Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả
bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas
L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: MÃ YẾN THANH

Niên khóa

: 2007 – 20011

Tháng 07/2011
i


LỜI CẢM ƠN
Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin được
gửi lòng biết ơn sâu sắc nhất tới ba mẹ và em trai, những người luôn dõi theo con trên
mỗi bước đường trong thời gian con học xa nhà, luôn là điểm tựa để con vực dậy sau
mỗi lần vấp ngã, luôn là động lực để con sống, học tập và phấn đấu.
Xin chân thành cảm ơn cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt

những kiến thức quý báu và thầy Bùi Minh Trí đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi
hoàn thành khoá luận.
Cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM đã tạo điều kiện
cho tôi trong bốn năm học tập tại trường. Các Thầy Cô đã từng dạy dỗ tôi và quí thầy
cô Bộ môn Công nghệ Sinh học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên ngành
bổ ích. Bạn bè và những người thân xung quanh đã cảm thông và chia sẻ những khó
khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Thiết lập quy trình tái sinh cây in vitro và đánh giá kết quả
bước đầu chuyển nạp gen vào cây dầu mè (Jatropha curcas L.) thông qua
Agrobacterium tumefaciens” đã được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Công
nghệ Sinh học Thực vật - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm
Tp HCM. Thời gian thực hiện từ tháng 1 - 7/2011. Các thí nghiệm được tiến hành để
xác định thời gian khử trùng mẫu hạt thích hợp, theo dõi khả năng tái sinh chồi và khả
năng thu nạp gen ngoại lai của mẫu J. curcas. Qua quá trình thực hiện thí nghiệm
chúng tôi nhận thấy:
Chế phẩm NaOCl 5% cho hiệu quả khử trùng mẫu hạt tốt khi xử lý khử trùng 2
lần, lần lượt trong 10 phút ở nồng độ 10% và 20 phút ở nồng độ 20%. Đạt tỉ lệ 96,66%
mẫu sạch, không bị nhiễm nấm khuẩn.
Chồi tái sinh từ callus của mẫu lá mầm, số chồi cao nhất được ghi nhận trên môi
trường MS bổ sung BA 1,5 mg/l kết hợp với IBA 0,05 mg/l, tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt
70%, trung bình khoảng 4,72 chồi trên một mẫu (ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy). GA3
nồng độ 0,1 mg/l khi bổ sung vào môi trường trên (môi trường MS bổ sung BA 1,5
mg/l kết hợp với IBA 0,05 mg/l) cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất (8,91 chồi/ mẫu).
Đối với mẫu phôi, nồng độ BA 0,5 mg/l kết hợp với IBA 0,25 mg/l cho hiệu quả tái
sinh chồi từ callus đạt 20%, trung bình khoảng 1,27 chồi trên một mẫu tái sinh (ghi

nhận sau 45 ngày nuôi cấy).
Các chồi khỏe mạnh được đem tạo rễ trên môi trường 1/2 MS bổ sung IBA 0,5
mg/l, tỉ lệ hình thành rễ đạt 75% (sau 3 tuần).
Nồng độ kháng sinh kanamycin dùng chọn lọc mẫu phôi và lá mầm chưa chuyển
gen là 30 mg/l. Nồng độ glufosinate 1,5 mg/l dùng cho chọn lọc lá mầm và 1 mg/l
dùng chọn lọc phôi chưa chuyển gen. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
EHA101pIB-GUS do Jabcobsen cung cấp mang plasmid pGII0229 (gồm các gen bar
kháng thuốc diệt cỏ, gen nptII kháng kanamycin và gen chỉ thị gusA) đã được sử dụng
để chuyển vào cây J. curcas. Bước đầu ghi nhận kết quả biểu hiện của gen gusA được
chuyển vào genome của cây cho thấy:
Hiệu quả chuyển gen đạt 40% ở phôi và 66,67% ở lá mầm khi ủ trong dịch khuẩn
thời gian là 30 phút, đồng nuôi cấy trong 4 ngày.
iii


SUMMARY
The thesis "Establishment of an efficient in vitro regeneration protocol and
assessment for initial results of gene transfer into

J. curcas via Agrobacterium

tumefaciens" was carried out at Research Institute for Biotechnology and
Environment, Nong Lam university from 1/2011 to 7/2011.
The goal of this study was to develop an efficient regeneration protocol to be
used for genetic transformation of Jatropha curcas. Results shown that the surfacesterilised protocol which seeds were surface-sterilised with 70% (v/v) ethanol for 30
sec, followed by 10% and 20% (v/v) commercial bleach (with NaOCl as the active
agent) containing 2 - 3 drop Tween 80 for 10 and 20 minutes is the highest percentages
of aseptic cultures (96.66%).
Shoot regeneration from cotyledon and embryo - derived callus is generally
influenced by a combination of auxin and cytokinin. Zygotic embryo - derived callus

regenerated shoot on low concentration of BA (0.5 mg/l). MS Medium supplemented
with 0.5 mg/l BA in combination with 0.25 mg/l IBA gave callus regeneration
frequency of 20% and produced on avegare 1.27 shoots per plant (after 45 days).
In the case of cotyledon explants, the highest number of shoots was obtained on
MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA in combination with 0.05 mg/l IBA. The
callus regeneration frequency of 70% and produced on avegare 4.72 shoots per explant
(after 45 days). Efficient adventitious shoot multilication rate was achieved on MS
medium supplemented with 1.5 mg/l BA + 0.05 mg/l IBA + 0.1 mg/l GA3, producing
on average 8.91 shoots per explant.
Regenerated shoots were cut off and placed onto root induction media for
rooting. About 75% of the shoots (after 3 weeks) successfully produced roots on 1/2
MS medium supplemented with 0.5 mg/l .
Optimal concentration of kanamycin for selecting transformed cotyledon and
embryo were 30 mg/l. 1 mg/L of glufosinate for selection of transformed embryo and
1.5 mg/L for selection of transformed cotyledon. Agrobacterium tumefaciens strain
EHA101pIB-GUS, harboring a binary transformation vector pGII0229 (containing
Trgus cp148 luc carrying β-glucuronidase (gusA) gene, neomycin phosphotransferase
(nptII) gene and bialaphos resistance (bar) gene with nos poly–A promoter and CaMV
iv


35S terminator) was used to assess transformation efficiency in J. curcas. Initial result
of expression of gusA gene was observed:
Embryo explants produced high transformation frequency of 40% when coincubated in Agrobacterium suspension for 30 min (cocultured for 4 days). In the case
of cotyledon explant, frequency of transformation obtained 66.67% when co-incubated
in Agrobacterium suspension for 30 min (cocultured for 4 days).

v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................. ii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iii
SUMMARY................................................................................................................... iv
MỤC LỤC ..................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu .....................................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Giới thiệu về cây dầu mè ..........................................................................................3
2.1.1. Vị trí phân loại .......................................................................................................3
2.1.2. Nguồn gốc..............................................................................................................3
2.1.3. Phân bố ..................................................................................................................3
2.1.4. Đặc điểm hình thái.................................................................................................3
2.1.5. Điều kiện sinh thái .................................................................................................4
2.1.6. Giá trị của cây dầu mè ...........................................................................................4
2.2. Sự tái sinh in vitro ....................................................................................................5
2.2.1. Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật ...........................................................................5
2.2.2. Ý nghĩa của sự tái sinh trong quy trình chuyển nạp gen .......................................6
2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh .........................................................6
2.2.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ....................................................................... 6
2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy .....................................................................8
2.2.4. Các nghiên cứu về vấn đề tái sinh cây J.curcas trong in vitro ..............................9
2.3. Giới thiệu chung về chuyển gen ở thực vật ............................................................10
2.3.1. Khái niệm ............................................................................................................10
2.3.2. Các biện pháp chuyển gen vào trong thực vật.....................................................10

2.3.2.1. Biện pháp sinh học ................................................................................................... 10
vi


2.3.2.2. Biện pháp cơ học ...................................................................................................... 11
2.3.2.3. Biện pháp vật lí......................................................................................................... 13
2.3.3. Thành phần của gen chuyển nạp .........................................................................13
2.3.3.1. Promoter .................................................................................................................... 13
2.3.3.2. Gen thông báo ......................................................................................................... 13
2.3.3.3. Chỉ thị chọn lọc ........................................................................................................ 14
2.3.4. Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến .................................................................15
2.3.4.1. Gen bxn...................................................................................................................... 15
2.3.4.2. Gen bar ...................................................................................................................... 15
2.3.5. Hiện trạng và xu hướng phát triển cây trồng biến đổi gen trên thế giới .............18
2.3.6. Tình hình trồng cây chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ trên thế giới .....................19
2.3.7. Tình hình nghiên cứu cây trồng chuyển gen tại Việt Nam .................................20
2.4. Các nghiên cứu chuyển nạp gen vào Jatropha curca bằng Agrobacterium ..........21
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................24
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................24
3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................24
3.2.1. Giống ...................................................................................................................24
3.2.2. Vi khuẩn ..............................................................................................................24
3.2.3. Vật liệu ................................................................................................................25
3.2.3.1. Vật liệu dùng trong hệ thống tái sinh .................................................................... 25
3.2.3.2. Vật liệu dùng trong quy trình chuyển gen ............................................................ 25
3.2.3.3. Vật liệu dùng trong phản ứng PCR ........................................................................ 25
3.2.4. Thiết bị dùng trong thí nghiệm .................................................................................. 25
3.2.5. Điều kiện nuôi cấy ...............................................................................................26
3.2.6 Phương pháp bố trí và xử lý số liệu .....................................................................26
3.3. Phương pháp thí nghiệm.........................................................................................26

3.3.1. Khảo sát các quy trình khử trùng hạt...................................................................26
3.3.2. Nhóm thí nghiệm tái sinh cây Jatropha curcas in vitro ......................................27
3.3.3. Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen.......................................................................29
3.3.4. Nhóm thí nghiệm chuyển gen..............................................................................31
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................34
4.1. Khảo sát các quy trình khử trùng hạt......................................................................34
vii


4.2. Nhóm thí nghiệm tái sinh .......................................................................................34
4.3. Nhóm thí nghiệm tiền chuyển gen..........................................................................40
4.4. Nhóm thí nghiệm chuyển gen.................................................................................44
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................46
5.1. Kết luận...................................................................................................................46
5.1.1. Quy trình khử trùng hạt .......................................................................................46

5.1.2. Môi trường tái sinh cây........................................................................................46
5.1.3. Nồng độ kanamycin và glusinate dùng chọn lọc .................................................46
5.1.4. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả chuyển gen .........................................46
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................47
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................49
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µl

Microlit

µM

Micromol

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

AS

Acetosyringone

BA

6-benzyl adenin

BAP

6-benzyl aminopurine

Bp

Base pair

Bromoxynil

3,5–dibromo–4–hydroxybenzonitrile

Bxn

Bromoxynil nitrilase

DNA

Deoxiribonucleic Axit

g (mg)

Gram (miligram)

GA3

Gibberellic axit

Glufosinate

DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic axit

GM

Genetically Modified

GMC

Genetically Modified Crops

gusA

β–glucuronidase

IAA

Indole-3-acetic axit

IBA

Indolebutyric axit

J. curcas

Jatropha curcas Linn

KN

Kinetin

l (ml)

Lit (mililit)

LB

Luria-Bertania

mM

Milimol

MS

Murashige và Skoog

NAA

α-naphthaleneacetic axit

nptII

Neomycin phospho transferase

NT

Nghiệm thức

OD

Mật độ quang (Optical density)

PCR

Polymerase Chain Reaction
ix


PEG

Polyethylene glycol

TDZ

Thidiazuron

Ti-plasmid

Tumor-inducing plasmid

Vir

Virulence

X-gluc

5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro ...................7
Bảng 2.2 Một số cytokinin được phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro ...........................8
Bảng 2.3 Các loại thuốc diệt cỏ và gen kháng phổ biến ...............................................19
Bảng 2.4 Các cây trồng chuyển gen phổ biến nhất trên thế giới trong năm 2005 ........20
Bảng 3.1 Các quy trình thử nghiệm khử trùng hạt........................................................27
Bảng 3.2 Các nghiệm thức của môi trường tái sinh chồi từ phôi J. curcas ..................27
Bảng 3.3 Các nghiệm thức của môi trường tái sinh chồi từ lá mầm của J. curcas ......28
Bảng 3.4 Các nghiệm thức của môi trường nhân chồi từ callus lá mầm ......................29
Bảng 3.5 Các môi trường chọn lọc với glufosinate ......................................................29
Bảng 3.6 Các môi trường chọn lọc với kanamycin.......................................................30
Bảng 3.7 Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR .............................................31

Bảng 3.8 Chương trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR ................................................31
Bảng 3.9 Các nghiệm thức về thời gian ngâm ..............................................................33
Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu sống và sạch nấm khuẩn ở hai quy trình khử trùng .....................34
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tái sinh chồi từ mẫu phôi ......................35
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và IBA đến sự tái sinh chồi từ lá mầm .........................38
Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng độ GA3 trong đến tốc độ nhân chồi ..................................38
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến khả năng tái sinh của lá
mầm và phôi cây Jatropha curcas chưa chuyển gen ....................................................41
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ glufosinate đến tỷ lệ sống và khả năng tái sinh của
lá mầm cây Jatropha curcas chưa chuyển gen .............................................................42
Bảng 4.7 Nồng độ plasmid của dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ................44
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu quả chuyển gen ...................................44

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây dầu mè (Jatropha curcas L.) ................................................................... 3
Hình 2.2 Các bộ phận của cây J. curcas ........................................................................ 4
Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của Bialaphos.....................................................................16
Hình 2.4 Diện tích cây chuyển gen trên toàn cầu ..................................................................... 18

Hình 3.1 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc ..............................................................24
Hình 3.2 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc. .......................24
Hình 3.3 Quy trình kiểm tra plasmid và gen bar. .........................................................30
Hình 3.4 Các bước của quy trình nhuộm GUS. ............................................................33
Hình 4.1 Callus và chồi tái sinh từ phôi. ......................................................................35
Hình 4.2 Các giai đoạn tái sinh của mẫu lá mầm cây J. curcas. ..................................37
Hình 4.3 Các môi trường tái sinh chồi. .........................................................................39
Hình 4.4 Rễ hình thành sau 3 tuần chuyển lên môi trường tạo rễ. ...............................39

Hình 4.5 Ảnh hưởng của kanamycin lên sự phát triển của lá mầm chưa chuyển gen .41
Hình 4.6 Ảnh hưởng của kanamycin lên sự phát triển của phôi chưa chuyển gen. ....42
Hình 4.7 Biểu hiện của lá mầm cây Jatropha curcas do ảnh hưởng của glufosinate ..42
Hình 4.8 Biểu hiện của phôi cây Jatropha curcas chưa ảnh hưởng của glufosinate ..43
Hình 4.9 Ladder và kết quả điện di của phản ứng PCR................................................43
Hình 4.10 Kết quả nhuộm GUS của phôi. ....................................................................45
Hình 4.11 Kết quả nhuộm GUS của lá mầm ..............................................................45

xii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam cây dầu mè (Jatropha curcas L.) còn được gọi là cây cọc rào hay
cây ma phong thụ. Cây cọc rào du nhập vào Việt Nam từ rất lâu, được sử dụng làm
thuốc chữa bệnh, trồng làm hàng rào và hạt được sử dụng để thắp sáng (Du, 2006).
Sản phẩm quan trọng nhất vẫn là hạt lấy dầu cho sản xuất diesel sinh học. Diesel
sinh học từ cây J.curcas có đặc tính là khó cháy nổ, có oxi trong phân tử và không có
sunphua nên được đốt cháy hết, giảm thiểu 40 - 80% khí gây hiệu ứng nhà kính và
100% khí gây ung thư. Hơn nữa trồng cây còn giúp cố định trung bình 10 tấn
CO2/ha/năm (Lê Võ Định Tường, 2006). Chính vì thế loài cây này đã được chọn là
một trong các phương án nhiên liệu thay thế quan trọng nhất cho con người - nhiên
liệu diesel sinh học (Saxena, 2007).
Hiện nay, do tình hình khủng hoảng năng lượng chất đốt trên thế giới và các vấn
đề ô nhiễm môi trường toàn cầu nên dầu diesel sinh học nói chung và dầu diesel sinh
học từ hạt cây cọc rào nói riêng đã bắt đầu được sử dụng khá phổ biến ở các dạng B5,
B10, B20, B30 và thậm chí B100 tại các nước như Đức, Anh, Tây Ban Nha, Mỹ, Ấn
Độ, Braxin v.v. (thisisdorset.net, 2007).
Tuy nhiên việc phổ biến và ứng dụng dầu của J. curcas còn thấp do giới hạn về năng
suất dầu chứa trong hạt thấp. Đến nay năng suất hạt của J. curcas vẫn còn là vấn đề khó khăn,

phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác nhau như môi trường (Openshaw, 2000), đặc
điểm phân nhánh của cây (Achten và ctv, 2009), di truyền học (Ginwal và ctv, 2004).
và kỹ thuật canh tác (Gour, 2006). Sản lượng hạt bị hạn chế bởi một số yếu tố môi
trường (abiotic stresses), đặc biệt là lạnh và hạn hán (www.jatropha.org; Adebowale
và Adedire, 2006). Vì vậy đòi hỏi cần có các công cụ di truyền, chọn giống hiệu quả.
Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã trở thành một phương pháp
được lựa chọn cho các nghiên cứu cơ bản về thực vật, cũng như là kĩ thuật chính để tạo ra cây
chuyển gen cho ngành công nghiệp công nghệ sinh học nông nghiệp (Stafford, 2000; Gelvin,
2003). Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kĩ thuật nuôi cấy
mô và tế bào thực vật. Ngoài việc mở ra triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào cây
trồng, các kĩ thuật này còn cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen.

Đề tài nhằm thiết lập quy trình chuyển gen và tái sinh cây hiệu quả ở J. curcas. Ứng
dụng quy trình đó để chuyển nạp gen kháng thuốc diệt cỏ (bar) vào cây nhằm đánh giá hiệu
1


quả của quy trình được xây dựng. Nghiên cứu này giúp tạo tiền đề cho các nghiên cứu chuyển
nạp gen tiếp sau nhằm mục đích cải thiện năng suất, tăng sản lượng dầu trong hạt và tăng tính
chống chịu của cây Jatropha curcas L.

1.2. Yêu cầu
- Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hoàn chỉnh cho cây J. curcas.
- Bước đầu đánh giá hiệu quả của quy trình lây nhiễm Agrobacterium
tumefaciens vào phôi và lá mầm cây J. curcas bằng phương pháp kiểm tra gen chỉ thị
gus A.
1.3. Nội dung thực hiện
- Khảo sát các quy trình khử trùng hạt nhằm thiết lập nguồn mẫu nuôi cấy sạch
ban đầu.

- Thiết lập quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh từ mẫu phôi và lá mầm cây của J.
curcas.
- Đánh giá ảnh hưởng của kanamycin và glufosinate lên sự phát triển của phôi và
lá mầm chưa chuyển gen. Xác định nồng độ kanamycin và glufosinate tối thiểu gây
chết 100% mẫu phôi và lá mầm chưa chuyển gen, nhằm sử dụng cho việc chọn lọc thể
chuyển gen về sau.
- Kiểm tra chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA101pIB-GUS có
mang gen bar trên plasmid pGII0229 bằng phương pháp PCR.
- Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn vào mẫu phôi và lá mầm cây J. curcas. Bước đầu
đánh giá khả năng thu nạp gen của 2 loại mẫu trên ở các thời gian ủ khác nhau với vi
khuẩn dựa vào sự biểu hiện của gen chỉ thị gusA.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây dầu mè (Jatropha curcas L.) 
2.1.1. Vị trí phân loại
Giới

:

Plantae

Ngành

:

Embryophyta

Lớp

:

Malpighiales

Họ

:

Euphorbiaceae

Chi

:

Jatropha

Loài

:

Jatropha curcas Linn

Tên tiếng Anh
Tên tiếng Việt

:
:

Physic nut

Dầu mè, cọc rào, Dầu lai

Hình 2.1 Cây dầu mè
(Nguồn:http//www.jatropha.de/
news/jcl-news.htm).

2.1.2. Nguồn gốc
Cây dầu mè được cho là có nguồn gốc từ Trung Mỹ, sau đó du nhập vào khu vực
nhiệt đới và cận nhiệt đới như: Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ và hiện nay đã trở thành
loài cây phổ biến trên toàn thế giới. Ở Việt Nam, cây dầu mè có mặt từ rất sớm, mọc
nhiều ở vùng núi chủ yếu được người dân trồng để làm hàng rào nên được gọi là cây
cọc rào.
2.1.3. Phân bố
Theo vùng khí hậu, J. curcas thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nóng, nó
còn có thể sống tốt ở vùng nhiệt độ thấp và có thể chịu lạnh nhẹ. Nhu cầu về nước của
nó rất thấp và có thể chịu hạn trong thời gian dài bằng cách rụng lá để giảm lượng
thoát hơi nước (Lele và Satish, 2006; Nguyễn Công Tạn, 2008).
2.1.4. Đặc điểm hình thái
Cây nhỏ, cao trung bình 1- 3 m, những cây để tự phát triển có thể cao 5 m. Cành
mập, mọng nước, khó cháy, có các vấu nổi lên do sẹo của lá rụng để lại. Khi bị thương
sẽ chảy ra mủ trắng. Lá đơn, mọc so le, sẻ chân vịt, chia làm 3 - 5 thùy nông, dài 10 13 cm, rộng 8 – 11 cm. Hoa màu vàng, nhỏ, cùng gốc, mọc thành chùy tận cùng ngọn
cành hoặc nách lá. Hoa đực mọc ở đầu các nhánh với cuốn ngắn và có khuỷu. Hoa cái
mọc ở giữa nhánh với cuống không có khuỷu. Quả non mọng, có cuốn dài, lúc đầu
xanh lá cây sau chuyển sang vàng khi chín. Khi khô thành quả nang, hình trứng, nâu,
3


đen nhạt hay đỏ nhạt, mở theo 3 mép. Quả có 3 hạt, hạt có áo hạt hình trứng dài tùy

theo giống nhưng thường dài 2 cm, rộng 1 cm, nhẵn, màu đen nhạt, có khi đốm nhạt
(Lê Võ Định Tường, 2006).

Hình 2.2 Các bộ phận của cây J. curcas
A, B, C, D lần lượt là lá, hoa, quả và hạt của của J. curas (
forum.com/africa/jatropha_seeds.htm;
/>
2.1.5. Điều kiện sinh thái
Thường thấy ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.Thời tiết nóng và ẩm ướt thích
hợp cho sự nảy mầm và phát triển của cây. Cây thích nghi tốt với các vùng khô hạn, có
thể mọc trên đất đá, sỏi, có hàm lượng dinh dưỡng thấp. Nó thích ánh sáng trực tiếp.
Dầu mè là loài có khả năng thích nghi rộng, tiềm năng sinh trưởng của chúng thể hiện
ưu thế nhất trên đất khô và nghèo kiệt.
2.1.6. Giá trị của cây dầu mè
Cho năng suất từ 10 - 12 tấn/ha (phụ thuộc vào canh tác), hàm lượng dầu trong
hạt trung bình 32 - 35%. Đây là nguồn nguyên liệu dầu Diesel sinh học rất tiềm năng
để dần thay thế các tài nguyên nhiên liệu hoá thạch đang càng ngày càng bị cạn kiệt.
Cây dầu mè có chu kỳ sống dài (30 - 50 năm), khả năng cộng sinh với nấm rễ
Mycorrhiza cao, nên thích nghi sinh trưởng tốt trên những lập địa suy thoái, khô cằn
cỗi, thậm chí ô nhiễm và hoang hóa, do vậy cây có tác dụng cải tạo đất, cải tạo môi
4


trường rất tốt. Năng suất sinh học và hàm lượng chất dinh dưỡng cao, có thể sử dụng
bã ép dầu nguyên liệu làm phân bón hữu cơ, thành phần hoạt chất của phế liệu có khả
năng sử dụng làm chế phẩm phòng trừ sâu bệnh. Đây là loài cây có ý nghĩa to lớn
trong cải thiện đời sống cộng đồng các vùng nông thôn xa xôi, khó khăn, đất đai nghèo
kiệt, hoang hóa.
Ngoài ra, trong thành phần của cây có những hợp chất chủ yếu như tecpen,
flavon, coumarin, lipit, sterol và alkaloit. Nhiều bộ phận của cây này có thể chữa bệnh

như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu của hạt có thể nhuận
tràng; dịch nhựa trắng tiết ra từ vết thương của cành có thể trị viêm lợi, làm lành vết
thương, chữa trị bệnh trĩ và mụn cơm; nước sắc từ lá dùng để chữa trị bệnh phong
thấp, đau răng v.v. Trong cây dầu mè có nhiều thành phần độc tố, nhất là phytotoxin
(curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể tạo ra hợp chất mới về
nguồn dược, từ đó độc tố thực vật có thể trở thành một loại tài nguyên về nguồn dược
liệu mới.
2.2. Sự tái sinh in vitro
2.2.1. Cơ chế của sự tái sinh ở thực vật
Đặc tính vốn có của cây là khả năng khôi phục lại tính nguyên vẹn đó bằng sự tái
sinh. Khác với động vật, thực vật có khả năng tái sinh mạnh mẽ hơn nhiều, từ một bộ
phận tách rời khỏi cây mẹ trong điều kiện nhất định nó có thể tái sinh để tạo thành một
cây mới hoàn chỉnh. Sự tái sinh ở thực vật có thể chia thành 2 dạng là tái sinh sinh lý
và tái sinh bệnh.
Tái sinh sinh lý được hiểu như là sự thay thế những bộ phận đã mất đi và điều
này cần thiết cho đời sống của chúng, chẳng hạn như cây rụng lá vào mùa thu, mùa
đông, sang mùa xuân chúng lại tái sinh ra lá mới để đảm nhận chức năng quang hợp
tốt hơn.
Tái sinh bệnh là quá trình tái sinh do vết thương gây ra. Khi cây bị tổn thương sẽ
xuất hiện sự tái sinh để làm lành vết thương hoặc phục hồi các phần đã mất đi hay tái
sinh cho ra cơ quan mới để khôi phục tính nguyên vẹn của cây.
Khả năng tái sinh của thực vật rất khác nhau phụ thuộc vào đặc tính của loài,
giống, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, mùa vụ và điều kiện sinh thái. Từ lâu con
người đã biết sử dụng đặc tính tái sinh này trong việc nhân giống vô tính các loại cây

5


trồng thông qua biện pháp giâm cành, chiết cành, ghép mắt và nuôi cấy mô tế bào thực
vật in vitro.

2.2.2. Ý nghĩa của sự tái sinh trong quy trình chuyển nạp gen
Để tạo cây chuyển gen, trước hết phải tạo ra được cây tái sinh từ một bộ phận,
mô hoặc một tế bào duy nhất, phát triển trong môi trường nuôi cấy in vitro. Đây là
bước rất quan trọng trong quy trình tạo ra cây trồng chuyển gen. Nhờ con đường tái
sinh này khi ta đưa một đoạn T-DNA mang gen có ích vào tế bào thực vật, ta có thể
thu nhận cây tái sinh mang gen này. Trong quá trình xây dựng hệ thống tái sinh cần
xác định các chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, nồng độ các chất này, vật liệu tái sinh,
thời điểm tái sinh. Khi đã xác định được bộ phận nuôi cấy tốt nhất, môi trường nuôi
cấy thích hợp nhất thì hầu hết các thực vật đều có khả năng tái sinh.
2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái sinh
2.2.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc rất nhiều vào sự lựa
chọn môi trường dinh dưỡng, bao gồm cả chủng loại và nồng độ hóa chất sử dụng (Vũ
Văn Vụ, 1999); nhu cầu dinh dưỡng cho việc sinh trưởng tối ưu của các loài thực vật
là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng có ít nhiều
sự khác nhau.
Các hợp chất cung cấp nitơ (N)
Các hợp chất vô cơ chứa N được bổ sung vào môi trường in vitro dưới 2 dạng
nitrate (NO3-) và amon (NH4+). Lượng NO3- trong hầu hết các môi trường là nhiều hơn
NH4+. Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm nguồn N hữu cơ là các amino axit như Lglutamin hay L-asparagin (Narayanaswamy, 1994) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999).
Nguồn carbon
Đường được sử dụng làm nguồn carbon (C) cung cấp năng lượng cho các mô
nuôi cấy (Hu và ctv, 1979) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Ngoài ra, đường còn
đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Trong số nguồn carbon thì
saccharose là loại đường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô. Các loại
đường khác cũng thường được sử dụng glucose, mannitol và mantose.
Các vitamin
Hầu hết các mô nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cần
thiết cho quá trình sinh trưởng phát triển nhưng thường không đầy đủ về số lượng
6

(Czosnowski, 1952; Paris, 1958) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Vitamin có vai trò
xúc tác các quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào. Vì vậy, để các mô cấy đạt được
sự sinh trưởng tối ưu, người ta thường bổ sung vào môi trường một số vitamin như
thiamin (B1), axit nicotinic (B3), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Mỗi loài thực vật
sẽ cần số lượng và nồng độ các vitamin khác nhau.
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Đây là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy in vitro.
Nhóm auxin: bao gồm một số hợp chất có chứa nhân indol. Auxin có nguồn gốc
từ tiếng Hi Lạp là auxein có nghĩa là sinh trưởng. Auxin thúc đẩy quá trình phân chia
và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều
chỉnh sự phân hóa của rễ và chồi (Bhojwani và Razdan, 1983) (trích dẫn bởi Vũ Văn
Vụ, 1999). Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp với nồng độ sử dụng từ
0,1 - 2 mg/l tùy theo mục đích và vật liệu nuôi cấy. Nồng độ auxin thấp sẽ kích thích
sự phân hóa rễ và ngược lại nồng độ cao sẽ kích thích quá trình tạo mô sẹo. Thông
thường, người ta thường bổ sung các chất IBA, NAA vào trong môi trường để tạo rễ
và sử dụng chất 2,4-D để tạo mô sẹo.
Bảng 2.1 Một số auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro
Tên viết tắt
2,4-D
2,4,5-T
Dicamba
IAA
IBA
MCPA
NAA
NOA
Picloram
(Bayrac, 2004)

Tên hóa học
2,4-dichlorophenoxyacetic axit
2,4,5-trichlorophenoxyacetic axit
2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic axit
Indole-3-acetic axit
Indole-3-butyric axit
2-methyl-4-chlorophenoxyacetic axit
1-naphthyl acetic axit
2-naphthyloxy acetic axit
4-amino-2,5,6-trichloropicolinic axit

Cytokinin: là nhóm phytohoocmon dẫn xuất của adenin. Cytokinin được hình thành chủ
yếu trong hệ thống rễ và một số cơ quan đang sinh trưởng mạnh như chồi, lá non, quả non
(Vũ Văn Vụ và ctv, 1998). Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin là kích thích sự phân
chia tế bào mạnh mẽ, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo.

7


Bảng 2.2 Một số cytokinin được phổ biến trong nuôi cấy mô in vitro

Tên viết tắt
BAP
2iP (IPA)
Kinetin
Thidiazuron
Zeatin
BA
(Bayrac, 2004).

Tên hoá học
6-benzylaminopurine
N6-(2-isopentyl) adenine
6-furfurylaminopurine
1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) urea
4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl amino purine
benzyladenine

Theo Vũ Văn Vụ (1999), sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động
qua lại giữa 2 nhóm chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin. Tỷ lệ
auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích sự tạo chồi. Đây
là nguyên tắc chung, còn nồng độ cụ thể sẽ phụ thuộc vào từng loài thực vật.
2.2.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Yêu cầu về khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng phát triển của từng loại
cây in vitro cũng khác nhau. Thông thường, người ta nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ
phòng từ 25 - 280C. Theo các tác giả Shigenobu và Sakamoto (1981) (trích dẫn bởi Vũ
Văn Vụ, 1999) thì nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đổi
trong suốt thời gian nuôi cấy.
Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng (bao gồm cường độ, chu kỳ và thành phần quang phổ) có ảnh hưởng
mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Read, 1990; Dooley, 1991)
(trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999). Cường độ ánh sáng từ 2.500 – 3.500 lux thường
được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô. Cường độ ánh sáng lớn hơn thì sự sinh
trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ (Murashige, 1977) (trích
dẫn bởi Vũ Văn Vụ, 1999).
Thành phần quang phổ cũng có ảnh hưởng đáng kể đến mô nuôi cấy. Ví dụ nuôi
cấy cây quỳ thiên trúc Pelar gonium ở ánh sáng đỏ sẽ làm tăng chiều cao chồi trong
khi ánh sáng xanh lại có biểu hiện ức chế (Appelgen, 1991) (trích dẫn bởi Vũ Văn Vụ,

1999). Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng và
chất liệu của bình nuôi cấy.

8


2.2.4. Các nghiên cứu về vấn đề tái sinh cây J.curcas trong in vitro
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự nuôi cấy, phát
sinh phôi sinh dưỡng, chuyển gen và tái sinh cây đã được thực hiện khá nhiều bởi các
tác giả như Kim và ctv (2003, 2004, 2005); Rao và ctv (2006), Nakamura và Ishikawa(
2006).
Nghiên cứu về ảnh hưởng của loại mẫu và yếu tố tăng trưởng của thực vật lên sự
hình thành chồi từ J. curcas cũng được tiến hành. Mayuree Kaewpooa và Sompong
Te-chato (2009) đã khảo sát khả năng tạo chồi từ các loại mẩu khác nhau của cây J.
curcas như thân, mầm nách (axillary bud), đỉnh sinh trưởng (shoot tip). Tất cả được
nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA (0,5 mg/l) and IBA (0,25 mg/l) tạo ra số
chồi cao nhất lần lượt là 5,1; 5,3; và 5,25 trên một mẫu nuôi cấy sau 30 ngày nuôi cấy.
Chồi tái sinh được tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 - 40 ngày
nuôi cấy. Hệ thống tái sinh từ đĩa lá (leaf dish) của cây J.curcas đã được trình bày bởi
Deore và Johnson, 2008. Mầm chồi bất định được tạo ra từ lá non của cây con nảy
mầm in vitro và cây trưởng thành ngoài đồng khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ
sung TDZ 2,27 µM, 6-benzylaminopurine (BA) 2,22 µM và indole-3-butyric axit
(IBA) 0,49 µM. Sự hiện diện của TDZ trong môi trường có ảnh hưởng tốt lên việc tạo
mầm chồi bất định. Ngược lại nếu có BA mà không có TDZ thì kích thích tạo callus
hơn là tạo mầm chồi. Mầm chồi được nhân lên và kéo dài thành chồi khi chuyển lên
môi trường MS bổ sung BA 4,44 µM, kinetin 2,33 µM, indole-3-acetic axit (IAA) 1,43
µM và gibberellic axit (GA3) 0,72 µM. Chồi phát triển tốt được chuyển môi trường
tạo rễ gồm MS bổ sung IBA 0,5 µM sau 30 ngày. Kumar và Reddy (2010) nghiên cứu
tái sinh cây thông qua việc tạo trực tiếp chồi mầm (shoot buds) từ mẫu cuốn lá của
Jatropha curcas L. (không qua callus). Hiệu suất tạo mầm chồi cao nhất là 58,35%, số

mầm chồi trên 1 mẫu là 10,1 thu được khi đặt mẫu cuốn lá lên môi trường MS bổ sung
2,27 µM TDZ sau 6 tuần. Mầm chồi được tạo thành chuyển lên môi trường MS chứa
10 µM kinetin (Kn), 4,5 µM 6-benzyl aminopurine (BAP) và 5,5 µM αnaphthaleneacetic axit (NAA) để nhân chồi. Môi trường MS bổ sung 2,25 µM BAP và
8,5 µM IAA thích hợp nhất để kéo dài chồi, khoảng 3,01 - 3,91cm trong 6 tuần nuôi
cấy. Tác giả cho rằng hướng (ngang hoặc thẳng đứng) và nguồn (in vitro hay in vivo)
của mẫu cũng ảnh hưởng đến sự tái sinh cây. Môi trường 1/2 MS bổ sung 15 µM IBA;
5,7 µM IAA; 5,5 µM NAA and 0,25 mg/ L than hoạt tính thích hợp cho việc tạo rễ.
9


Kumar và ctv (2010) thực hiện tái sinh chồi từ lá mầm của Jatropha curcas. Đây là
phương pháp nhân giống đơn giản, đạt hiệu quả cao nhờ sự tái sinh thành cây thông
qua việc phát sinh cơ quan từ mẫu lá mầm của cây Jatropha curcas. Sử dụng môi
trường MS chứa TDZ thì có ảnh hưởng tốt hơn lên sự tái sinh so với BAP. Mầm chồi
được tạo ra chuyển lên môi trường MS chứa 10 µM kinetin (KN); 4,5 µM BAP và 5,5
µM a-naphthaleneacetic axit (NAA) cho sự nhân chồi. Chồi được nhân có thể kéo dài
trên môi trường MS chứa 2,25 µM BAP và 8,5 µM IAA cho kết quả tốt nhất. Rễ được
tạo thành khi ngâm chồi trong môi trường ½ MS lỏng trong 4 ngày sau đó chuyển lên
môi trường ½ MS không chất kích thích sinh trưởng bổ sung 0,25 g/l than hoạt tính.
2.3. Giới thiệu chung về chuyển gen ở thực vật
2.3.1. Khái niệm
Chuyển gen là quá trình chuyển đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) bằng các kĩ
thuật khác nhau (Agrobacterium, vi tiêm, bắn gen, xung điện v.v.) vào cơ thể của vật
chủ (động vật, vi sinh vật hay thực vật) (Trần Nguyễn Thúy An, 2007).
Thực vật chuyển gen: là thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vào một
cách nhân tạo thay vì thông qua lai tạo (www.agbiotech.com.vn).
2.3.2. Các biện pháp chuyển gen vào trong thực vật
2.3.2.1. Biện pháp sinh học
Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn gram âm sống trong đất, tác

nhân gây ra những khối u trên cây 2 lá mầm. Khi có một vết thương ở rễ cây, vi khuẩn
sẽ xâm nhập và tạo khối u, khối u này sẽ phát triển không giới hạn và có thể đạt đến 1
m đường kính ở một vài loại cây. Các khối u sẽ có nhiệm vụ tổng hợp một loại dinh
dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Theo Schell và Van Montagu (1974)
(trích dẫn bởi Trần Thị Lệ Minh, 2000) nguồn gốc của những gen tạo ra khối u nằm
trong một plasmid có kích thước khoảng 200 kb. Plasmid này được gọi là Ti-plasmid
(tumor-inducing plasmid), chứa nhiều gen, đặc biệt là những gen qui định khả năng tự
sao chép. Sự gắn kết giữa Agrobacterium vào tế bào cây bị thương được kiểm soát bởi
2 gen chvA và chvB định vị trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, 2 gen này thể hiện rất ổn
định trong tế bào vi khuẩn. Gen chvA và chvB chỉ có thể hoạt động khi Agrobacterium
ở gần các tế bào bị thương do những tế bào này tiết ra các phân tử truyền tín hiệu làm
cho gen ở vùng vir (virulence) của Ti-plasmid hoạt động. Các phân tử truyền tín hiệu
10


đã được ghi nhận là những hợp chất phenolic như acetosyringone (AS) và α-hydro
acetosyringone (OH-AS).
Sau khi xâm nhập vào tế bào thực vật, một phần nhỏ của Ti-plasmid là T-DNA
sẽ xâm nhập vào bộ gen của tế bào và biểu hiện. Các gen vir trên Ti-plasmid sẽ đóng
vai trò điều khiển quá trình xâm nhiễm. Có 6 loại gen vir là A, B, C, D, E và G. Gen
virA có nhiệm vụ truyền phân tử tín hiệu AS (acetosyringone) từ mô thực vật bị
thương xuyên qua màng vào tế bào vi khuẩn. AS sẽ hỗ trợ virG-protein để kích thích
sự thể hiện của các gen vir B, C, D, E. Sự thể hiện của các gen này giúp cắt T-DNA ra
khỏi Ti-plasmid và chuyển nó vào tế bào thực vật. Dựa vào đặc điểm này, người ta
tiến hành cải tiến Ti-plasmid bằng cách loại bỏ các gen gây khối u (oncogene) và chèn
thêm vào đó các gen mang tính trạng mong muốn. Tiến trình này được thực hiện bằng
cách sử dụng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) và enzyme nối (ligase).
Nuôi tế bào thực vật trong môi trường có vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã
cải tiến ta sẽ thu được những tế bào chuyển gen. Hiện nay, sử dụng Agrobacterium
tumefaciens là phương pháp phổ biến nhất trong chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao,

đặc biệt trên cây 2 lá mầm. Gen được chuyển nạp bằng phương pháp này tỏ ra rất ổn
định và thường di truyền các tính trạng theo định luật Mendel (De Block và ctv, 1984;
Muller và ctv, 1987; Hiei và ctv, 1996) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2004).
Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), phương pháp chuyển gen bằng
Agrobacterium tumefaciens không làm ảnh hưởng đến các bộ phận được chuyển gen
và các bộ phận này vẫn có thể sống và phát triển bình thường sau quá trình đồng nuôi
cấy với vi khuẩn. Quá trình chuyển nạp được xem là thành công khi có sự biểu hiện
của các gen thông báo và chỉ thị chọn lọc trong các mô thực vật. Tần số chuyển nạp từ
vi khuẩn vào tế bào thường phụ thuộc rất lớn vào loài thực vật, các điều kiện sinh
trưởng, giai đoạn sinh trưởng của thực vật. Tần số này còn phụ thuộc vào môi trường
nuôi vi khuẩn và mật độ vi khuẩn trong môi trường xâm nhiễm (infiltration medium).
2.3.2.2. Biện pháp cơ học
Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn
trong một điện trường cực mạnh để làm tăng khả năng xâm nhập của DNA cần chuyển
vào tế bào trần (Nagara, 1989) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
11


Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gen trên cả động
vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyết được về mặt kỹ
thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen thành công trên
cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và ctv, 1989), trên
cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu (Guerche và ctv, 1987) (trích dẫn
bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)
Phương pháp bắn gen được John Stanford ở Đại học Cornell phát minh (Klein và
ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Đây là phương
pháp chuyển nạp gen trực tiếp vào cây trồng. Ưu điểm của phương pháp này là có thể

áp dụng trên tất cả các loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần vector hai
nguồn (binary vector) và quy trình vận hành tương đối đơn giản.
Hiện nay có 3 loại dụng cụ bắn gen khác nhau:
- Loại 1: là một bộ phận cung cấp năng lượng giống như khẩu súng, gây nổ nhờ
một kim hỏa (Klein và ctv, 1987) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
2004).
- Loại 2: hoạt động theo nguyên tắc phóng điện đưa DNA phủ lên các phân tử
bằng vàng cực mịn (DNA–coated gold particles) (Christou và ctv, 1988) (trích dẫn bởi
Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
- Loại 3: hoạt động bằng áp suất của khí từ một xi lanh chứa khí trơ như helium
hoặc nitrogen. Vận tốc của vi đạn khi bắn bằng dụng cụ này chậm hơn rất nhiều so với
loại 1 nhưng nó tỏ ra rất có hiệu quả trong trường hợp chuyển plasmid DNA vào tế
bào cây trồng (Cao và ctv, 1991) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
2004).
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2004) trong quy trình bắn gen trước
tiên bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn
lên viên đạn plastic. Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng
các hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên vào
tế bào. Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các chất
chọn lọc thích hợp. Mô nhận gen sẽ xuất hiện mô sẹo sau 5 - 7 ngày nuôi cấy còn các
mô không nhận gen sẽ chết trong môi trường chọn lọc.
12


2.3.2.3. Biện pháp vật lí
Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)
Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực
vật. Phương pháp này chuyển nạp gen vào tế bào trần dưới dạng plasmid DNA dựa
trên nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập
gen lạ vào tế bào. Cao và ctv (1991) đã sử dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi 4,

Taipei 309 và Nipponbare trong thí nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG, kết
quả là đã thu được những tế bào trần mang các gen chuyển nạp (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 2004).
Theo Fritsch và Kovalchuk (2000), nhìn chung mỗi phương pháp chuyển gen đều
có các ưu nhược điểm riêng. Ví dụ phương pháp chuyển gen PEG có thể chuyển trực
tiếp gen mục tiêu vào tế bào trần (protoplast) hay chuyển gen bằng vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens qua mẫu lá thực vật còn có những hạn chế vì tế bào phải
trải qua quá trình tái sinh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô. Trong thực tế, có nhiều loài
thực vật rất khó tái sinh hoặc các tế bào nuôi trong môi trường tái sinh thường phát
sinh các biến dị soma và biến dị nhiễm sắc thể không mong muốn. Phương pháp sử
dụng súng bắn gen thường được áp dụng đối với những thực vật không phải là đối
tượng xâm nhiễm của Agrobacterium tumefaciens hay những đối tượng khó tái sinh.
Phương pháp này có thể áp dụng trên cây trưởng thành, trên tế bào mầm (germ line
cells) ở phát hoa. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi những máy
móc đắt tiền và quy trình bắn gen phải được thiết lập rất nghiêm ngặt.
2.3.3. Thành phần của gen chuyển nạp
2.3.3.1. Promoter
Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình
tự thích hợp đi kèm theo nó. Với mỗi promoter cần có các vector tương ứng. Hiện nay,
promoter CAMV35S của virus gây bệnh khảm trên cải bông là một promoter mạnh và
được sử dụng phổ biến nhất. Theo Heldt (1997) (trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn
Thị Lang, 2004) promoter này bao gồm các enhancer có khả năng chuyển mã ở mức
độ cao.
2.3.3.2. Gen thông báo (reporter gene)
Theo Jacobsen (2007) bất cứ phương pháp chuyển gen nào dù là chuyển nạp gen
gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium hay chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen
13