Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa chất độc tế bào trên chuột cống trắng và áp dụng đánh giá tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ (carica papaya l )
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.12 MB, 67 trang )
s TẾ
BỘ Y
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐINH THỊ CHI
TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY GIẢM
TIỂU CẦU BẰNG HÓA CHẤT ĐỘC TẾ
BÀO TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG VÀ
ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA
CAO TOÀN PHẦN LÁ ĐU ĐỦ
(CARICA PAPAYA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2018
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐINH THỊ CHI
MÃ SINH VIÊN: 1301037
TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY GIẢM
TIỂU CẦU BẰNG HÓA CHẤT ĐỘC TẾ
BÀO TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG VÀ
ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA
CAO TOÀN PHẦN LÁ ĐU ĐỦ
(CARICA PAPAYA L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS. TS. Nguyễn Thùy Dương
2. ThS. Phạm Đức Vịnh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới
PGS.TS. Nguyễn Thùy Dương, ThS. Phạm Đức Vịnh và DS. Nguyễn Tùng Sơn
những người thầy đã luôn tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Đinh Đại Độ và DS. Đinh Thị Kiều Giang là
những anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực đã trực tiếp tham gia và giúp đỡ em
trong thời gian nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các bộ môn,
phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong thời
gian học tập và nghiên cứu.
Trong quá trình thực hiện đề tài, em còn nhận được sự giúp đỡ, ý kiến đóng góp
từ các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực. Em xin chân thành cảm ơn
sự giúp đỡ quý báu đó.
Em xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đã và đang nghiên cứu khoa học tại Bộ môn
Dược lực đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề
tài.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng
hộ, chia sẻ khó khăn và động viên em thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Đinh Thị Chi
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Giảm tiểu cầu ......................................................................................................3
1.2. Các mô hình gây giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm ..............................9
1.3. Đu đủ .................................................................................................................16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................21
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ...............................................................21
2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................23
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................24
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .............................................................................................29
3.1. Kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA trên chuột cống
trắng..........................................................................................................................29
3.2. Kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan trên chuột
cống trắng ................................................................................................................34
3.3. Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá đu đủ trên mô
hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA .........................................................................39
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ...........................................................................................44
4.1. Về kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA trên chuột
cống trắng ................................................................................................................44
4.2. Về kết quả triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan trên chuột
cống trắng ................................................................................................................46
4.3. Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá đu đủ .......................................48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2C9.G2
Kháng thể không liên hợp hoặc liên hợp với isothiocynate chống lại
GPIIIa (The unconjugated or fluorescein isothiocynate (FITC)conjugated antibody against GPIIIa)
ADP
Adenosine triphosphat
ALT
Alanin transaminase
AST
Aspart transaminase
CPA
Cyclophosphamid
DIC
Hội chứng đông máu nội mạch rải rác
HIT
Giảm tiểu cầu do heparin
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IC50
Nồng độ ức chế 50%
IL
Interleukin
ITP
Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (immune thrombocytopenia)
IVIg
Globulin miễn dịch đường tĩnh tĩnh mạch (intravenous
immunoglobulin)
EDTA
Ethylendiamin tetraacetic acid
MWReg30
The monoclonal antibody specific for glycoprotein (GP)IIb
PBS
Muối đệm phosphat (phosphate-buffered saline)
PDI
Protein disulfid isomerase
PF4
Yếu tố 4 tiểu cầu
RAMPS
Huyết thanh thỏ kháng tiểu cầu chuột (Rabbit anti-mouse platelet
serum)
TLC
Sắc ký lớp mỏng
TNF
Yếu tố hoại tử khối u (tumor necrosis factor)
TPO
Thrombopoietin
TTP
Ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Đánh giá bệnh nhân giảm tiểu cầu [35] ...........................................................3
Hình 2.1. Quy trình chiết xuất cao lá đu đủ...................................................................21
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu ..............................................................................23
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA 25
Hình 2.4. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng
busulfan .........................................................................................................................26
Hình 2.5. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao lá đu
đủ trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA ................................................................27
Hình 3.1. Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến tỷ lệ chuột chết ........29
Hình 3.2. Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến mức độ tăng khối
lượng chuột theo thời gian .............................................................................................30
Hình 3.3. Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến số lượng tiểu cầu tại
các thời điểm khác nhau ................................................................................................31
Hình 3.4. Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến số lượng bạch cầu tại
các thời điểm khác nhau ................................................................................................32
Hình 3.5. Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến số lượng hồng cầu tại
các thời điểm khác nhau ................................................................................................33
Hình 3.6. Ảnh hưởng của CPA với các mức liều khác nhau đến thể tích trung bình tiểu
cầu tại các thời điểm khác nhau.....................................................................................34
Hình 3.7. Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến tỷ lệ chuột chết tích lũy theo thời
gian ................................................................................................................................35
Hình 3.8. Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến mức độ tăng khối lượng chuột
theo thời gian .................................................................................................................36
Hình 3.9. Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến số lượng tiểu cầu.......................37
Hình 3.10. Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến số lượng bạch cầu ...................38
Hình 3.11. Ảnh hưởng của 2 chế độ liều busulfan đến số lượng hồng cầu...................39
Hình 3.12. Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến số lượng tiểu cầu ....................................40
Hình 3.13. Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến số lượng bạch cầu ...................................41
Hình 3.14. Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến số lượng hồng cầu ..................................42
Hình 3.15. Ảnh hưởng của cao lá đu đủ đến thời gian đông máu và thời gian chảy máu
chuột ..............................................................................................................................43
ĐẶT VẤN ĐỀ
Giảm tiểu cầu là một rối loạn thường gặp, đặc trưng bởi số lượng tiểu cầu giảm
dưới ngưỡng 150 000 tế bào/mm3 máu. Rối loạn này có thể là tiên phát (xuất huyết
giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc thứ phát do các nguyên nhân khác nhau (như nhiễm
virus, sử dụng hóa trị liệu, mang thai, …) với mức độ thay đổi từ nhẹ, không triệu
chứng đến xuất huyết đe dọa tính mạng [35], [54]. Trong một khoảng thời gian dài,
điều trị giảm tiểu cầu chủ yếu dựa trên việc loại bỏ nguyên nhân gây bệnh và điều trị
hỗ trợ thông qua truyền máu hoặc truyền tiểu cầu khi có chỉ định. Gần đây, sự ra đời
và phát triển các thuốc kích thích tiểu cầu thế hệ thứ hai đã mở ra một hướng điều trị
đầy hứa hẹn trên các bệnh nhân mắc chứng giảm tiểu cầu nghiêm trọng như xuất huyết
giảm tiểu cầu miễn dịch kháng trị và thiếu máu bất sản [45]. Tuy nhiên, khả năng tiếp
cận của phần lớn bệnh nhân với các thuốc này khá hạn chế do giá thành của thuốc rất
cao. Do đó, việc nghiên cứu các thuốc điều trị giảm tiểu cầu mới nhằm bổ sung hoặc
thay thế cho các thuốc kích thích tiểu cầu hiện có là một hướng tiếp cận tiềm năng và
có ý nghĩa thực tiễn lớn.
Dựa trên kinh nghiệm dân gian trong điều trị các rối loạn liên quan đến giảm tiểu
cầu, một số nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu tác dụng kích thích sản
sinh tiểu cầu của một số thuốc có nguồn gốc dược liệu và thu được những kết quả khả
quan với nhiều dược liệu khác nhau như đu đủ (Carica papaya), xuyên tâm liên
(Andrographis Paniculata), ổi (Psidium guajava) [23], [60], [68]. Trong đó, đu đủ là
đối tượng được quan tâm nhiều hơn cả do tác dụng tăng sinh tiểu cầu đã được ghi nhận
nhất quán trong một loạt các nghiên cứu in-vitro, in-vivo và một số thử nghiệm lâm
sàng ở Ấn Độ [17], [23], [27], [68]. Đáng chú ý, mặc dù đu đủ cũng là một loài thực
vật phổ biến ở Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu thực hiện đánh giá chuyên biệt tác
dụng kích thích tạo tiểu cầu của dược liệu thu hái trong nước.
Để bước đầu đánh giá tác dụng tăng sinh tiểu cầu của đu đủ cũng như các đối
tượng nghiên cứu tiềm năng khác, trước hết cần phải xây dựng được một mô hình thực
nghiệm có tính khả thi, tin cậy và mô phỏng được cơ chế sinh bệnh học của giảm tiểu
cầu trên người. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn mô hình gây giảm
tiểu cầu bằng hóa trị liệu do đây là mô hình có quy trình đơn giản, dễ thực hiện và đã
được sử dụng thành công để đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các thuốc có
1
nguồn gốc dược liệu. Tuy nhiên, trong các công bố trước đây, việc lựa chọn chế độ
liều của tác nhân gây độc cũng như xác định thời điểm lấy mẫu đánh giá ảnh hưởng
của mẫu thử đến số lượng tiểu cầu còn có sự khác biệt lớn giữa các nghiên cứu [23],
[37], [60], [64], [68]. Ngoài ra, các chủng động vật thí nghiệm thường khác nhau về
đặc tính sinh miễn dịch, dẫn đến biến thiên về mức độ giảm tiểu cầu và sự nhạy cảm
với độc tính của hóa trị liệu. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Triển khai mô hình
gây giảm tiểu cầu bằng hóa chất độc tế bào trên chuột cống trắng” với 2 mục tiêu:
1. Triển khai được mô hình gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid và busulfan
trên chuột cống trắng.
2. Đánh giá được tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ trên một mô hình gây giảm
tiểu cầu đã triển khai.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giảm tiểu cầu
Định nghĩa
Giảm tiểu cầu là một vấn đề lâm sàng phổ biến được định nghĩa là số lượng tiểu cầu
giảm dưới ngưỡng 150 000/mm3 máu [54]. Giảm tiểu cầu được chia thành ba giai đoạn:
nhẹ (100 000 – 150 000 /mm3 máu), trung bình (50 000 – 100 000 /mm3 máu), nghiêm
trọng (< 50 000/mm3 máu). Tuy nhiên, giảm tiểu cầu thường không được phát hiện trên
lâm sàng cho đến khi số lượng tiểu cầu đã giảm xuống dưới mức 100 000/mm3 [26].
Chẩn đoán
Số lượng tiểu cầu < 150 000/mm3
Hemoglobin và số lượng bạch cầu
Bình thường
Bất thường
Xém xét tủy xương
Tiểu cầu: xác định lại trong natri
citrat hoặc heparin
Tiêu bản máu ngoại vi
Hình thái hồng cầu
bình thường, tiểu cầu
bình thường hoặc tăng
kích thước
Tế bào
hồng cầu bị
phân mảnh
Thiếu máu tan máu vi mạch
(DIC, TTP)
Xem xét:
Giảm tiểu cầu do thuốc
Giảm tiểu cầu do nhiễm trùng
Giảm tiểu cầu miễn dịch tự phát
Giảm tiểu cầu bẩm sinh
Hình 1.1. Đánh giá bệnh nhân giảm tiểu cầu [35]
3
Giảm tiểu cầu không phải một bệnh nhưng cần được chẩn đoán. Trên một bệnh
nhân giảm tiểu cầu cụ thể cần xác định nguyên nhân gây giảm tiểu cầu: giảm tiểu cầu
do thuốc (kiểm tra các loại thuốc bệnh nhân đang sử dụng hoặc gần đây đã sử dụng do
thuốc là nguyên nhân phổ biến gây giảm tiểu cầu), các rối loạn di truyền bất thường,
rối loạn tủy xương (ảnh hưởng đến cả bạch cầu và hồng cầu, xem xét tiền sử các bệnh
về máu), tình trạng nhiễm trùng [26], [35]. Khi đối diện với bệnh nhân có số lượng
tiểu cầu thấp nhưng không có nguyên nhân rõ ràng gây giảm tiểu cầu, cần loại trừ
trường hợp giảm tiểu cầu giả. Đây là hiện tượng xuất hiện do tiểu cầu kết dính với
kháng thể (thường là IgG, nhưng cũng có thể là IgM và IgA) khi lượng calci giảm do
thu mẫu máu trong ống chứa chất chống đông EDTA. Để loại trừ trường hợp giảm tiểu
cầu giả, cần tiến hành đánh giá tiêu bản máu ngoại vi kết hợp với thực hiện lại xét
nghiệm tiểu cầu với mẫu máu chống đông bằng heparin hoặc citrat. Quy trình đánh giá
một bệnh nhân giảm tiểu cầu được trình bày trong Hình 1.1. [35].
Nguyên nhân
Ba nguyên nhân chính dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu bao gồm: (1) ức chế sản
xuất tiểu cầu bởi tủy xương, (2) tăng phá hủy tiểu cầu và (3) tăng bắt giữ tiểu cầu tại
lách. Các yếu tố này có thể xuất hiện đơn độc hoặc đồng thời trong các rối loạn sinh
lý/bệnh lý khác nhau [35].
- Giảm sản xuất tiểu cầu: các bệnh làm tổn hại đến tế bào gốc hoặc ngăn chúng tăng
sinh trong tủy xương thường gây giảm tiểu cầu. Do chúng thường tác động đến nhiều
dòng tế bào tạo máu, giảm tiểu cầu đi kèm với thiếu máu và giảm bạch cầu với những
mức độ khác nhau. Để chẩn đoán một khiếm khuyết trong quá trình sản sinh tiểu cầu,
cần tiến hành xét nghiệm chọc hút hoặc sinh thiết tủy xương và kết quả phải cho thấy
có sự giảm số lượng tế bào nhân khổng lồ. Các nguyên nhân phổ biến nhất dẫn đến
giảm sản xuất tiểu cầu là bất sản tủy, xơ tủy hoặc thâm nhiễm tế bào ác tính tại tủy.
Tất cả những bệnh lý trên gây ra những bất thường tủy rất đặc trưng. Các thuốc độc tế
bào, thường được dùng trong hóa trị liệu ung thư, làm tổn hại đến sự tăng sinh và
trưởng thành của các tế bào nhân khổng lồ, dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu. Ngoài ra,
một số bệnh tủy hiếm gặp như thiểu sản tế bào nhân khổng lồ bẩm sinh và giảm mẫu
tiểu cầu kết hợp với thiếu xương quay làm giảm sản sinh tế bào nhân khổng lồ một
cách chọn lọc [8], [26], [29].
4
- Tăng bắt giữ tiểu cầu tại lách: 1/3 khối tiểu cầu bình thường bị giữ lại trong lách.
Cắt lách sẽ làm tăng số lượng tiểu cầu khoảng 30%. Tăng tiểu cầu sau cắt lách là một
bệnh lành tính tự khỏi không đòi hỏi liệu pháp đặc biệt. Trái lại, khi lách phì đại, số
lượng tiểu cầu bị giữ lại ở lách tăng lên, dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu trong máu
ngoại vi. Nguyên nhân thường gặp nhất gây phì đại lách là tăng áp lực tĩnh mạch cửa
thứ phát sau bệnh gan và thâm nhiễm các tế bào u vào lách trong các bệnh loạn sản
tủy, tăng sinh tế bào lympho hoặc đại thực bào trong bệnh Gaucher. Lách to hiếm khi
xuất hiện đơn độc mà thường đi kèm với nhiều biểu hiện lâm sàng khác của một bệnh
cơ bản. Nhiều bệnh nhân bị bệnh bạch cầu, u lympho hoặc hội chứng loạn sản tủy có
cả thâm nhiễm tủy lẫn lách to và phát triển giảm tiểu cầu do phối hợp hai cơ chế giảm
sản xuất tiểu cầu ở tủy xương và tăng bắt giữ tiểu cầu tại lách [8], [26], [29].
- Tăng phá hủy tiểu cầu: rối loạn thành mạch, cục huyết khối fibrin và các bộ phận
nhân tạo trong mạch máu, có thể rút ngắn thời gian sống của tiểu cầu và gây ra giảm tiểu
cầu không do miễn dịch. Hiện tượng này thường gặp trên các bệnh nhân bị viêm mạch,
hội chứng tan máu do tăng ure huyết, ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối, đông
máu nội mạch rải rác và bệnh nhân có van tim nhân tạo. Ngoài ra, tiểu cầu có phủ kháng
thể, phức hợp miễn dịch, hoặc bổ thể sẽ nhanh chóng bị các thực bào đơn nhân trong
lách hoặc trong các mô khác dọn dẹp, gây giảm tiểu cầu miễn dịch. Nguyên nhân phổ
biến nhất của giảm tiểu cầu miễn dịch là nhiễm virus hoặc vi khuẩn, do thuốc và một
bệnh tự miễn mạn tính là ban xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch [8], [26], [29].
Giảm tiểu cầu trong một số bệnh lý cụ thể
Giảm tiểu cầu là một triệu chứng phổ biến xuất hiện trong nhiều bệnh lý khác nhau
như: hội chứng suy tủy, xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch, ban xuất huyết giảm tiểu cầu
huyết khối, giảm tiểu cầu do heparin, nhiễm trùng (sốt xuất huyết, sốt rét, viêm gan C...),
… Dưới đây chỉ trình bày cơ chế bệnh sinh và tiếp cận điều trị của một số bệnh lý
quan trọng trên lâm sàng.
1.1.4.1. Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch
Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (Immune thrombocytopenia – ITP) là một rối
loạn miễn dịch mắc phải, trong đó kháng thể kháng tiểu cầu làm giảm thời gian sống của
tiểu cầu và ức chế sinh mẫu tiểu cầu dẫn đến giảm tiểu cầu (tiểu cầu < 100 000/mm3)
[29]. ITP xuất hiện ở cả người lớn và trẻ em. Ở trẻ em, chủ yếu là ITP cấp, thường sau
5
nhiễm trùng, bệnh thường nhẹ và tự giới hạn, trong đó hơn 70 % sẽ tự hồi phục. Ở người
lớn, bệnh khởi phát âm thầm và hầu hết sẽ chuyển thành mạn tính (> 80 %) [2], [35].
ITP có thể không rõ nguyên nhân (nguyên phát) hoặc do các tình trạng khác cùng
tồn tại (thứ phát) hoặc do thuốc. Trong ITP nguyên phát, tự kháng thể kết hợp với
kháng nguyên bề mặt tiểu cầu và gây phá hủy tiểu cầu ở hệ thống liên võng nội mô,
bên cạnh đó là sự ức chế sản xuất tiểu cầu thông qua trung gian miễn dịch. ITP thứ
phát xảy ra trong lupus ban đỏ hệ thống, hội chứng kháng phospholipid, nhiễm HIV,
virus viêm gan C, Helicobacter pylori và các rối loạn tăng sinh tế bào lympho. ITP do
thuốc là kết quả tương tác thuốc - tiểu cầu dẫn đến kết hợp kháng thể. Thuốc liên quan
đến giảm tiểu cầu bao gồm quinidin và quinin; chất ức chế tiểu cầu abciximab,
eptifibatid, tirofiban và ticlopidin; kháng sinh linezolid, rifampin, sulfonamid và
vancomycin; các phenytoin chống co giật, acid valproic và carbamazepin; các thuốc
giảm đau acetaminophen, naproxen và diclofenac; cimetidin; và chlorothiazid [29].
Cơ chế bệnh sinh
Ban xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch là một rối loạn mắc phải trong đó có sự
phá hủy tiểu cầu qua trung gian miễn dịch và ức chế sự giải phóng tiểu cầu từ tế bào
nhân khổng lồ [35].
Tiểu cầu có thể bị phá hủy thông qua trung gian tự kháng thể IgG. Các tự kháng
thể gắn kết với một hay nhiều glycoprotein của màng tiểu cầu qua phần Fab của phân
tử kháng thể: GP IIb/IIIa, GP Ib/IX (75%), GP Ia/IIIa, GP IV, GP V (25%). Phức hợp
miễn dịch sẽ gắn kết với phần thụ thể Fc của đại thực bào. Tiểu cầu gắn kháng thể sẽ
bị tăng thực bào bởi đại thực bào, có thể bị ly giải qua hệ thống bổ thể. Tự kháng thể
cũng có thể làm giảm số lượng và ức chế sự trưởng thành của tế bào nhân khổng lồ
trong tủy, ức chế yếu tố sinh tế bào nhân khổng lồ. Ngoài ra, tiểu cầu cũng có thể bị ly
giải thông qua trung gian lympho T. Trong bệnh ITP, không có sự tăng số lượng
thrombopoietin như giảm tiểu cầu trong suy tủy hay loạn sản tủy. Kháng nguyên đích
thường gặp trên bề mặt tiểu cầu là phức hợp glycoprotein IIb/IIIa. Tiểu cầu có kháng
thể trên bề mặt được bắt giữ phần lớn tại lách. Cơ chế xuất hiện các tự kháng thể này
vẫn chưa được xác định. Có giả thuyết cho rằng các tự kháng thể này có thể xuất hiện
sau khi nhiễm virus vài tuần, sau đó phản ứng chéo với kháng nguyên tiểu cầu [2].
Tiếp cận điều trị
6
Điều trị đặc hiệu: quyết định điều trị ITP nguyên phát phụ thuộc vào mức độ
nghiêm trọng của giảm tiểu cầu và nguy cơ chảy máu. Lựa chọn đầu tay là
glucocorticoid. Trên các bệnh nhân không có đáp ứng đầy đủ, có thể điều trị bằng
globulin miễn dịch đường tĩnh mạch (IVIg) hoặc anti-D immunoglobulin (bệnh nhân
Rh dương tính) [29]. Biện pháp cắt lách được cân nhắc khi đã điều trị 6 tháng bằng
glucocorticoid và các thuốc ức chế miễn dịch khác nhưng không hiệu quả [4]. Với
những bệnh nhân cắt lách thất bại, có thể lựa chọn phác đồ phối hợp glucocorticoid và
thuốc ức chế miễn dịch. Hiện có một số thuốc mới tác động trên thụ thể
thrombopoietin, có tác dụng kích thích sản sinh tiểu cầu như romiplostim và
eltrombopac, được sử dụng cho bệnh nhân ITP nguyên phát kháng thuốc có tăng nguy
cơ chảy máu [29].
Điều trị hỗ trợ: truyền khối tiểu cầu được chỉ định khi có xuất huyết hoặc khi
không có xuất huyết nhưng số lượng tiểu cầu < 20 000/mm3 máu (ưu tiên truyền khối
tiểu cầu gạn tách từ một người cho). Nếu số lượng tiểu cầu < 10 000/mm3 máu và xuất
huyết nặng thì kết hợp truyền khối tiểu cầu, glucocorticoid liều cao (hoặc IVIg hoặc
anti-D immunoglobulin) và acid tranexamic [4].
Điều trị ITP thứ phát có thể kết hợp giữa điều trị căn nguyên và liệu pháp điều trị
sử dụng cho ITP nguyên phát. Đối với giảm tiểu cầu do thuốc nghiêm trọng, truyền
tiểu cầu có thể làm giảm nguy cơ chảy máu, trong khi hiệu quả của IVIg, steroid và
thay huyết tương chưa được xác định [29].
1.1.4.2. Sốt xuất huyết
Sốt xuất huyết Dengue là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus Dengue gây
nên. Virus Dengue có 4 týp là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4 với trung gian
truyền bệnh là muỗi Aedes aegypti. Bệnh sốt xuất huyết Dengue có biểu hiện lâm sàng
đa dạng, tiến triển nhanh. Bệnh thường khởi phát đột ngột và diễn biến qua ba giai
đoạn: giai đoạn sốt, giai đoạn nguy hiểm và giai đoạn hồi phục. Giảm tiểu cầu là một
đặc trưng phổ biến và gắn liền với các giai đoạn của bệnh. Giai đoạn đầu số lượng tiểu
cầu bình thường hoặc giảm dần (nhưng còn trên 100 000/mm3), đến giai đoạn nguy
hiểm (thường vào ngày thứ 3-7 của bệnh) số lượng tiểu cầu giảm dưới 100 000/mm3,
có thể có các dấu hiệu xuất huyết da, niêm mạc, tiêu hóa. Giai đoạn hồi phục, số lượng
tiểu cầu dần trở về bình thường [5].
7
Trong bệnh sốt xuất huyết, có sự giảm số lượng tiểu cầu kèm theo bất thường
chức năng tiểu cầu.
Cơ chế giảm tiểu cầu
Hai cơ chế có thể liên quan đến giảm tiểu cầu do sốt xuất huyết là ức chế tủy
xương sản xuất tiểu cầu và tăng phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi [33].
- Ức chế tủy xương sản xuất tiểu cầu: sau 2 đến 4 ngày nhiễm virus Dengue, tủy
xương bị ức chế dẫn đến giảm sản xuất tiểu cầu. Virus Dengue gây ức chế quá trình
sản sinh tế bào nhân khổng lồ trực tiếp bằng cách gây nhiễm và ức chế tế bào tiền thân
tạo máu; hoặc gián tiếp thông qua ức chế tế bào đệm, là tế bào có chức năng biến đổi
tính đặc hiệu của cytokin trong tủy xương. DEN-4 lan truyền trong các tế bào tủy
xương và thay đổi khả năng tăng sinh của chúng. Ngoài ra, virus Dengue còn có thể
xâm nhập vào tế bào đệm và gây ức chế quá trình tạo máu [33].
- Tăng phá hủy tiểu cầu ở máu ngoại vi:
+ Cơ chế tự miễn dịch: kháng thể kháng virus Dengue tạo ra phản ứng chéo với
tiểu cầu, tạo điều kiện loại tiểu cầu khỏi tuần hoàn.
+ Tăng tương tác của tiểu cầu với bạch cầu và tế bào nội mô: các tế bào nội mô
bị nhiễm virus làm tăng khả năng kết dính với tiểu cầu. Đồng thời, khi nhiễm virus
Dengue, có sự kết tập tiểu cầu với bạch cầu, từ đó gây giảm tiểu cầu.
+ Rối loạn chức năng tiểu cầu: hiện tượng giảm kết tập tiểu cầu trong sốt xuất
huyết có thể liên quan đến việc nhận dạng protein disulfid isomerase (PDI) trên bề mặt
tiểu cầu bằng kháng thể kháng NS1. Ngoài ra, hiện tượng này được cho là do tăng vận
chuyển L-arginin và tạo nitric oxyd trong tiểu cầu.
+ Virus Dengue tương tác trực tiếp với tiểu cầu: virus Dengue làm thay đổi hình
thái của tiểu cầu, làm tăng biểu hiện P-selectin và fibrinogen trên bề mặt tiểu cầu.
ARN của virus và một số hạt virus được phát hiện trong tiểu cầu gây rối loạn chức
năng tiểu cầu và giảm tiểu cầu.
+ Các chất trung gian hòa tan: Các chất trung gian kích hoạt tiểu cầu và gây giảm
tiểu cầu thường xuất hiện trong bệnh sốt xuất huyết. Các sản phẩm phân hủy fibrin và
các phức hợp thrombin/antithrombin thường tăng sau sốt xuất huyết. Yếu tố von
Willebrand cũng tăng lên, làm tăng hoạt hóa tiểu cầu. Một loạt các cytokin, như yếu tố
hoại tử khối u (TNF-α) và interleukin-1β (IL-1β) cũng được tạo ra trong sốt xuất
8
huyết. Các cytokin này có liên quan đến khởi phát và điều hòa huyết khối, cầm máu.
Mức tăng TNF-α và IL-1β ở bệnh nhân sốt xuất huyết có mối tương quan với giảm
tiểu cầu [33].
Tiếp cận điều trị
Chủ yếu là điều trị triệu chứng và theo dõi chặt chẽ nhằm phát hiện sớm sốc để
xử trí kịp thời [5].
Điều trị xuất huyết nặng:
- Truyền máu và các chế phẩm máu: khi người bệnh có sốc cần phải tiến hành
xác định nhóm máu để truyền máu khi cần. Truyền khối hồng cầu hoặc máu toàn phần
sau khi đã bù đủ dịch nhưng sốc không cải thiện, hematocrit giảm xuống nhanh (mặc
dù còn trên 35%) hoặc xuất huyết nặng.
- Truyền tiểu cầu: khi số lượng tiểu cầu xuống nhanh dưới 50 000/mm3 kèm theo
xuất huyết nặng. Nếu số lượng tiểu cầu dưới 5 000/mm3 mặc dù chưa có xuất huyết có
thể truyền tiểu cầu tùy từng trường hợp cụ thể.
- Truyền huyết tương tươi, đông lạnh: xem xét truyền khi người bệnh có rối loạn
đông máu dẫn đến xuất huyết nặng [5].
1.2. Các mô hình gây giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm
Hiện nay, một số nhóm mô hình đã được sử dụng để mô phỏng các cơ chế bệnh
sinh khác nhau của rối loạn giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm, bao gồm gây giảm
tiểu cầu bằng hóa trị liệu, dùng kháng thể kháng tiểu cầu, gây nhiễm virus Dengue trên
động vật và một số mô hình mô phỏng các rối loạn hiếm gặp như giảm tiểu cầu do
heparin.
Mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu
Hầu hết các tác nhân hóa trị liệu có tác dụng không mong muốn là ức chế tủy
xương, dẫn đến giảm các tế bào máu bao gồm tiểu cầu [60]. Thách thức với việc lựa
chọn các tác nhân này trong các mô hình gây giảm tiểu cầu thực nghiệm bao gồm
giảm tiểu cầu nghiêm trọng, kéo dài và gây độc tính quá mức trên động vật thí nghiệm.
1.2.1.1. Gây giảm tiểu cầu bằng Cyclophosphamid
Cyclophosphamid (CPA) là một tác nhân alkyl hóa kìm tế bào, có hoạt tính
chống khối u và ức chế miễn dịch. Bản thân cyclophosphamid không có hoạt tính nên
không có tác dụng tại chỗ. Để tạo ra tác dụng, CPA cần được chuyển hóa qua hệ
9
cytochrom P450 ở gan tạo thành các chất chuyển hóa có hoạt tính là aldophosphamid
và phosphoramid mustard. Các chất chuyển hóa này liên kết đồng hóa trị với những
gốc guanin trên phân tử ADN, tạo liên kết chéo giữa hai sợi ADN, do đó ngăn chặn sự
sao chép và phiên mã ADN, đồng thời khởi phát quá trình chết tế bào. CPA ức chế
chung sự phân chia của tất cả các tế bào đang tăng sinh, đặc biệt là các tế bào tủy
xương dẫn đến giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu và thiếu máu [3], [32].
Trên thực nghiệm, CPA thường được sử dụng trong các mô hình gây giảm tiểu cầu
trên động vật nhờ khả năng gây giảm tiểu cầu ổn định và ít gây biến đổi hình thái và cấu
trúc của tiểu cầu [32], [59]. Mức độ gây giảm tiểu cầu của CPA phụ thuộc vào liều. Một
nghiên cứu triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu trên chuột cống trắng đã sử dụng CPA
tiêm dưới da trong 3 ngày liên tiếp với các mức liều 25 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg,
150 mg/kg cân nặng, trong đó cả 4 mức liều CPA đều bắt đầu gây giảm tiểu cầu vào
ngày thứ 7, tuy nhiên đến ngày thứ 8, tất cả động vật thí nghiệm sử dụng CPA mức liều
100 và 150 mg/kg cân nặng đều đã chết [37]. Trái lại, một số nghiên cứu khác đã sử
dụng các mức liều cao của CPA lên tới 50 và 100 mg/kg nhưng không ghi nhận chuột
chết. Trong nghiên cứu sử dụng CPA mức liều 50 mg/kg, số lượng tiểu cầu được xác
định vào các ngày 1, 4, 7 và 11, kết quả số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm rõ rệt vào ngày
11 [49]. Với nghiên cứu sử dụng CPA liều 100 mg/kg, thời gian giảm tiểu cầu kéo dài từ
ngày 7 đến khi kết thúc nghiên cứu (ngày 15) nhưng không xác định được thời điểm số
lượng tiểu cầu phục hồi [17]. Một nghiên cứu khác đã sử dụng CPA với liều 25 mg/kg
trong 3 ngày liên tiếp và số lượng tiểu cầu được xác định vào ngày 1, 4, 7, 11, kết quả số
lượng tiểu cầu bắt đầu giảm từ ngày 4 kéo dài đến ngày 11 [23].
Trong các nghiên cứu trên, mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng CPA đã được
sử dụng để nghiên cứu tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu của một số dược liệu
như lá đu đủ (Carica papaya), xuyên tâm liên (Andrographis Paniculata) và ổi
(Psidium guajava).
1.2.1.2. Gây giảm tiểu cầu bằng busulfan
Busulfan là tác nhân alkyl hóa và có tác dụng ức chế chọn lọc trên tủy xương. Ở
liều thấp, thuốc ức chế quá trình tạo bạch cầu hạt và ức chế cả quá trình tạo tiểu cầu
nhưng với một mức độ yếu hơn. Với liều cao hơn, thuốc ức chế mạnh tủy xương dẫn
đến giảm toàn bộ các tế bào máu. Ức chế tủy xương do busulfan có thể kéo dài hoặc
10
không hồi phục được [3].
Cho đến nay, nhiều mô hình gây giảm tiểu cầu bằng busulfan đã được xây dựng
trên các loài động vật khác nhau như thỏ, cừu và chuột cống [39], [40], [64]. Trên
chuột cống, busulfan đã được sử dụng để gây giảm tiểu cầu trong một số nghiên cứu
đánh giá tác dụng của thuốc kích thích tiểu cầu cũng như những khía cạnh sinh bệnh
học khác nhau của giảm tiểu cầu. Trong những nghiên cứu này, busulfan thường được
dùng theo đường tiêm màng bụng vào ngày 0, 3 hoặc tiêm dưới da vào các ngày 1, 5,
10, 15. Trong nghiên cứu được thực hiện bởi Yang C. và cộng sự, busulfan được tiêm
màng bụng với các mức liều 10, 15, 20 mg/kg lặp lại vào ngày 0 và 3, tương ứng với
tổng liều busulfan là 20, 30 và 40 mg/kg. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy các
động vật thí nghiệm được tiêm busulfan với tổng liều 30 và 40 mg/kg ban đầu xuất
hiện giảm tiểu cầu vào ngày thứ 7. Tuy nhiên, tất cả động vật thuộc 2 lô này đều tử
vong trong khoảng thời gian từ ngày 12 đến ngày 16 của nghiên cứu. Với mức liều 20
mg/kg, số lượng tiểu cầu của chuột tiêm busulfan bắt đầu giảm từ ngày 9, đạt đáy vào
ngày 13 và tiếp tục duy trì khoảng 1 tuần sau đó trước khi có xu hướng hồi phục. Tất
cả chuột tiêm busulfan với tổng liều 20 mg/kg đều còn sống đến cuối nghiên cứu [46],
[64]. Những kết quả này được tái khẳng định trong nghiên cứu của Okamura Y. và
cộng sự, trong đó, chỉ có busulfan với tổng liều 20 mg/kg (trong khoảng liều từ 20 - 40
mg/kg) chia làm 2 lần (ngày 0 và 3) có thể gây giảm tiểu cầu rõ rệt nhưng đồng thời
không gây chết động vật thí nghiệm [43]. Dựa trên 2 công bố này, các nghiên cứu sau
đó đều sử dụng mức liều 10 mg/kg busulfan tiêm màng bụng, chia làm 2 lần cách nhau
3 ngày để gây giảm tiểu cầu trên chuột cống và thu được những kết quả khá tương
đồng. Thời gian duy trì giảm tiểu cầu kéo dài từ ngày 10 đến ngày 20 của nghiên cứu
với mức giảm thấp nhất là trên 90 % so với nhóm chứng [57], [63].
Ngoài ra, một chế độ liều khác của busulfan cũng được sử dụng trong nghiên cứu
đánh giá tác dụng kích tích tăng tiểu cầu của dịch chiết lá đu đủ. Trong nghiên cứu
này, busulfan được tiêm dưới da vào các ngày 1, 5, 10, 15 với liều 5 mg/kg. Mẫu máu
được lấy vào ngày trước khi tiêm busulfan và vào ngày thứ 20 sau khi tiêm busulfan.
Chế độ liều này gây giảm rõ rệt số lượng tiểu cầu vào ngày thứ 20, tuy nhiên không
xác định được thời điểm tiểu cầu bắt đầu giảm cũng như sự biến thiên số lượng tiểu
cầu theo thời gian [68].
11
1.2.1.3. Gây giảm tiểu cầu bằng carboplatin
Carboplatin là thuốc chống ung thư dẫn chất platin. Carboplatin tạo liên kết chéo
ở trong cùng một sợi hoặc giữa hai sợi của phân tử ADN, làm thay đổi cấu trúc và gây
ức chế tổng hợp ADN. Tác dụng không mong muốn thường gặp trên máu của
carboplatin là gây suy tủy xương, trước tiên dẫn đến giảm tiểu cầu, sau đó gây giảm
bạch cầu, thiếu máu và xuất huyết [3].
Carboplatin đã được sử dụng để gây giảm tiểu cầu ở linh trưởng, chó, chuột nhắt
và chuột cống, chủ yếu để đánh giá các tác nhân kích thích tạo máu [18], [58].
Với mục đích theo dõi tình trạng thiếu máu do hóa trị liệu trên chuột cống, Woo
S. và cộng sự đã tiến hành tiêm tĩnh mạch carboplatin liều duy nhất 60 mg/kg, sau đó
theo dõi các thông số huyết học trong vòng 4 tuần để đánh giá sự thay đổi của các
thông số huyết học theo thời gian. Kết quả cho thấy carboplatin gây giảm tiểu cầu
nghiêm trọng, xảy ra vào ngày 8-11 với tỷ lệ giảm hơn 90% so với nhóm chứng. Tuy
nhiên, số lượng tiểu cầu hồi phục tương đối nhanh. Tại thời điểm ngày thứ 13, số
lượng tiểu cầu đã tăng lên mức gần tương đương so với nhóm chứng [61].
Một nghiên cứu khác đã tiến hành triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng
carboplatin để đánh giá tác dụng kích thích tăng tiểu cầu của dịch chiết lá đu đủ trong
các dung môi khác nhau. Trong nghiên cứu này, carboplatin được tiêm màng bụng với
các mức liều 50, 100 và 150 mg/kg cân nặng để gây giảm tiểu cầu trên chuột cống.
Dựa trên độc tính và khả năng gây giảm tiểu cầu của các mức liều carboplatin, nghiên
cứu đã chọn mức liều 50 mg/kg để gây giảm tiểu cầu và áp dụng mô hình này để đánh
giá tác dụng kích thích tăng tiểu cầu của lá đu đủ [52].
1.2.1.4. Gây giảm tiểu cầu bằng hydroxyure
Hydroxyure là một thuốc điều trị ung thư có độc tính cao. Một trong những tác
dụng phụ của thuốc là ức chế tủy và gây suy tủy, làm giảm số lượng tiểu cầu [30].
Để gây giảm tiểu cầu trên chuột thí nghiệm, hydroxyure được hòa tan trong nước
và cho động vật uống với liều 1,5 mg/kg một lần duy nhất. Sau đó, mẫu máu được thu
thập vào các ngày 0, 3 và 6. Kết quả cho thấy có sự giảm số lượng tiểu cầu vào ngày 3
và ngày 6, với mức giảm tối đa đạt được tại thời điểm ngày thứ 6 [38]. Mặt khác,
hydroxyure liều duy nhất đường uống không gây ra bất kỳ dấu hiệu độc tính nào cũng
như không ảnh hưởng rõ rệt đến cân nặng và các chỉ số sinh hóa máu như AST, ALT,
12
ure và creatinin huyết thanh [28]. Tuy nhiên, kết quả từ một nghiên cứu khác cho thấy
liều duy nhất 1,6 mg/kg hydroxyure làm giảm tiểu cầu rõ rệt vào ngày 1 nhưng không
ảnh hưởng đến số lượng tiểu cầu vào ngày 3 và 5. Trái lại, nếu dùng hydroxyure với
liều 1,6 mg/kg/ngày, lặp lại trong 5 ngày, sự giảm số lượng tiểu cầu được ghi nhận vào
cả 3 thời điểm đánh giá (ngày 1, 3 và 5) [30].
Mô hình gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động
1.2.2.1. Gây giảm tiểu cầu bằng huyết thanh kháng tiểu cầu
Huyết thanh từ động vật được miễn dịch với tiểu cầu của một loài khác đã được
truyền vào loài cho để gây giảm tiểu cầu. Đây là mô hình đã được sử dụng phổ biến từ
những năm 1950 để nghiên cứu một loạt các khía cạnh liên quan đến chức năng tiểu
cầu hoặc tương tác giữa tình trạng giảm tiểu cầu và các yếu tố sinh lý, bệnh lý và dược
lý. Một số loài động vật như thỏ, chuột nhắt, chuột cống, cừu, lợn, ngựa, gia súc đã
được sử dụng trong các mô hình nghiên cứu giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động. Những
nghiên cứu này nhằm giải thích các khía cạnh khác nhau về bệnh xuất huyết giảm tiểu
cầu miễn dịch và vẫn còn ứng dụng cho đến thời điểm hiện tại. Ví dụ, những nghiên
cứu trên mô hình động vật gây giảm tiểu cầu miễn dịch đã được sử dụng để đánh giá
tác động của thrombopoietin; tác động đến quá trình phát triển dòng tế bào sản xuất tiểu
cầu; ảnh hưởng đến thời gian chảy máu và đông máu; tác dụng làm giảm mức độ giảm
tiểu cầu của cortison [53].
Phương pháp này có thể ngay lập tức gây giảm mạnh số lượng tiểu cầu, tuy nhiên
thời gian duy trì tác dụng của một liều huyết thanh kháng tiểu cầu thường ngắn [18].
McDonald T. P. và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế tác dụng của huyết thanh kháng tiểu
cầu [41]. Tiểu cầu chuột được thu thập từ khoảng 200 chuột đực bằng cách ly tâm vi
sai, rửa ba lần trong amoni oxalat 1% và hai lần trong nước muối, sau đó tiếp tục cho
vào nước (5% huyền phù) và đông lạnh. Các tiểu cầu tinh khiết đồng nhất đã được rã
đông và tiêm dưới da thỏ tại nhiều vị trí hai lần mỗi tuần trong 3 tuần. Bảy ngày sau
lần tiêm cuối cùng, thỏ bị chảy máu từ tĩnh mạch tai và huyết thanh được thu thập. Sau
đó, kháng huyết thanh thu được được xử lý và loại bỏ các kháng thể kháng tiểu cầu
chuột không đặc hiệu. Tiêm màng bụng 0,1 ml huyết thanh thỏ kháng tiểu cầu chuột
(RAMPS) vào mỗi chuột. Kết quả là tiểu cầu chuột giảm sâu trong vòng 4 giờ sau khi
tiêm huyết thanh kháng tiểu cầu nhưng không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu và
13
bạch cầu. Trong số 1095 chuột được tiêm RAMPS, 1044 chuột có số lượng tiểu cầu
giảm từ 900 000 /mm3 xuống dưới 50 000 /mm3 sau 4 giờ. Nguyên nhân có thể do
RAMPS gây kết tập tiểu cầu dẫn đến phản ứng giải phóng - mất ADP tiểu cầu và có
thể cả mucopolysaccharides [41].
1.2.2.2. Gây giảm tiểu cầu bằng kháng thể kháng tiểu cầu
Vào đầu những năm 1980, các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu người đầu tiên
được phát triển và sau đó mở rộng sang các loài động vật khác như bò, chó và chuột.
Một trong những kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu chuột đầu tiên là MReg30 và đã
được sử dụng để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động trên chuột thực nghiệm . Sau
đó, một số kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu khác cũng được sử dụng với mục đích
tương tự. Đối với bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) ở người, đóng góp
lớn nhất của các mô hình động vật giảm tiểu cầu miễn dịch gây ra bởi kháng thể đơn
dòng là làm sáng tỏ các cơ chế tác dụng của IVIg (immunoglobulin đường tĩnh mạch).
Nghiên cứu đầu tiên đánh giá ảnh hưởng của IVIg chỉ ra rằng IVIg người có thể làm
tăng số lượng tiểu cầu ở những chuột được gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động. Các
nghiên cứu sau đó cho thấy hiệu quả của IVIg là do ức chế thụ thể FcγIIb, đồng thời
xác định được một số cơ chế khác của IVIg trong việc làm tăng số lượng tiểu cầu,
cùng với đó là phát triển các liệu pháp tế bào mới cho ITP [53].
Để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động, chuột nhắt được tiêm màng bụng kháng
thể đơn dòng kháng tiểu cầu (2 μg MWReg30 hoặc 10 μg 2C9.G2). Sau 24 giờ, lấy máu
từ tĩnh mạch đuôi để xác định số lượng tiểu cầu. Với mô hình gây giảm tiểu cầu miễn
dịch này, số lượng tiểu cầu giảm thoáng qua sau 24 giờ truyền kháng thể kháng tiểu cầu,
số lượng hồng cầu không bị ảnh hưởng. Nếu được tiêm 24 giờ trước khi gây giảm tiểu
cầu bằng kháng thể kháng tiểu cầu, IVIg sẽ có tác dụng bảo vệ chống lại giảm tiểu cầu
gây ra do kháng thể kháng tiểu cầu. Nghiên cứu cũng chứng minh rằng IgG đơn dòng có
tính đặc hiệu với kháng nguyên đích tuần hoàn, có thể cung cấp một liệu pháp điều trị
thay thế cho IVIg trong điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch [55].
Ưu điểm của việc sử dụng kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu là loại bỏ một số
yếu tố gây nhiễu tiềm tàng có liên quan đến việc sử dụng huyết thanh kháng tiểu cầu,
đặc biệt là tính biến thiên giữa các lô huyết thanh miễn dịch khác nhau và thiếu các
đặc tính kháng nguyên tiểu cầu đặc trưng [53].
14
Các mô hình gây giảm tiểu cầu khác
1.2.3.1. Gây giảm tiểu cầu bằng virus Dengue
Một nghiên cứu đã chứng minh rằng có thể gây nhiễm virus Dengue-2 cho chuột
qua đường tiêm tĩnh mạch dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu thoáng qua sau 10 – 13
ngày. Hai tháng sau đó, những động vật này được tái nhiễm với cùng một lượng virus
Dengue-2, giảm tiểu cầu tiếp tục được ghi nhận sau 10 ngày tái nhiễm virus. Ngoài ra,
còn có sự xuất hiện của kháng thể kháng tiểu cầu sau khi nhiễm virus Dengue, bắt đầu
từ ngày thứ 4 và duy trì trong 2-3 tuần. Mô hình này có thể được sử dụng để nghiên
cứu cơ chế bệnh sinh, đặc biệt là quá trình hoạt hóa miễn dịch trong nhiễm virus gây
sốt xuất huyết [34].
1.2.3.2. Phương pháp chiếu xạ ion hóa
Một phương pháp khác để giảm tiểu cầu ở động vật là chiếu xạ [19], [22], [62].
Cường độ và thời gian chiếu xạ phải được điều chỉnh một cách thận trọng để gây giảm
tiểu cầu mà không gây ra độc tính quá mức dẫn đến tử vong. Số lượng tiểu cầu thấp nhất
xuất hiện từ 8 đến 14 ngày sau khi chiếu xạ. Giảm bạch cầu thường xảy ra vài ngày sau
khi chiếu xạ và thường xuất hiện trước khi tiểu cầu bắt đầu giảm [18].
1.2.3.3. Giảm tiểu cầu do heparin
Trước khi các kỹ thuật chuyển gen được sử dụng để chuyển các gen đặc hiệu của
người sang động vật, rất khó mô phỏng giảm tiểu cầu do heparin (HIT) trên động vật.
Hoạt hóa tiểu cầu bởi các kháng thể HIT thường xảy ra thông qua các thụ thể FcγRIIA
trên tiểu cầu. Tuy nhiên, nhiều loài động vật, bao gồm cả chuột, thiếu thụ thể này. Hơn
nữa, kháng thể HIT của người nhận có phản ứng chéo rất yếu với phức hợp yếu tố 4
tiểu cầu - heparin. Mặc dù vậy vẫn có những nghiên cứu đã gây giảm tiểu cầu thành
công trên chuột không biến đổi gen bằng cách tiêm kháng thể kháng PF4/heparin từ
huyết thanh bệnh nhân [18].
Phát triển một mô hình động vật có chứa các yếu tố cần thiết cho HIT trở nên dễ
dàng hơn với việc sử dụng chuột chuyển gen. Các dòng chuột chuyển gen khác nhau
biểu hiện FcγRIIA tiểu cầu hoặc PF4 của người được lai tạo để tạo ra những chuột
chuyển gen kép biểu hiện cả hai kháng nguyên này. Khi những động vật này được
tiêm KKO, một kháng thể đơn dòng hoạt hóa tiểu cầu nhận diện phức hợp PF4/heparin
của người, đã ghi nhận sự giảm số lượng tiểu cầu và các biến cố huyết khối [18].
15
1.3. Đu đủ
Đặc điểm thực vật
Cây đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn, họ đu đủ (Caricaceae). Cây
nhỏ hoặc cây nhỡ, cao 2 - 4 m. Thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều vết sẹo do
cuống lá rụng để lại. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống rất dài, xẻ 5 - 7 thùy
sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều,
gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [1].
Đu đủ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ song nguồn gốc xuất hiện các
giống trồng trọt vẫn chưa được rõ ràng. Đu đủ chủ yếu được trồng ở các nước vùng
nhiệt đới, một số nước trồng đu đủ nhiều như Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan,
Philippin, Mianma, Malaixia (châu Á); Tazania, Uganda (châu Phi); Braxin, Equado,
Hoa Kỳ (châu Mỹ); Úc, Niuzilan (châu Đại Dương) [13].
Ở Việt Nam, đu đủ là cây trồng khá lâu đời và chưa xác định được cụ thể thời
gian cây được nhập vào. Đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam.
Tuy nhiên chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên
các loại đất phù sa. Những vùng trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hà Nam, Hưng Yên,
Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Lái Thiêu, Tiền Giang, các tỉnh Tây Nguyên … [13].
Các bộ phận của cây đu đủ (quả, hoa, lá, rễ, nhựa từ quả) được dùng với nhiều
mục đích khác nhau.
Tình hình nghiên cứu trong nước
1.3.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ
Cho đến nay ở nước ta đã có một số công bố về các chất có trong lá đu đủ
Alkaloid carpain: năm 1983, Nguyễn Tường Văn và cộng sự đã chiết xuất và xác định
được alkaloid carpain trong lá đu đủ [14]. Năm 2014, Hồ Thị Hà xác định được alkaloid
mới từ lá đu đủ là carpainon, ngoài ra hai hợp chất danielon và apocynol A lần đầu tiên
được tách ra từ lá đu đủ [6].
Carotenoid: năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC để xác định
thành phần một số carotenoid (beta-caroten, lutein, lycopen) có trong lá đu đủ. Kết quả
cho thấy hàm lượng % beta-caroten, lutein tương ứng là 57,059% và 11,864% so với
tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopen trong lá đu đủ [11].
Triterpen: năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết
16
