Xây dựng phương pháp định lượng ceftazidim trong huyết tương người bằng HPLC phục vụ cho giám sát điều trị

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MAI HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG CEFTAZIDIM TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG HPLC
PHỤC VỤ CHO GIÁM SÁT ĐIỀU TRỊ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MAI HƯƠNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG CEFTAZIDIM TRONG
HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG HPLC
PHỤC VỤ CHO GIÁM SÁT ĐIỀU TRỊ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Đình Chi

HÀ NỘI 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới TS.
Lê Đình Chi, người thầy đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ, động viên
tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Bộ môn Hóa Phân tích - Độc chất
và Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giảng viên và các anh chị
kỹ thuật viên đồng nghiệp tại bộ môn Hóa Phân tích – Độc chất đã tận tình
giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian tôi
học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ, giảng viên trường Đại
học Dược Hà Nội đã dìu dắt, giảng dạy tôi trong những năm tháng học tập tại
trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và
những sinh viên đã chia sẻ, giúp đỡ, khích lệ tôi trong suốt quá trình hoàn
thành luận văn.
Hà Nội, ngày 03 tháng 04 năm 2018
Học viên
Nguyễn Mai Hương


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................

1

Chương 1. TỔNG QUAN............................................................................

3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CEFTAZIDIM......................................................

3

1.1.1. Công thức hóa học...............................................................................

3

1.1.2. Tính chất hóa lý, độ ổn định................................................................

3

1.1.3. Dược lý, dược động học......................................................................

4

1.1.3.1. Dược động học.................................................................................

4

1.1.3.2. Chỉ định............................................................................................

5

1.1.3.3. Liều lượng và cách dùng...................................................................

5

1.2. ỨNG DỤNG HPLC TRONG GIÁM SÁT ĐIỀU TRỊ
CEFTAZIDIM.............................................................................................

6

1.2.1. Giám sát điều trị (TDM)......................................................................

6

1.2.1.1. Khái niệm.........................................................................................

6

1.2.1.2. Giám sát điều trị ceftazidim..............................................................

6

1.2.2. Ứng dụng HPLC trong phân tích thuốc phục vụ cho giám sát điều trị
ceftazidim......................................................................................................

8

1.2.3. Một số phương pháp định lượng ceftazidim trong huyết tương bằng
HPLC............................................................................................................

9

1.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG
DỊCH SINH HỌC........................................................................................

17

1.3.1. Độ chọn lọc..........................................................................................

17


1.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính......................................................

18

1.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ).......................................................

19

1.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày..................................

19

1.3.5. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)...............................................................

19

1.3.6. Độ ổn định...........................................................................................

20

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............

22

2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU..........................

22

2.1.1. Hóa chất – chất chuẩn..........................................................................

22

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ..................................................................................

22

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................

23

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................

23

2.2.1. Chuẩn bị mẫu.......................................................................................

23

2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích........................................................

25

2.2.2.1. Xác định điều kiện sắc ký và lựa chọn chuẩn nội...............................

25

2.2.2.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương........................................

26

2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích.......................................................

27

2.2.3.1. Độ chọn lọc.......................................................................................

27

2.2.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính...................................................

27

2.2.3.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)....................................................

27

2.2.3.4. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày...............................

28

2.2.3.5. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)............................................................

28

2.2.3.6. Độ ổn định........................................................................................

28

2.2.4. Xác định nồng độ CFZ trong mẫu huyết tương thực của người đang
sử dụng ceftazidim vào mục đích điều trị hoặc nghiên cứu............................

30

2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ..................................................

30

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.......................................................

31

3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH..................

31

3.1.1. Khảo sát, xác định điều kiện sắc ký và lựa chọn chuẩn nội...................

31

3.1.1.1. Lựa chọn chuẩn nội..........................................................................

31

3.1.1.2. Lựa chọn điều kiện detector..............................................................

32

3.1.1.3. Lựa chọn pha động và tốc độ dòng pha động....................................

33

3.1.2. Khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu................................................

35

3.1.2.1. Lựa chọn dung môi tủa protein.........................................................

35

3.1.2.2. Lựa chọn dung môi chiết loại tạp......................................................

35

3.1.3. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương
bằng HPLC - UV...........................................................................................

38

3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH................

38

3.2.1. Độ phù hợp hệ thống............................................................................

38

3.2.2. Độ chọn lọc..........................................................................................

39

3.2.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính......................................................

41

3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ).......................................................

42

3.2.5. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày..................................

43

3.2.5.1. Độ đúng, độ chính xác trong ngày....................................................

43

3.2.5.2. Độ đúng, độ chính xác khác ngày......................................................

46

3.2.6. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)...............................................................

48

3.2.6.1. Độ lặp lại của hiệu suất chiết............................................................

48

3.2.6.2. Hiệu suất chiết CFZ và IS.................................................................

49

3.2.7. Độ ổn định...........................................................................................

51

3.2.7.1. Độ ổn định của dung dịch IS làm việc sau thời gian ngắn.................

51

3.2.7.2. Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc CFZ sau thời gian ngắn..........

51

3.2.7.3. Độ ổn định mẫu huyết tương sau thời gian ngắn ở nhiệt độ
phòng.............................................................................................................

52

3.2.7.4. Độ ổn định mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông.................

53

3.2.7.5. Độ ổn định của mẫu sau xử lý...........................................................

54


3.2.7.6. Độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương........................................

54

3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG CFZ TRONG HUYẾT TƯƠNG
THỰC CỦA NGƯỜI ĐANG SỬ DỤNG CEFTAZIDIM.........................

55

Chương 4. BÀN LUẬN................................................................................

58

4.1. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CFZ TRONG HUYẾT TƯƠNG
NGƯỜI.........................................................................................................

58

4.1.1. Kỹ thuật xử lý mẫu...............................................................................

59

4.1.2. Phương pháp phân tích định lượng CFZ..............................................

60

4.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích.......................................................

61

4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MẪU HUYẾT TƯƠNG BỆNH NHÂN.....

63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.....................................................................

65

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AN

: Chất phân tích (Analyte)

AR

: Thuốc thử phân tích (Analytical reagent)

CFE

: Cefepim

CFZ

: Ceftazidim

CT

: Chiết tách

CV

: Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

ELISA

: Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzym
(Enzyme-linked Immunosorbent Assays)

EMA

: Cơ quan quản lý Dược Châu Âu (European Medicines Agency)

HILIC

: Sắc ký lỏng tương tác ưa nước
(Hydrophilic interaction chromatography)

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid chromatography)

HQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao (High quality control)

HT

: Huyết tương

HTT

: Huyết tương trắng

ICU

: Khoa điều trị tích cực (Intensive care unit)

IMI

: Imipenem

IS

: Chuẩn nội (Internal standard)

LLOQ

: Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantitation)

LQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp (Low quality control)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

MERO

: Meropenem

MIC

: Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory concentration)

MQC

: Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa (Medium quality control)


MS

: Khối phổ (Mass spectrometry)

PA

: Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

QC

: Mẫu kiểm tra chất lượng (Quality Control Sample)

S/N

: Tín hiệu/ nhiễu (Signal/ noise)

SKĐ

: Sắc ký đồ

STT

: Số thứ tự

T > MIC

: Thời gian nồng độ thuốc trên nồng độ ức chế tối thiểu
(Time above the minimum inhibitory concentration)

TB

: Trung bình

TCCS

: Tiêu chuẩn cơ sở

TDM

: Theo dõi điều trị (Therapeutic drug monitoring)

TLTK

: Tài liệu tham khảo

TM

: Tĩnh mạch

tR

: Thời gian lưu (retention time)

tt/ tt

: thể tích/ thể tích

ULOQ

: Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantitation)

US - FDA : Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ
(United States – Food and Drug Administration)
UV

: Tử ngoại (Ultra Violet)


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Trang
Bảng 1.1. Nồng độ thuốc trong huyết thanh sau khi tiêm ceftazidim…............

4

Bảng 1.2. Một số phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương bằng
HPLC.............................................................................................................. 10
Bảng 2.1. Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu........................................... 22
Bảng 2.2. Các dung môi hóa chất dùng trong nghiên cứu............................... 22
Bảng 2.3. Các thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu................................... 23
Bảng 2.4. Cách chuẩn bị mẫu chuẩn trong huyết tương, mẫu huyết tương
trắng................................................................................................................ 24
Bảng 2.5. Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương......................... 25
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống của phương pháp................. 38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời gian lưu của CFZ và IS.............. 41
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát đường chuẩn........................................................ 41
Bảng 3.4. Kết quả thẩm định giới hạn định lượng dưới................................... 42

Bảng 3.5-1 – 3.5-4. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày....... 44
Bảng 3.6. Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác khác ngày....................... 46
Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại của hiệu suất chiết CFZ và IS............................. 48
Bảng 3.8. Kết quả hiệu suất chiết của IS.......................................................... 49
Bảng 3.9. Kết quả hiệu suất chiết của CFZ...................................................... 50
Bảng 3.10. Độ ổn định của dung dịch IS làm việc thời gian ngắn.................... 51
Bảng 3.11. Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc CFZ thời gian ngắn............. 51
Bảng 3.12. Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng sau 6 giờ.......... 52
Bảng 3.13. Kết quả độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ đông – rã đông........ 53
Bảng 3.14. Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý............................................ 54
Bảng 3.15. Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT...................................... 55
Bảng 3.16. Kết quả định lượng mẫu huyết tương bệnh nhân dùng CFZ.......... 56


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ceftazidim..................................................

3

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu huyết tương........................................... 26
Hình 3.1. SKĐ chuẩn CFZ............................................................................ 31
Hình 3.2. SKĐ chuẩn IMI.............................................................................. 31
Hình 3.3. SKĐ chuẩn MERO – CFZ.............................................................. 32
Hình 3.4. Chồng SKĐ chuẩn MERO – CFZ và huyết tương trắng................. 32
Hình 3.5. SKĐ chuẩn CFE - CFZ.................................................................. 32
Hình 3.6. Chồng SKĐ chuẩn CFE – CFZ và huyết tương trắng.................... 32
Hình 3.7. Phổ UV của ceftazidim.................................................................. 33
Hình 3.8. Phổ UV của cefepim...................................................................... 33
Hình 3.9. SKĐ mẫu chuẩn trong huyết tương với pha động gồm dung dịch

đệm phosphat pH 3,2 : MeCN (90:10, tt/ tt), tốc độ dòng 1,5 mL/ phút........... 34
Hình 3.10. SKĐ mẫu chuẩn trong huyết tương xử lý bằng kết tủa protein..... 37
Hình 3.11. SKĐ mẫu chuẩn trong huyết tương chiết bằng chloroform.......... 37
Hình 3.12. SKĐ mẫu chuẩn trong huyết tương chiết bằng ethyl acetat.......... 37
Hình 3.13. SKĐ huyết tương trắng................................................................ 39
Hình 3.14. SKĐ huyết tương trắng thêm CFZ và IS....................................... 39
Hình 3.15. SKĐ huyết tương trắng thêm CFZ............................................... 40
Hình 3.16. SKĐ huyết tương trắng thêm IS................................................... 40
Hình 3.17. SKĐ mẫu chuẩn trong huyết tương (2 µg/mL)............................. 43
Hình 3.18. SKĐ mẫu huyết tương bệnh nhân dùng CFZ................................ 56


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ceftazidim (CFZ) là kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba có nhiều ưu
điểm nổi bật như phổ rộng, tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram âm, kháng nhiều
β-lactamase, tác dụng tốt trên P. aeruginosa [29] [32] [35]. Ceftazidim được
cấp bằng sáng chế vào năm 1978 và được sử dụng vào năm 1984 [19].
Ceftazidim nằm trong Danh mục Thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới
[49], được sử dụng rộng rãi trong các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn
Gram âm như: nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiết
niệu có biến chứng, nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới… [1] [16] [32].
Một chế độ điều trị kháng sinh thích hợp là yếu tố quyết định tới kết quả
điều trị của những bệnh nhân nhiễm khuẩn nặng [31]. Dược động học của
ceftazidim có thể rất khác nhau tùy thuộc vào tình trạng lâm sàng, nồng độ
thuốc trong huyết tương không phải lúc nào cũng được duy trì ở đối tượng bệnh
nhân nhiễm khuẩn nặng [31] [24]. Các rối loạn chức năng và yếu tố cá thể của
người bệnh cũng khiến nồng độ thuốc trong huyết tương trở nên khó dự đoán.
Đối với kháng sinh phụ thuộc thời gian như penicillin, cephalosporin và
carbapenems, thời gian trên nồng độ ức chế tối thiểu (T > MIC) có liên quan
đến tác dụng diệt khuẩn và quyết định hiệu quả điều trị của thuốc [33] [31] [20].

Với mức độ sử dụng cao, việc sử dụng ceftazidim còn ảnh hưởng đến sự phát
triển và tăng trưởng của vi khuẩn kháng kháng sinh [2]. Định lượng ceftazidim
trong huyết tương phục vụ cho giám sát điều trị (TDM) giúp điều chỉnh liều,
tối ưu hóa quá trình điều trị, hạn chế kháng thuốc và giảm độc tính của thuốc
[2] [9] [18] [31] [23].
Hiện nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu về định lượng ceftazidim
trong huyết tương được công bố. Nồng độ ceftazidim trong máu thấp, nền mẫu
có nhiều thành phần phức tạp có thể gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích
thuốc. Để phục vụ cho giám sát điều trị (TDM), phương pháp định lượng kháng
sinh trong huyết tương đòi hỏi phải có tính thực tiễn cao, chuẩn bị mẫu đơn
1


giản và nhanh chóng, thời gian phân tích mẫu ngắn, LLOQ thấp, ULOQ (giới
hạn trên của định lượng) đủ cao; được thẩm định để đảm bảo độ tin cậy và phù
hợp với điều kiện thực tế để áp dụng thành công trên lâm sàng [2].
Xuất phát từ những lý do trên, luận văn: “Xây dựng phương pháp định
lượng ceftazidim trong huyết tương người bằng HPLC phục vụ cho giám sát
điều trị” được thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng ceftazidim trong
huyết tương người bằng HPLC theo các hướng dẫn thẩm định phương
pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US - FDA.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định nồng độ ceftazidim
trong các mẫu huyết tương thực của người đang sử dụng ceftazidim
vào mục đích điều trị hoặc nghiên cứu.

2


Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ CEFTAZIDIM
1.1.1. Công thức hóa học [29] [41]
- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ceftazidim
- Tên khoa học: (6R,7R)-7-[[(Z)-2-(2-aminothiazol-4-yl)-2-[(1-carboxy-1methylethoxy)imino]acetyl]amino]-8-oxo-3-[(1-pyridinio)methyl]-5-thia-1azabicyclo[4.2.0]-oct-2-ene-2-carboxylate pentahydrate [5].
- Công thức phân tử:
Ceftazidim khan: C22H22N6O7S2.
Ceftazidim pentahydrat: C22H22N6O7S2.5H2O.
Khoảng 1,16 g ceftazidim pentahydrat tương đương với 1 g ceftazidim
khan [29].
- Khối lượng phân tử:
C22H22N6O7S2: 546,30 [29].

C22H22N6O7S2.5H2O: 636,6 [5].

1.1.2. Tính chất hóa lý, độ ổn định
- Bột màu trắng hoặc trắng ngà.
- Chuyển sang màu nâu đậm và phân hủy ở 135 – 137ºC [29].
- Hơi tan trong nước và trong methanol, thực tế không hòa tan trong aceton và
trong alcol (độ tan 5 mg/mL nước và dưới 1 mg/mL alcol) [5] [29]. Tan trong
dung dịch acid và kiềm [5].
- Góc quay cực riêng: + 24,5º.

3


- Ceftazidim có: pKa1 = 1,9; pKa2 = 2,7; pKa3 = 4,1 [29].
- Hệ số phân bố: log P (octanol) = -1,6 [7].
- Dung dịch muối Natri của ceftazidim có pH 5 - 8 và có màu vàng nhạt đến hổ

phách tùy thuộc vào dung môi, nồng độ thuốc và thời gian bảo quản.
- Phổ hấp thụ UV trong H2SO4 0,1 N có cực đại hấp thụ ở 260 nm, trong nước
ở 258 nm và trong methanol ở 257 nm.
- Thuốc tương đối ổn định ở trạng thái khô và có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng
nhưng cần được bảo vệ tránh ánh sáng. Khi pha với nước để tiêm, hiện tượng
mất hiệu lực xảy ra chậm [29]. Ceftazidim kém bền vững trong dung dịch Natri
bicarbonat [1].
1.1.3. Dược lý, dược động học
1.1.3.1. Dược động học
Ceftazidim không hấp thu qua đường tiêu hóa, do vậy thường dùng tiêm
tĩnh mạch hoặc tiêm bắp ở dạng muối Natri. Nồng độ thuốc trong huyết thanh
đạt được sau khi tiêm được thể hiện trong bảng 1.1 [1] [29]:
Bảng 1.1. Nồng độ thuốc trong huyết thanh sau khi tiêm ceftazidim
Tiêm bắp

Tiêm TM

Tiêm truyền TM không

(sau 1 - 1,5 giờ)

(sau 5 phút)

liên tục (sau 20 - 30 phút)

Khoảng 15 mg/L

Khoảng 45 mg/L

Khoảng 40 mg/L

1g

Khoảng 35 mg/L

Khoảng 85 mg/L

Khoảng 70 mg/L

2g

Không có báo cáo

Khoảng 170 mg/L

Khoảng 170 mg/L

500
mg

Chỉ khoảng 10 % thuốc gắn với protein huyết tương. Ceftazidim phân bố
rộng rãi trong các mô của cơ thể, thấm vào các mô ở sâu và cả dịch màng bụng.
Thuốc đạt nồng độ điều trị trong dịch não tủy khi màng não bị viêm. Ceftazidim
có thể qua nhau thai và bài tiết vào sữa mẹ. Ceftazidim hấp thu sau liều tiêm
qua màng bụng cho người bệnh điều trị thẩm tách màng bụng. Ceftazidim

4


không bị chuyển hóa trong cơ thể và bài tiết ở dạng không biến đổi chủ yếu qua

lọc cầu thận. Khoảng 80 – 90 % liều dùng bài tiết qua nước tiểu sau 24 giờ. Sau
khi tiêm tĩnh mạch 1 liều duy nhất 500 mg hay 1 g, khoảng 50 % liều xuất hiện
trong nước tiểu sau 2 giờ đầu, 2 - 4 giờ sau khi tiêm bài tiết thêm 20 % liều vào
nước tiểu và sau 4 – 8 giờ tiếp theo lại thêm 12 % liều bài tiết vào nước tiểu.
Hệ số thanh thải ceftazidim trung bình của thận là 100 mL/phút; thuốc bài tiết
qua mật dưới 1 %. Thời gian bán thải của ceftazidim trong huyết tương ở người
bệnh có chức năng thận bình thường xấp xỉ 2,2 giờ; thời gian này kéo dài hơn
và nồng độ thuốc cao hơn ở người bệnh suy thận hoặc trẻ sơ sinh [1] [29].
1.1.3.2. Chỉ định
Ceftazidim được sử dụng trong những nhiễm khuẩn rất nặng đã điều trị
bằng các kháng sinh khác phổ biến hơn nhưng không đáp ứng để hạn chế hiện
tượng kháng thuốc. Ceftazidim sử dụng trong những trường hợp nhiễm khuẩn
nặng do vi khuẩn Gram âm như: nhiễm khuẩn huyết; viêm màng não; nhiễm
khuẩn đường tiết niệu có biến chứng; nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới; nhiễm
khuẩn trong bệnh nhày nhớt; nhiễm khuẩn xương và khớp; nhiễm khuẩn phụ
khoa; nhiễm khuẩn trong ổ bụng; nhiễm khuẩn da và mô mềm bao gồm nhiễm
khuẩn bỏng và vết thương. Những trường hợp nhiễm khuẩn kể trên đã xác định
hoặc nghi ngờ do Pseudomonas hoặc Staphylococcus như viêm màng não do
Pseudomonas, nhiễm khuẩn ở người bị giảm bạch cầu trung tính cần phải phối
hợp ceftazidim với kháng sinh khác [1].
1.1.3.3. Liều lượng và cách dùng
Ceftazidim dùng tiêm bắp sâu, tiêm tĩnh mạch chậm trong 3 – 5 phút,
hoặc tiêm truyền tĩnh mạch. Người lớn trung bình 1 g tiêm bắp sâu hoặc tiêm
tĩnh mạch (tùy mức độ nặng của bệnh) cách nhau 8 – 12 giờ một lần. Liều dùng
tăng lên 2 g/8 giờ trong viêm màng não do vi khuẩn Gram âm và các bệnh suy
giảm miễn dịch. Trường hợp nhiễm khuẩn đường tiết niệu sử dụng liều 500
mg/12 giờ. Người trên 70 tuổi, liều 24 giờ giảm xuống còn 1/2 liều của người
5

bình thường, tối đa 3 g/ngày. Trẻ em trên 2 tháng tuổi, liều thường dùng 30 –
100 mg/kg/ngày chia làm 2 – 3 lần, (cách nhau 8 hoặc 12 giờ). Có thể tăng liều
tới 150 mg/kg/ngày (tối đa 6 g/ngày) chia 3 lần cho các bệnh rất nặng. Trẻ sơ
sinh và trẻ nhỏ dưới 2 tháng tuổi, liều thường dùng 25 – 60 mg/kg/ngày chia
làm 2 lần, cách nhau 12 giờ. Trường hợp viêm màng não ở trẻ nhỏ trên 8 ngày
tuổi, thường dùng liều 50 mg/kg, 12 giờ một lần. Người bệnh suy giảm chức
năng thận (có liên quan đến tuổi), liều dựa vào độ thanh thải creatinin, khi độ
thanh thải creatinin dưới 50 mL/phút, nên giảm liều do sự thải trừ thuốc chậm
hơn. Với người bệnh nghi có suy thận, thường sử dụng liều đầu 1 g, sau đó thay
đổi liều tùy thuộc vào độ thanh thải creatinin [1].
1.2. ỨNG DỤNG HPLC TRONG GIÁM SÁT ĐIỀU TRỊ CEFTAZIDIM
1.2.1. Giám sát điều trị (TDM)
1.2.1.1. Khái niệm
Giám sát điều trị thuốc (TDM) dựa trên việc đo nồng độ thuốc trong dịch
sinh học để từ đó có những can thiệp nhằm tối ưu hóa việc sử dụng thuốc trong
điều trị và giảm các tác dụng không mong muốn [40] [22].
1.2.1.2. Giám sát điều trị ceftazidim
Các kháng sinh beta-lactam được sử dụng phổ biến cho phần lớn các
bệnh nhiễm trùng và phác đồ kháng sinh cần được tối ưu hóa để đạt hiệu quả
điều trị tối đa. Mặc dù trong giám sát điều trị thuốc (TDM), các kháng sinh
glycopeptides và aminoglycosides cho đến nay đã là đối tượng phổ biến nhưng
beta-lactam nói chung và ceftazidim nói riêng còn chưa được quan tâm nhiều
[44] [24]. Nguyên nhân là do thuốc có chỉ số điều trị rộng và phản ứng phụ
thường gặp nhất liên quan đến phản ứng dị ứng không phụ thuộc vào liều. Tuy
nhiên, nhận thức này đang dần thay đổi và một số nghiên cứu đã chứng minh
lợi thế của TDM trong việc nâng cao hiệu quả điều trị đối với kháng sinh này
[21] [24].

6

Một số tác dụng phụ như bệnh não, co giật, bệnh sỏi giả xảy ra khi sử
dụng liều quá cao. Các bệnh nhiễm trùng khác nhau như viêm nội tâm mạc,
viêm màng não và viêm tuỷ xương, cần dùng kháng sinh truyền liều cao nên
hiểu biết về nồng độ kháng sinh trong huyết tương kết hợp với tính nhạy cảm
của vi khuẩn được đánh giá theo MIC sẽ cho phép tối ưu hóa hiệu quả điều trị,
hạn chế tác dụng phụ liên quan đến liều, duy trì nồng độ kháng sinh ở mức cần
thiết [21] [24].
Dược động học của beta-lactam có thể rất khác nhau tùy thuộc vào tình
trạng lâm sàng, đặc biệt là với những bệnh nhân ở khoa điều trị tích cực
(Intensive Care Unit – ICU). Các bệnh nhân nhiễm trùng nặng có biểu hiện thể
tích phân bố và thời gian bán thải của thuốc bất thường. Tương tự, dược động
học của thuốc thay đổi ở những bệnh nhân bị bỏng nặng có nguy cơ nhiễm
trùng cao. Nồng độ thuốc trong huyết tương cũng thay đổi ở bệnh nhân suy
thận cần điều chỉnh liều [24]. Các rối loạn chức năng của cơ quan, việc điều trị
thay thế thận hoặc tăng thải thận và các yếu tố cá thể của người bệnh (như thiếu
cân hoặc béo phì) làm nồng độ thuốc trong huyết tương trở nên khó dự đoán.
Nồng độ thuốc phải đảm bảo không quá thấp (không đủ tác dụng) và cũng
không quá cao (nguy cơ nhiễm độc) [31]. Kháng sinh beta-lactam thể hiện hiệu
quả khi nồng độ thuốc trong huyết tương gấp 4 đến 5 lần so với MIC trong hơn
50 % khoảng thời gian giữa hai lần tiêm. Trong những trường hợp nhiễm trùng
nặng, nồng độ cần thiết trên 10 lần MIC trong toàn bộ thời gian giữa hai lần
tiêm. Khi nồng độ kháng sinh thấp hơn 4 lần giá trị này, kháng sinh không còn
hiệu quả [24].
Phần lớn các bằng chứng đều cho thấy dùng kháng sinh theo kinh nghiệm
có thể dẫn đến tác dụng phụ, thất bại điều trị và kháng kháng sinh [11]. Tuy
nhiên, kháng sinh beta-lactam được kê đơn theo phương pháp chuẩn truyền
thống với chế độ liều cố định, chỉ điều chỉnh trong một vài trường hợp cụ thể
như suy thận không được thiết kế cho những trường hợp bệnh nhân phức tạp ở
7

ICU. Nguyên nhân do không tính đến sự giảm nhạy cảm của vi sinh vật và dược
động học của thuốc thay đổi hoặc không thể dự đoán trước ở những bệnh nhân
này [30].
Xác định nồng độ kháng sinh trong huyết tương phục vụ cho giám sát
điều trị (TDM) giúp điều chỉnh liều, tối ưu hóa hiệu quả điều trị, hạn chế kháng
thuốc và giảm độc tính của thuốc là rất cần thiết, đặc biệt có ý nghĩa với những
bệnh nhân có dược động học thay đổi đáng kể như ở ICU [2] [9] [18] [31] [23].
1.2.2. Ứng dụng HPLC trong phân tích thuốc phục vụ cho giám sát điều
trị ceftazidim
Xác định nồng độ ceftazidim trong huyết tương có thể được thực hiện
bằng các phương pháp vi sinh [42] hoặc phương pháp ELISA huỳnh quang [8],
tuy nhiên các phương pháp này không phù hợp cho TDM do kỹ thuật phức tạp,
tốn kém, thời gian phân tích kéo dài. Các phương pháp phù hợp cho TDM đòi
hỏi phải có tính thực tiễn cao, chuẩn bị mẫu đơn giản và nhanh chóng, thời gian
phân tích ngắn, cung cấp kết quả đáng tin cậy, LLOQ thấp và giới hạn trên của
định lượng (ULOQ) đủ cao để áp dụng thành công trên lâm sàng [27] [24]. Một
số phương pháp đã được phát triển để xác định nồng độ ceftazidim trong huyết
tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV hoặc MS.
Những phương pháp này phù hợp cho giám sát điều trị và độc tính do có thời
gian phân tích nhanh, độ nhạy, độ chính xác và chọn lọc cao với ceftazidim,
yêu cầu lượng mẫu nhỏ; nhiều phương pháp đã được ứng dụng trong thực tiễn
lâm sàng cho kết quả tốt [43], [12], [13]. Ngoài ra, định lượng ceftazidim trong
huyết tương cũng có thể thực hiện bằng kỹ thuật HPLC sử dụng detector điện
hóa [15], tuy nhiên phương pháp này ít được ứng dụng trong lâm sàng do thiết
bị phân tích không phổ biến.
Phương pháp HPLC sử dụng detector UV cho phép phân tích thuốc một
cách đơn giản, không tốn kém, thiết bị phân tích tương đối phổ biến so với thiết
bị sử dụng detector MS. Detector mảng diod được sử dụng cho phép xác định

8


độ tinh khiết của pic và sự phù hợp của phổ hấp thụ. Detector UV bước sóng
duy nhất có thể sử dụng nếu chỉ có một chất phân tích được quan tâm [4]. Để
phân tích đồng thời nhiều chất có thể sử dụng detector UV đo tại nhiều bước
sóng [13]. Phương pháp phân tích đơn giản, có độ nhạy, độ chính xác và chọn
lọc cao phù hợp cho giám sát điều trị trong lâm sàng [36] [43] [4] [13].
Detector khối phổ (MS) có thể cải thiện độ nhạy và độ chọn lọc. Sắc ký
lỏng tương tác thân nước (HILIC) đang trở nên phổ biến và cung cấp những lợi
thế cho việc phát hiện MS các hợp chất phân cực và ion [3] [14]. Cột HILIC
giúp lưu giữ mạnh các chất phân tích không được giữ lại trong điều kiện sắc ký
pha đảo thông thường mà không cần thêm chất tạo cặp ion trong pha động. Chất
rửa giải chứa hàm lượng hữu cơ cao hơn trong HILIC giúp bay hơi dung môi
hiệu quả, do đó tăng cường độ nhạy và làm thay đổi sự ức chế ion. HILIC đặc
biệt thích hợp cho phân tích HPLC - MS để phân tích nhanh các hoạt chất phân
cực hoặc các chất chuyển hóa. Thời gian phân tích nhanh rất thuận lợi để có thể
phân tích liên tiếp nhiều mẫu [27]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp
này là sử dụng thiết bị, hóa chất đắt tiền, hiện tại vẫn còn chưa sẵn có ở hầu hết
các phòng thí nghiệm [43] [31].
1.2.3. Một số phương pháp định lượng ceftazidim trong huyết tương bằng
HPLC
Trong những năm vừa qua, đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhằm
định lượng nồng độ ceftazidim trong huyết tương. Dưới đây là các phương pháp
xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đã được sử dụng trong các nghiên cứu:

9


Bảng 1.2. Một số phương pháp định lượng CFZ trong huyết tương bằng HPLC

TLTK
(năm)
[16]

Xử lý mẫu

Điều kiện sắc ký

Chiết pha rắn: - Cột C18 (300 mm × 3,9 mm; 10

LLOQ
(µg/mL)
1

(1998) Cột Bond Elut μm).
C18

(thể

tích - Pha động: Dung dịch đệm phosphat

tiêm 80 μL).

pH 5,5 - MeCN (91:9).
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút.
- Detector: UV 255 nm.
- TR = 13,1 phút.

[17]

Tủa protein bằng - Cột µBondapakTM C18 (300 mm x

3

(2005) MeCN, ly tâm. 3,9 mm; 10 µm).
Thêm

- Pha động: Dung dịch đệm acetat pH

dicloromethan

4 - MeCN (90:10).

vào lớp trên, lắc, - Tốc độ dòng: 2 mL/phút.
ly tâm. Lấy pha - Detector: UV 257 nm.
nước phía trên - TR: 5,25 phút.
tiêm sắc ký (thể
tích tiêm 50 μL).
[36]

Chiết pha rắn: - Cột Symmetry® C8 (250 mm × 4,6

(2008) Cột sep-pak C18 mm; 5 μm).
(Waters)

(thể - Pha động: Dung dịch đệm phosphat

tích tiêm 40 μL). pH 7,4 - MeCN (gradient nồng độ).
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút.
- Detector: UV 256 nm.

- IS: ceforanid.
- TR: 11,5 phút.

10

2,5


[4]

Tủa protein bằng - Cột Waters X-bridge C18 (30 mm ×

5

(2010) MeCN, lắc, ly 4,6 mm; 2,5 μm).
tâm. Dịch sau ly - Pha động: Dung dịch đệm phosphat
tâm chiết bằng (50 mM, pH 2,4) - MeCN (92:8).
cloroform, lắc, ly - Tốc độ dòng: 1 mL/phút.
tâm.

Lấy

lớp - Detector: UV 260 nm.

nước phía trên - IS: cefotaxim.
tiêm sắc ký (thể - TR: 1,7 phút.
tích tiêm 10 μL).
[24]

Tủa protein bằng - Cột Atlantis T3 (150 mm × 4,6 mm;

2

(2011) MeCN, lắc, ly 5 μm).
tâm ở 4°C. Dịch - Pha động: Acid phosphoric (10 mM,
sau ly tâm pha pH 2) - MeCN (gradient nồng độ).
loãng với nước - Tốc độ dòng: 2 mL/phút.
rồi tiêm sắc ký - Detector: UV 230 nm.
(thể tích tiêm 20 - TR = 4,2 phút.
μL).
[26]

Tủa protein bằng - Cột Acquity UPLC BEH C18 (100

(2012) MeCN, lắc, ly mm × 2,1 mm; 1,7 μm).
tâm. Dịch sau ly - Nhiệt độ khay: 4°C; điều nhiệt cột:
tâm chiết bằng 50°C.
dicloromethan,

- Pha động: A (0,1 % acid formic

lắc, ly tâm. Lấy trong nước) và B (0,1 % acid formic
lớp nước phía trong MeCN) (gradient nồng độ).
trên tiêm sắc ký - Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút.
(thể tích tiêm 10 - Detector: MS.
μL).

- IS: Đồng vị deuteri hóa.

11

0,5


- TR: 2,02 phút.
[34]

Chiết pha rắn: - Cột Acquity HSS T3 (50 mm × 2,1

(2013) Cột
MCX

0,76

Oasis® mm; 1,7 μm).
(thể tích - Điều nhiệt cột: 40°C.

tiêm 1 μL).

- Pha động: A (1 mM dung dich đệm
CH3COOH/ CH3COONH4 với 5 %
MeCN) và B (MeCN) (gradient nồng
độ).
- Tốc độ dòng: 0,6 mL/phút.
- Detector: MS.
- IS: đồng vị ổn định.
- Thời gian phân tích: 5 phút.

[13]

Tủa protein bằng - Cột YMC ODS AQ (250 mm × 4,6

2

(2013) MeOH, lắc, ly mm; 5 μm).
tâm.

Bay

hơi - Nhiệt độ khay: 4°C; điều nhiệt cột:

dung môi, hòa 35°C.
tan

cắn

bằng - Pha động: Dung dịch đệm phosphat

dung dịch đệm (0,05 M, pH 3,8) - MeCN (gradient
phosphat

(0,05 nồng độ).

M pH 2,5) rồi - Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút.
tiêm sắc ký (thể - Detector: UV 260 nm.
tích tiêm 40 μL). - IS: cefoperazon.
- TR: 8,68 phút.
[38]

Tủa protein bằng - Cột Acquity UPLC BEH C18 (100

(2014) MeCN, lắc, ly mm × 2,1 mm; 1,7 μm).
tâm. Dịch sau ly - Nhiệt độ khay: 8°C; điều nhiệt cột:
tâm pha loãng 30°C.

12

0,1


với pha động rồi - Pha động: Dung dịch acid formic
tiêm sắc ký (thể trong nước 0,01 % - MeOH (gradient
tích tiêm 5 μL).

nồng độ).
- Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút.
- Detector: MS.
- TR: 1,15 - 1,5 phút.

[12]

Tủa protein bằng - Cột kinetex® C18 (50 mm × 2,1

0,1

(2014) MeCN chứa 0,1 mm; 2,6 μm).
% acid formic, - Nhiệt độ khay: 4°C; điều nhiệt cột:
lắc, ly tâm ở 4°C. 35°C.
Dịch sau ly tâm - Pha động: Nước chứa 0,1 % acid
pha loãng với formic - MeCN chứa 0,1 % acid

nước chứa 0,1 % formic (gradient nồng độ).
acid formic rồi - Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút.
tiêm sắc ký (thể - Detector: MS.
tích tiêm 20 μL). - IS: fluconazol.
- TR: 3,4 phút.
[39]

Tủa protein bằng - Cột Kinetex C18 (100 mm x 4,6

(2015) MeOH, ly tâm. mm; 2,6 µm).
Dịch sau ly tâm - Điều nhiệt cột: 40°C.
lọc rồi tiêm sắc - Pha động: A (0,1 % acid formic
ký (thể tích tiêm trong nước) và B (MeCN) (gradient
10 μL).

nồng độ).
- Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút.
- Detector: MS.
- IS: prasozin.
- TR: 2,7 phút.

13

1,5


[28]

Tủa protein bằng - Cột Acquity UPLC BEH C18 (100

0,62

(2015) MeCN, lắc, ly mm × 2,1 mm; 1,7 µm)
tâm. Dịch sau ly - Nhiệt độ khay: 4°C; điều nhiệt cột:
tâm pha loãng 50°C.
với nước, trộn - Pha động: A (Nước chứa 0,1 % acid
đều rồi tiêm sắc formic và 2 mM amoni acetat) và B
ký (thể tích tiêm (MeOH chứa 0,1 % acid formic và 2
40 μL).

mM amoni acetat) (gradient nồng độ).
- Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút.
- Detector: MS.
- IS: chuẩn nội deuteri hóa.
- Thời gian phân tích: 2,5 phút.

[43]

Tủa protein bằng - Cột Hypersil® Gold PFP (100 mm

2

(2016) MeCN, lắc, ly × 2,1 mm; 1,9 μm).
tâm.

Bay

dung

môi

hơi - Nhiệt độ khay: 4°C, điều nhiệt cột:
ở 40°C.

40°C, hòa tan - Pha động: acid phospohoric (10
cắn bằng dung mM) - MeCN (gradient nồng độ).
dịch
phosphoric

acid - Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút.
10 - Detector: UV 260 nm.

mM rồi tiêm sắc - IS: thiopental.
ký (thể tích tiêm - TR: 5,65 phút.
10 μL).
[2]

Tủa protein bằng - Cột Waters Acquity UPLC BEH

(2017) MeCN, lắc, ly Amide (100 mm × 2,1 mm; 1,7 μm).
tâm. Lấy dịch - Điều nhiệt cột: 40ºC.
sau ly tâm tiêm

14

0,1