Nghiên cứu in silico đặc điểm dược lý và cơ chế độc tính tế bào của một số hợp chất lignan phân lập từ cây cách hoa đông dương (cleistanthus indochinensis)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ MẠNH CẦM

NGHIÊN CỨU IN SILICO ĐẶC ĐIỂM
DƯỢC LÝ VÀ CƠ CHẾ ĐỘC TÍNH
TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
LIGNAN PHÂN LẬP TỪ CÂY
CÁCH HOA ĐÔNG DƯƠNG
(Cleistanthus indochinensis)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ MẠNH CẦM

1301034

NGHIÊN CỨU IN SILICO ĐẶC ĐIỂM
DƯỢC LÝ VÀ CƠ CHẾ ĐỘC TÍNH
TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT
LIGNAN PHÂN LẬP TỪ CÂY
CÁCH HOA ĐÔNG DƯƠNG
(Cleistanthus indochinensis)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. TS. Phạm Thế Hải
2. TS. Đoàn Thị Mai Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2018


Lời cảm ơn
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới Thầy giáo TS. Phạm Thế Hải là người đã tận tình hướng dẫn và giúp
đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Dưới sự hướng dẫn của thầy, em đã có điều
kiện học tập và sáng tỏ rất nhiều điều trong lý thuyết cũng như trong thực hành. Cảm
ơn thầy đã đồng hành cùng em qua bao khó khăn từ những ngày bắt đầu con đường
nghiên cứu, luôn quan tâm, tạo động lực giúp em trưởng thành hơn.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Thị Mai Hương đã tạo điều kiện, giúp đỡ
em nhiệt tình từ những ngày đầu thực hiện đề tài.
Trong quá trình nghiên cứu, em cũng đã nhận được sự quan tâm, giúp sức của
các anh chị, các em trong nhóm nghiên cứu, đặc biệt là sự chỉ bảo của anh Phạm Trọng
Lâm khoa Hóa – Đại học Khoa học Tự nhiên. Em vô cùng cảm kích những sự giúp đỡ
quý báu này.
Thực tế luôn cho thấy, sự thành công nào cũng đều gắn liền với những sự hỗ trợ,
giúp đỡ của những người xung quanh dù cho sự giúp đỡ đó là ít hay nhiều, trực tiếp hay
gián tiếp. Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Bộ môn Hóa dược đã hết sức nhiệt tình,
tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, người thân trong gia đình
đã đồng hành, động viên, giúp đỡ em hoàn thành nhiệm vụ của mình.
Hà Nội, 18 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Đỗ Mạnh Cầm

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................
DANH MỤC CÁC BẢNG...........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ....................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. Tổng quan về cây Cách hoa Đông Dương và các hợp chất khung lignan .......2
1.1.1. Cây Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis)..........................2
1.1.2. Hợp chất mang khung lignan ......................................................................3
1.2. Tổng quan về chu trình độc tế bào Apoptosis ..................................................4
1.2.1. Khái niệm Apoptosis ...................................................................................4
1.2.2. Các con đường Apoptosis ............................................................................5
1.2.3. Chu trình Apoptosis trong bệnh ung thư .....................................................6
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu in silico .............................................6
1.3.1. Tính toán năng lượng electron ....................................................................7
1.3.2. Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý ...................................................9
1.3.2.1. Dự đoán ADMET .................................................................................9
1.3.2.2. Tính toán các thông số hóa lý .............................................................10
1.3.3. Mô phỏng Protein Docking .......................................................................10
1.3.3.1. Tổng quan về phương pháp mô phỏng Protein Docking ....................10
1.3.3.2. Quy trình Docking ..............................................................................11
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .........................................................................................................13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .................................................................................13
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................15


2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................15

2.3.1. Tính toán năng lượng electron ..................................................................15
2.3.2. Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý .................................................15
2.3.3. Mô phỏng Protein Docking .......................................................................15
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................17
3.1. Kết quả thực nghiệm.......................................................................................17
3.1.1. Tính toán năng lượng electron ..................................................................17
3.1.1.1. Xác định vân đạo LUMO - HOMO ....................................................17
3.1.1.2. Giá trị năng lượng chênh lệch LUMO - HOMO ................................18
3.1.2. Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý .................................................19
3.1.3. Mô phỏng Protein Docking .......................................................................23
3.2. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu ............................................................27
3.2.1. Về ưu điểm của phương pháp ...................................................................27
3.2.2. Về hạn chế của phương pháp ....................................................................27
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................29


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Caspase

Cysteine-aspartic protease

Bcl-2

B-cell lymphoma 2

FADD

Fas-associated death domain

PARP-1

Poly [ADP-ribose] polymerase 1

Apaf-1

Apoptotic protease activating factor 1

ICAD

Inhibitor of Caspase Activated DNase

Receptor

Thụ thể

HOMO

Highest occupied molecular orbital (Vân đạo phân tử “liên kết
có mức năng lượng cao nhất”)

LUMO

Lowest unoccupied molecular orbital (Vân đạo phân tử “phản
liên kết có mức năng lượng thấp nhất”)

Egap

Giá trị năng lượng chênh lệch LUMO - HOMO

ADMET

Hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính

LogP

Hệ số phân bố Octanol – nước

LogS

Hệ số tan

TPSA

Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực

Kd

Hằng số liên kết

ΔGL

Năng lượng tự do Gibbs

BBB

Hàng rào máu - não

HIA

Hấp thu qua đường ruột ở người

Pgb

P-glycoprotein

Ser

Serine

Glu

Glutamic Acid

Phe

Pheniline

Gly

Glycine

Lys

Lysine

Asn

Asparagine

His

Histidine

Asp

Aspastic Acid


Tyr

Tyrosine

FDA

Food and Drug Administration (Cơ Quan Quản lý Thực phẩm
và Dược phẩm Hoa Kỳ)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của các chất nghiên cứu ..........3
Bảng 2.1. Mã PDB và cấu trúc 3D của các tinh thể protein .........................................13
Bảng 3.1. Tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu .....................................................19
Bảng 3.2. Đặc tính hấp thu, phân bố, thải trừ của các hợp chất nghiên cứu.................20
Bảng 3.3. Đặc tính chuyển hóa của các hợp chất nghiên cứu với các enzym gan........21
Bảng 3.4. Kết quả khả năng tương tác của các chất với các đích protein.....................23


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Quả của cây Cách hoa Đông Dương (C.indochinensis) .................................2

Hình 1.2. Các hợp chất mới từ quả cây Cách hoa Đông Dương ....................................3
Hình 1.3. Chu trình Apoptosis tế bào ..............................................................................6
Hình 1.4. Các thuyết xấp xỉ trong tính toán lượng tử .....................................................8
Hình 1.5. Qui trình tính toán bằng công cụ admetSAR ................................................10
Hình 3.1. Vân đạo HOMO của các chất nghiên cứu ....................................................17
Hình 3.2. Vân đạo LUMO của các chất nghiên cứu .....................................................17
Hình 3.3. Mối tương quan giá trị năng lượng chênh lệch – Hoạt tính..........................18
Hình 3.4. Tương tác của hợp chất số 1 (a) với protein CD95L (b) với TRAIL-R2 .....24
Hình 3.5. Giá trị điểm tương tác của các chất nghiên cứu với các receptor .................25
Hình 3.6. Ví trị các chất trong hốc liên kết của PARP-1 và tương tác của chúng .......26


ĐẶT VẤN ĐỀ
Gần đây, dự án sàng lọc cây thuốc của Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam kết hợp với Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Gif-sur
Yvette của Pháp đã phát hiện khả năng gây độc lên tế bào ung thư mạnh của
Cleistantoxin và một số lignan aryltetralin chiết tách từ cây Cách hoa Đông Dương
(Cleistanthus indochinensis) [35]. Tuy nhiên, cơ chế gây độc một cách chính xác của
các chất chưa được xác định một cách rõ ràng.
Hiện nay, các phương pháp tính toán bằng máy tính (in silico) được áp dụng rộng
rãi trong nghiên cứu phát triển thuốc. Các phương pháp này bao gồm xây dựng mô hình
tương quan cấu trúc - tác dụng, tính toán năng lượng electron để xác định tương quan
năng lượng electron và hoạt tính, phương pháp Protein Docking giúp sàng lọc hoạt tính
và dự đoán tương tác của hợp chất hóa học với các đích phân tử. Lợi thế của phương
pháp in silico là giảm thiểu thời gian nghiên cứu và tiết kiệm ngân sách mà các phương
pháp thực nghiệm yêu cầu. Hơn nữa, với sự phát triển của khoa học máy tính, phương
pháp này càng ngày càng nhanh và chính xác hơn, giúp hỗ trợ hiệu quả cho quá trình
nghiên cứu và phát triển thuốc. Từ các phân tích nêu trên, chúng tôi tiến hành khóa luận
“Nghiên cứu in silico đặc điểm dược lý và cơ chế độc tính tế bào của một số hợp chất
lignan phân lập từ cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis)” với ba mục

tiêu chính:
1. Đánh giá mối tương quan giữa năng lượng chênh lệch LUMO - HOMO và
hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất lignan phân lập từ cây Cách hoa Đông
Dương (Cleistanthus indochinensis).
2. Phân tích đặc điểm dược động học và độc tính của các hợp chất nghiên cứu sử
dụng công cụ dự đoán in silico.
3. Dự đoán con đường gây chết tế bào ung thư thông qua mô phỏng Protein
Docking.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Cách hoa Đông Dương và các hợp chất khung lignan
1.1.1. Cây Cách hoa Đông Dương (Cleistanthus indochinensis)
Cây Cách hoa Đông Dương có tên khoa học Cleistanthus indochinensis là loại
cây bụi thuộc thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại kích, được mô
tả lần đầu tiên bởi Drew Merrill và Léon Camille Marius Croizat năm 1942 [8]. Loài
cây này ban đầu được tìm thấy ở Vụ Bản, Hòa Bình vào năm 1938 [8] nhưng sau đó
chưa có nhiều nghiên cứu về loài cây này.

Hình 1.1. Quả của cây Cách hoa Đông Dương (C.indochinensis) Hình 1
Tới đầu thế kỉ 21, Viện Hóa sinh biển thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam kết hợp với Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Gif-sur Yvette của Pháp tiến
hành dự án nghiên cứu hóa thực vật của hệ thực vật Việt Nam. Các nhà khoa học lấy
mẫu cây tại huyện Quỳ Châu, tỉnh Nghệ An vào tháng 5 năm 2003 [1]. Kết quả nghiên
cứu cho thấy dịch chiết quả cây Cách hoa Đông Dương có khả năng ức chế tế bào ung
thư biểu mô KB đến 94% ở nồng độ 1µg/ml [1]. Từ dịch chiết quả cây, các nhà khoa
2

học tách ra được được 9 hoạt chất mới mang khung lignan có hoạt tính gây độc tế bào
trên các dòng tế bào ung thư biểu mô KB.

Hình 1.2. Các hợp chất mới từ quả cây Cách hoa Đông Dương Hình 2
Dưới đây là bảng kết quả thử hoạt tính trên dòng tế bào biểu mô KB đã có của 9
hợp chất mới chiết từ quả cây Cách hoa Đông Dương.
Bảng 1.1. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của các chất nghiên cứu bảng 1
Hợp chất

% Ức chế

Hợp chất

10µg/ml

1µg/ml

1

97

97

2

96

3

% Ức chế
10µg/ml

1µg/ml

6

9

5

22

7

14

11

96

38

8

3

10

4

0

9

9

95

19

5

8

13

1.1.2. Hợp chất mang khung lignan
Các lignin thuộc nhóm chất polyphenol và là các phenylpropanoid dimer được
tìm thấy trong thực vật. Lignan là một trong những nhóm chính của phytoestrogen, đó
3


là những hợp chất cấu trúc giống với estrogen, có hoạt động của chất chống oxy hóa.
Các hợp chất khung lignan có nhiều trong hạt lanh, hạt vừng, ngũ cốc (lúa mì, lúa mạch
đen, đậu nành). Các thực phẩm này rất phổ biến trong thực đơn hằng ngày của con
người. Với những tác dụng được ghi nhận, hợp chất khung lignan đang được nghiên cứu
thành thuốc chống viêm, chống oxy hóa cho con người [20].
Ngoài ra, các hợp chất khung lignan còn được ghi nhận có khả năng kích hoạt
chu trình apoptosis của tế bào ung thư ở người [15][31]. Do vậy, các nghiên cứu đã mở

rộng sang tìm kiếm các hoạt chất khung lignan có tác dụng tiêu diệt tế bào ung thư, mà
đích tác dụng ở đây là trên chu trình apoptosis. Đích tác dụng này mở ra một hướng đi
đầy tiềm năng trong việc nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư.
1.2. Tổng quan về chu trình độc tế bào Apoptosis
1.2.1. Khái niệm Apoptosis
Thuật ngữ apoptosis hay còn được gọi là sự chết rụng tế bào lần đầu tiên xuất
hiện trong bài báo của Kerr, Wyllie, và Currie năm 1972 [9][18][40], được định nghĩa
là sự chết đã được lập trình sẵn của tế bào khi chúng bị tổn thương hoặc đã già, xảy ra
trong các sinh vật đa bào. Apoptosis xảy ra bình thường trong quá trình phát triển và lão
hóa như là một cơ chế duy trì quần thể tế bào trong các mô. Đồng thời, apoptosis xảy ra
như là một cơ chế bảo vệ của cơ thể khi tế bào bị tổn thương do bệnh tật hoặc các tác
nhân độc hại.
Nghiên cứu trong nhiều thập kỉ cho thấy có hàng trăm gen điều hòa quá trình này
từ giai đoạn khởi phát, hoạt động cho đến sự điều chỉnh chu trình [7].
Các con đường của chu trình apoptosis đều phục vụ mục đích cuối cùng là kích
hoạt các enzym phân cắt tế bào Caspase-3 và Caspase-7 (và có thể là Caspase-6) [32].
Một khi các enzym này được hoạt hóa, chúng sẽ phân cắt protein và tế bào bị phân rã
một cách nhanh chóng.
Tế bào khi được khởi động chương trình apoptosis bắt đầu có những thay đổi về
hình thái: khung tế bào bị phân giải do caspase khiến tế bào bị co rút lại [18], tế bào chất
trở nên đậm đặc, các bào quan bị ép chặt lại. Ribosom bị phân tách, các túi lysosom bị
vỡ khiến cho enzym phân hủy protein được giải phóng đẩy nhanh quá trình phân rã tế

4


bào. Tế bào tan vỡ thành những túi tiết mang tên là tiểu thể chết rụng, các tiểu thể này
sẽ bị các đại thực bào tiêu thụ [9][19][12][39].
1.2.2. Các con đường Apoptosis
Chương trình apoptosis gồm ba con đường chính: con đường nội bào, con đường

ngoại bào [9][11] và con đường qua kênh Perforin/granzym B [32][9].
Con đường ngoại bào
Con đường này được kích hoạt khi các phối tử gắn vào các receptor gây chết trên
màng tế bào (CD95L hoặc các receptor TRAIL-R2). Khi được các phối tử gắn vào, các
receptor gây chết kết tụ lại, có thể hình thành phức hợp tồn tại trime [27].
Phức hợp này thu hút các phân tử protein kết nối tới như FADD, hình thành phức
hợp lớn hơn, hoạt hóa enzym caspase-8 [20] (Một số trường hợp là caspase-10) [17].
Sau đó, chuỗi phản ứng hàng loạt được kích hoạt như Hình 1.3 thông qua sự truyền tín
hiệu qua các protein họ Bcl-2. Cuối cùng, các enzym phân cắt được kích hoạt dẫn tới
quá trình chết rụng tế bào chính thức bắt đầu.
Con đường nội bào
Các tín hiệu dẫn tới quá trình apoptosis nội bào liên quan đến một loạt các kích
thích trung gian không qua receptor màng tế bào, tạo ra các tín hiệu nội bào, trực tiếp
hoạt hóa các yếu tố bên trong và các hoạt động do ty thể phát động. Khi tế bào chịu
những kích thích bất lợi như nito monooxid [4], tia xạ, tình trạng thiếu oxy, nhiễm virus,
các chất độc [26], gốc tự do, sự tăng nồng độ canxi nội bào một cách bất thường [23],...
ty thể sẽ được hoạt hóa, màng ty thể thay đổi tính thấm thông qua một loạt chuỗi các
chất mà khởi đầu từ protein PARP-1. Ty thể giải phóng các chất có vai trò quan trọng
trong chu trình apoptosis như cytocrom c. Cytocrom c liên kết và kích hoạt Apaf-1 và
procaspase-9 tạo thành phức hợp Apoptosom [5], có khả năng hoạt hóa mạnh các enzym
phân cắt protein cuối cùng trong chu trình.
Con đường qua granzym B
Sự kích hoạt chu trình apoptosis thông qua granzym B thường xảy ra với các tế
bào T độc (cytotoxic T lymphocyte) [34] trong việc tiêu diệt tế bào khối u và tế bào
nhiễm virus. Các tế bào lympho T độc tiết ra granzym B, đi qua kênh protein perforin
vào tế bào và kích hoạt chu trình apoptosis. Granzym B sẽ tách protein ở dư lượng
aspartate và do đó sẽ kích hoạt procaspase-10. Granzym B còn có thể phân tách yếu tố
ức chế enzym caspase-3 như ICAD [30] hay có thể nói granzym B có thể kích hoạt trực
5

tiếp Caspase-3. Các báo cáo cũng cho thấy granzym B khuếch đại tín hiệu tử vong của
tế bào bằng việc phân tách BID (một enzym trong họ Bcl-2) và cảm ứng enzym
cytochrome c [3][28]. Con đường hoạt hóa qua Granzym B chỉ đặc trưng đối với tế bào
T độc.
1.2.3. Chu trình Apoptosis trong bệnh ung thư
Như đã nói, apoptosis xảy ra nhằm mục đích tiêu hủy các tế bào không mong
muốn [18], các tế bào xảy ra đột biến, tế bào bị tổn thương do bệnh tật hoặc các tác nhân
độc hại [24], là quá trình điều hòa sinh lý tự nhiên của cơ thể. Sự rối loạn của chu trình
này gây ra một số bệnh lý của con người bao gồm ung thư, bệnh tự miễn và rối loạn
thoái hóa thần kinh [13][14][37][41]. Hiện tượng xảy ra là sự gián đoạn cân bằng giữa
số lượng tế bào sinh ra và tế bào chết đi trong cơ thể. Thực tế, sự trốn tránh chương trình
chết rụng của tế bào là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các khối u ác tính.

Hình 1.3. Chu trình Apoptosis tế bàoHình 3
Hơn nữa, ung thư mà có sự thay đổi protein liên quan tới chu trình apoptosis
thường có khả năng kháng thuốc hóa trị liệu. Với trường hợp này, các thuốc thiết kế
khôi phục lại lập trình apoptosis hiệu quả hơn trong việc chống lại bệnh ung thư [10].
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu in silico
Thuật ngữ in silico bắt nguồn từ tiếng Latin, được sử dụng từ năm 1989 nghĩa là
thực hiện các thí nghiệm trên máy tính bằng công nghệ mô phỏng. Ban đầu, phương

6


pháp này chủ yếu được sử dụng trong các mô hình sinh học với mục đích giải thích và
dự đoán động học giải phẫu. Một số lĩnh vực đầu tiên sử dụng mô hình in silico bao gồm
hóa sinh, di truyền học và sinh lý học.
Các nhà khoa học sớm nhận ra ưu điểm vượt trội của phương pháp này và mở
rộng ứng dụng của nó, cho phép dự đoán khả năng phát triển một hợp chất cho mục đích

y học cũng như tác dụng phụ của chúng trên con người [29].
Mô hình in silico còn được coi là công cụ thay thế nhân đạo đối với các thử
nghiệm thực nghiệm trên động vật, đồng thời cũng tiết kiệm tương đối so với ngân sách
mà thử nghiệm trên động vật tiêu tốn. Hơn nữa, sử dụng mô hình in silico còn tiết kiệm
được rất nhiều thời gian mà các thử nghiệm lâm sàng yêu cầu [22].
Năm 2007, các nhà nghiên cứu đã thành công thiết lập mô hình in silico trong
bệnh lao để hỗ trợ trong phát hiện các thuốc điều trị, cho phép các thí nghiệm chỉ mất
vài phút thay vì thực nghiệm tiêu tốn thời gian vài tháng [36].
Công nghệ mô hình hóa trên máy tính còn được áp dụng rộng rãi trong phân
tích protein, mô phỏng khả năng tương tác của thuốc, dự đoán kết quả các thử nghiệm
trên tế bào ung thư,…
1.3.1. Tính toán năng lượng electron
Ngay từ khi cơ học lượng tử mới ra đời, ý tưởng mô tả tính chất của hệ electron
bằng hàm mật độ đã được nêu lên trong các công trình của Llewellyn Hilleth Thomas
và Enrico Fermi. Hai nhà khoa học khẳng định rằng năng lượng electron ở trạng thái cơ
bản là một phiếm hàm của mật độ electron, do đó có thể mô tả hầu hết các tính chất của
hệ electron qua hàm mật độ.
Năng lượng electron được tính toán nhằm mô tả khả năng hoạt động cũng như
khả năng tương tác của phân tử này với phân tử khác. Tính chất của hệ electron được
mô tả bởi lý thuyết phiếm hàm mật độ DFT trong khuôn khổ của lý thuyết lượng tử. Hệ
N electron được biểu diễn qua hàm mật độ electron của toàn bộ hệ thay vì hàm sóng.
Từ khi ra đời đến nay, lý thuyết DFT đã được sử dụng rộng rãi trong các ngành
khoa học nhằm tính mô tả cũng như toán năng lượng của hệ electron phân tử. Phương
trình Thomas-Fermi mô tả năng lượng hệ electron theo thuyết phiếm hàm mật độ DFT
được biểu diễn như sau:

7


Để giải được hoàn toàn phương trình này, các máy tính giải thuật đòi hỏi phải có

công năng lớn và thời gian tính toán khổng lồ đối với các hệ phức tạp. Do vậy, các phép
xấp xỉ đơn giản bán thực nghiệm đã ra đời.

Hình 1.4. Các thuyết xấp xỉ trong tính toán lượng tửHình 4
Việc lựa chọn phương pháp xấp xỉ cần cân nhắc đến công năng của máy tính
được sử dụng và độ chính xác cần thiết đối với bài toán đặt ra.
Obital LUMO - HOMO
- LUMO viết tắt của vân đạo phân tử “phản liên kết có mức năng lượng thấp
nhất” đặc trưng cho vùng hút điện tử mạnh trong phân tử. Các vùng điện tử này có ý
nghĩa là vùng tương tác mạnh của phân tử.
- HOMO viết tắt của vân đạo phân tử “liên kết có mức năng lượng cao nhất” đặc
trưng cho vùng mang nhiều điện tử của phân tử. Năng lượng HOMO càng nhỏ thì vùng
điện tử càng dày, khả năng cho electron càng lớn.
Hai vùng vân đạo này có khả năng tương tác cực kì mạnh với chất khác. Việc tìm
ra hai vùng này có ý nghĩa dự đoán vùng có khả năng liên kết của phân tử.
Năng lượng chênh lệch LUMO - HOMO
Năng lượng chênh lệch LUMO - HOMO kí hiệu là

Egap, đo lường độ bền

vững của phân tử. Năng lượng chênh lệch các lớn thì khả năng tương tác càng thấp. Do
vậy, có giả thuyết rằng giá trị năng lượng này tương quan với hoạt tính của các chất.
8


1.3.2. Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý
1.3.2.1. Dự đoán ADMET
Các thông số hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính có vai trò quan
trọng trong việc đánh giá một chất có phù hợp hay không để làm thuốc phù hợp với cơ
thể người. Việc khám phá ra một thuốc mới đòi hỏi hao tổn rất nhiều thời gian và tiền

bạc bao gồm các bước: lựa chọn đích tác dụng, nhận dạng mục tiêu, phát hiện chất có
tiềm năng, thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng.
Trước đây, chỉ có một vài thuốc được cho phép vào thị trường trong số hàng trăm
ngàn các ứng cử viên. Hai nguyên nhân chính cho sự thất bại này là do hiệu quả tác
dụng của các hợp chất kém và độc tính của chúng quá cao. Khảo sát cho thấy có tới 50%
các chất có tiềm năng bị loại bỏ do thất bại trong việc thử nghiệm lâm sàng hoặc bị loại
khỏi thị trường do tác dụng phụ không thể chấp nhận được. Ngày nay, khi việc đánh giá
thông số ADMET được chú ý hơn, chỉ còn 8% các thuốc thất bại do không đáp ứng
được các thuộc tính ADMET, một con số nhỏ hơn nhiều so với trước đây [6].
Việc chắt lọc và tối ưu hóa các thông số ADMET trong giai đoạn đầu thử nghiệm
thuốc được nghiên cứu kĩ lưỡng. Tuy nhiên, với hàng triệu các hợp chất tiềm năng, việc
đánh giá thuộc tính dược động học của tất cả các hợp chất tiêu tốn một số tiền khổng lồ.
Do đó, kết hợp với các nghiên cứu thử nghiệm in vitro, kỹ thuật tính toán thuộc
tính ADMET bằng các sever ảo được coi là phương pháp thay thế tối ưu.
Hiện nay có rất nhiều công cụ dự đoán ADMET được xây dựng bởi các tổ chức
lớn trên thế giới như các Web sever: PreADMET ADMET Prediction, PreADMET
Toxicity Prediction, SwissADME, admetSAR,…, các phần mềm như chemTree,
Volsurf, ADMET, MDL®Metabolite Database,…
Trong đó, admetSAR là một trong các công cụ phổ biến nhất được công bố bởi
Feixiong Chen và các cộng sự năm 2012. Bộ công cụ này tích hợp hơn 210000 dữ liệu
liên quan đến hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ, độc tính (ADMET) của hơn 96000
hợp chất. Có 45 mô hình liên quan giữa cấu trúc và các thông số ADMET như tính thấm
qua hàng rào máu não, tính thấm qua màng ruột, khả năng tương tác với một số enzym
gan như CYP450 2C9, CYP 3A4, độc tính trên chuột [ 6]...
Bộ công cụ này được thiết kế một cách đơn giản, thân thiện và dễ sử dụng, tích
hợp trên trang web online Việc tính toán thông
qua cấu dạng SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification) - là dạng
9

cấu trúc phân tử số hóa dưới dạng ký tự ASCII. SMILES được sử dụng khá rộng rãi
trong danh pháp hóa học và định dạng cấu trúc dữ liệu trên máy tính. Qui trình tính toán
thông số ADMET sử dụng bộ công cụ admetSAR được biểu diễn như hình dưới:

Hình 1.5. Qui trình tính toán bằng công cụ admetSARHình 5
1.3.2.2. Tính toán các thông số hóa lý
Với sự phát triển vượt bậc của công nghệ, các nguồn dữ liệu công khai lớn như
PubChem và ChEMBL đã ra đời. Nhằm mục đích phân tích sàng lọc dữ liệu khổng lồ
này, các nhà khoa học đòi hỏi các công cụ phần mềm kết hợp liền mạch thuật toán hóa
tin học như dự đoán thuộc tính lý hóa, phân tích dữ liệu đa biến, và hiển thị tương tác.
Trong số các công cụ hóa tin học, công cụ tính toán các thông số hóa lý tỏ ra cực
kì hiệu quả, cho phép xác định được các chỉ số quan trọng của phân tử để cân nhắc một
chất có phù hợp để phát triển thành thuốc hay không. Các thông số này giúp hỗ trợ
nghiên cứu phát triển thuốc song song với tính toán thông số ADMET của phân tử.
Phần mềm Datawarrior được phát triển trong hơn 20 năm bởi tiến sĩ Thomas
Sander và các cộng sự với mục đích hỗ trợ các nhà hóa học tổng hợp bằng các công cụ
hóa tin tiên tiến để giảm bớt gánh nặng trong công việc phân tích tính toán. Công cụ tích
hợp các chức năng như hiển thị tương tác hóa học, dự đoán tính chất phân tử từ cấu trúc
hóa học như các thông số logP (hệ số phân bố Octanol – nước), logS (hệ số tan), TPSA
(Topological polar surface area – Diện tích bề mặt phân cực) [33],…
1.2.3. Mô phỏng Protein Docking
1.2.3.1. Tổng quan về phương pháp mô phỏng Protein Docking
Phương pháp Protein docking ra đời từ những năm 1980, được sử dụng phổ biến
trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc với khả năng dự đoán sự hình thành liên
kết của cấu tử với receptor trong túi liên kết với độ chính xác khá cao. Không những chỉ
ra được các liên kết có ý nghĩa, docking còn có thể định lượng khả năng tương tác thông
10


qua các hàm tính điểm, qua đó phân hạng các liên kết mạnh yếu của các cấu tử [16].

Nhờ ưu điểm thực hiện trên máy tính với tốc độ càng ngày càng nhanh và chính xác,
Protein docking dần được coi là bước khởi đầu cho nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại.
Docking thực chất là một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của
một cơ chất gắn kết lên protein. Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking
là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất, tương đương với cấu
hình bền nhất sau khi tạo thành liên kết giữa phối tử và protein. Để tìm cấu hình phù
hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết
của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm [16].
Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để lượng giá
khả năng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor. Năng lượng này được cho bởi hằng số
liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL). Dự đoán về năng lượng liên kết được
thực hiện bằng cách đánh giá những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác
liên phân tử, các ảnh hưởng solvat và entropy [16]. Do đó, số lượng các tham số hoá lý
được đánh giá càng lớn thì độ chính xác càng cao. Tuy nhiên, nếu số lượng biến càng
lớn thì thời gian tính toán sẽ lâu. Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng
giữa độ chính xác và tốc độ.
1.2.3.2. Quy trình Docking
Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị
protein, mô phỏng docking.
Chuẩn bị cấu tử
Các cấu trúc được vẽ trên phần mềm ChemDraw. Sau khi xây dựng được cấu
trúc 3D, sử dụng phần mềm MOE để xử lí cấu tử theo các bước: chỉnh sửa điện tích cho
phù hợp, tối giản hóa năng lượng, gắn trường lực cho phân tử.
Chuẩn bị protein
Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng dữ liệu protein (protein
data bank). Trong trường hợp chưa có sẵn, chúng ta có thể xây dựng cấu trúc 3D theo
phương pháp mô hình hóa tương đồng (Homology modeling) [38]. Lý thuyết cơ bản của
phương pháp mô hình hóa tương đồng là sắp xếp chuỗi amino acid của protein thu được
bởi quá trình giải mã gen lên khung cấu trúc bậc 3 của protein có độ phân giải cao nhưng
thiếu thông tin của toàn bộ amino acid.

11


Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để chuẩn bị protein cho chương
trình mô phỏng docking. Các bước chuẩn bị thường gồm: loại nước và các cấu tử (nếu
có), thêm hydro, gắn trường lực, phân tích vùng có khả năng tương tác.
Mô phỏng docking
Trước khi tiến hành mô phỏng, cần sử dụng phần mềm để tìm kiếm túi tương tác
trên protein để đánh giá khả năng liên kết của phối tử tại vị trí đó. Vị trí của vùng tìm
kiếm thông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Khi quá trình docking
được tiến hành, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm cấu dạng phù hợp nhất của phối tử,
tương ứng với năng lượng của toàn hệ thấp nhất. Cấu dạng này cùng với các tương tác
sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như: MOE, Discovery studio.

12


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
Nguyên liệu
Dữ liệu gồm cấu trúc của 9 hợp chất mới được phát hiện, tách chiết từ quả của
cây Cách hoa Đông Dương (Hình 1.2) có nguồn gốc từ Việt Nam và các thông tin như
nguồn gốc dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu [1].
Cấu trúc tinh thể tia X của 12 protein gồm có CD95L, TRIAL-R2, PARP-1, p53,
BAX, BIM, BID, BAK, HRK, BIK, PUMA, NOXA được tải từ ngân hàng dữ liệu
protein (Protein Data Bank). Các cấu trúc chỉ được giữ lại chuỗi A để tiến hành mô
phỏng.
Dữ liệu chuỗi FASTA (chuỗi trình tự amino acid) lấy trên cơ sở dữ liệu Pubmed.

Bảng 2.1. Mã PDB và cấu trúc 3D của các tinh thể protein bảng 2
STT

Protein

Mã PDB

1

CD95L

5I19

2

TRAIL-R2

3X3F

3

PARP-1

4ZZZ

4

p53

4QO1

Cấu trúc 3D

13


5

BAX

4S0O

6

BIM

4B4S

7

BID

2BID

8

BAK

2IMT

9

HRK

2L5B

10

BIK

2IPE

11

PUMA

5UUL

12

NOXA

3MQP

14


Thiết bị
Sử dụng các phần mềm trên máy tính ASUS X550C – Hệ điều hành Windows 10.
Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:

1. ChemBioOffice 2015

5. Gaussian 09

2. MOE 2009

6. OSIRIS Data warrior 4.7.2

3. UCSF Chimera 1.10.2

7. Công cụ online Swiss modeling

4. Gaussview 5

8. Công cụ online admetSAR

2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Tính toán năng lượng electron của các hợp chất khảo sát bằng phương pháp
phiến hàm mật độ.
2. Khảo sát khả năng tương tác của các phân tử trên các receptor đích bằng
Protein Docking, đưa ra dự đoán cơ chế tác dụng của các chất nghiên cứu.
3. Mô phỏng tính toán các thông số dược động học và đánh giá khả năng sử dụng
làm thuốc của các chất nghiên cứu.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tính toán năng lượng electron
Các phân tử được vẽ và chuyển sang cấu hình 3D bằng bộ phần mềm Chemoffice.
Sử dụng phần mềm GaussView và Gaussian để tính toán các thông số năng lượng
LUMO - HOMO. Thiết lập tính toán theo thuyết phiếm hàm ở mức độ B3LYP/6-31G
(d). Các chỉ số năng lượng LUMO - HOMO được trích xuất ra. Giá trị năng lượng chênh
lệch

Egap được tính theo công thức:
Egap = ELUMO – EHOMO

2.3.2. Dự đoán ADMET và các thông số hóa lý
Các thông số ADMET được dự đoán trên sever admetSAR [6]. Dữ liệu cấu trúc
3D được nạp vào phần mềm OSIRIS DataWarrior để tính toán các thông số hóa lý của
các phân tử.
2.3.3. Mô phỏng Protein Docking
Chuẩn bị phối tử
Sử dụng bộ phần mềm Chemoffice để vẽ và chuyển các hợp chất sang dạng cấu
trúc 3D. Sau đó đưa vào phần mềm MOE tối ưu hóa năng lượng, thay đổi điện tích nếu
cần thiết và thiết lập điện tích nguyên tử.
15


Chuẩn bị protein
Cấu trúc tinh thể của các protein được tải xuống từ ngân hàng dữ liệu protein
(Protein Data Bank). Sau đó, sử dụng phần mềm Chimera loại nước, các cấu tử ra khỏi
cấu trúc của protein.
Các cấu trúc protein sau khi được xử lí bằng phần mềm Chimera được đưa vào
phần mềm MOE. Quá trình xác định trạng thái proton được tiến hành, tiếp theo là xác
định túi liên kết của protein. Cuối cùng, tất cả protein được thêm trường lực phù hợp để
thêm điện tích cho các nguyên tử.
Mô phỏng docking
Dữ liệu các cấu trúc được tích hợp lại và tiến hành docking hàng loạt trên các
đích đã được chuẩn bị. Số lượng kết quả docking cho mỗi chất được thiết đặt là 30.
Thang điểm đánh giá kết quả theo phương trình Affinity dG.
Đánh giá kết quả
Kết quả docking đánh giá dựa trên 2 tiêu chí: điểm đánh giá tương tác của hợp

chất và các tương tác của hợp chất với receptor.
-

Điểm đánh giá tương tác: Điểm số đánh giá theo thuyết Affinity dG.

Phương trình là tập hợp giá trị các tham số đi kèm với hệ số theo một lý thuyết áp đặt
nhất định. Mỗi loại tương tác, ví dụ như tương tác liên kết hydro, tương tác kị nước,…
đều được gán cho 1 miền giá trị. Kết quả cuối phản ánh khả năng tương tác mạnh hay
yếu của phối tử với receptor.
-

Khả năng tương tác: sử dụng phần mềm MOE để phân tích các tương tác giữa

các phối tử với receptor. Các phối tử chỉ có liên kết lỏng lẻo hoặc không có liên kết được
bỏ qua. Mặt khác khả năng tương tác còn được đánh giá thông qua thông số năng lượng
liên kết, năng lượng liên kết càng thấp, khả năng tương tác giữa cấu tử và protein càng
mạnh.

16