PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ NỐT SẦN CỦA CÂY ĐẬU XANH ( Vigna radiata )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ NỐT SẦN
CỦA CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: ĐINH THỊ HÀ

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 07/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ NỐT SẦN

CỦA CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

ĐINH THỊ HÀ

Tháng 07/2011


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận được rất nhiều sự ủng hộ và
giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến
 Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả thầy cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ,
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
 TS. Lê Đình Đôn đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
 Anh Võ Khánh Hưng, anh Nguyễn Phan Thành, các thầy cô và các anh chị cán
bộ của viện nghiên cứu Sinh học và Môi Trường của trường Đại học Nông Lâm đã
tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi về mặt cơ sở vật chất cũng như về mặt kỹ thuật.
 Các bạn lớp DH07SH đã chia sẽ cùng tôi nhưng vui buồn cũng như hết lòng hỗ
trợ, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập.
 Con xin ghi ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như
đã động viên, hỗ trợ về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này.
Xin chân thành cảm ơn
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07/2011

Đinh Thị Hà

i


TÓM TẮT
Hiện nay, cùng với tình hình tăng dân số, diện tích đất canh tác ngày càng thu hẹp
và bị thoái hóa mà nhu cầu lương thực, thực phẩm ngày càng tăng. Do đó, vấn đề cải
tạo đất và tăng năng suất cây trồng đang được sự quan tâm của toàn xã hội. Hàng năm
trên thế giới lượng nitơ khí quyển được cố định và chuyển hoá thành nguồn đạm dưới
các dạng khác nhau, thông qua quá trình cố định đạm sinh học tự nhiên ước tính gấp
hai lần lượng nitơ hóa học sản xuất hàng năm. Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn
Rhizobium với rễ các cây họ đậu có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng
suất cây trồng và bền vững hệ sinh thái. Vi khuẩn cố định đạm đang được quan tâm,
nghiên cứu nhiều trên các loại cây họ Đậu, trong đó có cây đậu xanh (Vigna radiata).
Kỹ thuật phân lập, tuyển chọn, định danh vi khuẩn cộng sinh với rễ cây họ Đậu làm
nền tảng để tạo chế phẩm từ loại vi khuẩn này phụ vụ cho sản xuất nông nghiệp. Do
đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của cây đậu
xanh (Vigna radiata).
Thí nghiệm gồm 4 nội dung: Phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật từ nốt
sần cây đậu xanh; Xác định hình thái, nhuộm Gram; Thực hiện các thử nghiệm sinh
hóa để chọn lọc các chủng vi sinh vật có đặc điểm của Rhizobium sp.; Phát hiện vi
khuẩn Rhizobium sp. bằng phản ứng PCR với cặp primer (FGPS 1490, FGPS 132).
Kết quả: Thu thập được 24 mẫu nốt sần cây đậu xanh. Sau khi xác định hình thái,
nhuộm gram, thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. 7 chủng vi khuẩn có đặc điểm tương
đồng với Rhizobium sp. .Sản phẩm PCR gồm các band có kích thước khoảng 380 - 550
pb. Chọn 2 mẫu đi giải trình tự có kết quả tương đồng tới 99% là Klebsiella
pneumoniae subsp.

ii

SUMMARY
Thesis title “Initially isolated nitrogen-fixing bacteria from nodules of green bean
plants (Vigna radiata)”.
Now, togerther with population growth, the land area shrinking and increasingly
degraded, the food need to increase. So, to solve this problem care of society. Every
year, on the world have quantity atmospheric nitrogen is fixed and to transform
nitrogen sources under various forms through the process of biological nitrogen
fixation naturally, is estimated double chemical nitrogen fertilizer produced annually
on the world. The symbiosis relationship between Rhizobium bacteria with roots of
legumes, has an important role in nutrient cycles of nitrogen, a stable crop yields and
unshakeable ecosystem. Nitrogen-fixing bacteria are interested in attracting more
research and applied to many different crops. Green bean plants (Vigna radiata) is a
plant of high economic value. Technical isolation, selection, identification the bacteria
symbiosis with roots of green bean plants contribute to improvement soil, increased
crop yields.
The experiment consists of four main: Isolation and purification of microbial
strains from nodules of green bean plants; Determine morphology, Gram staining;
Perform biochemical testing for testing for microorganisms collected for selected
characteristics to consistent with Rhizobium sp.; Detecting bacteria Rhizobium sp. by
PCR with primer pair (FGPS 1490, FGPS 132).
The Result: 24 samples collected strain from nodules of green bean plants;. After
the process of determining morphology, gram staining, biochemical tests, seven strains
have characteristics similar with Rhizobium sp.. Product of PCR band size about 380
to 550 pb. Choose 2 samples to decipher sequence has similar results to 99% of
Klebsiella pneumoniae subsp.

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i
TÓM TẮT ...................................................................................................................ii
SUMMARY .............................................................................................................. iii
MỤC LỤC..................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2. Yêu cầu.................................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................3
2.1. Thực vật họ Đậu ...................................................................................................3
2.2. Giới thiệu về cây đậu xanh (Vigna radiata)...........................................................3
2.2.1. Phân loại ............................................................................................................3
2.2.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái của cây đậu xanh (Vigna radiata)..........................4
2.3. Vai trò của nitơ đối với thực vật............................................................................4
2.4. Các nguồn nitơ cung cấp cho cây ..........................................................................5
2.5. Quá trình cố định nitơ trong tự nhiên ....................................................................5
2.6. Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ ......................................................................7
2.6.1. Phân loại vi khuẩn cố định nitơ ..........................................................................7
2.6.2. Đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ..........................................................................7
2.6.3. Vai trò vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên.......................................................8
2.7. Vi khuẩn Rhizobium..............................................................................................8
2.7.1. Lịch sử phát hiện vi khuẩn Rhizobium................................................................8
2.7.2 Phân loại vi khuẩn Rhizobium .............................................................................8
2.7.3. Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium..........................................................................11
2.7.5 .Cơ chế cộng sinh của Rhizobium với cây họ đậu .............................................. 12
2.8. Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction) ............................ 14

2.8.1. Ly trích DNA...................................................................................................14

iv


2.8.1.1. Nguyên lý .....................................................................................................14
2.8.2. Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................... 15
2.8.2.1. Khái niệm chung ........................................................................................... 15
2.8.2.2. Nguyên lý .....................................................................................................15
2.8.2.3. Các thành phần phản ứng PCR......................................................................15
2.8.2.4. Các giai đoạn phản ứng PCR.........................................................................18
2.9. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước................................................ 19
2.9.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp. trên thế giới ............................. 19
2.9.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp. ở Việt Nam.............................. 19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 21
3.1. Thời gian và Địa điểm......................................................................................... 21
3.2. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 21
3.2.1. Mẫu thí nghiệm:............................................................................................... 21
3.2.2. Hóa chất sử dụng ............................................................................................. 22
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 23
3.3. Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................... 23
3.3.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nốt sần cây đậu xanh ........... 23
3.3.2. Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và xác định Gram vi khuẩn ................ 23
3.3.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa.................................................................24
3.3.3.1. Khả năng tạo thành Indol .............................................................................. 24
3.3.3.2. Khả năng dịch hóa gelatin ............................................................................. 24
3.3.3.3. Khả năng phân giải urê.................................................................................. 25
3.3.3.4. Khả năng lên men đường .............................................................................. 25
3.3.3.5. Phản ứng VP (Voges – Prokauer)..................................................................25
3.3.3.6. Khả năng di động .......................................................................................... 25

3.3.4.Thí nghiệm 4: Phát hiện chủng vi khuẩn Rhizobium bằng phương pháp PCR....26
3.3.4.1. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ............................................................... 26
3.3.4.2. Thực hiện phản ứng PCR .............................................................................. 27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................29
4.1. Phân lập và làm thuần chủng vi khuẩn từ nốt sần cây đậu xanh........................... 29
4.2. Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và nhuộm Gram vi khuẩn ..................... 30
4.3. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa....................................................................32
v


4.4. Thí nghiệm 4: Phát hiện vi khuẩn Rhizobium sp. bằng phương pháp PCR..........36
4.4.1. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn phân lập từ nốt sần cây đậu xanh .............. 36
4.4.2. Phản ứng PCR..................................................................................................36
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 40
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 41

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ctv :

Cộng tác viên

bp :

Base pair

DNA :

Deoxyribonucleotide acid

DNTP :

Deoxynucleotide triphosphate

EtBr :

Ethidium bromide

ha :

Hecta

mM :

Mili mol / lít

NaCl :

Natri clorua

ng :

Nano gam

PCR :

Polymerase chain reaction

RNAse : Ribonuclease
SDS :

Sodium dodecyl sulfate

TAE :

Tris Acetate EDTA

Taq :

Thermus aquaticus

TE :

Tris EDTA

Tm :
UV :

Melting temperature
Ultra violet

YEMA : Yeast extract manitol agar
μl :

Micro lít

μg :

Micro gam

μM :

Micro mol / lít

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây đậu xanh................................................................................................3
Hình 2.2 Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên. ...........................................................6
Hình 2.4 Vi khuẩn Rhizobium.....................................................................................9
Hình 2.6 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ đậu.............................................................. 13
Hình 2.7 Nguyên tắc phản ứng PCR.........................................................................18
Hình 4.1 Màu sắc, hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường YEMA................ 30
Hình 4.2 Vi khuẩn trên môi trường chọn lọc YEMA - Congo Red. .......................... 31
Hình 4.3 Hình dạng, màu sắc khi quan sát dưới kính hiển vi 100X............................ 31
Hình 4.5 Thử nghiệm khả năng lên men đường......................................................... 33
Hình 4.6 Thử nghiệm khả năng tạo thành Indol......................................................... 34
Hình 4.7 Thử nghiệm khả năng phân giải ure. ........................................................... 34
Hình 4.8 Thử nghiệm khả năng di động. ...................................................................35
Hình 4.9 Điện di kiểm tra mẫu ................................................................................. 36
Hình 4.10 Sản phẩm PCR ......................................................................................... 37

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các Rhizobium sp. đã được định danh............................................................... 9
Bảng 2.2 Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ ............. 12
Bảng 3.1 Kí hiệu và địa chỉ lấy mẫu ................................................................................ 21
Bảng 3.2 Thành phần cho một phản ứng PCR ................................................................ 27
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR .................................................................. 27
Bảng 4.1 Kết quả màu sắc, hình dạng, nhuộm Gram vi khuẩn ..................................... 32
Bảng 4.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa ........................................................................... 32

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Dân số thế giới đã tăng từ 3 tỷ người vào năm 1960 lên 5,3 tỷ người vào năm
1990 và dự kiến đạt 8,5 tỷ người vào năm 2050. Đồng nghĩa với việc tăng dân số là
giảm diện tích đất canh tác, và tăng nhu cầu về lương thực, thực phẩm.( Nguyễn Minh
Hưng và ctv, 2007) . Để đáp ứng nhu cầu lương thực, thực phẩm thiết yếu nhiều biện
pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cây trồng, như sử dụng thuốc trừ sâu,
phân bón hóa học ngày càng phổ biến. Những giải pháp trên tuy đem lại hiệu quả
nhanh chóng trong việc cải thiện năng suất, gia tăng phẩm chất cây trồng, nhưng các
biện pháp này còn nhiều hạn chế như gây ô nhiễm môi trường, thoái hóa đất nông
nghiệp, tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi. Ngoài ra vấn đề ô
nhiễm môi trường là vấn đề chung cấp bách của các quốc gia trên thế giới nên việc xây
dựng một nền nông nghiệp năng suất cao nhưng bền vững và thân thiện với môi
trường đã trở thành xu hướng mới trên toàn cầu. Nghiên cứu sự tương tác có lợi giữa
vi sinh vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng để cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng
hứa hẹn nhiều tiềm năng. Trong đó vi khuẩn cố định đạm là đối tượng điển hình.
Hàng năm trên toàn thế giới có khoảng 120 - 160 triệu tấn nitơ khí quyển được
cố định và chuyển hoá thành nguồn đạm dưới các dạng khác nhau thông qua quá trình
cố định đạm sinh học tự nhiên (Gibson, 1995). Lượng đạm này ước tính gấp khoảng 2

lần lượng phân nitơ hoá học sản xuất ra hàng năm trên thế giới. Thông qua sự cộng
sinh giữa vi khuẩn Rhizobium với rễ các cây họ đậu, quá trình cố định đạm được thực
hiện. Quan hệ cộng sinh này có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng suất
cây trồng và bền vững hệ sinh thái (Macdicken, 1994. Balasundaran, 1995).
Trên thế giới vi khuẩn cố định đạm đã được nghiên cứu vào khoảng đầu thế kỷ
19, và thu được nhiều kết quả được ứng dụng trong cải tạo đất, tăng năng suất cây
trồng (Howieson và ctv, 2000). ở Việt Nam, tiềm năng ứng dụng của chúng vẫn chưa
được khám phá hết, việc nghiên cứu, phân lập và định danh các vi khuẩn cố định đạm
trên cây họ đậu như cây đậu xanh (Vigna radiata) đang được sự quan tâm của nhiều
nhà khoa học, các doanh nghiệp,...dựa trên những cơ sở đó tiến hành đề tài “ Phân lập
vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của cây đậu xanh (Vigna radiata)”.

1


1.2. Yêu cầu
Phân lập vi khuẩn Rhizobium sp. từ nốt sần cây đậu xanh tại các tỉnh (Đồng
Tháp, An Giang, Cần Thơ, Tp. Hồ Chí Minh).
1.3. Nội dung thực hiện
- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn thu được từ nốt sần của cây đậu.
- Quan sát hình thái, nhuộm Gram; Thực hiện các thử nghiệm sinh hóa để chọn
lọc các dòng có đặc tính của vi khuẩn Rhizobium sp.
- Phát hiện vi khuẩn Rhizobium sp. bằng phản ứng PCR (polymerase Chain
Reaction) với cặp primer (FGPS 1490, FGPS 132).

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Thực vật họ Đậu

Thực vật họ Đậu, tên khoa học Leguminosae (Fabaceae)- là họ hai lá mầm của
thực vật có hoa với 650 chi và 18000 loài. Nhiều cây trong họ này làm lương thực cho
con người và gia súc như cây đậu Hà Lan, đậu Cove, đậu tương.. hoặc làm phân xanh
như cỏ ba lá, muồng. Ngoài ra một số cây trong họ này được dùng trong mục đích cải
tạo đất bị thoái hóa, phục hồi, cải tạo môi trường sinh thái như keo, bồ kết ba gai. Một
số chi trong họ này như Mimosa, Delonix, Acacia… là các loại cây cảnh. Một số loài
còn có tính chất dược học hoặc diệt trừ sâu bọ. Một đặc điểm nổi bật của những loại
cây thuộc họ Đậu là các loại cây ký chủ cho nhiều loại vi khuẩn cố định nitơ ở rể. Các
loại vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn nốt rễ (rhizobium), có khả năng lấy
khí nitơ trong không khí và chuyển hóa nitơ thành các dạng chất mà cây có thể hấp thụ
được (NO3-, NH3-). Hoạt động này được gọi là cố định đạm. Cây họ Đậu, trong vai trò
của cây chủ, còn vi khuẩn nốt rễ, trong vai trò của nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ra
một quan hệ cộng sinh. (Kristina và ctv, 2005)
2.2. Giới thiệu về cây đậu xanh (Vigna radiata)
2.2.1. Phân loại
Phân loại khoa học:
Giới: Plantae
Nghành: Magnoliophyta (hạt kín)
Lớp: Magnoliopsida (2 lá mầm)
Bộ: Fabales
Họ: Fabaceae
Chi: Vigna
Loài: Vigna radiata (Phaeolus aureus Roxb).
Hình 2.1 Cây đậu xanh.
(Shanmugasundaram. S, 2006).

3


2.2.2. Đặc điểm sinh học, sinh thái của cây đậu xanh (Vigna radiata)

Cây đậu xanh (Vigna radiata) thuộc loại cây thân thảo mọc đứng. Lá mọc kép 3 lá
chét, có lông hai mặt. Hoa màu vàng lục mọc ở kẽ lá. Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng số
lượng nhiều, có chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng, có
mầm ở giữa.( />Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi với
các vùng có điều kiện khắc nghiệt như khu vực Đông và Nam Châu Á, được trồng
nhiều ở các quốc gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal Trung
Quốc, Thái Lan, Philippin, Miến Điện, Inđônexia...; Hiện nay, được phát triển tại một
số quốc gia ở vùng ôn đới, ở Châu Úc, lục địa Châu Mỹ. Một đặc trưng của cây đậu
xanh là loại cây ký chủ cho nhiều loài vi khuẩn trên rễ của chúng.
( />2.3. Vai trò của nitơ đối với thực vật
Đối với thực vật nói chung và cây họ đậu nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt
quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất. Nitơ có mặt trong rất
nhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và năng
lượng, đến hoạt động sinh lý của cây. Nitơ là nguyên tố đặc thù của protein mà protein lại
có vai trò cực kỳ quan trọng đối với cây. Protein là thành phần chủ yếu tham gia cấu trúc
nên hệ thống chất nguyên sinh trong tế bào, cấu tạo nên hệ thống màng sinh học, các bào
quan trong tế bào; Protein là thành phần bắt buộc của các enzyme.( dam.515026.html)
Nitơ có trong thành phần của acid nucleic (DNA và RNA). Ngoài chức
năng duy trì và truyền thông tin di truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào ; Nitơ
là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết định
hoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trên
trái đất, là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin.
Thừa nitơ: Khác với các nguyên tố khác, việc thừa nitơ có ảnh hưởng rất
nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất ở cây trồng. Cây sinh
trưởng quá mạnh, thân lá tăng nhanh mà mô cơ giới kém hình thành nên cây rất yếu,
dễ lốp đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có trường hợp không có thu hoạch.

4

Thiếu nitơ: Cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ,
lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy,
giảm năng suất. Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít.
Trong trường hợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinh
trưởng và phát triển bình thường. ( />2.4. Các nguồn nitơ cung cấp cho cây
Hàm lượng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật thường từ 1 - 3%. Tuy
hàm lượng trong cây thấp, nhưng nitơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất đối với đời
sống thực vật cũng như toàn bộ thế giới hữu cơ.
Trong tự nhiên, nitơ tồn tại dưới 2 dạng: Dạng khí tự do trong khí quyển (N 2)
chiếm khoảng 79% không khí (theo thể tích), dạng này cây không thể sử dụng được;
Dạng các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ.
Nitơ liên kết chủ yếu ở 3 dạng hợp chất: Hợp chất nitơ vô cơ trong các muối
ammonium (NH4+), muối nitrate (NO3-); Nitơ hữu cơ của các protein ở dạng xác bã
động vật, thực vật chưa phân giải hoàn toàn, ở dưới dạng mùn protein. Các sản phẩm
phân giải của protein như các acid amine, các peptid và các amine.
Trong số các dạng nitơ trên, cây chỉ sử dụng nitơ vô cơ là chủ yếu. Trong đất
nitơ vô cơ chiếm 1 - 2% lượng nitơ tổng số có trong đất. Trên những loại đất phì nhiêu
lượng nitơ trong đất có thể đạt 200 kg/ha.
( dam.515026.html)
2.5. Quá trình cố định nitơ trong tự nhiên
Khí nitơ chiếm khoảng 80% trong bầu khí quyển. Tuy nhiên hầu hết các sinh
vật sống đều không thể sử dụng dạng nitơ này. Khí nitơ có thể được các vi sinh vật cố
định đạm biến đổi thành dạng amminoa (NH3-), là dạng nitơ mà hầu hết thực vật trong
tự nhiên sử dụng để tạo ra amoni acid, protein, nucleic acid và những thành phần khác
chứa nitơ cần thiết cho sự sống. Cũng như carbon, nitơ trong tự nhiên có chu trình
chuyển hóa giữa nitơ và không khí có sự trao đổi thường xuyên : nitơ phân tử chuyển
thành dạng nitơ kết hợp do các quá trình cố định nitơ sinh học, do tác động của điện và
cố định quang học. ( />Chu trình nitơ trong tự nhiên có hai giai đoạn là cố định nitơ và khoáng hóa nitơ :

5


- Giai đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống
cộng sinh với rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do…sẽ biến đổi nitơ trong
không khí thành amonia, từ amonia sẽ tổng hợp nên các hợp chất chứa nitơ khác cung
cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Phản ứng cố định nitơ
được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:

Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi hai thành phần, đó là
protein có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là
nitrogenase khử hay thành phần II. Thành phần kia gọi là protein sắt-molybden (MoFe protein) còn gọi là thành phần I. (Samuel S. Gnamanickam.2006).
- Giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các chủng vi khuẩn nitrat hóa
như Nitrosomonat và Nitrobacter để chuyển hóa nitrat (NO3-), là dạng thích hợp nhất
để cho cây trồng hấp thu.
( />huong2.htm)

Hình 2.2 Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên.
( />
6


2.6. Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ
2.6.1. Phân loại vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ được chia làm 3 nhóm: vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh, vi
khuẩn cố định nitơ sống tự do và vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật ký chủ. Tuy
nhiên, sự phân biệt giữa 3 nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do
và nhóm vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật thì vẫn chưa được mô tả một cách rõ
ràng và một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm. (Samuel S. Gnamanickam, 2006).
2.6.2. Đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ

Vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh là những vi sinh vật sinh vật sống cộng
sinh với thực vật ký chủ theo kiểu hai bên cùng có lợi. Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ
tiến hành trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở
nơi vi khuẩn định cư, điển hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu.
Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật được xem là sự tương tác gần giữa vi
khuẩn và thực vật, trong đó vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh. Hầu hết những vi
khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ
Đậu; hay là những thành viên của xạ khuẩn chi Frankia- là những vi khuẩn Gram
dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây hai lá mầm và cây bụi.
Ban đầu những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu được phân loại thành chi Rhizobium,
do đó những vi khuẩn này thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ
(rhizobia). Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở rễ cây họ Đậu được phân loại
thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium
(Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium. (Samuel S. Gnamanickam, 2006).
Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn tương
tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng
cộng sinh chuyên biệt. Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azobacter,
Pseudomonas và Clostridium. (Samuel S. Gnamanickam, 2006).
Vi khuẩn cố định nitơ tương tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình trao
đổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật.
Để phân biệt được vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ
thì chủ yếu dựa vào mức độ tương tác. Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình
cố định nitơ bởi những vi khuẩn sống tự do nhưng lại chịu ảnh hưởng trực tiếp của cây
trồng. Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố
7


định nitơ đề có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự
cộng tác bắt buộc. Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa
quá trình cố định nitơ cộng sinh và tự do. Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm

những vi khuẩn sống tự do trong vùng lân cận của rễ cây thực vật đến những vi khuẩn
sống nội sinh trong mô tế bào thực vật. Để quá trình cố định nitơ tương tác có thể diễn
ra cần những yêu cầu sau đây; 1) thực vật ký chủ; 2) vi khuẩn cố định N; 3) chất nền
thực vật; 4) môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động; 5) quá trình
chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng. Một số vi khuẩn tham gia cố
định nitơ tương tác điển hình như: Azosprium, Burkholderia, Enterobacter,
Gluconoacetobacter, Herbaspirillum, và Klebsiella. (Samuel S. Gnamanickam, 2006)
2.6.3. Vai trò vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Vai trò của tất cả những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cung
cấp đạm cho cây trồng. Tuy nhiên bên cạnh đó các vi khuẩn cố định nitơ còn được biết
đến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như: Kích thích sinh trưởng ở thực vật
bằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase, hay tạo ra các phytohormone như
auxin, cytokinin và gibberlin. Giảm tác động có hại của các mầm bệnh bằng cách cạnh
tranh về dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, các
enzyme thủy phân chống lại bệnh xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng
vệ của cây ký chủ. (Dracourt và ctv, 2001; Loon, 2007).
2.7. Vi khuẩn Rhizobium
2.7.1. Lịch sử phát hiện vi khuẩn Rhizobium
Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình cố định
nitơ phân tử. Họ đã chứng minh được khả năng của cây họ đậu lấy được nitơ khí
quyển là nhờ vi khuẩn nốt sần (VKNS) sống ở vùng rễ cây họ đậu. Họ đặt tên cho loài
vi sinh vật này là Bacillus radicicola. Năm 1889, Pramovskii đã đổi tên vi sinh vật
này là Bacterium radicicola. Cuối năm 1889 Frank đề nghị đổi tên là Rhizobium.
2.7.2 Phân loại vi khuẩn Rhizobium
Phân loại khoa học

Bộ: Rhizobiales

Giới: Bacteria

Họ: Rhizobiaceae

Nghành: proteobacteria

Chi: Rhizobium

Lớp: Alphaproteobacteria

( />
8


Hình 2.4 Vi khuẩn Rhizobium.(a) Rhizobium trên môi trường thạch,
(b) Rhizobium dưới kính hiển vi vật kính100’.( />Bảng 2.1 Các Rhizobium sp. đã được định danh
STT
Tên loài
1
R. leguminosarum
R. l.biovar trifolii
R. l.biovar viciae
2
R. lupini

Tác giả và năm công bố
Frank, 1889
(Schroeter, 1886) Eckhardt và ctv, 1931

3

R. rhizogenes

(Riker và ctv, 1930) Young và ctv, 2001

4

R. rubi

(Hildebrand, 1940) Young và ctv, 2001

5

R. phaseoli

Dangeard,1926. Emend.Ramírez-Bahena và ctv, 2008

6

R. radiobacter

Beijerinck và van Delden, 1902. Young và ctv, 2001

7

R. vitis

Ophel và Kerr, 1990. Young và ctv, 2001

8

R. tropici

Martínez-Romero và ctv, 1991

9

R. galegae

Lindström, 1989

10

R. etli

Segovia và ctv, 1993

11

R. giardinii

Amarger và ctv, 1997

R. gallicum
12

R. hainanense

Chen và cv,. 1997

13

R. huautlense

Wang và ctv, 1998

14

R. undicola

(De Lajudie và ctv, 1998). Young và ctv, 2001

15

R. mongolense

Van Berkum và ctv, 1998

16

R. yanglingense

Tan và ctv, 2001

17

R. sullae

Squartini và ctv, 2002

18

R. indigoferae

Wei và ctv, 2002

19

R. loessense

Wei và ctv, 2003

9


20

R. larrymoorei

(Bouzar và Jones, 2001). Young, 2004

21

R. daejeonense

Quan và ctv, 2005

22

R.lusitanum

Valverde và ctv, 2006

R. mediterraneum
23

R. cellulosilyticum

García-Fraile và ctv, 2007

24

R. fabae

Tian và ctv, 2008

25

R. oryzae

Peng và ctv, 2008

26

R. miluonense

Gu và ctv, 2008

27

R. pisi

Ramírez-Bahena và ct. 2008

28

R. selenitireducens

Hunter và ctv, 2008

corrig.
29

R. alamii

Berge và ctv, 2009

30

R. mesosinicum

Lin và ctv, 2009

31

R. alkalisoli

Lu và ctv, 2009

32

R. tibeticum

Hou và ctv, 2009

33

R. soli

Yoon và ctv, 2010
( />
Vi khuẩn Rhizobium tồn tại trong đất, có thể xâm nhập vào các lông hút của rễ
cây bộ đậu và kích tác tạo thành nốt sần nên còn gọi là vi khuẩn nốt sần.
Căn cứ vào hệ thống phân loại mới, các loài vi khuẩn nốt sần được đề cập trong
cuốn "Phân loại vi khuẩn theo Bergey",dựa vào khả năng sinh trưởng phát triển trên
môi trường thạch, vi khuẩn nốt rễ được chia làm 2 nhóm:
Nhóm mọc nhanh (vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá, đậu Hà Lan, mục túc,...) thuộc chi
Rhizobium. Đây là nhóm vi sinh vật có hoạt động cố định N mạnh nhất. Vi khuẩn nốt
rễ tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch sau 3 - 5 ngày nuôi cấy.
Nhóm mọc chậm (vi khuẩn nốt sần đậu tương, lạc...) thuộc chi
Bradyrhizobium. Vi khuẩn mọc chậm cần thời gian tạo khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy
lớn

hơn

5

ngày.

( />
dam.515026.html)

10


2.7.3. Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium
Rhizobium Là loại trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí. Kích thước
tế bào dao động 0,5 - 1,2 × 2,0 - 3,5 m, khuẩn lạc thuộc nhóm S, nhày lồi, màu trắng
trong hoặc trắng đục, kích thước khuẩn lạc dao động 2,3 - 4,5 mm sau một tuần nuôi
trên môi trường thạch bằng. Vi khuẩn Rhizobium có tiêm mao, có khả năng di động
được, chúng thích hợp ở pH từ 6,5 - 7,5, nhiệt độ 25 - 28oC, độ ẩm 50 - 70%. Khi già
có một số loài tạo được nang xác, khuẩn lạc sẽ chuyển sang màu nâu nhạt. Vi khuẩn
nốt sần có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau (đường đơn, đường kép,
axit hữu cơ, rượu bậc thấp, dextrin, glycogen, ). Khoảng 30% lượng đường do vi
khuẩn nốt sần đồng hóa được dùng để tạo chất nhầy của chúng. (parker, 2001). Vi
khuẩn nốt sần có thể đống hóa tốt nhiều loại axit amin, một số dòng có thể đồng hóa
được pepton. Khả năng sử dụng các protein phân tử lớn nói chung là rất ít. Vi khuẩn
nốt sần có thể sử dụng dễ dàng các muối amon, nitrat và các gốc kiềm purin, pirimidin.
Chúng còn có thể sử dụng được ure hoặc biure.
Nhu cầu vitamin thay đổi đối với tùy từng nòi vi khuẩn nốt sần. Nói chung nhiều
loại vi khuẩn nốt sần có khả năng tự tổng hợp khá nhiều loại vitamin (B1, B2, B12,…).
Phát triển của Rhizobium còn phụ thuộc vào hàm lượng nitơ vô cơ trong đất. Quá nhiều
nitơ ở dạng này cũng kìm hãm Rhizobium phát triển vì lúc đó một phần nitơ đã sử dụng
vào giai đoạn đầu phát triển của cây. Canxi, phospho và kali ảnh hưởng tới phát triển của
vi khuẩn nốt sần. Ví dụ, Ca tạo điều kiện thuận lợi cho việc xâm nhập của vi khuẩn. Các
vi lượng cũng tác động đáng kể tới vi khuẩn này, nhất là bo và molipden.
Đa số mỗi loài vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm được trên một nhóm cây nhất
định trong bộ Đậu. Ví dụ các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết vi khuẩn nốt sần Điền
thanh hoa vàng (S. cannnabana) có thể tạo được nốt sần trên Điền thanh hạt tròn (S.
paludosa) không có khả năng tạo nốt sần trên rất nhiều loại đậu khác (đậu tương, đậu
đen, đậu xanh, đậu lạc…). Một số trường hợp vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào những
loại cây họ Đậu không đặc hiệu, khi đó chúng tạo rất ít nốt sần và cố định nitơ yếu.

Một số giống vi khuẩn nốt sần thường gặp trên rễ các cây bộ đậu như: R.
leguminosorum (đậu Hà Lan); R. triofolii (cỏ ba lá); R. lupin (đậu lupin); R. phasoli
(đậu cô ve); R. meliloti (cỏ lucena); R. japonicum (đậu tương); R. archium (đậu
phộng); R. cajanus (đậu triều); R. vigna (đậu đũa); R. sesbania (điền thanh).
( />11


2.7.5. Cơ chế cộng sinh của Rhizobium với cây họ đậu
Quá trình tạo nốt sần phức tạp và được kiểm soát bởi gene nod của vi khuẩn nốt rễ
(rhizobia). Hầu hết các loại cây họ đậu có thể tạo nốt sần khi có sự xâm nhiễm của
Rhizobium. Gene nod quy định sự xâm nhiễm của Rhizobium vào cây chủ chuyên biệt.
Gene nod có khả năng nhận tín hiệu của flavonoid được tiết ra từ rễ cây họ đậu. Gene nod
đặc trưng cho tính đa dạng và cấu trúc protein của Rhizobium như enzymes. Khi gene nod
nhận tín hiệu lipoolygosaccharide từ rễ cây họ đậu được gọi Nod factors. Trong bộ gene của
Rhizobium, gene nod nằm trên plasmids gọi là sym plasmid, ngoài ra trên plasmid này còn
chứa gene kiểm soát khả năng cố định nitơ gọi là gene nif hoặc gene fix. Ví dụ như
Rhizobium legummisarum biovar viciae tạo nốt sần trên cây đậu Hà Lan (peas) sym
plasmid 220 kb có chứa gene nif và gene nod khoảng 35 kb. (Parker, 2001)
Gene nif là gene mã hóa cho phức hợp enzyme nitrogenase và những enzyme
khác liên quan đến quá trình cố định nitơ, gene nif có trình tự bảo tồn giống nhau ở
những vi sinh vật cố định nitơ. Mặc dù vậy, nhưng sự điều hòa biểu hiện của gene nif
là khác nhau giữa các vi sinh vật cố định nitơ. Có hơn 20 loại gene nif khác nhau có
chức năng vai trò khác nhau, trong đó có 3 gene quan trọng nhất là gene nifH, nifD, và
nifK giữ vai trò mã hóa những thành phần chính của enzyme nitrogenase.
( />Bảng 2.2 Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ
Gene nif

Vai trò

nifH

Nhường điện tử cho ditrogenase trong quá trình chờ nitrogenase hoạt động.

NifD

FeMo bị che lấp bởi nifD, là tiểu đơn vị  của nitrogenase.

NifK

Nhóm P xuất hiện ở bề mặt của nifK, là tiểu đơn vị  của nitrogenase.
( />Cơ chế tạo nốt sần của quá trình cộng sinh Rhizobium với cây họ đậu:
Ban đầu, vùng rễ tiết ra men polygalactoronaza dẫn dụ vi khuẩn Rhizobium

sống tự do trong đất di chuyển đến vùng rễ (Nguyễn Minh Hiếu, 2003). Nhờ gene nod
vi khuẩn nhận ra cây ký chủ chuyên biệt, nếu đúng là thực vật ký chủ chuyên biệt, vi
khuẩn gắn chặt vào rễ. Lúc này, rễ tiết ra flavonoid để truyền cảm ứng tín hiệu cho
những gene nod của vi khuẩn hoạt động để hình thành nốt sần trên cây (Turgeon và
Bauer,1985). Khi bám vào rễ, vi khuẩn sẽ phân tiết yếu tố nod (Nod factors) , yếu tố

12


này làm lông rễ cong lại, vi khuẩn bắt đầu xâm nhập vào rễ thông qua đường xâm
nhiễm (infection thread) ở đầu rễ. Đường xâm nhiễm này do tế bào rễ tự tạo ra để đáp
ứng lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Trong đường xâm nhiễm, vi khuẩn sinh trưởng
liên tục để tạo ra yếu tố Nod, yếu tố này sẽ kích thích tế bào lông rễ ngày càng phát
triển to ra và cuối cùng hình thành nên nốt sần. Trong các nốt sần có hàng nghìn vi
khuẩn Rhizobium sống tự do, hầu hết chúng ở dạng bất định (misshapen) và được gọi
là thể vi khuẩn. Một phần màng tế bào thực vật ký chủ sẽ bao bọc lại những thể vi
khuẩn. Cấu trúc này được gọi là thể cộng sinh (symbiosome) và trong thể cộng sinh,

quá trình cố định nitơ sẽ diễn ra. Bên trong nốt sần, vi khuẩn kiểm soát nồng độ oxy
bởi leghaemoglobin, là một loại protein có mang sắt, màu đỏ, có chức năng tương tự
haemoglobin trong máu, đó là gắn với oxy. Điều này sẽ giúp nồng độ oxy ở mức vừa
đủ để không làm bất hoạt enzyme nitrogenase.(Shin Okazaki và ctv, 2004)

Hình 2.6 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ đậu. (A) Sơ đồ biến đổi các chất

hóa học và quá trình nhiễm của vi khuẩn nốt sần. (B) Rễ tóc của Lotus
Japonicus. (C) Gene gfp của Mesorihizobium loti xâm nhiễm vào rễ tóc ở hình
(B). (D) Nốt sần trưởng thành được tạo do M. Loti xâm nhiễm vào L.Japonicus.
Kích thước hình (B,C) 10 m, hình (D) 1m. (Shin Okazaki và ctv, 2004)

13


2.8. Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction)
2.8.1. Ly trích DNA
2.8.1.1. Nguyên lý
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh các
tác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này.
Phương pháp tách chiết DNA gồm 3 bước:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường
người ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, CTAB) và
proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải
phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong các dung dịch phenol và chloroform, dung dịch
phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời hòa tan các acid
nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acid
nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:

chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là thu nhận acid nucleic dưới
dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme, mặt khác có
thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa:
- Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion
cao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 dung dịch ethanol/1 dung dịch
mẫu), nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho việc kết tủa. Hầu như toàn bộ acid
nucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên.
- Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiện
diện của muối, thể tích isopropanol/thể tích dung dịch mẫu là 1/1. Các DNA có trọng lượng
phân tử thấp không bị kết tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa isopropanol.
Trong cả 2 phương pháp trên, acid nucleic thu nhận lại bằng li tâm. Sau đó, cặn
tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của ethanol còn
dính lại trên mẫu (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008).

14