KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ MENTHONE Ở GIỐNG BẠC HÀ CHÂU Á (Mentha arvensis L.) ĐÃ ĐƯỢC CHIẾU XẠ VÀ CHIẾT XUẤT MENTHOL TRONG TINH DẦU BẠC HÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ
MENTHONE Ở GIỐNG BẠC HÀ CHÂU Á (Mentha arvensis L.)
ĐÃ ĐƯỢC CHIẾU XẠ VÀ CHIẾT XUẤT MENTHOL
TRONG TINH DẦU BẠC HÀ

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : TRƯƠNG THỊ TUYẾT TRINH
Niên khóa

: 2007 – 2011
Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL VÀ
MENTHONE Ở GIỐNG BẠC HÀ CHÂU Á (Mentha arvensis L.)
ĐÃ ĐƯỢC CHIẾU XẠ VÀ CHIẾT XUẤT MENTHOL
TRONG TINH DẦU BẠC HÀ

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

TRƯƠNG THỊ TUYẾT TRINH

ThS. TRỊNH THỊ PHI LY

Tháng 7/2011


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều Thầy, Cô
các anh chị và các bạn. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
 TS. Trần Thị Lệ Minh, ThS. Trịnh Thị Phi Ly đã trực tiếp hướng dẫn tôi
trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
 Các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Viện Công nghệ sinh học và Môi
trường trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
 Bạn Lucile Manon đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa
luận.
 Toàn thể các bạn lớp DH07SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và làm đề tài tốt nghiệp.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình đã luôn tạo
điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.
Chân thành cảm ơn.

Tháng 7 năm 2011
Trương Thị Tuyết Trinh

i


TÓM TẮT
Hiện nay, tinh dầu là nguồn nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp và cũng là nguồn
nguyên liệu xuất khẩu có giá trị cao ở nhiều nước trên thế giới, trong đó tinh dầu được
chiết xuất từ cây bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L) đang rất được ưa chuộng do
chúng có nhiều công dụng. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về tinh dầu và
những hợp chất thứ cấp trong tinh dầu bạc hà Á và gần đây đã có một số nghiên cứu về
ảnh hưởng của chiếu xạ lên cây bạc hà Á. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm
khảo sát những ảnh hưởng của chiếu xạ đến hàm lượng tinh dầu và menthol trong tinh
dầu bạc hà Á
Đề tài bao gồm những nội dung sau: tiến hành trồng và khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng
về số lá, số cành, chiều cao của cây bạc hà chiếu xạ và cây bạc hà không chiếu xạ (cây
đối chứng), so sánh hàm lượng tinh dầu, hàm lượng menthol và menthone trong cây
chiếu xạ và cây không chiếu xạ, tinh sạch menthol trong tinh dầu bạc hà bằng phương
pháp làm lạnh và phương pháp sử dụng dung môi.
Cây bạc hà chiếu xạ tăng trưởng về số lá, số cành, chiều cao nhanh hơn so với bạc hà
cây đối chứng. Hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone trong tinh dầu của cây chiếu
xạ cũng cao hơn cây đối chứng. Và phương pháp làm lạnh là tốt nhất để tinh sạch
menthol trong tinh dầu bạc hà.

ii


SUMMARY
Currently, essential oil is the raw material of many industries and it is also the

high value materials for export in the world, in which the essential oil from the mints
(Mentha arvensis L ) are very popular and useful. The world studied more about
essential oil and secondary compounds in mint oil and recently it has been several
studies on the effects of radiate to the mints (Mentha arvensis L ). So we made this
experiment to study the effects of radiate to mints oil and menthol in the mints oil
The goal of experiment: Surveying on the growth of the leaves, branches and body
height of the radiation mints, study essential oil in the radiation mints and the
control mints by the steam distillation, quantiative the yeild of menthol, menthone
in the radiation mints and the control mints by Gas chromatography, isolation
menthol in the essential oil by cooling method and using solvent method.
The radiation mint growth for leaf number, branch number, body height more
than the control mints. Essential oil, menthol and menthone is also higher than the
control mint. The cooling method is best for isolation menthol in the essential oil.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................................i
TÓM TẮT ............................................................................................................................ii
SUMMARY ....................................................................................................................... iii
MỤC LỤC...........................................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH .................................................................................................vi
Chương 1 MỞ ĐẦU............................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu .....................................................................................................................................2
1.3. Nội dung của đề tài ...................................................................................................................2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3

2.1 Giới thiệu về cây bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn) ..........................................................3
2.1.1 Phân loại..................................................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học ...........................................................................................................3
2.1.3. Đặc điểm sinh vật học ............................................................................................................4
2.1.4. Kỹ thuật trồng và thu hoạch ...................................................................................................6
2.2. Tinh dầu ....................................................................................................................................7
2.2.1. Giới thiệu về tinh dầu bạc hà .................................................................................................7
2.2.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn) .........................8
2.2.3. Phương pháp chưng cất hơi nước ........................................................................................10
2.2.4. Công dụng của tinh dầu bạc hà ............................................................................................12
2.3. Giới thiệu về sắc ký khí (GC) và sắc ký lớp mỏng (TLC) ......................................................12
2.3.1 Sắc kí khí (GC) .....................................................................................................................12
2.3.2. Sắc kí lớp mỏng (TLC) ........................................................................................................13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 14
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành..............................................................................................14
iv


3.2. Đối tượng thí nghiệm ..............................................................................................................14
3.3. Hóa chất thiết bị ......................................................................................................................14
3.4. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................................15
3.4.1. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà đã được
chiếu xạ ..........................................................................................................................................15
3.4.2. Xác đinh hàm lượng tinh dầu ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà chiếu xạ bằng
phương pháp chưng cất hơi nước...................................................................................................16
3.4.3. Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bạc hà bằng sắc ký khí ................19
3.4.4. Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà ...........................................................................19
3.5. Phương pháp xử lí số liệu .......................................................................................................21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 22
4.1.Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng của giống bạc hà Châu Á đã được chiếu xạ..............................22
4.2. Xác định hàm lượng tinh dầu ở giống bạc hà Châu Á đã được chiếu xạ bằng phương
pháp chưng cất hơi nước ................................................................................................................24
4.3. Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bằng sắc ký khí ..............................25
4.4 Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà Á ............................................................................27

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................... 31
5.1. Kết luận ...................................................................................................................................31
5.2. Đề nghị ....................................................................................................................................31

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 32

v


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Kết quả trắc nghiệm thống kê so sánh về chỉ tiêu chiều cao thân, số lá, số
cành của cây bạc hà Châu Á đã được chiếu xạ sau 70 ngày trồng……………………..22
Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng tinh dầu trong cây bạc hà Á đã được chiếu xạ………….24
Bảng 4.3 Kết quả đường chuẩn menthol trong tinh dầu bạc hà Á bằng sắc kí khí…….25
Bảng 4.4 Kết quả đường chuẩn menthone trong tinh dầu bạc hà Á bằng sắc kí khí…..25
Bảng 4.5 Kết quả hàm lượng (%) menthol, menthone trong tinh dầu cây bạc hà Á đã
được chiếu xạ bằng sắc kí khí………………………………………………………….26

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Mentha arvensis Linn ............................................................................. 3
Hình 2.2 Công thức cấu tạo của menthol .............................................................. 9
Hình 2.3 Công thức cấu tạo của menthone ......................................................... 10
Hình 3.1 Khay đất ươm bạc hà Á ........................................................................ 16

Hình 3.2 Cây bạc hà Á ngoài đồng ruộng ......................................................... 16
Hình 3.3 Tinh dầu bạc hà .................................................................................... 17
Biểu đồ 4.1 Sự tăng trưởng số lá của cây bạc hà Á đã được chiếu xạ ................ 22
Biểu đồ 4.2 Sự tăng trưởng số cành của cây bạc hà Á đã được chiếu xạ ............ 22
Biểu đồ 4.3 Sự tăng trưởng chiều cao của cây bạc hà Á đã được chiếu xạ......... 23
Biểu đồ 4.4 Đường chuẩn menthol trong mẫu tinh dầu ...................................... 25
Biểu đồ 4.5 Đường chuẩn menthone trong mẫu tinh dầu .................................... 26
Biểu đồ 4.6 So sánh hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bạc hà
Châu Á cây chiếu xạ và cây đối chứng ................................................................ 27
Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích tinh dầu ................................................................... 18

vi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Tinh dầu là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất dễ bay hơi, thường ở thể lỏng ở
nhiệt độ phòng, có mùi đặc trưng tuỳ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh
dầu. Phần lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật, chỉ có một số ít có nguồn gốc từ động
vật (cầy hương, chồn hôi, cá voi…).
Ở thực vật, tinh dầu được tạo ra và tích trữ trong các mô có vai trò dẫn dụ côn
trùng đến giúp cho hoa thụ phấn, góp phần bảo vệ cây chống lại sự xâm nhiễm của nấm
mốc, vi sinh vật và hỗ trợ cho sự phát triển của cây.
Trước đây, tinh dầu đơn thuần chỉ được xem như một nguồn dược liệu. Nhưng
hiện nay, tinh dầu đã được con người khai thác một cách triệt để hơn, do đó chúng có
rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm, hoá mỹ phẩm… Một
số tinh dầu đang được sử dụng nhiều hiện nay là: tinh dầu hoa hồng, tinh dầu tràm, tinh
dầu quế, tinh dầu cam chanh,… Trong đó, tinh dầu bạc hà từ cây bạc hà châu Á
(Mentha arvensis L.) đang rất được quan tâm
Do tinh dầu bạc hà và menthol trong tinh dầu có rất nhiều ứng dụng trong cuộc

sống nên vấn đề đặt ra ở đây là làm sao phải gia tăng được hàm lượng tinh dầu và hàm
lượng menthol trong cây bạc hà. Và gần đây đã có nhiều báo cáo thành công cho thấy
chiếu xạ có ảnh hưởng đến khả năng sản xuất hợp chất thứ cấp trong cây bạc hà.
Dựa trên những cơ sở đó và được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học
trường Đại Học Nông Lâm TPHCM và với sự hướng dẫn của cô Trần Thị Lệ Minh,
chúng tôi tiến hành đề tài “ Khảo sát hàm lượng tinh dầu, menthol và menthone ở giống
bạc hà Châu Á (Mentha arvensis L.) đã được chiếu xạ và tinh sạch menthol trong tinh
dầu bạc hà”

1


1.2. Yêu cầu
Xác định hàm lượng tinh dầu trong cây bạc hà chiếu xạ bằng phương pháp
chưng cất hơi nước
Sử dụng sắc kí khí để định lượng hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu
Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà
1.3. Nội dung của đề tài
Khảo sát và so sánh sự sinh trưởng và phát triển ở cây bạc hà chiếu xạ và cây
bạc hà đối chứng
So sánh hàm lượng tinh dầu trong cây chiếu xạ và cây đối chứng bằng phương
pháp chưng cất hơi nước
Sử dụng sắc kí khí để định lượng hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu ở
cây chiếu xạ và cây đối chứng
Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà bằng phương pháp làm lạnh và phương
pháp sử dụng dung môi.

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn)
2.1.1 Phân loại
Giới: Plantae
Phân nhóm: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Lamiales
Họ: Lamiaceae
Giống: Mentha
Loài: Mentha arvensis
Tên khoa học: Mentha arvensis L

Hình 2.1: Mentha arvensis L

Tên khác: Bạc hà nam – Nhân đơn thảo (Trung Quốc), Mentha (Pháp), Peppermint
(Anh)
2.1.2. Đặc điểm thực vật học
Rễ Bạc hà: thuộc loại rễ chùm, mọc từ các đốt thân ngầm dưới mặt đất và phân
bố ở tầng đất có độ sâu 20 - 30 cm. Rễ bạc hà thích hợp với độ ẩm khá cao khoảng
70-80% nhưng chúng không chịu được ngập úng. Thân ngầm không chứa tinh dầu
Thân, cành Bạc hà: thân bạc hà là thân thảo, thân và cành có nhiều đốt, các đốt ở
thân, cành có khả năng phát sinh thành rễ và phát sinh các mầm cành thứ cấp tại các
mắt đốt. Chiều cao của cây biến động trung bình từ 0,6 -1,2 m và là cây trồng một năm.
Màu sắc của thân cành bạc hà tùy thuộc vào giống (xanh đậm, xanh nhạt hoặc tím).
Thân chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỉ lệ tinh dầu
Lá Bạc hà: là lá đơn, mọc đối trên thân, có màu xanh hoặc đỏ tím, lá có hình
trứng, bầu dục cân đối hay thon dài, đầu lá nhọn . Mép lá có răng cưa và cả mặt trên và
lá đều có lông, mức độ nhiều hay ít là tùy vào giống. Chiều dài lá 4 - 8 cm, rộng 2 - 4
cm, phía trên và phía dưới bề mặt lá đều có chứa tinh dầu. Lá là nguyên liệu chính để
chưng cất tinh dầu chiếm khoảng 2,4 - 2,7 % tỉ lệ tinh dầu

3


Hoa Bạc hà: là loại hoa chùm, hoa lưỡng tính nên có các bộ phận như đài, cánh
hoa, nhị và nhụy. Đài có 5 cánh đối xứng hai bên, mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ.
Chiếm khoảng 4 - 6 % tỉ lệ tinh dầu.
2.1.3. Đặc điểm sinh vật học
2.1.3.1. Các thời kì sinh trưởng của cây bạc hà
 Thời kì mọc
Thời kì mọc được xác định từ lúc trồng đến khi cây mọc lên định rõ hàng, trong
điều kiện bình thường thời kì này có thể kéo dài từ 10 – 15 ngày, sau khi trồng một
thời gian các đốt thân ngầm mọc rễ, phát triển mầm trong điều kiện nhiệt độ

< 100C,

ẩm độ < 60 %.
Vì vậy cần chú ý bố trí thời vụ trồng thích hợp để cho bạc hà mọc đều
 Thời kì phân cành
Sau khi mọc từ 45 – 55 ngày, bộ rễ đã phát triển đầy đủ, các cây con phát triển
mạnh về chiều cao, các cành hai bên nách lá phát triển ra các cành mới.
Sự phân cành theo thứ tự từ các đốt thân chính xuất hiện mầm từ dưới gốc lên,
các đốt trên cao sẽ ngắn lại tạo cho dáng cây có dạng hình chóp. Trong thời kỳ này tốc
độ sinh trưởng và khối lượng chất xanh tăng mạnh, quyết định đến năng xuất bạc hà sau
này.
Chú ý các biện pháp canh tác kĩ thuật trong thời gian này như: cung cấp đầy đủ
các chất dinh dưỡng, nước, ánh sáng để cho tốc độ phát triển của cây tôt nhất.
 Thời kì ra nụ
Thời kì này kéo dài 10 – 15 ngày, biểu hiện tốc độ ra lá của cây chậm lại, tuy
nhiên cây vẫn phát triển kích thước thân lá, tại đỉnh sinh trưởng thân chính xuất hiện
mầm hoa, ở thời kì này khối lượng chất xanh vẫn tăng và sự tích lũy tinh dầu vẫn diễn

ra.
Trong thời kì này phải chú ý về dinh dưỡng, phải giảm đạm, tăng lượng phân
lân, các yêu cầu về ánh sáng, nhiệt độ trong giai đoạn này đòi hỏi cao nhất.

4


 Thời kì nở hoa
Thời kì ra hoa cây bạc hà đạt khối lượng chất xanh và hàm lượng tinh dầu cao
nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg chất xanh/ha). Vào thời kì hoa nở 50% trên
đồng ruộng là lúc hàm lượng tinh dầu trong cây đạt cao nhất, đây là thời điểm thu
hoạch tốt nhất. Nếu hoa nở 100% thì năng xuất tinh dầu giảm do lá rụng bớt đi.
Trong thời kì này chú ý đến các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ cao, gió
mạnh, khô hạn, úng sẽ làm cho hàm lượng tinh dầu giảm.
2.1.3.2. Yêu cầu sinh thái của cây bạc hà
 Nhiệt độ
Cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 – 270C, tròn
thời kì ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là từ 25 – 270C. Tuy nhiên trong điều kiện nhiệt
độ > 100C cây vẫn có thể sinh trưởng được. Trong thời kì tiềm sinh, bạc hà có thể chịu
đựng được nhiệt độ rất thấp dưới -10C. Như vậy tùy theo nhiệt độ trong vùng trồng mà
người ta bố trí thời vụ cho thích hợp. Thời gian sinh trưởng của cây bạc hà từ 80 – 90
ngày khi nhiệt độ trung bình từ 18 – 190C và 90 – 100 ngày khi nhiệt độ trung bình từ
15 – 160C. Vì vậy để có sinh khối về tỉ lệ tinh dầu cao cần bố trí thời vụ thích hợp.
 Ẩm độ
Cây bạc hà không yêu cầu độ ẩm một cách nghiêm ngặt, tuy nhiên trồng để đạt
năng suất cao về chất xanh và tỉ lệ tinh dầu nên chú ý và coi trọng vấn đề tưới tiêu
nước, do rễ bạc hà phát triển ở trên tầng đất mặt nên sức hút nước và dinh dưỡng, kém
hơn so với các loại cây trồng khác. Tưới tiêu, giữ ẩm là cơ sở cho việc tạo năng suất
cao của cây bạc hà, trong một chu kì sinh trưởng bạc hà cần lượng nước 5700 m3/1ha.
Ẩm độ đất thích hợp là 70 – 75 %, ẩm độ không khí từ 75 – 80 %.

 Ánh sáng
Cây bạc hà rất mẫn cảm với thời gian chiếu sáng và cường độ chiếu sáng. Để cây
sinh trưởng và phát triển bình thường thì yêu cầu độ chiếu sáng trong ngày < = 12giờ,
trong điều kiện ánh sáng ngày dài 14 – 16 giờ/ ngày, cây bạc hà sẽ chuyển từ sinh
trưởng dinh dưỡng sang sinh trưởng sinh thực. Ngược lại, độ dài ngày chiếu sáng 8 – 10
5


giờ, cây sẽ sinh trưởng yếu và không nở hoa. Cây bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt
trong điều kiện ánh sáng trực xạ. Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ
trồng mật độ trồng, không trồng xen kẽ để dảm bảo ánh sáng hợp lí cho chúng sinh
trưởng và phát triển tốt.
 Đất đai và dinh dưỡng
 Đất đai
Cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ, giàu dinh dưỡng, giữ nước
và thoát nước tốt. Các loại đất phù sa ven sông suối,các loại đất đen có tầng canh tác
tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho cây bạc hà.
Độ pH thích hợp cho cây bạc hà là 6 – 7,5, trên các loại đất trồng liên tục từ 2 –
3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để
giảm tỉ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất.
 Dinh dưỡng
Trong từng giai đoạn sinh trưởng bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau. Chú ý
bón phân vào các thời kì: khi cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát
sinh. Nguyên tố kali cần bón kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng
đến quá trình tích lũy tinh dầu.
2.1.4. Kỹ thuật trồng và thu hoạch
2.1.4.1. Kỹ thuật trồng
Phương pháp nhân giống chính áp dụng trong trồng bạc hà là nhân giống vô tính,
thường sử dụng thân ngầm để trồng, ngoài ra có thể dùng thân giải bò, thân non đem
trồng.

Thân ngầm dùng để nhân giống phải có màu trắng hoặc xanh nhạt, các đốt ngắn,
đường kính đốt lớn (khoảng 5mm), chiều dài hom 60 -70 cm, rửa sạch cắt thành từng
đoạn ngắn 15 – 20 cm đem đi trồng.
Trước khi trồng nên xử lí bằng cách ngâm vào dung dịch CuSO4 nồng độ 5 %
trong thời gian 15 phút để diệt các loại nấm bệnh.

6


Tốt nhất nên trồng bạc hà vào mùa xuân và trồng theo luống để chủ động trong
việc tưới và thoát nước. Chiều rộng của luống 1,5 – 2 m, rãnh sâu 20 cm, chiều dài
luống tối đa 30 m, trồng hàng cách hàng 30 - 35 cm, cây cách cây 10 - 12 cm.
Khối lượng chất xanh của cây bạc hà rất lớn, cho nên cây bạc hà yêu cầu lượng
phân lớn và đa dạng về chủng loại phân bón như phân hữu cơ, các loại vô cơ, phân đa
lượng, trung lượng và vi lượng.
Cần tưới nước và giữ ẩm sau khi trồng cũng như suốt thời gian sinh trưởng. Cây
rất kị úng vì vậy cần phải thoát nước tốt vào mùa mưa và chú ý phải làm sạch cỏ
thường xuyên.
2.1.4.2. Thời điểm và phương pháp thu hoạch
Bạc hà trồng 2 – 3 tháng có thể thu hoạch. Dùng liềm cắt sát gốc, thu hoạch toàn
bộ thân lá để cất lấy tinh dầu. Cây thu hoạch xong cần chuyển ngay đến nơi cất tinh
dầu. Nếu chưa kịp cất tinh dầu ngay thì cần trãi mỏng ở những nơi râm mát, tuyệt đối
không đánh đống hoặc bó chặt cây sẽ làm tăng độ ẩm nóng, cây dễ bị thối hỏng, tinh
dầu giảm sút nghiêm trọng. Phơi nắng hàm lượng tinh dầu cũng bị giảm sút.
Để có năng suất cao và phẩm chất tinh dầu tốt thì phải thu hoạch đúng thời vụ,
chứng cất kịp thời. Để thu hoạch bạc hà đúng lúc người ta dựa vào căn cứ sau:
Tùy thuộc từng giống mà có thời điểm thu hoạch thích hợp, có giống khi hoa nở
50 % thì hàm lượng tinh dầu cao nhất, cũng có những giống hoa nở 70% thì hàm lượng
tinh dầu đạt cao nhất.
Tùy thuộc vào thời tiết, tuổi cây, nên thu hoạch vào lúc nắng ấm và khô sương.

2.2. Tinh dầu
2.2.1. Giới thiệu về tinh dầu bạc hà
Tinh dầu là chất lỏng không màu hay vàng nhạt, có mùi thơm đặc biệt, vị cay, rất
dễ tan trong dung môi ethanol 900, tan trong 2 - 3 thể tích ethanol 700.
 Tính chất vật lý
- Lỏng ở nhiệt độ thường, có mùi thơm không màu hoặc màu nhạt.
7


- Chỉ số khúc xạ cao, có năng suất quay cực.
- Ít tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ, este, cồn, có tính sát trùng
mạnh.
- Tinh dầu là một hỗn hợp nên không có một độ sôi nhất định và chỉ số
khúc xạ, chỉ số quay cực thay đổi trong phạm vi nhất định.
- Dễ bay hơi, khuếch tán mạnh ở nhiệt độ bình thường.
- Tỷ trọng đa số là nhẹ hơn nước (Bạc hà, Sả, Cam, Chanh, Quýt, Bưởi).
Một số tinh dầu nặng hơn nước (Quế, Hương lài, Đinh hương).
- Tinh dầu dễ bị biến mùi khi có tác động của ánh sáng, nhiệt độ.
 Tính chất hóa học
Một số tinh dầu chỉ có một hợp chất như: Tinh dầu Mơ, hạt Đào, hạt Cải.
Nhưng phần lớn tinh dầu là hỗn hợp của nhiều hợp chất với những tỉ lệ thay đổi,
thành phần quan trọng nhất (về phương diện thơm) có khi chỉ ở một tỉ lệ rất thấp.
Một số hợp chất gặp trong thành phần tinh dầu:
- Hydrocarbon: Cacbur tecpenic (chiếm nhiều nhất), camphen, pinen, limonen,
caryophyllen, cacbur no: heptan, parafin.
- Rượu: Menthol, rượu methylic, ethylic, xinamic, xitronellol, geraniol,
tecpineol, linalol, santatlol, xeneol.
- Phenol và este phenolic: Anetol, eugenol, safrol, apiol, timol.
- Andehyde: Xiamic, salyxilic, xitral.
- Xeton: Comfo, thuyon, menthone.

- Acid (dưới dạng este): Acetic, butyric, benzoic xinamic, saliailic (Nguyễn
Kim Phi Phụng, 2009).
2.2.2. Thành phần hóa học trong tinh dầu bạc hà châu Á (Mentha arvensis Linn)
Thành phần các chất các chất có trong tinh dầu bạc hà Mentha arvensis Linn: α –
pinene 0,13%, β – terpinene 0,09%, β – pinene 0,19%, β – myrcene 0,17%, 3 – octanol
0,66%, limonene 0,51%, eucalyptol 0,09%, terpineol Z – β 0,05%, isopulegol 0,43%,
menthone 8,09%, isomenthone 1,64%, neomenthol 1,91%, menthol 80,92%,
8


isomenthol 0,13%, α – terpineol 0,16%, pulegone 0,48%, piperitone 0,6%, thymol
0,4%, β – bourbonene 0,11%, caryophyllene 0,84%, α – caryophyllene 0,11%,
germacrene D 0,99%, β – bisabolene 0,7% (Nguyễn Trung Tín, Nguyễn Phương Vỹ,
2008).
Thành phần chủ yếu trong tinh dầu bạc hà là menthol và menthone.
 Menthol
Menthol C 10 H 19 O là một terpenoid, ở trạng thái rắn trong điều kiện nhiệt độ
phòng, không màu, trong suốt, không tan hoặc ít tan trong nước, nhưng tan trong dung
môi hữu cơ. Menthol trong tinh dầu chủ yếu ở trạng thái tự do nhưng một phần ở dạng
kết hợp với acid acetic – dạng este. Cả dạng este và dạng tự do cộng lại gọi là menthol
toàn phần. Trong công thức cấu tạo, menthol có chứa nhóm chức _OH vì vậy menthol
cũng có những tính chất hóa học giống như rượu thường (Nguyễn Trần Lâm Thanh,
2010).

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của menthol
 Menthone
Menthone là một hợp chất hữu cơ có công thức phân tử C 10 H 8 O, là một
monoterpen có công thức cấu tạo tương tự với menthol, chỉ khác nhau ở nhóm chức
_OH được thay thế bằng oxi.
Menthone được tổng hợp bằng cách nung nóng menthone với acid chromic.

9


Hình 2.3 Công thức cấu tạo của menthone
2.2.3. Phương pháp chưng cất hơi nước
Phương pháp chưng cất hơi nước dựa trên sự khuếch tán, thẩm thấu, hòa tan và
lôi cuốn theo hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi
tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao.
Dựa trên thực hành người ta chia các phương pháp cưng cất hơi nước ra ba loại
chính: chưng cất bằng nước, chưng cất bằng nước và hơi nước, chưng cất bằng hơi
nước
2.2.3.1. Phương pháp chưng cất bằng nước
Nước được phủ kín nguyên liệu, nhưng phải chừa một khoảng không gian tương
đối lớn phía trên lớp nước, để tránh khi nước sôi mạnh làm văng chất nạp qua hệ thống
hoàn lưu.
Sự chưng cất này thường không thích hợp với những tinh dầu dễ bị thủy giải.
Những nguyên liệu xốp và rời rạc rất thích hợp cho phương pháp này. Những cấu phần
có nhiệt độ sôi cao, dễ tan trong nước sẽ khó hóa hơi trong khối lượng lớn nước phủ
đầy, khiến cho tinh dầu sản phẩm sẽ thiếu những hợp chất này.
2.2.3.2. Phương pháp chưng cất bằng nước và hơi nước
Trong phương pháp này, nguyên liệu được xếp lên trên một vỉ đục lỗ và nồi cất
được đổ nước sao cho nước không chạm đến vỉ. Nhiệt cung cấp có thể là ngọn lửa đốt
10


trực tiếp hoặc dùng hơi nước từ nồi hơi dẫn vào lớp bao chung quanh phần đáy nồi. Ta
có thể coi phương pháp này là một trường hợp điển hình của phương pháp chưng cất
bằng hơi nước với hơi nước ở áp suất thường. Như vậy chất nhưng tụ sẽ chứa ít sản
phẩm phân hủy hơn trường hợp chưng cất bằng hơi nước trực tiếp, nhất là ở áp suất cao

hay hơi nước quá nhiệt.
Việc chuẩn bị nguyên liệu trong trường hợp này quan trọng hơn nhiều so với
phương pháp trước, vì hơi nước tiếp xúc với chất nạp chỉ bằng cách xuyên qua nó nên
phải sắp xếp thế nào cho chất nạp tiếp xúc tối đa với hơi nước thì mới có kết quả tốt.
Muốn vậy thì chất nạp nên có kích thước đồng đều không sai biệt nhau quá.
Nếu chất nạp được nghiền quá mịn, nó dễ tụ lại vón cục và chỉ cho hơi nước đi
qua một vài khe nhỏ do hơi nước tự phá xuyên lên. Như vậy phần lớn chất nạp sẽ
không được tiếp xúc với hơi nước. Ngoài ra, luồng hơi nước đầu tiên mang tinh dầu có
thể bị ngưng tụ và tinh dầu rơi ngược lại vào lớp nước nóng bên dưới gây hư hỏng thất
thoát. Do đó việc chuẩn bị chất nạp cần được quan tâm nghiêm túc và đòi hỏi kinh
nghiệm tạo kích thước chất nạp cho từng loại nguyên liệu.
Tốc độ chưng cất trong trường hợp này không quan trọng như trong trường hợp
chưng cất bằng hơi nước. Tuy nhiên tốc dộ nhanh sẽ có lợi vì ngăn được tình trạng quá
ướt của chất nạp và gia tăng vận tốc chưng cất.
Về sản lượng tinh dầu mỗi giờ được tạo ra bằng phương pháp này cao hơn so với
phương pháp chưng bằng nước nhưng vẫn thấp hơn phương pháp chưng cất bằng hơi
nước.
2.2.3.3. Phương pháp chưng cất bằng hơi nước
Hơi nước được tạo ra từ nồi hơi (thường áp suất cao hơn không khí) được đưa
thẳng vào bình chưng cất. Ngày nay, phương pháp này được thường dùng để chưng cất
tinh dầu từ nguyên liệu thực vật.
Hơi nước dùng trong phương pháp này không được quá nóng và quá ẩm. Nếu
quá nóng các cấu phần có nhiệt độ sôi thấp sẽ bị phân hủy hoặc nguyên liệu bị khô quăn

11


khiến hiện tượng thẩm thấu không xảy ra. Nếu quá ẩm sẽ sinh hiện tượng ngưng tụ,
nguyên liệu ở phía dưới sẽ bị ướt.
Thực tế khi chưng cất, ta nên bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và

cao dần cho đến khi kết thúc.
2.2.4. Công dụng của tinh dầu bạc hà
Cây bạc hà, tinh dầu và hoạt chất menthol trong cây bạc hà được người ta sử
dụng với nhiều cách khác nhau:
Lá bạc hà giúp cho tiêu hóa, trừ co thắt, trị nôn (do có tinh dầu). Các flavanoid
có tác dụng lợi mật. Trong y học cổ truyền người ta dùng bạc hà làm thuốc chữa cảm
nóng, nhức đầu, ho, viêm khí quản, mụn nhọt, lở ngứa.
Tinh dầu bạc hà dùng để chữa cảm lạnh nhứt đầu, chóng mặt, say tàu xe...Nó
còn là chất thơm trong công nghiệp thuốc lá, thuốc đánh răng, kẹo , mỹ phẩm...
Menthol có tính sát khuẩn, tiếp xúc với da gây cảm giác mát và tê tại chỗ (do
hiện tượng bay hơi)
2.3. Giới thiệu về sắc ký khí (GC) và sắc ký lớp mỏng (TLC)
2.3.1 Sắc kí khí (GC)
Máy sắc kí khí là một thiết bị không thể thiếu trong việc nghiên cứu về tinh dầu.
Có hai loại cột được sử dụng trong các máy sắc kí khí là cột nhồi (paked column,
colonne remplir) và cột mao quản (capillary column, colonne capillary). Cột mao quản
có độ phân giải tốt hơn.
Nguyên tắc của sắc kí khí là mỗi cấu phần trong tinh dầu sẽ bị hấp thụ trên pha
tĩnh của cột phân tích khác nhau. Trên cơ sở khác nhau về thời gian lưu này mà người
ta có thể định tính và định lượng cấu tử cần nghiên cứu.
Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc kí là hệ thống cột tách và detector.
Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào các cột tách nằm trong buồng
điều nhiệt. Quá trình sắc kí xảy ra ở đây, sau khi các cấu tử rời bỏ cột tách tại các thời
điểm khác nhau các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín

12


hiệu điện, tín hiệu này được khuếch đại và xử lý trên hệ thống máy tính thành các peak
khác nhau về cả chiều cao và diện tích.

Trên sắc kí đồ ta thu được các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak.
Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng cho chất cần tách (định tính) còn diện
tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu.
2.3.2. Sắc kí lớp mỏng (TLC)
Là kỹ thuật tách các chất khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, trên đó ta đặt
hỗn hợp các chất cần phân tách.
Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo yêu cầu cần phân tách được trải
thành một lớp mỏng và được cố định trên các phiến kính hay kim loại.
Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỉ lệ
phù hợp cho từng yêu cầu phân tích.
Khi di chuyển qua lớp hấp phụ, các thành phần trong mẫu được di chuyển trên
lớp mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau. Trong quá trình di chuyển,
các thành phần được giữ lại ở những khoảng cách khác nhau tùy theo đặc điểm của
chúng. Kết quả ta thu được một sắc kí đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức
độ di chuyển của các chất phân tách là hệ số di chuyển R f được định tính bằng tỉ lệ
giữa khoảng cách di chuyển của chất thử và khoảng cách di chuyển của dung môi.
R f = (khoảng cách di chuyển của chất thử)/ (khoảng cách đường di chuyển của dung
môi)
R f chỉ có giá trị từ 0 đến 1
R f của chất cần phân tách bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố nên có nhiều thay đổi
giữa các lần thực hiện. Vì vậy nên triển khai song song với các chất chuẩn hoặc chất đối
chiếu. Khi đó,ta có hệ số dịch chuyển R r. Hệ số dịch chuyển tương đối R r được xác
định bằng tỉ số giữa khoảng cách di chuyển của vết chất phân tách và khoảng cách di
chuyển của vết chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều kiện và trên cùng bản mỏng với
chất phân tách.
R r = (khoảng cách di chuyển của chất thử)/ (khoảng đường di chuyển của chất chuẩn)
13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành
Thời gian: từ tháng 10/2010 đến tháng 6/2011
Địa điểm trồng cây: cây được trồng tại Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi
trường thuộc Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2. Đối tượng thí nghiệm
Giống cây: Thí nghiệm được tiến hành trên giống bạc hà Á (Mentha arvensis L.)
Mẫu thí nghiệm:
• Mẫu trồng ở vườn ươm: Cây bạc hà invitro 4 tuần tuổi đã được chiếu xạ
trong quá trình nuôi cấy mô
• Mẫu chiết xuất tinh dầu: bao gồm lá và thân của cây bạc hà 3 tháng tuổi.
3.3. Hóa chất thiết bị
Hóa chất sử dụng trong chiết xuất tinh dầu: dietyl ether (Trung Quốc),
natrisulphate (Trung Quốc), natriclorua (Trung Quốc).
Hóa chất sử dụng trong chiết xuất menthol: heptane (Trung Quốc), methanol
(Trung Quốc), natrisulphate (Trung Quốc).
Hóa chất sử dụng trong sắc kí lớp mỏng: ethylacetate (Trung Quốc), toluene
(Trung Quốc), dietylether (Đức), vanillin (Pháp), acid sunfuric (Trung Quốc), ethanol
(Trung Quốc), menthol (Ấn Độ).
Thiết bị:
• Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức).
• Bộ chưng cất hơi nước Clevenger (Ấn Độ).
• Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R – 200 – Buchi (Thụy Sĩ).
• Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Aligent technologies (Mỹ).
14


• Bộ dụng cụ sắc ký lớp mỏng (Đức).
3.4. Nội dung nghiên cứu

Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của giống bạc hà Châu Á khi được chiếu
xạ.
Xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước.
Xác định hàm lượng menthol, menthone trong tinh dầu bằng sắc ký khí (GC).
Chiết xuất menthol trong tinh dầu bạc hà bằng phương pháp sử dụng dung môi
và phương pháp làm lạnh
3.4.1. Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà
đã được chiếu xạ
Mục đích thí nghiệm : So sánh chỉ tiêu tăng trưởng của cây đối chứng và
cây chiếu xạ.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, gồm 2
nghiệm thức: cây không chiếu xạ (cây đối chứng) và cây chiếu xạ. Mỗi nghiệm thức
bao gồm 30 cây được trồng ngoài đồng ruộng. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu: chiều
cao thân, số lá, số cành.
Phương pháp trồng cây: đất trồng được phối trộn theo tỉ lệ 1:1:1 (đất: phân
chuồng: tro trấu). Cây bạc hà sau khi được nuôi cấy mô, đưa ra ngoài vườn ươm và
được trồng trong các khay xốp (Hình 3.1), mỗi cây cách nhau 5 – 8 cm. Tưới nước
phun sương ngày 2 lần sáng và chiều.
Sau khoảng 3 – 4 tuần, cây con có độ cao trung bình từ 5 – 10 cm được trồng ra
ngoài đồng ruộng với mật độ 10 cm/ 1cây (Hình 3.2).
Cây được tưới nước 1 lần/ 1 ngày. Bón phân urê sau 14 và 28 ngày trồng, sau đó
bón phân N – P – K sau 42 ngày và 56 ngày trồng.

15


Hình 3.1 Khay đất ươm bạc hà Á

Hình 3.2 Cây bạc hà Á ngoài đồng ruộng

3.4.2. Xác đinh hàm lượng tinh dầu ở cây bạc hà đối chứng và cây bạc hà chiếu xạ
bằng phương pháp chưng cất hơi nước
Mục đích thí nghiệm : so sánh hàm lượng tinh dầu ở cây bạc hà đối chứng
và cây bạc hà chiếu xạ.
Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức (cây chiếu xạ và đối chứng), được bố trí theo
kiểu ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Các cây được trồng trong vòng 70 ngày. Sau đó thu hoạch toàn bộ sinh khối
(thân và lá), được bảo quản trong tủ lạnh và đưa về cùng độ ẩm. Tiến hành ly trích tinh
dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước. Cho nước cất và nguyên liệu vào bình cầu,
đun nóng và giữ nhiệt độ hơi nước khoảng 80 – 1000C. Sau 3 – 4 giờ ngừng chưng cất,
để nguội 15 phút, lấy tinh dầu ra, khử nước bằng Na 2 SO 4 (Sơ đồ 3.1)
Tinh dầu sau khi ly trích được bảo quản ở 40C trong các lọ thủy tinh tránh ánh
sáng.

16


Hàm lượng tinh dầu được xác định bằng công thức:
Khối lượng tinh dầu
Hàm lượng tinh dầu (%) =

x 100
Khối lượng mẫu khô

Hình 3.3 Tinh dầu bạc hà

17