Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng một số chất phân lập được của cây bảy lá một hoa (paris polyphylla var chinensis franchet)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MÃ VÂN KIỀU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP
ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA
(Paris polyphylla var. chinensis Franchet)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MÃ VÂN KIỀU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT PHÂN LẬP
ĐƢỢC CỦA CÂY BẢY LÁ MỘT HOA
(Paris polyphylla var. chinensis Franchet)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
GS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
PGS.TS. Đỗ Thị Hà
Nơi thực hiện:
Viện kiểm nghiệm thuốc

Trung Ƣơng

HÀ NỘI – 2018


MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................2
1.1.1. Dƣợc liệu Bảy lá một hoa .........................................................................2
1.1.2. Vị trí phân loại chi Paris L ........................................................................2
1.1.3. Đặc điểm thực vật .....................................................................................3
1.1.4. Sinh thái và phân bố ..................................................................................4
1.1.5. Công dụng .................................................................................................4
1.1.6. Thành phần hóa học ..................................................................................5
1.1.7. Tình hình nghiên cứu định tính, định lƣợng .............................................7
1.1.8. Tác dụng sinh học .....................................................................................8
1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT SẼ NGHIÊN CỨU TỪ BẢY LÁ MỘT HOA ............10
1.2.1. Paris saponin I ...........................................................................................10
1.2.2. Paris saponin II ........................................................................................ 11
1.2.3. Paris saponin V ......................................................................................... 12
1.2.4. Paris saponin VII ....................................................................................13
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO..............................14
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao .............................................14
1.3.2. Máy HPLC ..............................................................................................15
1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký............................................15

1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC .................................................................16
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) ........................18
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................20
2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ ............................................20
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..............................................................................20
2.1.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................20
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ......................................................................................21
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................22
2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ....................................................................................22
2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu ....................................................................23
2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký .............................................................23
2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích ..........................................................24
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu .......................................................................26
CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .....................................................27
3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN................................27
3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu ...............................................................................27
3.1.2. Chiết xuất ................................................................................................27
3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ...............................................................28
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký .................................................................................28
3.2.2. Lựa chọn pha động ..................................................................................28
3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng ..............................................................................29
3.2.4. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện ................................................................29
3.3. NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT ĐỐI
CHIẾU ...................................................................................................................31


3.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
TRONG BẢY LÁ MỘT HOA ..............................................................................33

3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký ...............................................37
3.4.2. Độ lặp lại của phƣơng pháp ...................................................................39
3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính .....................................................................41
3.4.4. Độ đúng ...................................................................................................45
3.4.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) .......................43
3.5. ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ
TRONG BẢY LÁ MỘT HOA ..............................................................................44
3.5.1. Xác định hàm lƣợng các chất trong phần thân rễ cây Bảy lá một hoa ...44
3.5.2. Xác định hàm lƣợng các chất trong phần thân rễ cây Bảy lá một hoa thu
hái đƣợc .................................................................................................45
3.5.3. Xác địn hàm lƣợng các chất có trong một số sản phẩm phân lập đƣợc từ
cây Bảy lá một hoa .................................................................................47
CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN......................................................................................51
4.1. VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU ...........................................................51
4.2. VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ......................................................51
4.3. VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ...........................................................51
4.4. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH
PHẦN CÁC DỊCH CHIẾT ...................................................................................52
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................55
KẾT LUẬN ...........................................................................................................55
ĐỀ XUẤT .............................................................................................................55

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AEPPC:

Dịch chiết Bảy lá một hoa (aqueous

extracts of Paris

polyphylla var. chinensis)
DAD:
HPLC:

Detector mảng diod (Diod Array Detector)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatography)

HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High- Performance
Liquid Chromatography–Mass Spectrometry)
LOD:

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ:

Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification)

NMR:

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic
Resonance)

RSD:

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation)

S/N:

Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise)

SKĐ:

Sắc ký đồ

STT:

Số thứ tự

PS I:

Paris saponin I

PS II:

Paris saponin II

PS VI:

Paris saponin VI

PS VII:

Paris saponin VII

PPC:

Paris polyphylla var. chinensis

cs:

Cộng sự


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dƣợc liệu ............................................ 27
Bảng 3.2. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lƣu. ...........................33
Bảng 3.3. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic. .......................... 34
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS VII ........................................... 35
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS VI. ........................................... 36
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS II .............................................. 36
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PS I ............................................... 37
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS VII .............. 37
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS VI ................ 38
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS II ............... 39
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PS I ................. 39
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với PS VII ........................................... 41
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với PS VI ............................................ 41
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với PS II .............................................. 42
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với PS I ............................................... 42
Bảng 3.16. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng ............................................. 43
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát LOD và LOQ .................................................... 43
Bảng 3.18. Kết quả xác định nồng độ các chất phân tích trong phần thân rễ
của cây Bảy lá một hoa ...............................................................................….44
Bảng 3.19. Kết quả xác định hàm lƣợng các chất phân tích trong phần thân rễ
của cây Bảy lá một hoa ...............................................................................….45

Bảng 3.20. Kết quả xác định nồng độ các chất có trong thân rễ của một số
mẫu cây Bảy lá một hoa ...................................................................................46
Bảng 3.21. Kết quả xác định hàm lƣợng các chất có trong thân rễ của một số
mẫu cây Bảy lá một hoa ...................................................................................47
Bảng 3.22. Kết quả xác định nồng độ và hàm lƣợng chất phân tích trong các
dung dịch thử của phần trên mặt đất cây Bảy lá một hoa ................................48
Bảng 3.23. Kết quả xác định hàm lƣợng của chất phân lập PS II ..................... 49


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cây bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet..2
Hình 1.2. Cấu trúc 2 aglycon của nhóm saponin steroid chính trong chi Paris.5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học một số hợp chất saponin steroid chính ở một số
loài thuộc chi Paris. ......................................................................................... 6
Hình 1.4. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC..................................................... 15
Hình 1.5. Cấu tạo detector mảng diod (DAD). ............................................... 18
Hình 3.1. Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu .............29
Hình 3.2. SKĐ của hỗn hợp 4 chất nghiên cứu. ............................................. 30
Hình 3.3. SKĐ của dịch chiết cây Bảy lá một hoa . ....................................... 31
Hình 3.4. SKĐ của chất đối chiếu PS VII. ..................................................... 31
Hình 3.5. SKĐ của chất đối chiếu PS VI. ....................................................... 32
Hình 3.6. SKĐ của chất đối chiếu PS II. ........................................................ 32
Hình 3.7. SKĐ của chất đối chiếu PS I........................................................... 32
Hình 3.8. SKĐ của mẫu trắng ......................................................................... 34
Hình 3.9. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS VII ....................... 38
Hình 3.10. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS VI ...................... 38
Hình 3.11. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS II ........................ 39
Hình 3.12. Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của PS I ......................... 40
Hình 3.13. SKĐ của dung dịch thử cây Bảy lá một hoa thu hái tại Cao Bằng

(trái) và hỗn hợp chuẩn (phải) .........................................................................46
Hình 3.14. SKĐ của dung dịch thử của phần trên mặt đất cây Bảy lá một hoa
(trên) và hỗn hợp chuẩn (dƣới) ....................................................................... 48
Hình 3.15. SKĐ của dung dịch thử sản phẩm PS II phân lập đƣợc (a)
và của dung dịch đối chiếu PS II (b)................................................................50


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp
định lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Bảy lá một hoa– Paris
polyphylla var. chinensis Franchet”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố
gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự khích lệ từ
phía thầy cô, gia đình, bạn bè và nhà trƣờng.
Trƣớc hết, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
GS .TS Thái Nguyễn Hùng Thu
PGS .TS Đỗ Thị Hà
ngƣời đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu, tạo mọi
điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: NCS.ThS Cao Ngọc
Anh đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị em Khoa Vật lý – Đo
lƣờng, Khoa Hóa thực vật, Viện Dƣợc liệu và Ban lãnh đạo Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ƣơng. Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá
trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn thầy cô Trƣờng Đại học Dƣợc Hà
Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian
học tập tại trƣờng.
Tác giả trân trọng cám ơn sự tài trợ một phần kinh phí từ Ngân sách sự
nghiệp Khoa học của Bộ Y tế, tên đề tài “Nghiên cứu cây Bảy lá một hoa
(Paris polyphylla var. chinensis Smith. theo hƣớng hỗ trợ điều trị ung
thƣ vú, Đề tài cấp Bộ Y tế; 50/HĐ-K2ĐT, ngày 11/8/2017”.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên về
mọi mặt và giúp đỡ tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực
không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 4 năm 2018

Mã Vân Kiều


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, xu hƣớng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử
dụng thuốc từ thảo dƣợc ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế địa hình và khí
hậu tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng nhƣ nguồn dƣợc liệu
dồi dào, cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc lâu đời.
Bảy lá một hoa (Paris polyphylla var. chinensis Franchet) là cây thuốc rất
quý và rất hiếm ở Việt Nam. Bảy lá một hoa (Paris chinensis) hiện chỉ còn có ở
một vài khu rừng nguyên sinh vùng núi cao, trong đó có ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát
(Nghệ An), Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai). Trên thế giới, chi Paris hiện đã
biết có 22 loài, phân bố ở Bhutan, Trung Quốc, India, Japan, Korea, Lào,
Mongolia, Myanmar, Nepal, Nga, Sikkim, Thái Lan, Việt Nam.
Với thành phần hóa học chính là Saponin steroid và Polyphyllin, Bảy lá một
hoa (Paris chinensis) đã đƣợc chứng minh có các tác dụng điều trị ung thƣ, cầm
máu, giảm đau, chống viêm, cầm máu, kích thích miễn dịch, chữa rắn độc cắn,... Ở
Việt Nam, NCS. Nguyễn Thị Duyên là ngƣời đầu tiên nghiên cứu toàn diện về
thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Bảy lá một hoa (Paris chinensis),
đã nhận biết, chiết xuất và phân lập đƣợc môt số thành phần từ cây Bảy lá một hoa
là gracillin, paris saponin D, paris saponin H, paris saponin I, paris saponin II,
paris saponin VI, paris saponin VII, diosgenin, pennogenin, dioscin…. Tuy nhiên
hiện nay vẫn chƣa có tài liệu nào xây dựng đƣợc tiêu chuẩn để kiểm nghiệm chất
lƣợng của dƣợc liệu này và các sản phẩm có chứa nó. Để đánh giá tiềm năng và

góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên
cứu xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số chất phân lập đƣợc của cây
Bảy lá một hoa – Paris polyphylla var. chinensis Franchet” với 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính và định lượng bằng HPLC
một số hợp chất phân lập được từ cây Bảy lá một hoa.
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng một số chất
phân lập được trong dược liệu và các sản phẩm chiết xuất từ Bảy lá một hoa
thu hái ở Việt Nam.
1


CHƢƠNG I
TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1. Dƣợc liệu Bảy lá một hoa
Bảy lá một hoa còn có các tên gọi thông thƣờng khác là thất diệp nhất chi
hoa, tảo hƣu, cúa dô (H’Mông), tên nƣớc ngoài Parisette, Herbe – Paris (Pháp).
Tên khoa học là Paris polyphylla var. chinensis Franchet. thuộc họ Trọng lâu
(Trilliaceae), chi Paris [1].

Hình 1.1. Cây bảy lá một hoa - Paris polyphylla var. chinensis Franchet (tên đồng
nghĩa Paris chinensis Franchet) được trồng tại Sapa – Lào Cai
1.1.2. Vị trí phân loại chi Paris L.
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (1987), vị trí phân loại của chi Paris
L. là:
Phân giới thực vật bậc cao.
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta).

Lớp Hành (Liliopsida).
Phân lớp Loa kèn (Lilidae).
Bộ củ nâu (Dioscoreales).
Họ Bảy lá một hoa (Trọng lâu) (Trilliaceae).
2


Chi Bảy lá một hoa, Tảo hƣu (Paris L.) [2].
Trên thế giới, cho đến nay ngƣời ta đã biết khoảng 22 loài [11], thuộc chi
Paris, phân bố ở vùng nhiệt đới và ôn đới, chủ yếu ở châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ,
Butan, Nê pan, Pakistan, Mianma, Thái lan, Việt Nam), châu Âu và châu Mỹ;
trong đó có hai loài đƣợc quan tâm nhất là Paris polyphylla var. yunnanensis và
Paris polyphylla var. chinensis Franchet [1], [4], [9]. Theo thông tin cập nhật trên
trang “The plantlist”, đến thời điểm 2016 có 36 loài thuộc chi Paris đã đƣợc chấp
nhận tên khoa học.
Ở Việt Nam, chi Paris L. có 6 loài [4] gồm: (1). Paris delavayi Franch.
(Trọng lâu kim tiền) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng
(Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo); (2). Paris polyphylla Smith (Trọng lâu
nhiều lá) phân bố ở Sơn La (Mộc Châu); (3). Paris hainanensis Levl. (Trọng lâu
hải nam) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Hải An), Vĩnh Phúc (Tam Đảo),
Ninh Bình (Cúc Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong); (4). Paris yunnanensis Franch.
(Trọng lâu vân nam) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Lai Châu (Phong Thổ); (5). Paris
chinensis Franch. (Bảy lá một hoa, Tảo hƣu) phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái
(Nghĩa Lộ), Lai Châu (Tuần Giáo), Phú Thọ (Thanh Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Hoà
Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu, Pà Cò); (6). Paris fargesii Franch. phân bố ở Sa Pa
(Lào Cai).
Gần đây, các nhà nghiên cứu đã bổ sung thêm thành phần loài thuộc chi
Paris ở Việt Nam gồm: (7) Paris vietnamensis (Takht.) H. Li; (8). Paris
caobangensis Y.H. Ji, H. Li, Z. K. Zhou; (9) Paris cronquistii (Takht.) H. Li.; (10).
Paris xichouensis (H. Li) Y. H. Ji, H. Li & Z. K. Zhou; (11). P dunniana H. Lesv

[12].
1.1.3. Đặc điểm thực vật
Cây cỏ nhiều năm, cao 40 - 100 cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, nằm ngang,
đƣờng kính khoảng 2 cm; thân trên mặt đất thẳng đứ vfng, đơn độc không phân
nhánh, nảy mầm vào mùa xuân, tàn lụi vào mùa đông. Lá 5 - 6, xếp thành 1 vòng
trên thân; phiến lá mỏng, màu lục, hình trứng ngƣợc, hình thuôn, kích thƣớc 25  5
3


- 7 cm, 5 - 7 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc tròn hoặc hình nêm,
cuống dài 2,5 - 4 cm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, lƣỡng tính; cuống dài
15 - 40 cm, thẳng đứng. Đài 5 - 6, dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thƣớc 5 8 × 1,5 - 2,5 cm, màu lục. Cánh hoa 5 - 6, màu vàng, dạng dải, kích thƣớc 4,5 - 6 
0,1 cm, bằng nhau. Nhị 10 - 12, dài 1,5 - 3 cm; chỉ nhị dẹp, dài 0,5 - 1,2 cm, đính ở
gốc mảnh bao hoa; bao phấn hình thuôn, đính gốc, 2 ô, mở bằng khe dọc, đỉnh
trung đới kéo dài thành hình kim, dài 1 - 3 mm. Bầu thƣợng, hình trứng, 4 - 5 lá
noãn, 5 - 6 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhuỵ 5 - 6, dính nhau
phần gốc; đầu nhuỵ 5 - 6. Quả nang, mở ở lƣng ô. Hạt màu nâu tối, hình cầu hoặc
hình bầu dục, nhẵn, vỏ hạt mọng nƣớc hoặc không, có nội nhũ rắn chắc hoặc nạc
chứa dầu, mỡ, tinh bột, phôi nhỏ, hình cầu hoặc hình trứng [9], [11].
1.1.4. Sinh thái và phân bố
Bảy lá một hoa mọc nơi đất ẩm, nhiều mùn, gần bờ nƣớc, khe suối hay hốc
đá, dƣới tán rừng kín thƣờng xanh ở độ cao trên 600 m. Mùa ra hoa tháng 2 - 6,
mùa quả tháng 3 - 10.
Bảy lá một hoa phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Phó Bảng), Cao Bằng
(Nguyên Bình), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Sơn La (Mộc Châu), Ninh Bình (Cúc
Phƣơng), Kon Tum (Kon Plong), Lai Châu (Phong Thổ), Phú Thọ (Thanh Sơn),
Hà Tây (Ba Vì), Hoà Bình (Lƣơng Sơn, Mai Châu: Pà Cò). Ngoài ra, Bảy lá một
hoa còn có ở Mianma, Trung Quốc, Lào, Thái Lan [1], [6], [9].
1.1.5. Công dụng
Bảy lá một hoa là một vị thuốc dùng trong dân gian. Theo đông y, bảy lá

một hoa có vị ngọt, hơi cay, tính bình không độc. Tác dụng chủ yếu của nó là
thanh nhiệt giải độc. Thân rễ bảy lá một hoa chữa sốt, sốt rét cơn, kinh giản, giải
độc, nhất là bị rắn cắn, chữa mụn nhọt, viêm tuyến vú, sốt rét ho lao, ho lâu ngày,
hen xuyễn. Dùng ngoài với tác dụng tiêu sƣng, sát trùng. Giã than rễ đắp lên những
nơi sƣng đau, vết rắn cắn, tràng nhạc, mụn lở, nhọt. [1], [4], [9].
Ngày dùng 4-12g dƣới dạng thuốc sắc, dùng ngoài không kể liều lƣợng.
Ở Trung Quốc, vị thuốc tảo hƣu đƣợc chế biến từ thân rễ nhiều loài cây
4


thuộc chi Paris mọc ở những tỉnh miền Tây Nam Trung Quốc đã đƣợc dùng chủ
yếu làm thuốc chữa sốt, giải độc và chữa ho.
Ở Ấn Độ và Nê Pan, thân rễ bảy lá một hoa trị giun sán bằng cách uống bột
thân rễ mỗi lần một thìa cà phê, ngày một lần, liền trong hai ngày. Để trị mụn nhọt
và nhọt độc, hàng ngày bôi bột nhão chế từ thân rễ bảy lá một hoa một cách đều
đặn.
1.1.6. Thành phần hoá học
Công bố năm 2014 của nhóm tác giả Wei Jin Chao tổng quan về thành phần
hóa học của saponin cho biết hiện đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của
trên 126 hợp chất từ chi Paris, trong đó chủ yếu lá các saponin steroid. Ngoài ra,
chi Paris còn có mặt các phytoecdyson, phytosterol, flavonoid, phenylpropanoid
glycosid, spingolipid…Trong đó, thành phần chính đƣợc quan tâm nghiên cứu là
saponin steroid [30].
- Saponin steroid: khoảng 94 saponin steroid đƣợc phân lập từ chi Paris trong
spirostan saponin có phần aglycon là pennogenin và diosgenin là thành phần chính,
ngoài ra còn có mặt các saponin hàm lƣợng thấp hơn nhƣ prototype saponin,
hydroxylated pennogenin, nuatigenin, isonuatigenin, pregnenolon…
Cấu trúc 2 aglycon của nhóm saponin steroid chính trong chi Paris xem ở Hình
1.1.

Hình 1.2. Cấu trúc 2 aglycon của nhóm saponin steroid chính trong chi
Paris.
5


Các nghiên cứu về thành phần hóa học chủ yếu tập trung ở loài Paris
polyphylla var. yunanensis và Paris polyphylla var. polyphylla, một số ít công bố
trên các loài khác nhƣ P. polyphylla var. chinensis, P. luquanensis, P. polyphylla
var. pseudothibetica, P. pubescens, P. axialis, P. vietnamensis, P. fargesii, P.
delavayi,….Thành phần hóa học chính và có nhiều hoạt tính sinh học đƣợc công bố
cho đến thời điểm hiện nay là saponin steroid có aglycon là diosgenin và
penogenin [37].
Diosgenin saponin có các hợp chất đáng chú ý sau: diosgenin, chonglou
saponin I (polyphylin D, paris saponin I), chonglou saponin II (paris saponin II,
paris II, polyphyllin II), dioscin (paris saponin III), paris IV, paris V, gracillin,
polyphyllin C, E, F, trillin… Penogenin saponin gồm có các hợp chất đáng chú ý
sau: chonglou saponin VI (paris saponin VI, paris VI), chonglou saponin VII (paris
saponin VII, paris VII, Tg), paris saponin H (paris H) [37].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học một số hợp chất saponin steroid chính
ở một số loài thuộc chi Paris.
6


1.1.7. Tình hình nghiên cứu định tính, định lƣợng
1.1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Mặc dù có nhiều công bố về chi Paris ở nƣớc ngoài, nhƣng chủ yếu tập
trung trên đối tƣợng Paris polyphylla var. yunnanensis, các nghiên cứu trên đối
tƣợng Paris polyphylla var. chinensis còn khá khiêm tốn.
Năm 2010, Ting Zhang và các cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao

kết hợp với máy sắc ký lỏng khối phổ để định lƣợng saponin steroid trong thân rễ
của Paris polyphylla var. yunnanensis và P. polyphylla var. chinensis. Các thí
nghiệm đƣợc tiến hành với điều kiện sắc ký dùng cột C18, gradient pha động gồm
acid formic 0,1 % và acetonitril. Các mảnh đặc trƣng của saponin steroid diosgenin
và pennogenin đã đƣợc nghiên cứu sử dụng nguồn ion hóa ở chế độ ion âm. Dữ
liệu phổ khối đã cung cấp thông tin cấu trúc về chuỗi đƣờng của các chuỗi
oligosaccharid và các aglycon của saponin steroid. Kết quả xác định đƣợc mƣời
saponin và bảy saponin trong P. polyphylla var. yunnanensis và P. polyphylla var.
chinensis, bao gồm bốn hợp chất không rõ. Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới
hạn định lƣợng (LOQ) dao động từ 0,5 đến 10 ng / ml và từ 2 đến 34 ng / mL tùy
thuộc vào từng chất khác nhau trong 6 chất đã tìm ra. Khả năng thu hồi từ 92% đến
104% đối với tất cả các hợp chất. Phƣơng pháp này đã đƣợc sử dụng thành công để
định lƣợng đồng thời sáu saponin steroid chủ yếu trong thân rễ của hai loài Paris
này. [33]
1.1.7.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Các nghiên cứu về phƣơng pháp định tính, định lƣợng thành phần trong
Paris polyphylla var. chinensis Franchet ở Việt Nam cho đến nay còn rất hạn chế.
Tháng 7 năm 2017, trong luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Duyên [10]
đã bƣớc đầu đề xuất dấu vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Paris bằng
phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết
quả cho thấy có sự khác biệt về thành phần hóa học giữa các loài thuộc chi Paris
thu ở Việt Nam. Mặt khác, thông qua tín hiệu píc của các hợp chất trên sắc ký đồ
TLC và HPLC, sự có mặt của các hợp chất của loài Paris polyphylla var. chinensis
7


thu hái tự nhiên và trồng cũng có những khác biệt. Đặc biệt, hợp chất paris saponin
II trong phần trên mặt đất mẫu trồng có cƣờng độ píc cao hơn loài thu tự nhiên.
Những nghiên cứu bƣớc đầu này đã đề xuất 2 phƣơng pháp HPLC và TLC để xác
định dấu vân tay của một số loài thuộc chi Paris phục vụ cho các nghiên cứu sâu

về lĩnh vực này trong tƣơng lai.
1.1.8. Tác dụng sinh học
1.1.8.1. Tác dụng chống ung thư
Theo tác giả Sun Jing và cs, cao chiết cồn 95% của loài Paris polyphylla
có tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ gan ngƣời SMMC-7721 phụ thuộc
theo thời gian và nồng độ [23]. Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả Qin Xu-Jie
và cs năm 2016 đã đánh giá tác dụng của các saponin steroid phân lập từ thân và lá
của loài P. polyphylla var. yunnanensis trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep G2,
HEK293. Nhóm tác giả Nhật Bản là Mimaki Yoshihiro năm 2000 đã đánh giá tác
dụng của saponin steroid từ thân rễ Paris polyphyla var. chinensis trên tế bào ung
thƣ vú [27].
Theo Kang li-Pin và cs, các polyhydroxylated steroidal glycosid phân lập từ
Paris polyphylla gồm các parisyunnanosid G-I, parisyunnanosid J, padelaosid B,
pinnatasteron, 20-hydroxyecdyson, paris saponin I, Th, proto-glacillin có tác dụng
độc tế bào ung thƣ máu CCRF [24].
Polyphyllin

D

(PD;

diosgenyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1/2)-(α-L-

arabinofuranosyl)-(1/4)]-[-D-glucopyranosid) là thành phần mang lại tác dụng
cho loài Paris polyphylla có tác dụng chống ung thƣ vú [20].
Polyphyllin D thể hiện tác dụng trong điều trị ung thƣ gan. Theo nghiên
cứu, poyphyllin D có tác dụng ức chế đối với dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và
cả dòng tế bào ung thƣ gan kháng thuốc R-HepG2 với IC50 lần lƣợt là 7 µM và 5
µM, tỉ số kháng thuốc là 0,7 [21].
Theo Lin-Lin Gao và cộng sự, dioscin phân lập từ Paris chinensis thể hiện

tác dụng ức chế sự tăng trƣởng của dòng tế bào ung thƣ buồng trứng SKOV3 phụ
thuộc thời gian và liều. Dioscin làm tăng đáng kể quá trình chết tự nhiên của tế bào
8


do làm tăng nồng độ Ca+ quá mức trong ti thể, dẫn đến tăng nồng độ enzym
caspase-3 và cytochrom C trong tế bào SKOV3 [18] .
1.1.8.2. Tác dụng khác
Ngoài tác dụng chống ung thƣ, một số loài thuộc chi Paris còn có tác dụng
sinh học khác nhƣ:
+ Tác dụng chống oxy hóa in vitro từ lá của Paris polyphylla Smith var.
yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz [26];
+ Tác dụng kháng virus, kháng nấm của cao chiết cồn 70% thân rễ Paris
polyphylla Smith trên Cladosporium cladosporioides và các loài Candida [12] và
dịch chiết ethanol 95% từ thân rễ loài này tác dụng kháng Enterovirus 71 (EV71)
và coxsackievirus B3 (CVB3); tác dụng kháng EV71 mạnh hơn [34];
+ Tác dụng kháng ký sinh trùng in vivo của dịch chiết methanol từ rễ P.
polyphylla var. yunnanensis và saponin dioscin và polyphyllin D phân lập từ thân
rễ loài này trên ký sinh trùng Dactylogyrus intermedius [14];
+ Tác dụng hạ sốt, giảm đau, an thần của Paris polyphylla và một số
saponin chính phân lập từ loài này và cao chiết cồn 6 loài thuộc chi Paris gồm P.
polyphylla var. yunnanensis, P. polyphylla var. chinensis, P. fargesii, P. thibetica,
P. vietnamensis và P. stenophylla có tác dụng giảm đau, an thần. Trong đó, các
loài P. polyphylla var. yunnanensis và P. polyphylla var. chinensis thể hiện tác
dụng giảm đau tốt hơn các loài còn lại, trong khi P. polyphylla var. chinensis, P.
fargesii và P. thibetica có tác dụng an thần tốt hơn.

9

1.2.

MỘT SỐ HỢP CHẤT SẼ NGHIÊN CỨU TỪ BẢY LÁ MỘT HOA

1.2.1. Paris saponin I

Tên khác: Polyphyllin I, Polyphyllin D
Công thức phân tử: C44H70O16 (M = 855,028 g/mol) [17].
1.2.1.1 Tính chất vật lý
Bột màu trắng.
1.2.1.2. Tính chất dược lý
Paris saponin I, phân lập từ loài Paris polyphylla đƣợc chứng minh có tác
dụng điều trị ung thƣ gan. Theo nghiên cứu, paris saponin I có tác dụng ức chế đối
với dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 và cả dòng tế bào ung thƣ gan kháng thuốc
RHepG2 với IC50 lần lƣợt là 7 µM và 5 µM, tỉ số kháng thuốc là 0,7. Cơ chế tác
dụng do hợp chất paris saponin I kích thích quá trình chết của tế bào thông qua
việc làm rối loạn chức năng ti thể. Hợp chất paris saponin I làm giảm điện thế
màng ti thể, sinh ra H2O2 và giải phóng các yếu tố kích hoạt quá trình chết của tế
bào cytochrom C và AIF. Tác dụng này phụ thuộc theo nồng độ và thời gian [21].
Bên cạnh đó, paris saponin I còn có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ vú. Kết quả
nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng sau 48 h nuôi cấy, chất paris saponin I ức chế cả hai
dòng tế bào ung thƣ vú MCF-7 và MDA-MB-231 với IC50 tƣơng ứng là 5 µM và
2,5 µM, cao hơn so với tamoxifen có IC50 lần lƣợt là 18 µM và 30 µM. Cơ chế tác
dụng cũng là do paris saponin I gây rối loạn chức năng ti thể, dẫn đến quá trình
chết tế bào. Khi nghiên cứu trên chuột thực nghiệm bị ung thƣ vú do tế bào MCF10


7, sau 10 ngày điều trị, paris saponin I làm giảm kích thƣớc khối u khoảng ~40% ở
liều 2,05 mg/kg và ~50% ở liều 2,73 mg/kg. Ở cả hai mức liều này, chất
polyphyllin D đều không gây độc với gan và tim [23].

Theo nghiên cứu của Yoshihiro Mimaki và cộng sự phân lập đƣợc 11
saponin steroid trong đó có paris saponin I từ cao methanol phần thân rễ Paris
polyphylla var. chinensis. Dịch chiết metanol ức chế 99% tăng sinh tế bào ung thƣ
HL-60 ở mức liều 10 µg/ml, IC50=3,3 µg/ml.
Năm 2015, Hao Jiang và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống ung thƣ phổi
của paris saponin I từ Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch) Hara và Paris
polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch) Hand-Mazz. Kết quả cho thấy paris
saponin I ức chế dòng tế bào ung thƣ phổi kháng gefitinib PC 9 ZD in vitro với
IC50 là 2,5132 μg/ml sau 24 h, giảm tỉ lệ kháng thuốc 1,77 lần. Tác dụng này là do
làm tăng tính nhạy cảm của dòng tế bào này với phƣơng pháp xạ trị. Cơ chế đƣợc
cho là do paris saponin I gây gián đoạn chu kì tế bào ở pha G2/M và gây ra quá
trình chết tế bào do làm tăng enzym caspase 3, yếu tố làm tăng giải phóng
cytochrom C Bax, enzym chặn chu kỳ tế bào P21waf1/cip1, giảm sản xuất Bcl 2 –
yếu tố ức chế giải phóng cytochrom C [35].
1.2.1.3. Phương pháp định lượng
Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C 18 (4,6mm×
100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc
ban đầu là 45%, tăng tuyến tính đến 55% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút;
bƣớc sóng 203 nm.
1.2.2. Paris saponin II

Tên khác: Polyphyllin II
11


Công thức phân tử: C44H70O16 (M = 855,028 g/mol).
1.2.2.1. Tính chất
Bột màu trắng.
1.2.2.2. Tác dụng dược lý
Năm 2006, Huang Y và cộng sự đã phân lập đƣợc 11 hợp chất, chủ yếu là

saponin diosgenin và pennogenin từ Paris vietnamensis (Takht.). Các hợp chất này
đƣợc đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thƣ HepG2 và SGC-7901. Kết quả cho
thấy có 4 hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thƣ
gan HepG2 và ung thƣ dạ dày SGC-7901 trong đó có hợp chất paris saponin II
[21].
1.2.2.3. Phương pháp định lượng
Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C18 (4,6mm×
100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc
ban đầu là 45%, tăng tuyến tính đến 55% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút;
bƣớc sóng 203 nm.
1.2.3. Paris saponin VI

Tên khác: Polyphyllin VI
Công thức phân tử: C39H62O13 (M = 738,912 g/mol).
1.2.3.1. Tính chất vật lý
Bột màu trắng.
1.2.3.2. Tác dụng dược lý
Năm 2006, Huang Y và cộng sự đã phân lập đƣợc 11 hợp chất, chủ yếu là
12


saponin diosgenin và pennogenin từ Paris vietnamensis (Takht.). Các hợp chất này
đƣợc đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thƣ HepG2 và SGC-7901. Kết quả cho
thấy có 4 hợp chất có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thƣ
gan HepG2 và ung thƣ dạ dày SGC-7901 trong đó có hợp chất paris saponin VI
[38].
1.2.3.3. Phương pháp định lượng
Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C18 (4,6mm×
100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc
ban đầu là 35%, tăng tuyến tính đến 45% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút;

bƣớc sóng 203 nm.
1.2.4. Paris saponin VII

Tên khác: Polyphyllin VII
Công thức phân tử: C52H82O11 (M = 1031,2 g/mol).
1.2.4.1. Tính chất vật lý
Dạng bột màu trắng.
1.2.4.2. Nguồn gốc
Từ Paris quadrifolia L. nhóm nghiên cứu của Jerzy Gajdus [21] đã phân lập
đƣợc 6 saponin pennogenin. Trong đó có hợp chất paris saponin VII.
1.2.4.3. Tác dụng dược lý
Từ Paris quadrifolia L. nhóm nghiên cứu của Jerzy Gajdus [21] đã phân lập
đƣợc 6 saponin pennogenin. Trong đó có hợp chất paris saponin VII thể hiện tác
dụng ức chế các dòng tế bào ung thƣ HL-60, Hela và MCF-7 với IC50 là 1,0 ±
0,04 μg/ml, 1,8 ± 0,072 μg/ml, 2,4 ± 0,096 μg/ml và 2,0 ± 0,08 μg/ml, 2,5 ± 0,125
13


μg/ml, 3,2 ± 0,128 μg/ml. Một nghiên cứu sau đó cũng chỉ ra rằng hợp chất trên
làm giảm khả năng sống của dòng tế bào Hela, IC50 là 0,87 ± 0,05 μg/ml, thông
qua cơ chế kích thích quá trình apoptosis bằng cả con đƣờng nội sinh và ngoại sinh
[38].
Năm 2014, Wenjie Zhang và cộng sự nghiên cứu tác dụng chống ung thƣ
của Paris saponin VII từ thân rễ Paris polyphylla. Kết quả cho thấy hợp chất paris
saponin VII ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ cổ tử cung Hela với IC50
2,62  ±  0,11μM. Cơ chế tác dụng có thể do hợp chất này kích thích quá trình tự
hủy diệt của tế bào bằng con đƣờng nội sinh thông qua việc làm tăng các enzym
caspase-3, caspase-9, protein Bax và làm giảm protein Bcl-2 trong tế bào Hela
[36].
Năm 2008, nhóm của Dawei Deng nghiên cứu tác dụng chống nấm của

Paris polyphylla Smith trên Cladosporium cladosporioides và các loài Candida.
Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 70% thân rễ loài này có tác dụng kháng C.
cladosporioides. Nghiên cứu sâu hơn, nhóm đã phân lập đƣợc 3 saponin trong đó
có paris saponin VII, saponin này đều tác dụng chống nấm [35].
1.2.4.4.

Phương pháp định lượng

Sử dụng phƣơng pháp HPLC với cột Thermo BDS Hypersil C18 (4,6mm×
100 mm; 2,4 µm); nhiệt độ cột: 30oC, pha động: acetonitril và nƣớc với tỷ lệ nƣớc
ban đầu là 35%, tăng tuyến tính đến 50% trong 15 phút; tốc độ dòng: 0,8 mL/phút;
bƣớc sóng 203 nm.
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dƣới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số
phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tƣơng đối của các chất
này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào
các yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi detector và đƣợc
14


ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic
của chất phân tích.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,
sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [6].
1.3.2. Máy HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha

động, bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đƣa
mẫu vào pha động, cột sắc ký, detector, hệ thu nhận và xử lý dữ liệu.
Hệ thống cấp
dung môi

Hệ thu nhận xử lý dữ
liệu (máy ghi, máy tính)

Bơm

Bộ phận
tiêm mẫu

Detector

Cột sắc ký

Thải

Hình 1.4. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.
1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký
1.3.3.1. Thời gian lưu tR
Thời gian lƣu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến
detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là
hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lƣu để phát hiện định tính các chất.
Thời gian chết tM là thời gian lƣu của chất không bị lƣu giữ.
Thời gian lƣu hiệu chỉnh t’R = tR – tM.
1.3.3.2. Hệ số dung lượng k’ và hệ số chọn lọc 
Hệ số dung lƣợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lƣợng chất tan trong pha tĩnh

15


và lƣợng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng. 
Hệ số chọn lọc  đặc trƣng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.
Thƣờng chọn  dao động từ 1,05 – 2. Nếu  quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.
1.3.3.3. Độ phân giải RS
Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột
sắc ký:
Rs =

trong đó:

=

RS: độ phân giải
(tR)1, (tR)2: thời gian lƣu chất 1, 2
W1, W2: lần lƣợt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic
W1/2 1, W1/2 2: lần lƣợt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
RS  1,5 thì 2 pic coi nhƣ tách đƣợc hoàn toàn.

1.3.3.4. Số đĩa lý thuyết
Mỗi cột sắc ký có thể đƣợc coi gồm nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa
lý thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan
giữa pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lƣợng đặc trƣng cho hiệu lực cột
sắc ký.
N =16(

trong đó:

) = 5,54(

)

W là chiều rộng pic ở đáy pic
W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC
1.3.4.1. Định tính
Ngƣời ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau [6]:
- So sánh thời gian lƣu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lƣu
của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm
chuẩn đối chiếu.
- So sánh phổ UV-Vis (chồng phổ) giữa phổ mẫu thử với phổ chất đối chiếu bằng
16