( />
Hình 2.4 Hiện tượng ung thư dạ dày giai đoạn đầu phát hiện nhờ nội soi
( />2.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố gây ra bệnh loét DD – TT
Quan niệm về sự sinh bệnh loét được hình thành từ những năm đầu của thế kỷ
20. Đó là do sự mất quân bình giữa 2 lực đối kháng tác động lên niêm mạc DD – TT:
(1) Lực tấn công làm phá hủy niêm mạc DD - TT mà tiêu biểu là HCl và pepsin
của dịch dạ dày.
(2) Lực bảo vệ đảm bảo sự nguyên vẹn của thành DD - TT do hàng rào nhày và
lớp tế bào niêm mạc DD - TT.

5


Theo quan niệm này, bất cứ một tác nhân nào làm gia tăng lực tấn công hoặc làm
giảm lực bảo vệ đều có thể gây bệnh loét DD - TT. Các tác nhân bao gồm các yếu tố
sau:
Giảm Lực Bảo Vệ

Tăng Lực Tấn Công

- Giảm tưới máu

- Vi khuẩn H. pylori

- Thuốc lá

- Các stress

- Bệnh gan mạn tính

- Thuốc AINS, Steroids …

- Hàng rào nhày, lớp tế bào niêm mạc

- Rượu

Trong số các tác nhân gây bệnh nêu trên, H. pylori là nguyên nhân quan trọng
nhất. Các thuốc AINS, Steroides có thể gây loét ở người phải điều trị dài ngày với các
thuốc này. Các stress về tâm lý thần kinh cũng có thể gây bệnh loét. Thuốc lá làm tăng
nguy cơ bị loét, tăng tỷ lệ tái phát và biến chứng của bệnh loét. Rượu cũng tăng tỷ lệ
tái phát loét.
2.1.4. Triệu chứng của bệnh loét DD - TT
Trong đa số bệnh lý lành tính ở dạ dày, tổng trạng toàn thân ít bị ảnh hưởng,
thông thường có thể có các triệu chứng sau đây:
+ Mệt mỏi, uể oải, khả năng làm việc kém, khả năng tập trung kém
+ Tính tình hay cáu gắt
+ Nhức đầu, chóng mặt, hoa mắt, ù tai
+ Ăn không ngon
+ Ợ hơi, ợ chua.
Đặc biệt trong bệnh lý ác tính ở dạ dày, giai đoạn đầu có thể không có triệu
chứng gì rõ ràng nhưng về sau làm cho người bệnh suy sụp nhanh chóng, giảm cân
nhanh, thiếu máu nặng.
 Triệu chứng tại ổ bụng: thường bệnh nhân có những triệu chứng sau đây:
+ Đau bụng: thường đau vùng giữa bụng trên rốn (vùng thượng vị), đau có thể
xuất hiện lúc đói, lúc no, hoặc không liên quan gì tới bữa ăn, đau âm ĩ hoặc đau xuất
hiện thành từng cơn.
+ Buồn nôn, nôn
+ Cảm giác đầy bụng, khó tiêu, sôi bụng, nóng rát vùng thượng vị…
6

+ Rối loạn tiêu hóa: táo bón hoặc tiêu chảy.
2.1.5. Các biến chứng của bệnh loét DD - TT
•

Xuất huyết tiêu hóa (chảy máu đường tiêu hóa): xuất huyết hay chảy máu

thường rầm rộ với ói ra máu, có hoặc không có đi tiêu phân đen. Bệnh nhân cần được
nhập viện ngay để điều trị cấp cứu.
•

Thủng DD - TT: xuất hiện cơn đau bụng đột ngột, dữ dội vùng thượng vị như

dao đâm, thường có nôn ói và bụng cứng như gỗ. Biến chứng này phải được mổ cấp
cứu, nếu không bệnh nhân sẽ tử vong.
•

Hẹp môn vị: lúc đầu ăn chậm tiêu, đầy bụng, nặng bụng, ợ nước chua, nhất là

về buổi chiều; tiếp theo bệnh nhân bị nôn ói sau ăn ngày càng nhiều hơn. Người bệnh
thường gầy sút do bị nôn ói. Biến chứng này phải điều trị bằng phẫu thuật.
•

Hóa ung thư: ngày nay người ta thấy có chứng cứ nhiễm H. pylori gây viêm

loét dạ dày lâu dài có thể dẫn đến ung thư dạ dày.
2.2. Vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori)
2.2.1. Lịch sử
Từ hơn 100 năm trước đây, Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận có sự hiện diện

của một loại vi khuẩn ở dạ dày chó. Tiếp theo, nhiều nhà khoa học cũng tìm thấy một
loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày nhưng lại thất bại trong việc nuôi
cấy vi khuẩn. Năm 1970, nhà giải phẩu bệnh Robin Warren nhận xét có mối liên hệ
giữa viêm dạ dày mãn tính và một loại xoắn khuẩn trong niêm mạc dạ dày. Mãi đến
năm 1982, Robin Warren và người học trò của mình là Barry Marshall đã thành công
nuôi cấy vi khuẩn từ 11 bệnh nhân viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh được
những ảnh hưởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày. Họ đặt tên vi khuẩn là
Campylobacter pylori do dựa theo hình dạng và đặc tính tăng trưởng. Năm 1983, sự
phát hiện vi khuẩn Campylobacter pylori và mối liên quan của nó với bệnh loét dạ dày
tá tràng được công bố trên tạp chí Lancet. Và năm 2005, với phát hiện này, hai ông đã
được trao tặng giải thưởng Nobel về Y học.
2.2.2. Đặc điểm chung
Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trưởng, người ta đặt tên vi khuẩn là
Campylobacter pyloridis, sau đó đổi thành Campylobacter pylori. Tuy nhiên dưới kính
hiển vi điện tử, vi khuẩn không giống Campylobacter vì có cấu trúc tiên mao khác
7


hẳn. Ngoài ra còn có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hóa và cấu trúc chuỗi
RNA do ribosom thể 16S, do đó hiện nay vi khuẩn được đặt tên là Helicobacter pylori.
Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (phylum):

Proteobacteria

Lớp (class):

Epsilon Proteobacteria

Bộ (ordo):

Campylobacterales

Họ (familia):

Helicobacteraceae

Chi (genus):

Helicobacter

Loài (species):

H. pylori

H. pylori là xoắn khuẩn Gram âm, có dạng chữ S, kích thước ngắn từ 0,2 – 0,5 µm,
có nhiều tiên mao, di động, có các men như men urease, oxidase, catalase, mucolytic,
protease, lipase…
Vi khuẩn này có thể nuôi cấy được trên thạch chocolate hoặc thạch máu cừu
trong môi trường vi ái khí (5 - 10% O 2 ), không mọc trong điều kiện ái khí hoặc kị khí
tiêu chuẩn.
Khi thay đổi điều kiện sống: O 2 , pH, nhiệt độ…thì vi khuẩn sẽ chuyển từ dạng
xoắn sang dạng hình cầu với nhiều kích thước khác nhau. Với thể hình cầu H. pylori
có thể tồn tại lâu hơn trong các môi trường không thuận lợi.
H. pylori sống ở phần sâu của lớp nhầy bao phủ niêm mạc dạ dày, giữa lớp
nhầy với bề mặt của lớp tế bào biểu mô và ở các nối giữa các tế bào này. Tuy nhiên vi
khuẩn này cũng được tìm thấy ở thực quản và tá tràng khi có chuyển sản niêm mạc dạ

dày.

Hình 2.5 Vi khuẩn Helicobacter pylori dạng xoắn
( />8


Hình 2.6 Vi khuẩn Helicobacter pylori dạng hình cầu
( />2.2.3. Đặc điểm về tuýp di truyền
Hiện nay, cấu tạo gen toàn bộ của 2 chủng H. pylori được biết là: H. pylori 26695
được phân lập ở Anh vào năm 1987 và chủng H. pylori J99 được phân lập ở Mỹ vào
năm 1994. Trình tự bộ gen của Helicobacter đã được xác định từ năm 1997, Cấu trúc
bộ gen bao gồm một cấu trúc nhiễm sắc thể vòng từ 1,64 đến 1,67 Mb. Mỗi gen mã
hoá cho một loại protein nhất định. Khác nhau chủ yếu về bộ gen cả 2 chủng này là do
ở số lượng và bản chất của đoạn chèn cũng như sự hiện diện hay không của gen mã
hóa các men hạn chế. Trong số những gen này, 55% cũng được tìm thấy ở các vi
khuẩn khác, còn 45% chỉ có ở H. pylori. Những đột biến của nucleotide làm tăng sự
khác biệt giữa các chủng vi khuẩn và ảnh hưởng đến đặc tính vi khuẩn, ví dụ như xuất
hiện tính đề kháng kháng sinh.
Tuy nhiên, ngoài đột biến còn một cách khác có thể dẫn đến sự thay đổi cấu trúc
di truyền của vi khuẩn. Một vi khuẩn có thể truyền những đoạn DNA cho một chủng vi
khuẩn khác, những đoạn DNA ngắn này có thể tự tích hợp vào nhiễm sắc thể của tế
bào nhận hoặc không gắn với nhiễm sắc thể, ở dạng tự do như một plasmid. Nếu đoạn
gen này mã hoá cho một loạt những đặc điểm độc tính của vi khuẩn thì được gọi là
một tiểu đảo sinh bệnh (PAI). Nếu đoạn DNA nhỏ này hoạt động có lợi cho sự tiến hoá
sinh học của vi khuẩn nhận thì nó sẽ tồn tại và từ một đoạn DNA ngoại lai trở thành
một phần trong bộ gen của một chủng vi khuẩn mới.
Độc tính của H. pylori và khả năng gây bệnh cho vật chủ phụ thuộc vào nhiễm
sắc thể nguyên bản của vi khuẩn, cụ thể là đoạn gen mã hoá cho độc tố gây rỗng tế bào
(vac), và cũng phụ thuộc vào đoạn DNA ngoại lai tích hợp vào nhiễm sắc thể sản xuất
9

độc tố liên quan đến tiểu đảo sinh bệnh (cagPAI). Đa số các chủng phân lập ở Đông Á
có CagA và các allen gây độc tế bào của gen VacA, trong khi đó chỉ có 50% ở châu Âu
và Mỹ là có các gen có sự hiện diện của cả 2 gen này.

Hình 2.7 Tiểu đảo sinh bệnh cagPAI
Hình vẽ mô tả sự sắp xếp các gen ở chủng 26695, là chủng được xác định trình tự gen đầu
tiên. Hầu hết gen cag là thành phần của một bộ máy bài tiết có chức năng đưa protein CagA
vào bào tương tế bào biểu mô dạ dày: 5 gen màu vàng cam là thành phần của hệ thống bài
tiết type IV (Virprotein). Những protein được mã hoá bởi tiểu đảo sinh bệnh có hai chức năng
chính là gây sản xuất interleukin-8 bởi tế bào biểu mô dạ dày và vận chuyển CagA từ vi
khuẩn vào tế bào vật chủ. Những gen minh hoạ bằng mũi tên đặc là cần thiết cho việc gây
đáp ứng interleukin-8, mũi tên gạch chéo là gen không liên quan đến quá trình này. Mũi tên
viền xanh là gen cần thiết cho vận chuyển CagA, viền vàng cam là những gen không liên quan
đến quá trình vận chuyển
( />=39:tinkhoahoc&Itemid=59)

2.2.4. Dịch tể học
Nhiễm H. pylori là một trong những nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp nhất ở
người. Tần suất nhiễm vi khuẩn này thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh tế, xã hội và
chủng tộc. Người ta ước tính có hơn 50% dân số đã bị nhiễm H. pylori, chủ yếu ở các
nước đang phát triển với tần số nhiễm rất cao từ 50 - 90% ở lứa tuổi lớn hơn 20 và hầu
hết trẻ em bị nhiễm ở độ tuổi từ 2 - 8. Việt Nam cũng có tỉ lệ nhiễm H. pylori cao vào
khoảng hơn 70% ở người lớn. Trong khi đó ở các nước đã phát triển, tuổi bị nhiễm
thường lớn hơn 50, chiếm hơn 50% dân số. Tần suất này tăng thêm 10% mỗi năm.
10


Đường lây nhiễm chủ yếu là đường ăn uống (phân - miệng) hoặc trực tiếp (miệng

- miệng) qua nước bọt. Ở những nơi có điều kiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị
nhiễm là nguồn lây lan quan trọng ban đầu.
2.2.5. Thành phần - cấu tạo
2.2.5.1. Tính di động
Nhờ hoạt động của các tiêm mao và cấu trúc hình xoắn, vi khuẩn di chuyển qua lớp
niêm dịch vào lớp dưới niêm mạc dạ dày để tồn tại trong môi trường acid của dịch vị.
2.2.5.2. Men urease
Men này giúp vi khuẩn thoát khỏi pH thấp của dịch vị bằng cách biến đổi urea
thành amoniac và bicarbonate giúp giữ môi trường chung quanh vi khuẩn có pH bằng
7. Urease còn có vai trò quan trọng trong biến dưỡng và tránh được đáp ứng miễn
dịch: tham gia tổng hợp protein bằng cách cung cấp nitơ, biến đổi glutamate thành
glutamine và kết hợp với kháng thể giúp ngăn chặn sự kết hợp với tế bào vì vậy ngăn
chặn sự opsonin hóa.

Hình 2.8 Thành phần cấu tạo của vi khuẩn H. pylori
( />11


2.2.5.3. Yếu tố chống tăng sinh
Chất trích tinh của H. pylori làm ức chế sự tăng sinh tế bào niêm mạc dạ dày. Các
protein này kích thích sự tăng trưởng của vi khuẩn và làm cho H. pylori dễ khu trú vào
niêm mạc dạ dày do hoạt động của men Cu - Zn superoxide dimutase và Mn
superoxyde dimutase làm cho vi khuẩn dễ bám vào niêm mạc.
2.2.5.4. Sự kết dính hồng cầu
H. pylori có khả năng kết dính hồng cầu rất mạnh qua trung gian của thụ thể acid
sialic giúp vi khuẩn tránh được sự thực bào. Các chủng H. pylori có khả năng kết dính
hồng cầu cao làm gia tăng tính kháng lại thực bào.
2.2.5.5. Các adhesion giúp thu giữ sắt
H. pylori rất cần sắt để phát triển mà bình thường trong dạ dày rất ít sắt do đó các
H. pylori tiết ra siderophore để bắt giữ sắt trong môi trường xung quanh, ngoài ra trên

vách H. pylori còn có protein kết hợp lactoferine cũng giúp H. pylori thu giữ sắt từ
môi trường xung quanh.
2.2.5.6. Phospholipase và protease
Các men này thủy phân chất nhầy giúp vi khuẩn đi xuyên qua lớp nhầy niêm mạc.
2.2.5.7. VacA (vacuolating cytoxin VacA) độc tố tạo không bào
Độc tố protein VacA có khối lượng phân tử là 89 kDa và hiện diện ở khoảng 50%
chủng H. pylori. Gen mã hóa protein này cấu tạo gồm 2 vùng: vùng dấu hiệu gồm các
đơn vị s1a, s1b, s1c, s2; vùng trung gian gồm các đơn vị m1, m2. Các chủng H. pylori
VacA s1m1 sản sinh lượng độc tố có hoạt tính cao hơn chủng VacA s1m2.
VacA là độc tố chính của vi khuẩn, gắn vào màng tế bào biểu mô và tạo thành
một kênh phụ thuộc điện thế chọn lọc anion hexameric gây không bào biểu mô dạ dày
làm ức chế sự họat hóa năng lượng do tổn thương ty lạp thể và làm tổn thương chu
trình tế bào. VacA còn phóng thích cytochrome C và làm chết tế bào.
2.2.5.8. CagA gen (cytotoxine associated gen A)
Vi khuẩn H. pylori có gen này thì có độc tính cao hơn. Gen này là một chỉ điểm
cho đoạn DNA 40 kb tương ứng với 25 gen gọi là đảo sinh bệnh, gây tổn thương tế
bào và thường phối hợp với loét và ung thư dạ dày. Sau khi vào tế bào CagA được
phosphoryl hóa và kết hợp với SHP - 2 tyrosine phosphatase tạo nên yếu tố đáp ứng
phát triển tế bào (growth factor – like cellular) và sản xuất cytokine của tế bào ký chủ.

12


Ở môi trường acid pH = 3 – 4,5 H. pylori sao chép gen bình thường; pH < 2,
H. pylori vẫn tồn tại; pH > 7, H. pylori ngưng hoạt động, trở thành cầu khuẩn và
không di chuyển.
H. pylori với nhóm máu: H. pylori dễ gắn lên bề mặt kháng nguyên Tewish,
Tewish có trên biểu mô niêm mạc dạ dày có ái lực cao đối với H. pylori, mà Tewish
đặc trưng cho cấu tạo nhóm máu O, vì vậy nhiễm H. pylori trên người có máu nhóm O
cao gấp 1,5 – 2 lần so với người có nhóm máu khác.

Hầu hết những người nhiễm H. pylori đều bị viêm dạ dày với mức độ từ vừa đến
trầm trọng. Trong khi đó viêm dạ dày sẽ tiến triển thành loét hay ung thư dạ dày. Sự
tiến triển này tùy thuộc vào chủng của H. pylori và đáp ứng của ký chủ.

Hình 2.9 Sơ đồ cơ chế gây tổn thương dạ dày của vi khuẩn.

1. H. pylori thẩm thấu qua lớp nhầy của dạ dày và bám chặt vào bề mặt của tế bào biểu
mô niêm mạc dạ dày .
2. Ammonia được sản xuất và trung hòa các acid dạ dày
3. Các H. pylori, và di chuyển, và cuối cùng gây ra nhiễm trùng.
4. Loét dạ loét được phát triển bởi sự tàn phá của viêm niêm mạc và chết tế bào niêm mạc
( />13


2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN NHIỄM HELICOBACTER PYLORI
Trong chẩn đoán, mỗi phương pháp có những ưu nhược điểm khác nhau và việc
chọn lựa phương pháp còn tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong
thực hành và giá thành của thử nghiệm. Điều quan trọng nhất là các thử nghiệm phải
có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để giúp chẩn đoán trước điều trị và theo dõi sau điều trị
đạt hiệu quả tốt nhất.
Các phương pháp chẩn đoán H. pylori có thể chia thành hai nhóm:
- Các thử nghiệm không xâm hại.
- Các thử nghiệm ít xâm hại được thực hiện qua nội soi dạ dày tá tràng.
2.3.1. Các thử nghiệm không xâm hại (noninvasive test)
2.3.1.1. Nghiệm pháp thở 13C hoặc 14C (UREA BREATH TEST = UBT)
Nghiệm pháp thở UBT được tác giả Graham mô tả đầu tiên vào năm 1987 và một
năm sau, 1988 Marshall và Surveyor mô tả nghiệm pháp thở 14C. Cả hai nghiệm pháp
này cho đến nay được xem là tiêu chuẩn vàng và trở thành một thử nghiệm phổ biến
không xâm hại trong chẩn đoán, đánh giá kết quả tiệt trừ H. pylori.
Bệnh nhân được cho uống urea đã đánh dấu 13C hoặc 14C. Sau khi uống, men

urease từ vi khuẩn sẽ tác động lên urea được đánh dấu và giải phóng 13CO 2 ... Chất
này đi vào máu và thải trừ qua phổi. Việc phát hiện trong hơi thở chất đồng vị được
đánh dấu là tỉ lệ 13C/12C được đo bằng sắc ký hơi và quang phổ kế khối hoặc một hệ
thống khác như quang phổ laser và hoặc quang phổ hồng ngoại. Kết quả cả hai thử
nghiệm thở 13C và 14C đều giống nhau và đều chính xác, khác nhau ở chổ 13C là chất
không gây phóng xạ còn 14C là chất có hoạt tính phóng xạ. Test hơi thở có độ chính
xác hơn 95%. Tuy nhiên, việc sử dụng test này còn hạn chế do giá thành cao và máy
khá đắt.
2.3.1.2. Chẩn đoán huyết thanh
Chẩn đoán huyết thanh bằng phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) để phát hiện kháng thể IgG kháng H. pylori. Đây là một xét nghiệm ít
tốn kém và thích hợp cho nghiên cứu dịch tể học với độ nhạy trên 90%.
Việc xác định nồng độ kháng thể IgG được sử dụng nhiều hơn các globuline
miễn dịch khác như IgA và IgM. Hiện nay trên thị trường có nhiều bộ kit khác nhau
dùng để chẩn đoán nhiễm H. pylori (trên 20 bộ kit). Độ nhạy và độ đặc hiệu cũng khác
nhau tùy theo các bộ kit này.
14