CỐ ĐỊNH GLUCOAMYLASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHỐT TRÊN GEL Na – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG THỦY PHÂN TINH BỘT KHOAI MÌ TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CỐ ĐỊNH GLUCOAMYLASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHỐT
TRÊN GEL Na – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG THỦY PHÂN
TINH BỘT KHOAI MÌ TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE

Họ và tên sinh viên : VÕ VĂN THỪA
Ngành

: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 08 năm 2011


CỐ ĐỊNH GLUCOAMYLASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHỐT TRÊN
GEL Na – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG THỦY PHÂN TINH BỘT
KHOAI MÌ TẠO ĐƯỜNG GLUCOSE

Tác giả

VÕ VĂN THỪA

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngành
CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

Giáo viên hướng dẫn
TS. VŨ VĂN ĐỘ
CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 08 năm 2011
i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin cảm ơn cha mẹ và người thân trong gia đình đã thương
yêu, khuyến khích và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con được sống và học tập trong
suốt những năm tháng qua.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Vũ Văn Độ và cô Đỗ Thị Tuyến phòng
Các chất có hoạt tính sinh học đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, sửa
luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất và thiết bị để em hoàn thành luận văn này.
Xin cảm ơn các cô chú, anh chị cán bộ Viện sinh học nhiệt đới TP.HCM đã tận tình
giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực tập tốt nghiệp tại đây.
Chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ
Hóa – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Và bạn bè, các bạn đã luôn bên tôi, dành những tình cảm tốt đẹp cho tôi, động
viên tôi những khi tôi vấp ngã. Tôi cũng cám ơn các bạn đã làm đề tài tốt nghiệp tại
phòng Các chất có hoạt tính sinh học đã giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn, thất bại
trong phòng thí nghiệm, đã cho tôi thêm niềm tin để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này.
Cuối cùng em xin chúc TS. Vũ Văn Độ, CN. Đỗ Thị Tuyến, quý Thầy Cô trong
Bộ môn Công Nghệ Hóa cùng toàn thể các bạn dồi dào sức khỏe và thăng tiến trên con
đường sự nghiệp.

Tp HCM, tháng 08 năm 2011
Sinh viên

Võ Văn Thừa.

ii


TÓM TẮT
Tên đề tài “ Cố định enzyme Glucoamylase bằng phương pháp nhôt trên gel
Na – Alginate và ứng dụng thủy phân tinh bột khoai mì tạo đường glucose ”.
Sinh viên thực hiện: Võ Văn Thừa
Đơn vị: Lớp DH07HH, Bộ môn Công nghệ Hóa, Đại Học Nông Lâm TP.HCM.
Thời gian thực hiện từ tháng 02 đến tháng 06/2011.
Địa điểm : phòng Các chất có hoạt tính sinh học – Viện Sinh Học Nhiệt Đới
TP.HCM. Địa chỉ : 9/621 khu phố 6 – phường Linh Trung – Thủ Đức – TP. Hồ Chí
Minh .
Kết quả.


Thu nhận được GA từ nấm mốc Asp. kawasaki trên môi trường bán rắn

với tỷ lệ cám gạo : bã khoai mì là 3 : 2 có bổ sung khoáng tối ưu, đổ ẩm môi trường
45%.


Đã tinh sạch được GA thu nhận (độ tinh sạch 4,726 lần và hiệu suất là

69,985 %), GA có khối lượng phân tử khoảng 23 – 74 kDa.


Thông số cố định tối ưu với nồng độ natrialginate là 3 % và nồng độ GA



GA cố định hoạt động tối ưu ở các điều kiện: pH = 6; nhiệt độ là 70 0C

là 5 %.
so với GA hòa tan là pH 4; nhiệt độ là 60 0C.


Khả năng tái sử dụng là 7 lần, hoạt tính giảm xuống gần 50 %.



Đối với quá trình thủy phân, điều kiện tối ưu trong quá trình dịch hóa là

nồng độ Termamyl 0,2 %, nồng độ tinh bột 25 %, thời gian dịch hóa khoảng 20 – 30
phút.


Tối ưu hóa các điều kiện trong quá trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo

đương glucose và thu được phương trình hồi qui


Tạo sản phẩm glucose với hàm lượng đường là 85,20 %.

iii

SUMMARY
Project: “Studying the Immobilization Glucoamylase in

Na - Alginate and

application in hydrolysis tapioca starch create glucose sugar”.
Practical student: VO VAN THUA
Address: class DH06HH, major Chemical Engineering, Chemical Engineering
Department, University of Agriculture and Forestry HCM City.
Instuctor: Dr. VU VAN DO; BA. DO THI TUYEN.
Place: Institute of Tropical Biology.
 Purpose:
 Survey of conditions appropriate to immobilize enzymes.
 Compared the effects of environmental factors (pH, temperature) on enzyme
activity before and after immobilization between enzyme from Asp.kawasaki
and commercial enzyme.
 Determine the optimal conditions to the process of tapioca starch hydrolysis
produces glucose.
 Method:
 To study overview document.
 To find out the suitable factors in the experiments.
 Results:
 Obtained glucoamylase from Asp. kawasaki on the semi-solid environment
rate of rice bran: tapioca residue is 3 : 2 has optimized mineral supplement,
relative humidity 45%.
 Purification of GA from Asp.kawasaki by the techniques of gel filtration
chromatography, the purity about 4 times and efficiency is 69,985 %, GA has
a molecular weight of about 23 – 74 kDa.
 Fixed parameter optimization with concentration of natrialginate is 3% , and

concentration of GA is 5%.


 Immobilized glucoamylase has optimum degree of activity in acetate buffer at
pH 6, temperature 70 0C and dissolve enzyme is pH 4 temperature 60 0C.
 The ability to reuse is 7 times
 Optimal conditions during process tapioca starch hydrolysis by α – amylase
at concentration of Termamyl is 0,2 %, concentration of starch is 25 %,
Hydrolysis time 30 minutes.
 Regression equation glucoamylase concentration, hydrolytic temperature, pH
and reaction time
Y = -2857,27 + 50,9103*x 1 + 58,1003*x 3 + 398,865*x 4 – 6,13216*x 1 *x 2 1,03679*x 1 *x 3 – 7,99395*x 1 *x 4 – 6,33811*x 2 *x 3 – 12,3428*x 2 *x 4 –
7,76758*x 3 *x 4

+

0,128569*x 1 *x 2 *x 3

+

0,256398*x 1 *x 2 *x 4

0,158948*x 1 *x 3 *x 4 + 0.31200x 2 *x 3 *x 4 – 0,006182*x 1 *x 2 *x 3 *x 4.
R2 = 88,7 %
Where :
 x 1 : enzyme concentration.
 x 2 : pH
 x 3 : hydrolytic temperature.
 x 4 : reaction time.
 Create products with sugar glucose is 85,20%.

+


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ........................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... ii
Tóm tắt ............................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ viii
Danh sách các hình ......................................................................................................... ix
Danh sách các bảng ......................................................................................................... x
Danh sách sơ đồ – đồ thị – biểu đồ................................................................................. xi
Chương 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2. Mục đích đề tài .................................................................................................. 2
1.3. Nội dung đề tài................................................................................................... 3
Chương 2. TỔNG QUAN................................................................................................ 4
2.1. Tổng quan về GA............................................................................................... 4
2.1.1. Giới thiệu về amylase ................................................................................ 4
2.1.2. Phân loại hệ enzyme amylase .................................................................... 4
2.1.2.1. α – amylase (endo – 1,4 – a – D – glucan glucohydrolaza) ............. 5
2.1.2.2. β – amylase (a – 1,4 – glucan maltohydrolase) ................................ 5
2.1.2.3. γ – amylase hay glucoamylase .......................................................... 5
2.2. Nguồn thu nhận.................................................................................................. 7
2.3. Ứng dụng của GA .............................................................................................. 7
2.4. Cơ chất của GA.................................................................................................. 8
2.4.1. Tinh bột ..................................................................................................... 8
2.4.1.1. Đặc điểm ........................................................................................... 8

2.4.1.2. Tính chất ........................................................................................... 8
2.4.2. Glycogen ................................................................................................... 9
2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp GA..................................................... 10
2.5.1. Ảnh hưởng của pH .................................................................................. 10
2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .......................................................................... 11

iv


2.5.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng .................................................. 11
2.5.4. Ảnh hưởng của ẩm độ. ............................................................................ 11
2.5.5. Ảnh hưởng của thời gian thu nhận enzyme............................................. 12
2.6. Sơ lược về enzyme cố định .............................................................................. 12
2.6.1. Định nghĩa ............................................................................................... 12
2.6.2. Các phương pháp cố định enzyme .......................................................... 12
2.6.2.1. Phương pháp hấp phụ vật lý............................................................ 12
2.6.2.2. Phương pháp đưa enzyme vào khuôn gel ....................................... 13
2.6.2.3. Phương pháp hóa học ...................................................................... 14
2.6.2.3.1. Phương pháp liên kết ion ........................................................ 14
2.6.2.3.2. Phương pháp gói enzyme trong bao cực nhỏ ......................... 14
2.6.2.3.3. Phương pháp tạo các liên kết chéo giữa các phân tử enzyme 14
2.6.2.3.4. Phương pháp gắn enzyme vào chất mang rắn bằng liên kết
cộng hóa trị ........................................................................... 15
2.7. Khái quát về chủng nấm mốc Asp.kawasaki. .................................................. 16
2.8. Tổng quan về cây khoai mì và tinh bột khoai mì ............................................ 16
2.8.1. Tinh bột sắn – nguồn nguyên liệu sản xuất glucose................................ 16
2.8.2. Đặc điểm về cây khoai mì ....................................................................... 17
2.8.3. Đặc điểm của tinh bột khoai mì .............................................................. 18
2.8.4. Ứng dụng của tinh bột khoai mì .............................................................. 19
2.8.4.1. Trong công nghệ thực phẩm ........................................................... 19

2.8.4.2. Trong công nghiệp giấy .................................................................. 19
2.9. Tổng quan về Glucose ..................................................................................... 19
2.9.1. Khái niệm ................................................................................................ 19
2.9.2. Đặc điểm của glucose .............................................................................. 20
2.9.3. Phương pháp sản xuất glucose ................................................................ 20
2.9.4. Ứng dụng ................................................................................................. 21
2.10. Thu nhận enzyme từ VSV bằng phương pháp lên men bề mặt .................... 22
2.10.1.Khái quát ................................................................................................. 22
2.10.2.Ưu điểm ................................................................................................... 22
2.10.3.Nhược điểm ............................................................................................. 22
2.10.4.Phương pháp ............................................................................................ 22

v


Chương 3. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 23
3.1. Thời gian và địa điểm ...................................................................................... 23
3.2. Vật liệu và hóa chất ......................................................................................... 23
3.2.1. Chủng nấm. ............................................................................................. 23
3.2.2. Môi trường ............................................................................................... 23
3.2.3. Thiết bị thí nghiệm .................................................................................. 24
3.2.4. Hóa chất ................................................................................................... 24
3.2.5. Dung dịch và đệm.................................................................................... 25
3.3. Nội dung thực hiện và phương pháp nghiên cứu............................................. 25
3.3.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 25
3.3.2. Phương pháp thực hiện ............................................................................ 26
3.3.2.1. Nuôi cấy và thu nhận GA................................................................ 26
3.3.2.1.1. Cấy chuyền nấm mốc Asp. Kawasaki ....................................... 26
3.3.2.1.2. Nuôi cấy mốc Asp. kawasaki trên môi trường bán rắn ............. 27
3.3.2.1.3. Trích ly GA từ sinh khối mốc Asp. kawasaki ........................... 27

3.3.2.2. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel ............................................ 28
3.3.2.2.1. Nguyên tắc ................................................................................. 28
3.3.2.2.2. Tiến hành ................................................................................... 29
3.3.2.3. Phân tích GA bằng điện di trên gel polyacrylamide (Polyacrylamide
Gel Electrophoresis). ....................................................................... 31
3.3.2.3.1. Nguyên tắc ................................................................................. 31
3.3.2.3.2. Tiến hành ................................................................................... 31
3.3.2.3.3. Phương pháp tính toán kết quả .................................................. 32
3.3.2.4. Xác định hoạt tính enzyme.theo phương pháp Miller .................... 33
3.3.2.5. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. ............ 35
3.3.2.6. Hoạt tính riêng của enzyme ............................................................ 36
3.3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên hoạt tính của GA ............ 36
3.3.2.7.1. Ảnh hưởng của pH .................................................................... 36
3.3.2.7.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................ 37
3.3.2.8. Cố định enzyme .............................................................................. 37
3.3.2.8.1. Phương pháp .............................................................................. 37
3.3.2.8.2. Xác định hiệu suất cố định enzyme .......................................... 38
3.3.2.8.3. Số lần tái sử dụng của GA cố định ............................................ 38
vi


3.3.2.9. Thủy phân tinh bột khoai mì tạo sản phẩm đường Glucose ........... 39
3.3.2.9.1. Xác đinh hoạt tính α – amylase theo Rose – Smith................... 39
3.3.2.9.2. Khảo sát quá trình dịch hóa tinh bột bằng α – amylase ............ 40
3.3.2.9.3. Khảo sát quá trình đường hóa bằng GA cố định ....................... 40
3.3.2.10. Quy trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo đường glucose........... 41
3.3.2.11. Định lượng glucose trong sản phẩm ........................................... 43
3.3.2.12. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 43
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 44
4.1. Hoạt tính và hàm lượng của enzyme GA dạng tự do ...................................... 44

4.2. Tinh sạch GA thu nhận bằng phương pháp lọc gel ......................................... 44
4.3. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di ............................... 46
4.4. Kết quả khảo sát GA dạng hòa tan. ................................................................. 48
4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính GA ............................................. 48
4.4.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính GA...................................................... 50
4.5. Kết quả khảo sát GA dạng cố định. ................................................................. 51
4.5.1. Nồng độ GA và Na – Alginate tối ưu trong phương pháp cố định ........ 51
4.5.2. So sánh hoạt tính enzyme GA dạng hòa tan và cố định .......................... 54
4.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính GA cố định................................. 55
4.5.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính GA cố định ......................................... 56
4.5.5. Số lần tái sử dụng .................................................................................... 57
4.6. Quá trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo đường glucose .............................. 58
4.6.1. Hoạt tính α – amylase .............................................................................. 58
4.6.2. Nồng độ α – amylase và tinh bột tối ưu trong quá trình dịch hóa .......... 58
4.6.3. Tối ưu hóa quá trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo đường glucose .... 59
4.6.4. Tạo sản phẩm đường glucose .................................................................. 62
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 65
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 65
5.2. Đề nghị............................................................................................................. 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 66
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 68

vii


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Asp

:

Aspergillus

CTPT :

Công thức phân tử.

DE

:

Dextrose Equivalen (đương lượng Glucose).

DNS

:

Dinitrosalixilic (thuốc thử acid).

E

:

Enzyme.

ES

:

Phức hợp enzyme – cơ chất.

GA

:

Glucoamylase.

KTDT :

Kĩ thuật di truyền.

TTHĐ :

Trung tâm hoạt động.

TN

:

Thí nghiệm.

MW

:

Trọng lượng phân tử.

P

:

Sản phẩm.

UI

:

Unit International (đơn vị quốc tế)

UV

:

Ultraviolet spectrocopy

HT

:

Hoạt tính.

VSV

:

Vi sinh vật.

SSF

:

Solid State Fermentation (lên men bán rắn).

S

:

Cơ chất của enzyme.

STT

:

Số thứ tự.

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Một phần cấu trúc phân tử amylose .............................................................. .9
Hình 2.2. Một phần cấu trúc phân tử amylopectin ......................................................... .9
Hình 2.3. Cấu trúc của glycogen .................................................................................. .10
Hình 2.4. Công thức cấu tạo của glycogen. .................................................................. .10
Hình 2.5. Hệ sợi nấm Asp. kawasaki ở thời điểm 40 giờ ............................................. .16
Hình 2.6. Cấu trúc phân tử glucose. ............................................................................. .20
Hình 2.7. Khả năng tách các phân tử bằng lọc gel ....................................................... .27
Hình 4.1. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch GA từ chủng Asp.
Kawasaki qua cột Sephadex G – 100............................................................ 46
Hình 4.2. Hạt GA cố định bằng phương pháp nhốt ....................................................... 54

Hình 4.3. Tẩy màu bằng than và tinh sạch bằng trao đổi ion. ....................................... 62
Hình 4.4. Sản phẩm đường glucose ............................................................................... 62

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Khả năng hoạt động của GA từ một số loài VSV .......................................... 6
Bảng 2.2. Hiện trạng sản xuất, chế biến và sử dụng tinh bột sắn ở một số nước ......... 17
Bảng 2.3. Thành phần chất dinh dưỡng của khoai mì trong 100 g nguyên liệu ........... 18
Bảng 2.4. Phân bố sử dụng glucose trong các lĩnh vực ở Mỹ năm 1992...................... 21
Bảng 3.1. Các thiết bị chính được dùng trong thí nghiệm ............................................ 24
Bảng 3.2. Danh sách các hóa chất chính dùng trong thí nghiệm .................................. 24
Bảng 3.3. Danh sách dung dịch và đệm trong thí nghiệm ............................................ 25
Bảng 4.1. Hoạt tính và hàm lượng GA của hang Novo và GA thu nhận từ
Asp. kawasaki .............................................................................................. 44
Bảng 4.2. Hiệu suất và độ tinh sạch của GA trước và sau sắc ký GA thu nhận ........... 51
Bảng 4.3. Giá trị Rf và trọng lượng phân tử (MW) protein trong thang chuẩn. ........... 47
Bảng 4.4. Giá trị Rf và MW từng vạch của peak 1 và enzyme hòa tan ........................ 48
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến GA hòa tan. .................................................... 48
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến enzyme GA hòa tan. ............................................... 50
Bảng 4.7. Khảo sát nồng độ GA cố định ...................................................................... 51
Bảng 4.8. Hàm lượng protein còn lại qua các lần sử dụng ........................................... 52
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme GA cố định. ...................................... 55
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ Termamyl và tinh bột đến quá trình dịch............ 58
Bảng 4.11. Tóm tắt các mức khảo sát thủy phân như sau............................................. 59
Bảng 4.12. Ma trận và kết quả TN. ............................................................................... 60
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Termamyl và tinh bột đến quá trình dịch
hóa ............................................................................................................... 69
Bảng 4.14a. Tóm tắt các mức khảo sát thủy phân ........................................................ 70

Bảng 4.14b. Ma trận và kết quả thực nghiệm ............................................................... 71

x


DANH SÁCH SƠ ĐỒ - ĐỒ THỊ - BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Tác dụng thủy phân của α - amylase ............................................................. 5
Sơ đồ 2.2. Tác dụng thủy phân của β - amylase ............................................................. 5
Sơ đồ 2.3. Tác dụng thủy phân của GA .......................................................................... 6
Sơ đồ 2.4. Tác dụng thủy phân của hệ amylase .............................................................. 7
Sơ đồ 3.1. Quy trình thực hiện đề tài ............................................................................ 25
Sơ đồ 3.2. Quy trình nuôi cấy ....................................................................................... 26
Sơ đồ 3.3. Quy trình thu nhận GA ................................................................................ 28
Sơ đồ 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính GA ............................................ 37
Sơ đồ 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính GA .................................... 37
Sơ đồ 3.6. Quy trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo đường glucose .......................... 42
Đồ thị 4.1. Sắc ký đồ của GA tủa bằng cồn theo tỉ lệ 1 : 3 ........................................... 45
Đồ thị 4.2. Sự tương quan tuyến tính giữa log (MW) và giá trị Rf. ............................. 47
Đồ thị 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme ........................................... 49
Đồ thị 4.4. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính GA hòa tan ............................................ 50
Đồ thị 4.5. Hoạt tính GA qua các lần sử dụng .............................................................. 52
Đồ thị 4.6. Hàm lượng protein được giữ lại trong gel .................................................. 53
Đồ thị 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme GA cố định........................ 56
Đồ thị 4.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính GA cố định . ........................................... 56
Đồ thị 4.9. Số lần tái sử dụng của GA cố định. ............................................................ 57
Đồ thị 4.10. Độ bền nhiệt của GA cố định .................................................................... 66
Đồ thi 4.11. So sánh độ bền nhiệt GA thương phẩm dạng cố định và dạng hòa tan .... 67
Đồ thi 4.12. So sánh độ bền nhiệt GA thu nhận dạng cố định và dạng hòa tan ........... 67
xi

Biểu đồ 4.1. Hiệu suất cố định GA ............................................................................... 51
Biểu đồ 4.2. Hoạt tính GA cố định ở các nồng độ khác nhau....................................... 53
Biểu đồ 4.3. So sánh hoạt tính của GA thương phẩm, GA thu nhận trước và sau cố
định .......................................................................................................... 54
Biểu đồ 4.4. Số lần tái sử dụng của GA cố định ........................................................... 68

xii


Khóa Luận Tốt Nghiệp

Chương 1.
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề.
Với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, enzyme cùng các chế phẩm
của nó ngày càng được sản xuất và sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như công nghệ
thực phẩm, da giầy, dệt may, nông nghiệp, chăn nuôi và trong y dược.
Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới vào khoảng 300.000 tấn và
được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất trên qui
mô công nghiệp đều thuộc enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy, khoảng
75 % chế phẩm enzyme được dùng cho việc thủy phân cơ chất [6].
Thấy được vai trò xúc tác quan trọng của enzyme trong các phản ứng hóa học
cũng như sinh học trong cơ thể sống. Vấn đề nghiên cứu enzyme ở Việt Nam thu hút
được sự quan tâm của nhiều nhà sinh hóa, sinh học thực nghiệm và các nhà khoa học
trong các lĩnh vực khác. Các hướng nghiên cứu chính là tách chiết, tinh sạch enzyme,
mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng vào
đời sống của enzyme.
Các enzyme thường được sử dụng là enzyme hòa tan, enzyme dạng này có

nhược điểm là không thể thu hồi hoặc việc thu hồi không mang lại hiệu quả về mặt
kinh tế. Để khắc phục nhược điểm trên, người ta sử dụng phương pháp cố định
enzyme để có thể sử dụng lại nhiều lần, từ đó mang lại hiệu quả cao và tiết kiệm chi
phí sản xuất ở qui mô công nghiệp. Ngoài ra khi sử dụng enzyme cố định sản phẩm sẽ
không bị lẫn enzyme làm giảm chi phí trong quá trình tinh sạch sản phẩm. Vì thế, việc
nghiên cứu tìm ra phương pháp cố định enzyme hiệu quả cao đang là một đòi hỏi cấp
thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam.

1


Khóa Luận Tốt Nghiệp
Glucoamylase (EC 3.2.1.3) là một enzyme quan trọng thuộc hệ amylase.
Enzyme này đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học nhờ vào khả năng thủy
phân liên kết α – 1,4 glycoside và α – 1,6 glycoside thậm chí cả liên kết α – 1,3
glycoside trong mạch amylose và amylopectin để thu được sản phẩm triệt để là
glucose [6]. Nhờ vào đặc tính này, GA được sử dụng trong công nghiệp sản xuất
đường glucose và mật tinh bột.
Theo kết quả nghiên cứu thu nhận GA từ Asp.kawasaki luận văn thạc sĩ của tác
giả Võ Viết Phi cho thấy GA tạo ra từ chủng nấm mốc này khi nuôi trên môi trường
bán rắn sẽ tạo năng suất và hoạt tính cao. Tuy nhiên việc cố định và ứng dụng enzyme
này thì chưa được nghiên cứu rộng rãi.
Cố đinh enzyme GA để ứng dụng thử nghiệm vào việc thủy phân tinh bột khoai
mì để tạo sản phẩm đường glucose nhằm làm tăng giá trị nguồn nguyên liệu vì nguồn
khoai mì có hàm lượng tinh bột cao nhưng hầu hết chỉ được sử dụng làm thức ăn gia
súc, chỉ một phần nhỏ được sử dụng trong công nghiệp tinh bột và thực phẩm cho con
người.
Vì vậy việc cố định enzyme GA, khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến việc
thủy phân và ứng dụng enzyme cố định trong việc thủy phân tinh bột khoai mì là một
vấn đề cần quan tâm và nghiên cứu. Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên

cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Cố định GA từ nấm mốc
Asp. kawasaki bằng phương pháp nhốt trên gel Na – Alginate và ứng dụng thủy phân
tinh bột khoai mì tạo đường glucose”.
1.2. Mục đích đề tài.
 Khảo sát các điều kiện thích hợp đến quá trình cố định enzyme.
 Khảo sát so sánh các yếu tố môi trường (pH, nhiệt độ) ảnh hưởng lên hoạt tính
enzyme trước và sau cố định, giữa enzyme thu nhận và enzyme thương phẩm.
 Xác định các điều kiện tối ưu đến quá trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo
đường glucose.

2


Khóa Luận Tốt Nghiệp
1.3. Nội dung đề tài.
 Nuôi cấy và thu nhận GA từ nấm mốc Asp. kawasaki.
 Cố định GA bằng phương pháp nhốt trong gel Na – Alginate.
 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt đô, pH) lên hoạt động của
GA dạng hòa tan và cố định.
 So sánh hoạt tính của GA dạng hòa tan và cố định, giữa GA thương phẩm và
thu nhận từ Asp.kawasaki.
 Khảo sát quá trình thủy phân tinh bột khoai mì tạo đường glucose bằng GA cố
định.

3


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

Chương 2.

TỔNG QUAN

2.1. TỔNG QUAN VỀ GA.
2.1.1. Giới thiệu về amylase.
Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải các liên kết
glucoside nội phân tử trong các polysaccharise với sự tham gia của nước. Amylase
thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin thành glucose, maltose và dextrin mạch
ngắn [6, 15].
Amylase là hệ enzyme quan trọng nhất và có ý nghĩa to lớn trong công nghệ
chế biến thực phẩm. Các enzyme này có trong dịch tiêu hóa, hạt nảy mầm, trong nấm
mốc... mặc dù được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhưng chỉ có enzyme từ nguồn
vi sinh vật (VSV) mới đáp ứng đủ nhu cầu sản xuất công nghiệp.
Amylase thu nhận từ nguồn VSV có khả năng chịu nhiệt cao. Tuy nhiên để thu
được enzyme có hiệu suất cao thì cần phải lưu ý tới việc phân lập và tuyển chọn giống.
Với những tiến bộ trong công nghệ sinh học, hiện nay amylase được ứng dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: y học, hóa phân tích, đường hóa tinh bột,
dệt nhuộm, công nghiệp thực phẩm, đồ uống và công nghiệp lên men.
Amylase giống như các enzyme khác đều có bản chất là protein được sinh vật
tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học.
2.1.2. Phân loại hệ enzyme amylase.
Hiện nay có 6 loại amylase bao gồm: α – amylase, β – amylase, γ – amylase,
dextrin – 6 – glucanhydrolase, amylopectin – 6 – lucanhydrolase và oligodextrin – 6 –
glucanhydrolase thủy phân các liên kết oligodextrin α – 1,6 glycoside. Trong đó được
ứng dụng nhiều nhất là các enzyme amylase gồm α, β, γ – amylase [6].
4


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

2.1.2.1. α – amylase (endo – 1,4 – a – D – glucan glucohydrolaza).

α – amylase là enzyme ngoại bào tan tốt trong nước, nó phân cắt một cách ngẫu
nhiên các liên kết α – D – 1 ,4 – glycoside trong mạch tinh bột, thủy phân tinh bột tạo
ra đường được gọi là α – amylase đường hóa. Sản phẩm chính của quá trình thủy phân
tinh bột bằng α – amylase dịch hóa gồm dextrin và maltodextrin.

α-amylase
Tinh bột

dextrin + maltose + glucose

(hoặc glycogen)
Sơ đồ 2.1: Tác dụng thủy phân của α – amylase.
2.1.2.2. β – amylase (a – 1,4 – glucan maltohydrolase).
Thường có nguồn gốc thực vật. Đây là một enzyme phân cắt từ đầu không khử
của phân tử amylose, amylopectin và phân tử glycogen.
β – amylase tham gia vào phân hủy liên kết α – 1,4 – glycoside và tạo ra
maltose (dưới dạng β – anomeric). β – amylase không thể thủy phân liên kết α – 1,6 –
glycoside trong phân tử amylopectin, sản phẩm thủy phân gồm 50 – 60 % là maltose
và dextrin.

β- amylase
Tinh bột

maltose + dextrin

Sơ đồ 2.2: Tác dụng thủy phân của β – amylase
2.1.2.3. γ – amylase hay glucoamylase (GA).
GA là một enzym ngoại bào quan trọng thuộc hệ amylase. Enzyme này đang
thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học nhờ vào khả năng thủy phân liên kết α –
1,4 glycoside và α – 1,6 glycoside thậm chí cả liên kết α – 1,3 glycoside trong mạch

amylose và amylopectin để thu được sản phẩm duy nhất là glucose [6].

5


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

Tinh bột hay oligosaccharide

80 % – 100 % glucose

(có liên kết α – 1, 4 và α – 1,6 glucoside)
Sơ đồ 2.3: Tác dụng thủy phân của GA
Khi thủy phân liên kết α – 1,4 – glucan trong chuỗi polysaccharide, GA tách lần
lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo glucose. Enzyme
này có nhiều tên gọi khác nhau: α – 1,4; 1,6 – glucan – 4,6 glucohydrolase, GA,
amyloglucosidase, taka – amylase B, γ – amylase,…[6].
GA có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin,
dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của
các loại amylase khác. Các polysaccharide có phân tử lớn, nhánh như amylopectin,
glucogen, β – dextrin bị GA thủy phân khá nhanh. Nhờ vào đặc tính này, GA được sử
dụng trong công nghiệp sản xuất glucose và mật tinh bột.
Đa số GA có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ là 50 0C, bền
với acid hơn α – amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo
vệ bởi Ca2+ [9].
Khi đun nóng lên 70 0C thì GA thì hầu như bị mất hoạt tính, chúng bị các chất
độc sulfulhydryl kìm hãm, do các chất này liên kết với nhóm – SH trong trung tâm
hoạt động của enzyme. Các chế phẩm enzyme GA từ nấm sợi, mô động vật khác nhau
về độ bền vững đối với tác động của kim loại nặng như: Cu, Fe, Hg…
Bảng 2.1: Khả năng hoạt động của GA từ một số loài VSV

STT

Nguồn enzyme

pH opt

T opt (0C)

T bất hoạt (0C)

1

Asp. niger

3 – 6; pH opt : 4,5 – 5

55 – 60

90

2

Asp. awamori

2 – 7; pH opt : 3 – 5

55 – 65

85

3

Rhizopus niveus

3 – 6; pH opt : 3 – 5,5

55 – 60

70 – 80

Đa số các chế phẩm GA từ VSV (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men) và mô động vật
đều có pH opt ở vùng acid trừ GA của Saccharomyces italicus và một số mô động vật
(gan chuột, niêm mạc ruột non chuột) có pH opt ở vùng trung tính…

6


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

Tinh
bột

α -amylase

Dextrin +
o ligosaccaride

Dextrin

β - a mylase

maltose

Dextrin không nhánh

γ - amylase

Glucose

Sơ đồ 2.4: Tác dụng thủy phân của hệ amylase
2.2. NGUỒN THU NHẬN.
GA có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau từ động vật, thực vật,
VSV. Trong đó GA thu nhận từ VSV được xem có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính
chất độc đáo so với các nguồn còn lại.
Trước hết, VSV là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng
lớn. Chu kỳ sinh trưởng của VSV ngắn (từ 16 – 100 giờ). VSV sinh trưởng, phát triển
với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, kích thước bé nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương
đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa,
enzyme từ VSV có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác.
VSV rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng
cũng như các tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi
cấy để chọn những chủng cho hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao.
Có thể nói rằng, với VSV người ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn
trên các đối tượng khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định
hướng enzyme.
Nấm mốc là một trong những đối tượng VSV có khả năng sinh tổng hợp GA
mạnh nhất.
2.3. ỨNG DỤNG CỦA GA.
GA là một trong những enzyme chuyển hóa tinh bột được sử dụng rộng rãi
trong các ngành công nghiệp khác nhau như: đường, tinh bột, nước giải khát, rượu,
bia, bánh kẹo. Trong các sản phẩm bánh mỳ, bánh quy GA được sử dụng làm tăng chất

lượng. Ví dụ làm tăng thể tích bánh, làm mềm bánh, làm tăng vị ngon. Trong sản xuất
bia GA dùng để đường hóa tinh bột thay thế một phần malt. Trong sản xuất rượu dùng

7


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

để đường hóa tinh bột, lên men rượu. Đặc biệt GA sử dụng như một enzyme không thể
thiếu được cho quá trình đường hóa tinh bột để sản xuất xiro glucose tinh thể.
Ở nhiều nước trên thế giới quá trình đường hóa tinh bột bằng phương pháp axit
đang được thay thế dần bằng phương pháp enzyme vì nó cho phép sử dụng dịch tinh
bột với nồng độ cao, không sinh các sản phẩm phụ làm tăng hiệu suất thu hồi (phương
pháp axit 87 %, phương pháp enzyme 98 %) và tăng chất lượng xiro glucose.
Trong công nghệ xử lý rác thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm
bún, bánh đa, bánh cuốn, chế biến nông sản ngô, khoai sắn…
Ngoài ra GA còn được sử dụng trong y tế để điều trị một số bệnh làm tăng khả
năng chuyển hóa tinh bột và maltoza trong cơ thể.
2.4. CƠ CHẤT CỦA GA.
2.4.1. Tinh bột.
2.4.1.1. Đặc điểm.
Tinh bột là chất bột vô định hình màu trắng, không tan trong nước lạnh nhưng
khi đun sôi ở 60 – 85 0C thì tinh bột bị hồ hóa khoảng 60 – 80 %. Tinh bột là nhóm
cacbohydrate ở thực vật chủ yếu có trong các loại củ như: khoai mì, khoai tây, khoai
lang, … là chất cung cấp năng lượng [2]. Tinh bột được cấu tạo từ amylose và
amylopectin (Meyer, 1940)
Dưới tác dụng của amylase hoặc acid chúng bị thủy phân do các liên kết
glycoside bị phân cắt. Khi tác dụng với iod chúng có màu xanh.
2.4.1.2. Tính chất.
Tinh bột là một polysaccharide bậc hai, đồng thể. Phân tử có khối lượng lớn,

các đơn phân là α – D – glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – gycoside và liên
kết 1,6 – glycoside.
Công thức hóa học tổng quát (C 6 H 10 O 5 )n, tồn tại ở hai dạng cấu tử là amylose
và amylopectin có cấu tạo và tính chất khác nhau. Tuy nhiên đa phần các tinh bột gồm
20 – 30 % amylose và 70 – 80 % là amylopectin.
 Amylose: có trọng lượng phân tử từ 50.000 – 160.000 và amylose được
cấu tạo bởi 200 – 1.000 phân tử D – glucoamylaseucose nối với nhau bằng liên kết α –

8


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

1,4 – glucoamylaseucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. Amylose
dễ tan trong nước tạo thành dịch nhớt không cao và bắt màu với iod [2].

Hình 2.1: Một phần cấu trúc phân tử amylose [20]
 Amylopectin: có trọng lượng phân tử rất lớn tới hàng chục triệu đơn vị,
được cấu tạo bởi từ 600 – 6.000 phân tử D – glucose, các phân tử D – glucose nối với
nhau bởi liên kết α – 1,4 – glycoside và α – 1,6 – glycoside tạo thành các mạch nhiều
nhánh. Amylopectin cho màu tím đỏ với iod, hòa tan trong nước nóng tới 60 – 90 %
cho dung dịch có độ nhớt cao.

Hình 2.2: Một phần cấu trúc phân tử amylopectin [20]
2.4.2. Glycogen.
Glycogen là một loại cacbohydrate được dự trữ ở các bộ phận của động vật và
được cơ thể chuyển hóa để sử dụng dần. Glycogen có số mạch nhánh nhiều hơn so với
tinh bột. Phân tử lượng từ 2 – 3 triệu, tập trung chủ yếu ở gan động vật. Glycogen dễ
tan trong nước, nếu như ta ăn quá nhiều carbohydrate thì cơ thể sẽ chuyển hóa chúng
thành chất béo để dự trữ.

9


Khóa Luận Tốt Nghiệp.

Hình 2.3: Cấu trúc của glycogen [19]

Hình 2.4: CTCT của glycogen [19]

2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp GA.
GA có khả năng xúc tác thủy phân liên kết 1,4 – 1,6 glycoside trong tinh bột,
glycogen, polysaccharide kiểu maltose. Là enzyme ngoại phân (exo – enzyme), nó
thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một. Chúng
không thủy phân được các dextrin vòng. Khi thủy phân tinh bột, cùng với việc tạo
thành glucose còn có thể tạo thành các oligosaccharide. Ngoài ra, GA còn có thể cắt
các liên kết 1,2; 1,3 glycoside.
Mọi hoạt động sống của VSV điều liên quan chặt chẽ tới môi trường sống của
chúng, các VSV không những có nhu cầu về thành phần và số lượng các chất dinh
dưỡng mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, độ ẩm, dinh
dưỡng,…các yếu tố này có thể làm kích thích hay ức chế sinh tổng hợp enzyme thậm
chí làm VSV bị tiêu diệt suốt thời gian bảo quản cả khi sử dụng [10].
2.5.1. Ảnh hưởng của pH.
Sự sinh trưởng của VSV có lẽ làm thay đổi pH đáng kể trong cơ chất, do cơ
chất bị oxi hóa không hoàn toàn, kết quả là acid được sinh ra, hoặc sự hấp thụ NH 4 + sẽ
làm giảm pH, ngược lại sự giải phóng NH 4 + qua các phản ứng loại nhóm amino của
urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH [17].
Động học của sự biến đổi pH phụ thuộc chủ yếu vào giống VSV. Ví dụ, đối với
Aspergillus sp., Pennicilium sp., và Rhizopus sp…, pH có thể giảm xuống dưới 3. Đối
với Asp. kawasaki hoạt động ở khoảng pH là 3,5 – 5,5, khi môi trường chuyển sang

trung tính hay kiềm thì hoạt độ giảm dần và mất khả năng hoạt động [18].
10