Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectinase trong bacillus subtilis ứng dụng trong cô ng nghiệp xử lý vải bông

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ TRỌNG TÀI

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HÓA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM
ƯNG DUNG TRONG CÔNG NGHIÊP XƯ LY VAI BÔNG

Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ VĂN TRƯỜNG

Hà Nội - 2015




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng
tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2015

Tác giả

Lê Trọng Tài



i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Văn Trường, là người thầy đã hướng
cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ
sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (nay là Trung tâm Giống và Bảo
tồn nguồn gen vi sinh vật) đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn
để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn - những người
luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu.
Tác giả

Lê Trọng Tài

ii


MỤC LỤC
LƠI CAM ĐOAN .........................................................................................................................i
LƠI CAM ƠN ..............................................................................................................................ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................................iii
DANH MUC TƯ VIÊT TĂT ...................................................................................................... v
DANH MUC BANG ..................................................................................................................vi
DANH MUC HINH ..................................................................................................................vii
MƠ ĐÂU ..................................................................................................................................... 1
TÔNG QUAN TAI LIÊU ............................................................................................................ 3
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis ................................................................................................. 3
1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis .............................................................................................. 4
1.3. Pectin ...................................................................................................................................
5
1.4. Pectinase ..............................................................................................................................
6
1.4.1. Khái niệm pectinase..........................................................................................................
6
1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase....................................................................
6
1.5. Pectinase của Bacillus subtilis ...........................................................................................
10
1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm ............................................................................................
11
1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên ..............................................................................................
11
1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông .........................................
12

1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy .............................................................
13
1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến cà phê và trà .
13
1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam ..............................
13
VÂT LIÊU VA PHƯƠNG PHAP ............................................................................................. 14
2.1.
14

Vật liệu .............................................................................................................................

2.1.1. Các chủng vi khuẩn ........................................................................................................
14
2.1.2. Hóa chất thí nghiệm .......................................................................................................
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



15
2.1.3. Các vector sử dụng .........................................................................................................
15
2.1.4. Trình tự mồi ....................................................................................................................
15
2.2. Môi trường nuôi cấy ..........................................................................................................
16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................................
17
2.3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis có hoạt tính pectinase trên môi trường thạch đĩa ......... 17

2.3.2. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng B. subtilis tự nhiên ...................................
17
2.3.3. Thu nhận pectinase ngoại bào từ các chủng tái tổ hợp..................................................
17
2.3.4. Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11]....................................................
17
2.3.5. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10]........
19
2.3.6. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................
21



iv


2.3.7. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 22
2.3.8. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli ................................................................................. 23
2.3.9. Tách chiết DNA plasmid từ B. subtilis ........................................................................... 23
2.3.10. Các phương pháp thao tác trong sinh học phân tử ...................................................... 23
2.3.11. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp xung điện ........................................ 26
2.3.12. Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B. subtlis 168 .............................................................. 26
2.3.13. Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) ........................................ 27
KÊT QUA VA THẢO LUÂN ................................................................................................... 28
3.1. Sàng lọc các chủng B. subtilis phân lập từ trong nước có hoạt tính pectinase cao ........... 28
3.1.1. Sàng lọc chủng B. subtlis có hoạt tính pectinase trên đĩa thạch ................................... 28
3.1.2. Nghiên cứu khả năng phân cắt pectin ở pH kiềm bởi dịch enzyme ngoại bào của các
chủng nghiên cứu...................................................................................................................... 29
3.1.3. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp phát hiện liên kết đôi ........................ 31
3.2. Tách dòng gen pectinase trong E. coli.............................................................................. 32

3.2.1. Tách chiết DNA tổng số của các chủng B. subtilis......................................................... 32
3.2.2. Nhân gen pectinase bằng PCR ....................................................................................... 33
3.2.3. Tách dòng các gen pel vào E. coli .................................................................................. 34
3.2.4. Giải trình tự các gen pectinase....................................................................................... 36
3.3. Tạo chủng B. subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase .......................................................... 38
3.3.1. Thiết kế vector biểu hiện gen pectinase trong B. subtilis ............................................... 38
3.3.2. Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B. subtilis........................................................... 43
3.3.3. Biểu hiện chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase trên môi trường lỏng .................... 44
3.4. So sánh tính chất của enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh ra từ
chủng tự nhiên
..................................................................................................................................... 47
3.4.1. So sánh ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ
chủng tự nhiên
..................................................................................................................................... 47
3.4.2. So sánh ảnh hưởng của pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp và pectinase từ chủng
tự nhiên
......................................................................................................................................... 48
KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI ................................................................................................... 49
4.1. Kết luận .............................................................................................................................. 49
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................................ 49
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


v


TÀI LIÊU THAM KHẢO ......................................................................................................... 50
Tài liệu tiếng Việt ...................................................................................................................... 50
Tài liệu tiếng Anh ...................................................................................................................... 50

vi


DANH MUC TƯ VIÊT TĂT
a.a

:

Amino acid

APS

:

Ammonium persulfate

B. subtilis

:

Bacillus subtilis

BMM

:

Môi trường khoáng chất Belisky

BSA

:

Bovine serum albumin

DEAE

:

Diethylethanolamine

DNA

:

Deoxyribonucleic axit

DNSA

:

3,5-Dinitrosalicylic axit

E. coli

:

Escherichia coli

EDTA

:

Ethylenediaminetetraacetic axit

HTAB

:

Hecxadecyl trimethyl

trimethyl

trimethyl

trimethyl

ammonium bromide
ISO

:

International standards organization

kDa

:

Kilo Dalton

LB

:

Luria bertani

M

:

Mole

OD

:

Optical density

PCR

:

Polymerase chain reaction

pel

:

Gen pectinase

Pel

:

Enzyme pectinase

RR

:

Rhuthenium red

rPel

:

Pectinase tái tổ hợp

SDS

:

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

:

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

:

Tetramethylethylenediamine

U

:

Unit

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

v


DANH MUC BANG
Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme ............................................................................. 7
Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông ............................................................................. 11
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng nhân gen ...............................................................................
23
Bảng 2.2. Chương trình nhân gen bằng PCR ........................................................................... 23
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC bằng HindIII ............................................... 24
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pJET/pel bằng HindIII .................................................... 24
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter ..................................................... 24
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel ................................................. 24
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc các chủng B. subtilis có khả năng phân hủy pectin trên đĩa thạch.
.................................................................................................................................................. 28

Bảng 3.2. Hoạt tính pectinase ở điều kiện pH phản ứng tối ưu của các chủng nghiên cứu ..... 30
Bảng 3.3. Hoạt tính pectinase của các enzyme thu được ......................................................... 31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vi


DANH MUC HINH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin........................................................................
6
Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases .............................................................
8
Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase ........................
8
Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase..............................................................
9
Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của sợi
bông. Pectin được tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin........................................ 11
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn protein ....................................................................................... 18
Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành 3 amino, 5-nitrosalicylic axit.. 19
Hình 2.3. Đường chuẩn glucose ............................................................................................... 20
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit của pectinase ...........................................................
21
Hình 3.1. Hình ảnh một số chủng B. subtilis tạo vòng thủy phân pectin trên đĩa thạch LB 0,2%
pectin. .......................................................................................................................................
29
Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng phân hủy pectin của các pectinase từ các chủng
nghiên cứu ................................................................................................................................
31

Hình 3.3. Điện di DNA tổng số của các chủng B. subtlis. ...................................................... 33
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase ................................................. 34
Hình 3.5. Khuẩn lạc các thể biến nạp E. coli DH5α mang pJET/pel trên môi trường chọn lọc
LB, 100 µg/ml ampicillin ......................................................................................................... 34
Hình 3.6. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII .......................................................... 35
Hình 3.7. Điện di sản phẩm cắt pJET/pel bằng HindIII ......................................................... 35
Hình 3.8. So sánh theo hàng trình tự amino acid của Pel từ 4 chủng B. subtilis phân lập ở Việt
Nam với Pel từ B. subtilis 168.................................................................................................. 37
Hình 3.9. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pel trong B. subtilis. ................................................ 39
Hình 3.10. Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC bằng HindIII. ................................................... 40
Hình 3.11. Thu nhận pel từ pJET/pel.. ..................................................................................... 40
Hình 3.12. Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ...................................................... 41
Hình 3.13. Nhân gen dung hợp BaP-pel bằng PCR. ................................................................ 42
Hình 3.14. Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel trong pMSE/BaP-pel........................................... 42
Hình 3.15. Kiểm tra pMSE/BaP-pel trong tế bào B. subtlis 168 tái tổ hợp. ........................... 44
Hình 3.16. Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào của chủng B. subtilis tái tổ hợp đa


copy trên môi trường LB+Kan.. ............................................................................................... 45
Hình 3.17. Kiểm tra sự biểu hiện pectinase của các thể biến nạp đa copy trong tế bào B.
subtlis 168 sau 24 giờ nuôi cấy.. ............................................................................................. 45
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

vii


Hình 3.18. Kiểm tra hoạt tính pectinase của thể biến nạp đa copy BSM và chủng B. subtilis
168 trên cơ chất pectin axit.......................................................................................................
46
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme........................................................ 47

Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính enzyme................................................................ 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

viii


MƠ ĐÂU
Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam đang phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng
trong nền kinh tế quốc. Nếu phát triển bông thực hiện đúng tiến độ theo Quyết định số
36/2008/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ thì đến năm
2015 sản xuất bông trong nước là 40 ngàn tấn, đáp ứng được 10% nhu cầu và đến 2020
là 60 ngàn tấn đáp ứng được 12% nhu cầu bông xơ tiêu thụ trong nước. Để “chiến lược
phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm
2015, định hướng đến năm 2020” thành công thì ngoài việc thúc đẩy tăng năng xuất và diện
tích trồng bông ra chúng ta cần phải cải tiến công nghệ, ứng dung
̣ công nghệ enzyme trong
quá trình sản xuất vải bông để tạo ra sản phẩm vải bông chất lượng cao, giá thành rẻ và
có thể cạnh tranh được trên thị trường quốc tế.
Sợi bông tự nhiên được cấu tạo bao gồm 95% là cellulose và 5% là không phải
cellulose. Vải bông mộc sau khi dệt còn chứa nhiều chất không phải cellulose. Trong quá
trình nhuộm vải, nếu không loại các chất không phải cellulose đi thì chúng sẽ làm cản trở
thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lượng của vải nhuộm. Thông thường để
loại bỏ các chất này, vải mộc phải qua bước nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng
đi, đây là công nghệ đơn giản nhưng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm sự rắn chắc của sợi bông
do tác động của chất kiềm tới cấu trúc của cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trường và tiêu
hao rất lớn năng lượng. Để giải quyết vấn đề này, những năm gần đây các nhà công nghệ
trên thế giới đã sử dụng enzyme pectinase, một loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy
pectin trong sợi bông, thay vì sử dụng hóa chất kiềm độc hại. Xử lý vải bông bằng pectinase
làm tăng khả năng thấm nước của vải bông, vải mịn và trơn nhẵn hơn, do đó mang lại hiệu

quả cao cho quá trnh t ẩy trắng (bleaching) và nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lượng vải
tốt hơn.
Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm trong công nghệ xử lý vải bông mới phát
triển khoảng 10 năm gần đây. Nhưng được nhiều nhà công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn
của chúng trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rút ngắn



1


thời gian xử lý, tiết kiệm năng lượng và giảm thiểu tác hại môi trường. Hiện nay một số
pectinase thương mại đã được sản xuất và bán trên thị trường để sử dung
̣ trong công nghiệp
dệt như Bioprep 3000L, ScourL-Novozyme (của hãng Novozyme), alkaline pectinase (Trung
Quốc), Cotonase (Mỹ).
Ở nước ta, công nghệ xử lý sợi bông hiện nay vẫn sử dun
̣ g chất kiềm, đây là lý do tại
sao chúng ta không có sản phẩm vải bông chất lượng cao và ảnh hưởng lớn đến môi trường.
Chính vì vậy việc sử dụng enzyme pectinase trong xử lý vải bông thay thế hóa chất kiềm
sẽ giúp cho bảo vệ môi trường, làm cho vải bông có chất lượng cao và giúp cho giá thành
sản xuất giảm. Từ đó nâng cao sự cạnh tranh trong thời buổi kinh tế thị trường.
Hiện nay ở nước ta chưa có cơ sở nào sản xuất được pectinase ưa kiềm ứng dun
̣ g
trong công nghiệp. Vì vậy việc nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn sản xuất enzyme pectinase
ưa kiềm tái tổ hợp để ứng dụng cho ngành sản xuất vải bông là điều cần thiết, giúp cho
ngành công nghiệp dệt nước ta chủ động được nguồn enzyme phục vụ cho việc xử lý vải
bông, nâng cao chất lượng vải bông để cạnh tranh được trên thị trường Quốc tế. Đề tài
“Nghiên cứu biểu hiện cao gen mã hóa pectnase trong Bacillus subtlis ưng dung trong cô
ng nghiêp xư ly vải bông ” sẽ góp phần tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ hợp sản sinh pectinase

sản lượng cao để ứng dụng cho công nghiệp xử lý pectin trong vải bông thô.



2


TÔNG QUAN TAI LIÊU
1.1. Sơ lược về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis (B. subtlis) là vi khuẩn gram dương, thuộc họ Bacillaceae, chi Bacillus,
phân bố rộng rãi trong sinh quyển nhưng phổ biến nhất là trong đất. Tế bào B. subtlis có Hình
que, có khả năng tạo thành nội bào tử để bảo vệ trong khi gặp điều kiện bất lợi, cho phép
sinh vật chịu được những điều kiện khắc nghiệt [35], [43] . Tế bào vi khuẩn B. subtlis được bao
bọc bởi thành vững chắc. Nó bao gồm các lớp peptidoglycan, là một polymer của các
loại đường và amino acid. Thành tế bào tạo thành các rào cản giữa môi trường và tế bào
vi khuẩn. Nó còn giúp duy trì Hình dạng của tế bào và giúp tế bào chịu được áp lực cao của
môi trường nội bào [36].
B. subtilis được tìm thấy tự nhiên rất nhiều trong đất và thảm thực vật, có ít hơn
trong nước hay không khí. B. subtlis phát triển trong phạm vi nhiệt độ trung bình. Nhiệt
o
độ tối ưu là 25-35 C. B. subtilis là sinh vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử có thể sống sót
ở điều kiện nhiệt độ cao, thường thấy khi nấu ăn.
Hệ gen B. subtilis 168 đã được giải mã thành công và công bố vào năm
1997 [23], bao gồm duy nhất một chromosome dạng vòng. Tổng kích thước hệ gen là 4,2
Mbp, trong đó 4 100 gen mã hóa cho các phân tử protein. Sự giải mã thành công hệ gen B.
subtilis mang một ý nghĩa to lớn, giúp thúc đẩy các nghiên cứu về proteome và metabolome
của vi khuẩn này.
B. subtilis là vi khuẩn không gây độc và ngày càng trở thành những vi sinh vật
quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng loạt lĩnh
vực từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, sinh học

phân tử, y dược học, trong các ngành công nghiệp và trong xử lí môi trường. Chính vì lẽ đó
nên ngày càng nhiều các nghiên cứu ứng dụng của chúng đối với đời sống con người. B.
subtilis là vi khuẩn có khả năng tiết một số enzyme quan trọng như protease, lipase,
xylanase, pectinase kiềm, trong đó pectinase kiềm là một trong những enzyme quan trọng



3


có nhiều ứng dun
̣ g trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây, công nghiệp xử lý giấy và
đặc biệt là công nghiệp xử lý vải bông thô.
1.2. Hệ biểu hiện Bacillus subtilis
B. subtilis là vi khuẩn đã được nghiên cứu khá sâu về sinh học phân tử (chỉ sau E.
coli). Chúng có nhiều đặc điểm quí như: là vi khuẩn không gây bệnh, khả năng sinh trưởng rất
mạnh, môi trường lên men đơn giản, rẻ và dễ ứng dung
̣ trong công nghiệp. Hệ tiết của B.
subtilis được biết là một trong những hệ tiết tốt nhất để ứng dụng sản xuất protein tái tổ
hợp. Vì vậy nhiều tác giả đã chọn hệ biểu hiện B. subtilis để sản xuất protein tái tổ hợp.
Promoter là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện gen ngoại lai trong B. subtilis. Việc sử
dụng promoter của gen ngoại lai khi biểu hiện trong tế bào B. subilis thông thường không
hiệu quả bằng sử dun
̣ g promoter của B. subtlis do RNA-polymerase holoenzyme của chúng
không bám hiệu quả vào promoter ngoại lai, ngoại trừ một vài trường hợp. Tín hiệu tiết
(signal peptide) cũng là yếu tố quan trọng cho sự biểu hiện hiệu quả của gen ngoại lai.
Wang và Doi (1989) đã định rõ các tín hiệu tiết cần thiết cho việc sao mã và dịch mã của
gen ngoại lai trong B. subtilis và những yếu tố cần thiết để vượt qua rào cản của sự biểu
hiện gen [49]. Việc sử dụng vector đa copy hay vector tích hợp gen để biểu hiện gen ngoại lai
cũng cần được cân nhắc bởi vì mỗi loại vector đều có những ưu điểm và nhược điểm. Vector

đa copy thông thường có khả năng biểu hiện mạnh hơn vector tích hợp do có lượng bản sao
nhiều hơn trong một tế bào chủ nhưng lại có tnh bền kém hơn. Hệ biểu hiện đa copy luôn
luôn cần duy trì áp lực chọn lọc (như bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy). Ngược
lại vector tích hợp do được tích hợp gen ngoại lai vào chromosome của tế bào chủ cho nên
có tính bền cao hơn, không cần đến áp lực chọn lọc khi biểu hiện gen.
Các chủng sản xuất protein tái tổ hợp trong công nghiệp hiện nay phần lớn là vi
khuẩn thuộc họ Bacillus. Lượng enzyme tái tổ hợp trong thương mại hiện nay được sản xuất
từ họ Bacillus chiếm tới 60% [17], [37]. Tuy nhiên, hệ biểu hiện B. subtilis cũng có những
nhược điểm như khi biểu hiện gen ngoại lai



4


trong chúng thì một hiện tượng hay gặp là sự tương tác bất lợi của sản phẩm biểu hiện
với chủng biểu hiện dẫn đến quá trình biểu hiện có hiệu quả thấp, thậm chí nhiều trường hợp
còn không thể biểu hiện được. Tuy nhiên, nếu sử dun
̣ g gen biểu hiện là gen có nguồn gốc từ
chúng thì khả năng ảnh hưởng bất lợi trong khi biểu hiện là hoàn toàn được loại bỏ. Hướng
sản xuất protein tái tổ hợp bằng cách này là một trong những hướng sản xuất mang lại hiệu
quả biểu hiện cao. Hướng biểu hiện này đã thành công với gen amylase và xylanase tái tổ
hợp trong B. subtilis ở một số nghiên cứu trong nước. [4], [5].
1.3. Pectin
Pectin là các đại phân tử polysaccharide phức tạp có nhiều trong tế bào thực vật bao
gồm: pectin (polymethylgalacturonate), pectin axit (polygalacturonate) và

các

oligogalacturonate. Pectin có khả năng tan trong nước và có ít nhất 75% các nhóm

carboxyl của galactoronate bị ester hóa với methanol. Oligogalacturonate là chất đa phân
tử nhỏ hơn, chỉ gồm hai hoặc vài đơn phân galacturonate. Oligo methylgalacturonate cũng
là chất đa phân tử gồm hai hoặc vài galacturonate, có thể một phần hoặc hoàn toàn bị
methyl hóa ở vị trí C-6 [50].
Hợp chất pectin tiêu biểu cho nhóm polysaccharide có mối liên hệ gần gũi với nhau.
Hai thành tố cơ bản tạo thành hợp chất pectin là galacturonan và rhamnogalacturonan trong
đó carbon ở vị trí C-6 của galactose bị oxy hóa tạo nhóm carboxyl, ngoài ra còn có arabinan,
galactan và arabinogalactan. Rhamnogalacturonan là thành phần chính trong hợp chất
pectin. Chuỗi sơ cấp gồm các đơn vị α-D-galacturonate liên kết (1-4) với 2-4% L-rhamnose
liên kết β-(1-2) và β-(1-4) với D-galacturonate. Chuỗi bên của rhamnogalacturonan có thành
phần và độ dài đa dạng. Chuỗi bên kéo dài thường là các polymer đồng nhất của axit Dgalacturonic hoặc L-arabinose [50].



5


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đoạn pectin
Cấu trúc hóa học đặc trưng của pectin được thể hiện ở Hình 1.1. Các đơn vị Dgalactorunate liên kết với nhau bằng các liên kết α-1-4 glycoside. Một số D-galacturonate
bị methyl-este hóa vị trí O-6 của nhóm carboxyl hoặc acetyl- este hóa ở vị trí O-2 hoặc O-3
của nhóm hydroxyl, một số khác bị biến đổi thành dạng COO hoặc –COOH phụ thuộc vào
độ pH. Mức độ methyl hóa và acetyl hóa rất đa dạng, phụ thuộc vào nguồn pectin [38].
1.4. Pectinase
1.4.1. Khái niệm pectnase
Các enzyme xúc tác phân cắt pectin được gọi chung là pectinase. Enzyme pectinase
được tạo ra trong tự nhiên bởi các vi sinh vật như: vi khuẩn, nấm, nấm men, côn trùng, giun
tròn, nguyên sinh động vật và thực vật. Trong đó vi khuẩn B. subtilis là một trong nhóm vi
khuẩn có khả năng tiết enzyme pectinase.
Pectinase được sử dụng nhiều trong một số ngành sản xuất như: sản xuất rượu vang,
nước ép trái cây, công nghiệp dệt may, xử lí rác thải. Việc ứng dụng pectinase kiềm trong

công nghệ xử lí vải bông mới phát triển khoảng 10 năm gần đây nhưng được nhiều nhà
công nghệ quan tâm vì ích lợi to lớn của chúng trong việc nâng cao chất lượng vải bông, rút
ngắn thời gian xử lí, tiết kiệm năng lượng và giảm thải tác hại môi trường. Hiện nay một số
pectinase thương mại đã được sản xuất và bán trên thị trường để ứng dụng trong công nghiệp
dệt.
1.4.2. Phân loại và cơ chế hoạt động của pectinase
Dựa vào cơ chế hoạt động và cơ chất chúng tham gia xúc tác phân cắt mà pectinase
được phân chia thành các enzyme khác nhau. Pectinase được phân loại thành 3 nhóm chính,
được tóm tắt trong Bảng 1.1.



6


Bảng 1.1. Phân loại các pectinolytic enzyme [50]
Tên enzyme
Esterase
- Pectin methylesterase
( pectin esterase)
- Pectin acetylesterase
Polygalacturonase
- Protopectinase
- Endopolygalacturonases
- Exopolygalacturonases
- Oligogalacturonate
hydrolases
- 4:5 unsaturated oligogalacturonate hydrolase

EC No.

Cơ chất

Sản phẩm

Cơ
chế
xúc tác

3.1.1.11

Pectin

Pectin axit +
Methanol

Thuỷ phân

3.1.1.-

Pectin

3.2.1.15
3.2.1.82

- Endopolymethylgalacturonase
Lyase
- Endopolygalacturonate
lyases (endopectinase)
- Exopolygalacturonate

lyase (exopectinase)

Chưa xác
định

Protopectin
Pectin axit
Pectin axit
Trigalactoronate
4:5
(galacturonate)n

Pectin
Oligogalacturonates
Monogalacturonate
Monogalacturonate

Pectin

Methyloligogalacturonates

4.2.2.2

Pectin axit

4.2.2.9

Pectin axit

- Oligogalacturonate lyase

4.2.2.6

Unsaturate
d
digalacturonate

- Endopolymethylgalactu
ronate lyase (endopetin
lyases)

4.2.2.10

Pectin

Unsaturated
monogalaturonate
và saturate (n-1)

Unsaturated
oligogalacturonates
Unsaturated
digalacturonates
Unsaturated
monogalacturonates
Unsaturated
methyloligogalacturonates

Thuỷ phân
Thuỷ phân

Thuỷ phân
Thuỷ phân
Thuỷ phân
Thuỷ phân

Chuyển
liên kết
Chuyển
liên kết
Chuyển
liên kết
Chuyển
liên kết

Pectinase có hai cơ chế phản ứng cơ bản: thủy phân (hydrolysis) và phân cắt chuyển
liên kết (trans –element). Cơ chế thủy phân đòi hỏi sự có mặt của nước, ngược lại, cơ chế
chuyển liên kết diễn ra trong điều kiện không cần nước và tạo ra sản phẩm có một liên kết
đôi (Hình 1.4).
Pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) tác động vào pectin để loại bỏ nhóm methoxyl từ
nhóm carboxyl C-6 của galacturonate bằng con đường thủy phân (Hình 1.2). Sản phẩm cuối
+
cùng của phản ứng là pectin axit, methanol và H từ


7


+
sự ion hóa các nhóm carboxyl. H giải phóng ra từ nhóm carboxyl mới Hình thành sẽ làm
giảm độ pH của môi trường phản ứng. Do vậy, có thể tiến hành đo pH của dung dịch sau

phản ứng để xác định hoạt tính pectin methylesterase.

m ethy leste rase s
2
Polymethylgalacturonates + nH
O 


 oligogalacturonates
galacturonate
Hình 1.2. Thủy phân pectin bởi pectin methylesterases
Pectin acetylesterase thủy phân pectin bằng cách loại bỏ nhóm acetyl khỏi nhóm
hydroxyl C2 và C3 của đơn vị galacturonate. Searle-van Leeuwen, Vincken và cộng sự (1996)
lần đầu phát hiện pectin acetylesterase ở Aspergillus niger [40]. Shevchik và HugouvieuxCotte-Pattat (1997) tìm thấy hai pectin acetylesterase khác ở Erwinia chrysanthemi 3937
[41]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về pectin acetylesterase còn rất hạn chế.

Polygalacturonates+ 2nH O endopolygalacturonase
oligogalacturonates galacturonate
exopolygalacturonase polygalactoronate  galacturonate
 Polygalacturonate


 n
n + nH2 O 
1
Hình 1.3. Sự thủy phân polygalacturonate bởi endo- và exopolygalacturonase
Endopolygalacturonase (EC 3.2.1.15) và exopolygalacturonase (EC
3.2.1.67) thủy phân liên kết glycosid bên trong của polygalacturonate (Hình 1.3). Sản phẩm
phản ứng là một loạt polygalacturonate mạch ngắn (đối với

8


endopolygalacturonate) hoặc galacturonate (với exopolygalacturonate). Hoạt tính của hai
enzyme này có thể được đo bằng cách xác định mức độ Hình thành nhóm khử với 3,5dinitrosalycylate.
Endopolymethylgalacturonase:

thủy phân polymethylgalacturonate ngẫu nhiên

thành oligomethylgalacturonate [6], [16]. Phản ứng được xúc tác bởi sơ đồ sau:
 Polymethylgalacturonate n
Oligomethylgalacturonates

+2 nH

O

E ndo polym eth ylgal actu ronas e
 

 


 

Hoạt tính của endopolymethylgalacturonase cũng có thể được đo bằng
cách xác định tỷ lệ nhóm khử Hình thành bởi sự thủy phân các liên kết glycosid.
Endopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.2), còn có tên gọi khác là
pectinase. Enzyme này chỉ được tm thấy ở vi sinh vật, pH tối ưu trong khoảng

8-10, cao hơn nhiều so với các enzyme phân giải pectin khác. Để hoạt động chúng cần sự có
2+
mặt của Ca và chúng phân cắt liên kết glycosid bằng cơ chế trans tạo thành liên kết đôi
giữa C-4 và C-5 của galacturonate (Hình 1.4). Phương pháp tốt nhất để xác định hoạt tính
enzyme này là phát hiện liên kết đôi trên máy đo quang phổ ở bước sóng 232 nm [28]. Ngoài
ra cũng có thể xác định hoạt tính bằng phương pháp đường khử với 3,5-dinitrosalicylate [10].
Phản ứng xúc tác bởi endopolygalacturnate lyase như sau:
Polygalacturonate Endopolygalacturonate lyase  4 : 5
unsaturated oligogalacturonates

Hình 1.4. Sự phân cắt polygalacturonate bởi pectinase
Exopolygalacturonate lyase (EC 4.2.2.9) được phát hiện chỉ ở một số loài vi khuẩn
như Clostridium multfermentan; Erwinia aroideae; Erwinia disolvens. Cơ chất thích hợp
không phải polymethylgalacturonate mà là


polygalacturonate. Sản phẩm tạo thành là Δ4:5 digalacturonate không no. Độ pH tối ưu của
các enzyme này trong khoảng 8,0 – 9,5. Hoạt tính của exopolygalacturonate lyase có thể
được xác định giống với cách tiến hành đối với endopolygalacturonate lyase. Phản ứng xúc
tác bởi enzyme exopolygalacturonate lyase theo sơ đồ sau:

Endo methylgalacturonate lyase (EC 4.2.2.10) phân cắt pectin bên trong phân tử
pectin, tạo thành sản phẩm cuối cùng là các oligomethylgalacturonates [6], [16]. Phản ứng
xúc tác bởi Endo methylgalacturonate lyase như sau:

Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định bằng phương pháp đường khử [10],
[42], hoặc đo trên máy quang phổ phát hiện các liên kết nối đôi ở bước sóng 232 nm [28].
1.5. Pectinase của Bacillus subtilis
Pectinase từ B. subtlis đã được Nasser tinh sạch và nghiên cứu tính chất và biểu
hiện trong E. coli từ những năm 90 của thế kỷ trước [31], [30]. Enzyme này xúc tác phản ứng

o
phân hủy pectin axit ở pH và nhiệt độ tối ưu là 8,4 và 42 C. Trọng lượng phân tử protein
khoảng 45,6 kDa, bao gồm 420 amino acid, trong đó có 21 amino acid của peptide tín hiệu
tiết. Cũng như các pectinase từ vi sinh vật khác, pectinase của B. subtilis cần bổ sung Ca

2+

2+
vào phản ứng xúc tác. Pectinase của B. subtilis có 3 vị trí bám của Ca là Asp-184, Asp-223
và Asp227 do đó phản ứng xúc tác của chúng không thể thiếu Ca

2+

[32].

Các chủng B. subtilis hiện có ở Việt Nam thông thường sẽ có gen pel này, các biến
chủng của chúng sẽ có một vài sai khác trong gen, do đó dựa vào trình tự nucleotide đã biết
của chúng mà có thể tổng hợp cặp mồi để nhân gen bằng PCR một cách dễ dàng.



10


1.6. Ứng dụng của pectinase kiềm
1.6.1. Cấu tạo sợi bông tự nhiên

Hình 1.5. Sự kết nối giữa cellulose và các chất không phải cellulose trong lớp thứ cấp của
sợi bông. Pectin được tồn tại ở hai loại: pectin axit và esterified pectin.
Sợi bông tự nhiên được cấu tạo bởi lớp ngoài mỏng gọi là lớp sơ cấp và

lớp dầy bên trong là lớp thứ cấp. Hàm lượng cellulose trong sợi bông chiếm tới
95%, chỉ 5% còn lại là chất không phải cellulose (non- cellulose). Các chất không phải
cellulose này chủ yếu là pectin, ngoài ra còn có chất dị cellulose (hemicellulose), protein và
chất sáp dính (waxe) [9], [39].
Bảng 1.2. Các thành phần cấu tạo sợi bông [9], [39]
Thành phần sợi bông

Trọng lượng khô (%)

- Cellulose

88-96

- Protein

1,1 – 1,9

- Pectin

0,7-1,2

- Sáp

0,4 – 1.0

- Tro

0,7-1,6

- Hemicellulose (xylan...)

- Các chất khác (khoáng...)

0,5 – 1.0

Chất không phải cellulose chiếm phần lớn trong lớp thứ cấp vì vậy quá trình xử lý sợi
bông chủ yếu là loại bỏ lớp thứ cấp. Pectin trong sợi bông chiếm khoảng 0,4-1,2%, chúng có
vai trò như chất kết dính liên kết cellulose và chất không phải cellulose (Hình 1.5). Vì vậy việc
loại bỏ pectin sẽ làm cho việc loại bỏ các chất không phải cellulose khác trong sợi bông dễ
dàng hơn.


11


1.6.2. Ứng dụng pectinase kiềm trong công nghiệp xử lý vải bông
Công nghệ xử lý vải bông bằng enzyme được gọi là “BioScouring” là công nghệ sử
dụng enzyme pectinase kiềm thay thế xút trong khâu nấu kiềm đã được nghiên cứu và triển
khai trong sản xuất và đã thu được kết quả tốt ở nhiều nơi. Tháng tư năm 1999, hãng
Novozymes (Đan Mạch) đã đưa chế phẩm pectinase kiềm ra thị trường có tên thương
mại BioPrep 3000L. Sau đó ít lâu, hãng Bayer (Đức) có sản phẩm enzyme pectinase kiềm là
Baylase EVO. Từ dó công nghệ “BioScouring” sử dụng enzyme pectinase kiềm xử lý vải bông
ra đời. Công nghệ “BioScouring” với các sản phẩm chứa pectinase kiềm đã được nhiều nhà
khoa học trên thế giới nghiên cứu cho thấy có hiệu quả tốt, có thể thay thế xút để loại pectin
trong quá trình nấu tẩy [8], [12], [15], [19], [26]. Pectin trong sợi bông có vai trò như chất kết
dính liên kết cellulose và chất không phải cellulose. Sử dụng enzyme pectinase kiềm không
làm ảnh hưởng đến cấu trúc cellulose của sợi vải, do đó tránh tổn hại sợi [22], [29], [48].
Klug-Santner và cộng sự đã chỉ ra pectinase từ Bacillus pumilus BK2 đã loại 80% pectin của
sợi bông [22]. Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy việc kết hợp pectinase
kiềm với một số enzyme khác như: lipase, protease, xylanase sẽ giúp hỗ trợ loại bỏ các
chất không phải cellulose (lignin, sáp, protein, hemicellulose…) hiệu quả hơn khi chỉ sử

dun
̣ g một loại enzyme pectinase trong công đoạn nấu kiềm [45], [47].
Các chế phẩm pectinase kiềm hiện nay có trên thị trường: Bioprep 3000L, Pulpzyme
HC, Scourzyme L –Novozymes, Baylase EVO – Bayer, Unizim PEC
– Color-Center SA, Baylase EVO, Sera Zyme C – PE của Singapore, Prima Green Ecoscour của
Genencor. Các chế phẩm pectinase kiềm thay thế xút đã giảm rõ rệt giá thành sản xuất nhờ
tiết kiệm nước, năng lượng và thời gian xử lý so với quá trình nấu truyền thống sử dun
̣ g xút.
Hơn nữa, do các điều kiện xử lý “ôn hòa” của enzyme pectinase dẫn đến tăng chất lượng vải,
tăng mức độ thấm, hút nước và cũng làm tăng độ tươi sáng màu sau nhuộm theo CavacoPaulo & Gübitz (2003) [14].



12


1.6.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột giấy
Trong công nghệ sản xuất bột giấy hiện nay, bước tẩy trắng bằng alkaline peroxide là
bước bắt buộc để tạo sản phẩm giấy trắng tinh khiết. Nếu bột giấy không được loại bỏ pectin
axit trong bột giấy thì trong quá tình tẩy trắng các pectina axit này sẽ kết hợp với peroxide
tạo ra phức hợp cationic polymer làm ảnh hưởng đến độ trắng của giấy. Sử dun
̣ g pectinase
kiềm để loại pectin axit trong bột giấy giúp cho quá trình tẩy trắng hiệu quả mà không ảnh
hưởng đến ô nhiễm môi trường [33], [34].
1.6.4. Ứng dụng pectinase kiềm trong chiết xuất dầu thực vật, trong chế biến
cà phê và trà
Pectinase kiềm có khả năng phá vỡ vách tế bào thực vật do đó có khả năng ứng
dụng trong công nghệ chiết xuất dầu thực vật từ các hạt như hạt cải, dầu dừa, hạt hướng
dương, hạt nho v.v.. Việc xử lý các hạt với pectinase kiềm giúp cho việc chiết rút dầu thực
vật hiệu quả hơn so với dùng dung môi hexane dễ gây ung thư [20].

Bổ sung pectinase

kiềm cùng với hemicellulase và protease trong quá trình chế biến cà phê và trà lên men
làm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm [7].
1.7. Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp trên thế giới và Việt Nam
Pectinase là enzyme quan trọng trong công nghiệp do đó được đã được nhiều nhà
khoa học quan tâm. Nhiều tác giả đã biểu hiện thành công pectinase dạng tái tổ hợp trong
tế bào E. coli [30], [21], [24], [46], trên tế bào Bacillus [27] hay tế bào nấm men Pichia
pastoris [18], [52]. Tuy nhiên phần lớn các công bố trên đều biểu hiện enzyme pectinase tái
tổ hợp cho mục đích nghiên cứu tnh chất của enzyme, các công bố về tình Hình sản xuất
enzyme trong công nghiệp cũng như năng suất sản sinh pectinase tái tổ hợp của các chủng tái
tổ hợp đều rất ít thông tin. Trên thực tế có nhiều chế phẩm enzyme pectinase thương mại là
enzyme tái tổ hợp nhưng có rất ít thông tin về sản xuất pectinase tái tổ hợp trong công
nghiệp được công bố. Lý giải cho việc không công bố này là do các công



13