Phát triển chỉ thị SSR phục vụ chọn giống chè kháng bệnh phồng lá do nấm exobasidium vexans ( Luận văn thac sĩ)

i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------------------------------

PHAN VĂN CƢƠNG

PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ SSR PHỤC VỤ
CHỌN GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ
DO NẤM Exobasidium vexans

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, năm 2014


ii
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
--------------------------------

PHAN VĂN CƢƠNG

PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ SSR PHỤC VỤ
CHỌN GIỐNG CHÈ KHÁNG BỆNH PHỒNG LÁ
DO NẤM Exobasidium vexans

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên, năm 2014


iii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu
đƣợc nguyên bản, không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi
trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Phan Văn Cƣơng


iv
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu và TS. Vũ
Thanh Trà đã định hƣớng khoa học, tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Hoàng Phú Hiệp và các thầy, cô Bộ môn Di
truyền và Sinh học hiện đại, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thại Nguyên đã tạo
mọi điều kiện cho tôi trong quá trình tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tại phòng

thí nghiệm.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ Khoa Khoa học sự sống,
trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và
truyền cho tôi niềm đam mê nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã nhiệt
tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.

, khoa Sinh – K

&

–

.

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014
Tác giả

Phan Văn Cƣơng


v
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ------------------------------------------------------------------------------- i
LỜI CẢM ƠN ----------------------------------------------------------------------------------- iv
MỤC LỤC ----------------------------------------------------------------------------------------v
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ------------------------------------------------------------------ viii
DANH MỤC CÁC BẢNG ---------------------------------------------------------------------x

DANH MỤC CÁC HÌNH --------------------------------------------------------------------- xi
1. Đặt vấn đề -------------------------------------------------------------------------------------1
2. Mục tiêu nghiên cứu--------------------------------------------------------------------------2
3. Nội dung nghiên cứu -------------------------------------------------------------------------3
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------4
1.1. CÂY CHÈ (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)-----------------------------------------4
1.1.1. Phân loại, nguồn gốc và phân bố của cây chè ----------------------------------------4
1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới và ở Việt Nam -------------------5
1.1.2.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè trên thế giới -----------------------------------5
1.1.2.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ chè ở Việt Nam ------------------------------------7
1.1.3. Đặc điểm di truyền của cây chè Camellia sinensis (L.) O. Kuntze -------------8
1.2. BỆNH PHỒNG LÁ DO NẤM Exobasidium vexans HẠI CHÈ ---------------------9
1.2.1. Tác nhân gây bệnh, phạm vi phân bố và lịch sử phát triển bệnh ------------------9
1.2.2. Đặc điểm phát sinh và diễn biến của bệnh ------------------------------------------ 10
1.2.3. Thiệt hại do bệnh phồng lá ở cây chè ----------------------------------------------- 12
1.2.4. Một số nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans
ở chè --------------------------------------------------------------------------------------------- 14


vi
1.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA -------------------------------------------------------------- 21
1.3.1. Một số chỉ thị phân tử sử dụng trong phân tích hệ gen và chọn giống---------- 21
1.3.2. Chỉ thị phân tử SSR -------------------------------------------------------------------- 22
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------- 24
2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ---------- 24
2.1.1. Vật liệu ---------------------------------------------------------------------------------- 24
2.1.2. Hóa chất --------------------------------------------------------------------------------- 26
2.1.3. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu------------------------------------------------------ 26
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU------------------------------------------------------ 27
2.2.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu lá chè và tách chiết DNA tổng số ------------------- 27

2.2.2. Tuyển chọn và tổng hợp các cặp mồi SSR cho phân tích chè ------------------- 28
2.2.3. Phản ứng PCR-SSR -------------------------------------------------------------------- 29
2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose ---------------------------------------- 29
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý dữ liệu PCR-SSR bằng phần mền NTSYS -- 29
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN-------------------------------------------------- 30
3.1. NHÂN BẢN CÁC PHÂN ĐOẠN DNA BẰNG PHẢN ỨNG PCR-SSR ------- 30
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá chè ------------------------------------------ 30
3.1.2. Kết quả của phản ứng PCR-SSR ----------------------------------------------------- 30
3.1.2.1. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11D02T ----------------------- 34
3.1.2.2. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-10H08S ----------------------- 35
3.1.2.3. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11H07S ----------------------- 36
3.1.2.4. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-31E06S ----------------------- 36
3.1.2.5. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-18A10T ----------------------- 37
3.1.2.6. Kết quả phản ứng PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S ------------------------ 38


vii
3.1.2.7. Tỷ lệ đa hình của các phân đoạn DNA xuất hiện -------------------------------- 39
3.2. PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC GIỐNG CHÈ KHÁNG
BỆNH PHỒNG LÁ KHÁC NHAU --------------------------------------------------------- 41
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ SSR LIÊN KẾT VỚI TÍNH KHÁNG BỆNH
PHỒNG LÁ Ở CHÈ --------------------------------------------------------------------------- 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ------------------------------------------------------------------ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO -------------------------------------------------------------------- 47


viii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ABC

ATP - binding cassette

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism

AP

Aspartic proteinase

ASM

Acibenzolar-S-methyl benzo-(1,2,3)- thiadiazole-7-carboxylic
acid S-methyl ester

ATP

Adenosin triphosphat

Bp

Base pair

CBL

Calcineurin B-like

CIGR

Chitin-inducible gibberellin-responsive

CITRX

Cf-9-interacting thioredoxin

CS

Cộng sự

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

ĐVT

Đơn vị tính

EDTA

Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid

EST

Expressed Sequence Tag

FAO

Food and Agriculture Organisation

Gbase

Giga Base

HRGP

Hydroxyproline-rich glycoprotein

ISSR

Inter - Simple Sequence Repeat

kb

Kilobase

LPTs

Lipid transfer proteins

LRR

Leucine Rich Repeat

MIP

Major intrinsic protein

NBS

Nucleotit Binding Site

OPR

12-oxo-phytodienoic acid reductase


ix
PLC5

Phospholipase C

PCR

Polymerase Chain Reaction

PIC

Polymorphic Information Content

PIP

Plasma membrane intrinsic protein

PK

Protein Kinaza

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RGA

Resistance Gene Analog

RubisCO

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase

SCAR

Sequence - Characterized Amplified Region

SDS

Sodium Đoecyl Sulphat

SNP

Single nucleotide polymorphism

SRFA

Selective restriction Fragment Amplication

SSR

Simple Sequence Repeats

STK

Serine/threonine kinase

STSs

Sequence Tagged Site

TAE

Tris – Acetate – EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan

TRX

Thioredoxin

UPS

Ubiquitin-proteasome system

XK

Xuất khẩu

XTHs

Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases


x
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1: Xếp hạng xuất khẩu chè thế giới từ năm 2008 đến 2011 ----------------------7
Bảng 2.1: Địa điểm thu mẫu và khả năng kháng bệnh phồng lá của một số giống/dòng
chè sử dụng trong nghiên cứu ---------------------------------------------------------------- 24
Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ------------------------ 28
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR-SSR ------------------------------------------------ 29
Bảng 3.1: Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ---------------------------------- 31
Bảng 3.2: Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR-SRR từ 6 cặp mồi
---------------------------------------------------------------------------------------------------- 31
Bảng 3.3: Tổng số phân đoạn DNA thu đƣợc khi thực hiện phản ứng PCR-SSR ở 30
giống/dòng chè với 6 cặp mồi nghiên cứu ------------------------------------------------- 32

Bảng 3.4: Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 6 cặp mồi SSR ------------------------ 40
Bảng 3.5: Hệ số sai khác di truyền của 30 giống/dòng chè sử dụng trong nghiên cứu
---------------------------------------------------------------------------------------------------- 42


xi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1: Sản xuất chè thế giới trong năm 2010 --------------------------------------------6
Hình 1.2: Các giai đoạn khác nhau của bệnh phồng lá do nấm Exobasidium vexans
trên cùng một lá. ------------------------------------------------------------------------------- 11
Hình 1.3: Các giai đoạn của bệnh phồng lá ------------------------------------------------ 12
Hình 3.1: Hình ảnh điện di DNA tổng số tách từ lá của các giống/dòng chè nghiên
cứu ----------------------------------------------------------------------------------------------- 30
Hình 3.2: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11D02T --------- 34
Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-10H08S---------- 35
Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-11H07S---------- 36
Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-31E06S ---------- 37
Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-18A10T --------- 38
Hình 3.7: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-SSR với chỉ thị TMSE-4C08S ----------- 39
Hình 3.8: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 30 giống/dòng chè có phản
ứng khác nhau với bệnh phồng lá dựa trên chỉ thị SSR ---------------------------------- 43

1
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Cây chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là loại cây
trồng lƣu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm. Tác dụng chữa
bệnh và chất dinh dƣỡng của nƣớc chè đã đƣợc các nhà khoa học khẳng định. Cafein
và một số hợp chất alkaloid khác có trong chè là những chất có khả năng kích thích
hệ thần kinh trung ƣơng, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn, tăng
cƣờng sự hoạt động của các cơ quan trong cơ thể, nâng cao năng lực làm việc [106].
Hỗn hợp tanin chè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đƣờng ruột nhƣ tả,
lỵ, thƣơng hàn. Nhiều thầy thuốc còn dùng nƣớc chè, đặc biệt là chè xanh để chữa
bệnh sỏi thận, sỏi bàng quang và chảy máu dạ dày và hiện nay chƣa tìm ra đƣợc chất
nào lại có tác dụng làm vững chắc các mao mạch tốt nhƣ catechin của chè.
Mgaloblisvili và cs đã xác định ảnh hƣởng tích cực của nƣớc chè xanh tới tình trạng
chức năng của hệ thống tim mạch, trao đổi muối - nƣớc, tình trạng của chức năng hô
hấp ngoại vi, sự trao đổi vitamin C, trạng thái chức năng của hệ thống điều tiết máu…
Chè còn chứa nhiều loại vitamin nhƣ vitamin A, B1, B2, B6, vitamin PP và nhiều
nhất là vitamin C. Các nhà khoa học Nhật Bản đã phát hiện một giá trị đặc biệt của
chè là tác dụng chống phóng xạ. Nghiên cứu này đã chứng minh chè có tác dụng
chống đƣợc chất stronti (Sr) 90 là một đồng vị phóng xạ rất nguy hiểm [106].
Ngoài ra, chè đƣợc dùng làm chất tạo màu thực phẩm vì nó vừa có khả năng
thay thế các chất tạp màu nhân tạo độc hại vừa có giá trị dinh dƣỡng cao. Các sản
phẩm phụ của chè nhƣ dầu hạt chè có thế sử dụng trong công nghiệp hay làm dầu
ăn nhƣ các loại thực phẩm khác.
Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nông
nghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩu cao.
Nƣớc ta có nhiều vùng trồng và chế biến chè nổi tiếng nhƣ Mộc Châu, Thái Nguyên,
Lâm Đồng, cùng với nhiều giống chè quý nhƣ chè Shan ở Hà Giang, Suối Giàng, chè
Tân Cƣơng ở Thái Nguyên…[109].

Luận vận đậy đu ở file:Luận vận Full