Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.71 MB, 56 trang )

BỘ Y TẾ
s
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THÚY HẰNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN
CỦA SILYMARIN HỆ TỰ NHŨ HÓA
SIÊU BÃO HÒA TRÊN MÔ HÌNH GÂY
ĐỘC GAN CẤP BẰNG CCl4
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ THÚY HẰNG
MÃ SINH VIÊN: 1301131

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN
CỦA SILYMARIN HỆ TỰ NHŨ HÓA
SIÊU BÃO HÒA TRÊN MÔ HÌNH GÂY
ĐỘC GAN CẤP BẰNG CCl4
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thùy Dương
2. Ths. Phạm Đức Vịnh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực

HÀ NỘI
2 - 2018

LỜI CẢM ƠN
Bằng tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới PGS.TS. Nguyễn Thùy Dương, Ths. Phạm Đức Vịnh, PGS.TS. Nguyễn Hoàng
Anh - Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, luôn quan tâm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Thạch Tùng, Bộ môn Bào chế, trường Đại học
Dược Hà Nội đã góp ý và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Đinh Đại Độ, kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực đã trực
tiếp tham gia và giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu.
Em xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các thầy, cô giáo trong Bộ môn Dược lực, trường Đại
học Dược Hà Nội đã truyền thụ cho em những bài học quý báu, giúp đỡ, tạo điều kiện
thuận lợi cho em được học tập và nghiên cứu tại bộ môn.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong
thời gian em học tập tại trường.
Em xin cảm ơn các anh chị, bạn bè đã và đang nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược
lực và Bộ môn Bào chế đã luôn đồng hành, hỗ trợ, động viên để em hoàn thành khóa
luận. Cuối cùng, em xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè
đã luôn bên cạnh, ủng hộ và là chỗ dựa tinh thần khi em gặp khó khăn trong học tập
cũng như trong cuộc sống.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Phan Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Thông tin chung về silymarin ................................................................................3
1.1.1. Thành phần và cấu trúc hóa học của silymarin .....................................................3
1.1.2. Tác dụng dược lý của silymarin ............................................................................4
1.1.3. Đặc điểm sinh dược học và dược động học ..........................................................5
1.1.4. Các phương pháp cải thiện sinh khả dụng của silymarin ......................................6
1.2. Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa ...................................................................................8
1.2.1. Khái niệm hệ tự nhũ hóa và hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa .......................................8
1.2.2. Thành phần của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa ..........................................................9
1.2.3. Cơ chế hấp thu và cải thiện sinh khả dụng đường uống của hệ tự nhũ hóa siêu bão
hòa .................................................................................................................................10
1.3. Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 ...................................................................12
1.3.1. Cơ chế gây độc gan cấp bằng CCl4 .....................................................................12
1.3.2. Lựa chọn điều kiện thí nghiệm để triển khai mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4
.......................................................................................................................................13
1.3.3. Các thông số đánh giá..........................................................................................13
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................15
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................................15
2.1.1. Chế phẩm thử.......................................................................................................15
2.1.2. Động vật thí nghiệm ............................................................................................15
2.1.3. Hóa chất thuốc thử ...............................................................................................16
2.1.4. Thiết bị nghiên cứu ..............................................................................................16
2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................................16

2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................17
2.3.1. Khảo sát mức liều có tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS trên mô hình gây độc
gan cấp bằng CCl4 .........................................................................................................17

2.3.2. So sánh tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và Legalon ® trên mô hình gây độc
gan cấp bằng CCl4. ........................................................................................................19
2.4. Phương pháp xác định các thông số nghiên cứu ...............................................20
2.4.1. Hoạt độ AST và ALT huyết thanh ......................................................................20
2.4.2. Hàm lượng MDA trong gan ................................................................................20
2.4.3. Hàm lượng GSH trong gan ..................................................................................21
2.4.4. Hoạt độ SOD trong gan. ......................................................................................22
2.5. Xử lý số liệu. ..........................................................................................................23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ..............................................................................................25
3.1. Kết quả xác định mức liều có tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS trên mô
hình gây độc gan cấp bằng CCl4 ................................................................................25
3.1.1. Ảnh hưởng của S-SMEDDS đến hoạt độ AST và ALT huyết thanh của chuột được
gây hoại tử gan bằng CCl4 .............................................................................................25
3.1.2. Ảnh hưởng của S-SMEDDS đến hàm lượng MDA trong huyết thanh của chuột
được gây hoại tử gan bằng CCl4 ....................................................................................26
3.2. Tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS so với Legalon® trên mô hình gây độc
gan cấp bằng CCl4. ......................................................................................................28
3.2.1. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đối chiếu Legalon ® đến hoạt độ AST
và ALT huyết thanh của chuột được gây hoại tử gan bằng CCl4 ..................................28
3.2.2. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đối chiếu Legalon ® đến hàm lượng
MDA trong gan của chuột được gây hoại tử gan bằng CCl4. ........................................29
3.2.3. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đối chiếu Legalon ® đến hàm lượng
GSH trong gan của chuột được gây hoại tử gan bằng CCl4 ..........................................31
3.2.4. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và chế phẩm đối chiếu Legalon® đến hoạt độ SOD
trong gan của chuột được gây hoại tử gan bằng CCl4 ...................................................32

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................34
4.1. Về kết quả thăm dò mức liều có tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ
hóa siêu bão hòa trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4.....................................34
4.2. Về kết quả tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa so
với Legalon® trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 ..........................................35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT

Alanin amino transferase

AST

Aspartat amino transferase

CCl4

Carbon tetraclorid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DMF

Dimethylformamid

DTNB

5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)

GSH

Glutathion dạng khử

kl/tt

Khối lượng/thể tích

MDA

Malondialdehyd

NaCMC

Natri carboxymethyl cellulose

SOD

Superoxid dismutase

S-SMEDDS

Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin

SMEDDS

Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa

THF

Tetrahydrofuran

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Công thức bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin [5] ..............15

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Các thành phần chính của silymarin: silibinin A (1a), silibinin B (1b),
isosilibinin A (1c), isosilibinin B (1d), silychristin A (1e), silydianin (1f) và taxifoli (1g)
[11]...................................................................................................................................3
Hình 1.2. Các dẫn chất thân nước từ vi sinh vật của silibinin [62]. ...............................8
Hình 1.3. Vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết và tĩnh mạch cửa [63] .......................11
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu .............................................................................17
Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế thí nghiệm khảo sát mức liều có tác dụng bảo vệ gan của SSMEDDS trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4. ....................................................18
Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế thí nghiệm so sánh tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và
Legalon® trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 ......................................................20
Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric.........................21
Hình 2.5. Sơ đồ phản ứng tạo phức giữa GSH và DTNB ............................................22
Hình 2.6. Sơ đồ phản ứng khử của anion superoxid và NBT .......................................23
Hình 3.1. Ảnh hưởng của S-SMEDDS ở các mức liều khác nhau đến hoạt độ AST và
ALT huyết thanh chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 .......................................25
Hình 3.2. Ảnh hưởng của S-SMEDDS ở các mức liều khác nhau đến hàm lượng MDA
trong gan chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 ...................................................27
Hình 3.3. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và Legalon® ở các mức liều khác nhau đến hoạt
độ AST, ALT trong huyết thanh chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 ...............28

Hình 3.4. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và Legalon ® ở các mức liều khác nhau đến hàm
lượng MDA trong gan chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 ..............................30
Hình 3.5. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và Legalon® ở các mức liều khác nhau đến hàm
lượng GSH trong gan chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 ................................31
Hình 3.6. Ảnh hưởng của S-SMEDDS và Legalon® ở các mức liều khác nhau hoạt độ
SOD trong gan chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 ..........................................32

ĐẶT VẤN ĐỀ
Silymarin là hỗn hợp các flavonoid được phân lập từ cây Kế sữa (Silybum
marianum, L. Gaertn), đã được sử dụng trên lâm sàng với mục đích điều trị một số rối
loạn chức năng gan như viêm gan nhiễm độc, bệnh gan do rượu, viêm gan virus…[25],
[68]. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của silymarin thường không ổn định do tính thấm và
khả năng hòa tan trong nước kém [33], [70]. Để cải thiện độ hòa tan cũng như tăng hấp
thu đường uống của silymarin, một số giải pháp khác nhau đã được áp dụng bao gồm
tạo phức hợp silibinin-phosphatidylcholin, liposome, hệ tự nhũ hóa và hệ tự nhũ hóa
siêu bão hòa (SMEDDS). Trong đó, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa được chú ý hơn cả do
có độ nhớt thấp và có tính ổn định về nhiệt động học, động lực học [41].
Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa (SMEDD) là một hệ giao thuốc đường uống chứa chất
mang lipid, có thể làm tăng sinh khả dụng của các thuốc khó tan trong nước thông qua
nhiều cơ chế khác nhau như cải thiện độ tan, tăng tính thấm qua niêm mạc đường tiêu
hóa và tăng cường vận chuyển thuốc vào hệ thống bạch huyết [40]. Những ưu điểm này
được dự đoán có thể cải thiện khả năng hấp thu và tăng hiệu quả điều trị của một dược
chất khó tan trong nước và có hiệu ứng qua gan bước một mạnh như silymarin. Kết quả
thực tế cho thấy, một số nhóm nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng thành công hệ sự nhũ
hóa để làm tăng khả năng giải phóng, hòa tan và hấp thu silymarin [22], [39]. Tuy nhiên,
mối tương quan giữa cải thiện sinh khả dụng in vitro và in vivo với tác dụng bảo vệ gan
của hệ tự nhũ hóa chứa silymarin chưa được chứng minh trong những nghiên cứu này.
Với mục đích phát triển một dạng bào chế mới ưu việt hơn so với các dạng bào
chế quy ước trên thị trường hiện nay, nhóm nghiên cứu thuộc Bộ môn Bào chế, Trường

Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành xây dựng và tối ưu hóa công thức của hệ tự nhũ hõa
siêu bão hòa chứa silymarin (S-SMEDDS). Các kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy
S-SMEDDS làm tăng tỷ lệ khuếch tán dược chất qua túi thẩm tích trong nghiên cứu giải
phóng in vitro và cải thiện rõ rệt sinh khả dụng trên thỏ, trong đó AUC của dược chất
chính silibinin tăng khoảng 10 lần so với biệt dược tham chiếu [5]. Tuy nhiên, do đặc
tính dược động học đặc biệt của silymarin với mức độ tích lũy cao tại hệ thống gan –
mật và chu kì gan – ruột kéo dài, cũng như những hạn chế về phương pháp định lượng,
sự tăng nồng độ thuốc đo được trong máu chưa thể dự đoán chính xác tác dụng bảo vệ
gan của dạng bào chế này. Do đó, để đánh giá mức độ cải thiện tác dụng dược lý của S1

SMEDDS, đề tài “Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu
bão hòa trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4” được thực hiện với hai mục tiêu:
1 Xác định mức liều có tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão
hòa trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4.
2 So sánh tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa và
Legalon® trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Thông tin chung về silymarin
1.1.1. Thành phần và cấu trúc hóa học của silymarin
Silymarin là hỗn hợp đồng phân của phức hợp flavonoid – flavonolignan, chiếm
1,5-3% trọng lượng khô của cây kế sữa [7]. Thành phần của silymarin bao gồm silibinin,
isosilibinnin, silychristin, isosilychristin, silydianin, silimonin và các thành phần khác
như các flavonoid, acid béo, tocopherol, sterol và protein. Trong đó, silibinin là thành
phần chính (chiếm khoảng 50-70% silymarin toàn phần) và có hoạt tính sinh học mạnh
nhất [12], [25].

Hình 1.1. Các thành phần chính của silymarin: silibinin A (1a), silibinin B (1b),
isosilibinin A (1c), isosilibinin B (1d), silychristin A (1e), silydianin (1f) và taxifoli (1g)
[11]
Cấu trúc của silibinin bao gồm hai đơn vị chính: taxifolin – một loại flavononol và
conyferil alcol, hai đơn vị này được liên kết với nhau bởi một vòng oxeran. Do cấu trúc
bao gồm các nhóm chức dị vòng và carbon mạch vòng xen kẽ nhau nên silibinin có tính
kị nước [11]. Các nhóm OH trong cấu trúc silibinin có dải pKa rộng (pKa = 6,63 cho
nhóm 5 – OH, pKa = 7,7 – 7,95 cho nhóm 7 – OH và pKa = 11 cho nhóm 20 – OH) dẫn
tới khả năng ion hóa kém của hoạt chất này [12], [64].
3

Do silibinin có cấu trúc hóa học cồng kềnh và khả năng ion hóa kém, độ tan của
silibinin tương đối thấp. Hoạt chất này không tan trong dung môi không phân cực như
chloroform và ether dầu hỏa, ít tan trong dung môi phân cực như ethanol và methanol,
nhưng tan nhiều hơn trong dung môi phân cực phi proton như dimethyl sulfoxid
(DMSO), axeton, dimethylformamid (DMF) và tetrahydrofuran (THF) [12].
1.1.2. Tác dụng dược lý của silymarin
Nhiều nghiên cứu trên động vật cho thấy, silymarin thể hiện tác dụng bảo vệ gan
trên chuột khi sử dụng các tác nhân gây độc như: ethanol, carbon tetrachlorid,
paracetamol… [61], [58], [47].
Silymarin giúp ổn định màng tế bào và ngăn các tác nhân gây độc xâm nhập vào
gan thông qua ức chế sự gắn kết của các tác nhân gây độc với các thụ thể trên màng tế
bào, qua đó làm giảm tổn thương tế bào gan do tác nhân gây độc gây ra [48], [57].
Hơn nữa, tác dụng bảo vệ gan của silymarin cũng có thể giải thích thông qua khả
năng chống lại các tác nhân gây độc. Silymarin làm giảm tình trạng stress oxy hóa bao
gồm ức chế quá trình peroxyd hóa lipid và tăng cường dự trữ các tác nhân chống oxy
hóa nội sinh tế bào gan (tăng dự trữ glutathion dạng khử và hoạt độ của enzym superoxid
dismutase) [53], [19].

Ngoài ra, silymarin cũng giúp tái tạo lại tế bào gan nhờ khả năng làm tăng tổng
hợp protein bằng cách hoạt hóa ARN polymerase I và tăng phiên mã rARN. Tuy nhiên,
quá trình này chỉ xảy ra ở trên tế bào gan bị tổn thương, mà không xảy ra trên các tế bào
gan lành [44], [19].
Bên cạnh đó, tình trạng xơ hóa ở gan cũng được cải thiện nhờ sử dụng silymarin
thông qua ức chế sự chuyển hóa của tế bào hình sao (Stellate cell) chuyển thành nguyên
bào sợi cơ (myofibroblasts) - nguyên nhân chủ yếu dẫn tới lắng đọng collagen ở gan dẫn
tới tình trạng xơ gan. Nghiên cứu đánh giá tác dụng cải thiện tình trạng xơ hóa của
silymarin cho thấy, khi nồng độ silibinin trong máu là 100 µmol/l, sự nhân lên của các
tế bào hình sao trên gan chuột giảm khoảng 75%, giảm lượng nguyên bào sợi được hình
thành, dẫn tới giảm xơ gan [20].
Bên cạnh tác dụng bảo vệ gan, silymarin có tính chống oxy hóa mạnh, tham gia
vào các quá trình truyền tín hiệu tế bào, ức chế hình thành chất trung gian gây viêm.
Ngoài ra, silymarin cũng được nghiên cứu theo định hướng điều trị ung thư và ức chế
4

thụ thể serin protease tham gia vào quá trình đông máu cũng như đáp ứng của tiểu cầu
đối với các chất chủ vận nội sinh [12].
1.1.3. Đặc điểm sinh dược học và dược động học
Do silymarin là một polyphenol có cấu trúc hóa học cồng kềnh và khả năng ion
hóa kém nên độ tan của silymarin trong nước rất thấp (độ tan trong nước của silibinin,
thành phần chính của silymarin, nhỏ hơn 50 µg/ml) và phụ thuộc nhiều vào pH [71]. Độ
tan trong nước kém nên khi uống các dạng bào chế quy ước, nồng độ của silymarin trong
máu thường thấp. Nghiên cứu của Lorenz và cộng sự là một trong những nghiên cứu
đầu tiên về dược động học của silymarin, 6 người tình nguyện khỏe mạnh sau khi sử
dụng silymarin dạng bào chế quy ước đường uống thì nồng độ đỉnh của silymarin trong
huyết thanh thấp và dao động [42]. Độ tan trong nước thấp là một trong các nguyên nhân
dẫn tới sinh khả dụng của silymarin thường thấp và không ổn định [71],
Sau khi uống, silymarin được hấp thu nhanh tại đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh

sau khoảng 2 – 4 giờ và thời gian bán thải của silymarin khoảng 6 giờ [33], [41]. Khoảng
2 – 3% lượng silymarin liên hợp với acid glucuronic được tái hấp thu vào tuần hoàn
chung nhờ chu kì gan – ruột [12], [19].
Thành phần chính và có hoạt tính mạnh nhất của silymarin là silibinin được phân
bố trong ở các cơ quan như gan, phổi, dạ dày, tuyến tụy, da và tuyến tiền liệt với lượng
silibinin tối đa trong các mô tương ứng là 8,8; 4,3; 123; 5,8; 1,4 và 2,5 µg/g mô khi sử
dụng với mức liều 50 mg/kg sau khoảng 0,5 giờ [72].
Silibinin, thành phần chính của silymarin, được chuyển hóa qua 2 pha: pha I và
pha II. Trong pha I, silibinin chuyển hóa qua một số cytocrom (CYP) nhất định. Sử dụng
phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Jancova và cộng sự đã chứng minh silibinin được chuyển
hóa in vitro qua CYP2C8 chủ yếu tạo thành O – demethylat silibinin, một phần nhỏ
monohydroxysilibinin và dihydroxysilibinin [12].
Tuy nhiên, silymarin được chuyển hóa chủ yếu ở pha II tạo thành các dạng liên
hợp với acid glucoronic và dạng liên hợp sulfat [33]. Các dạng liên hợp của silymarin
chiếm khoảng 90% tổng lượng silymarin hấp thu trong máu được thải trừ qua mật và
khoảng ít hơn 5% liều của sillymarin được thải trừ qua nước tiểu dưới dạng còn nguyên
hoạt tính [12], [46]. Dạng liên hợp của silymarin được vận chuyển đến mật nhờ các
protein vận chuyển, tuy nhiên các protein này chưa được xác định rõ ràng. Trong các
5

protein vận chuyển, Mrp2 đóng vai trò vận chuyển các anion hữu cơ và các chất
polyphenol đến mật [43]. Trong cấu trúc có 3 nhóm OH ở các vị trí 5, 7 và 20, silymarin
cũng được xem như là một polyphenol, do đó có tác giả hướng tới giả thuyết có thể
Mrp2 tham gia vận chuyển các dạng liên hợp của silymarin [29]. Nghiên cứu của Sonia
R. Miranda và cộng sự cho thấy sự thải trừ các dạng liên hợp của flavonolignan trong
silymarin qua mật giảm 80 – 92%, trong đó thải trừ dạng liên hợp glucuronid và sulfat
của các flavonolignans trong silymarin giảm tương ứng khoảng 94 – 98% và 73 – 84%
khi ức chế hoạt động của Mrp2. Như vậy, Mrp2 đóng vai trò quan trọng trong vận
chuyển các dạng liên hợp của silymarin để thải trừ qua mật trong đó dạng liên hợp với

acid glucoronid chiếm ưu thế [36], [69]. Hiệu ứng qua gan bước một mạnh được cho là
nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sinh khả dụng đường uống của silymarin thấp [12].
1.1.4. Các phương pháp cải thiện sinh khả dụng của silymarin
Silymarin đã được sử dụng để điều trị một số rối loạn chức năng gan, tuy nhiên độ
tan trong nước kém và hiệu ứng qua gan bước một mạnh khiến sinh khả dụng thấp và
dao động, dẫn tới hiệu quả điều trị thường không ổn định [25]. Để cải thiện sinh khả
dụng của silymarin, có nhiều biện pháp đã được nghiên cứu và áp dụng bao gồm tạo hệ
mang thuốc và biến đổi cấu trúc hóa học của silymarin.
 Tạo hệ mang thuốc
Liposome, phytosome, và hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa là các hệ mang thuốc có thể
sử dụng để cải thiện sinh khả dụng của silymarin.
Liposome là hệ mang thuốc bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một
vỏ phospholipid cấu tạo bởi một hoặc nhiều lớp màng kép của các phân tử phospholipid,
được sử dụng làm tăng độ tan của các dược chất ít tan trong nước [1]. El-Samaligy và
cộng sự đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan của liposome chứa silymarin trên mô hình gây
độc gan cấp bằng CCl4 cho kết quả làm giảm đáng kể hoạt độ AST và ALT và cải thiện
mô bệnh học của nhóm được điều trị bằng liposome chứa silymarin so với dạng bào chế
quy ước [18].
Khác với liposome được tạo từ nhiều phân tử phospholipid, phytosome là hệ mang
thuốc tạo bởi phức hợp giữa dược chất với một vài phân tử phospholipid tự nhiên.
Nghiên cứu của Barzaghi và cộng sự cho thấy trên người tình nguyện khỏe mạnh sử
dụng Silipide (IdB 1016) – phytosome chứa silymarin làm tăng sinh khả dụng đường
6

uống và nồng độ đỉnh trong huyết tương cao gấp nhiều lần so với silymarin dạng bào
chế quy ước [10].
Gần đây, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa là hệ mang thuốc thường được ứng dụng nhiều
để tăng sinh khả dụng của dược chất khó tan trong nước như silymarin. Thành phần của
hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa bao gồm các loại dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt và

polyme. Khi tiếp xúc với dịch tiêu hóa, hệ nhanh chóng được nhũ hóa tạo các giọt nhũ
tương dầu/nước có kích thước nhỏ, làm tăng diện tích hấp thu, dẫn tới tăng độ tan của
thuốc, từ đó làm tăng sinh khả dụng của dược chất. Ngoài ra, thành phần triglycerid có
mạch carbon dài giúp dược chất tăng vận chuyển qua hệ bạch huyết rồi đi vào tuần hoàn
chung, tránh chuyển hóa bước một qua gan, giúp cải thiện sinh khả dụng [51]. Nghiên
cứu của Li và cộng sự cho thấy sử dụng hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin làm
tăng đáng kể AUC0–12 h và Cmax so với dạng bào chế quy ước [41].
 Biến đổi cấu trúc hóa học
Ngoài cách sử dụng hệ mang thuốc, tạo dẫn chất thân nước cũng là một trong các
biện pháp làm tăng sinh khả dụng của silymain. Thêm vào đó, phương pháp này còn tạo
ra các dẫn chất có hoạt tính mạnh, ít tác dụng không mong muốn và có tác dụng chọn
lọc hơn [27].
Môt trong các hướng nghiên cứu tạo dẫn xuất thân nước của silymarin là liên kết
với nhóm glycosid tạo thành các phức hợp silibinin – glycosid, có độ tan trong nước cao
hơn 4 - 30 lần cũng như có tác dụng bảo vệ gan mạnh hơn silibinin ban đầu [37].
Ngoài ra, có thể sử dụng vi sinh vật để tạo ra các chất chuyển hóa mới có độ tan
trong nước cao hơn, cải thiện sinh khả dụng cũng như hiệu quả điều trị thông qua các
thông qua các phản ứng methyl hóa, acyl hóa, amino-acyl hóa… [62]. Nghiên cứu của
Abourashed và cộng sự (2012) sử dụng hai loại nấm men là Beauveria bassiana và
Cunninghamella sp. tạo ra các chất chuyển hóa mới của silibinin lần lượt là 8hydroxysilibinin và 2,3-dehydrosilibinin-7-sulfat có tác dụng dọn dẹp gốc tự do lần lượt
cao gấp 10 và 3 lần so với silibinin, tuy nhiên cấu trúc của 2,3-dehydrosilibinin-7-sulfat
khá cồng kềnh được thay đổi thành 2,3-dehydrosilibinin có hiệu quả gấp 25 lần so với
silibinin ban đầu [8].

7

Hình 1.2. Các dẫn chất thân nước từ vi sinh vật của silibinin [62].
Trong các hướng nghiên cứu làm tăng sinh khả dụng của silibinin, hệ tự nhũ hóa
siêu bão hòa cải thiện cả độ tan kém cũng như hiệu ứng qua gan bước một mạnh của

silymarin. Hơn thế nữa, chi phí và kĩ thuật bào chế của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa không
tốn kém và phức tạp so với các phương pháp cải thiện sinh khả dụng khác. Do đó, hệ tự
nhũ hóa siêu bão hòa là dạng bào chế tiềm năng giúp làm tăng sinh khả dụng của
silymarin.
1.2. Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa
1.2.1. Khái niệm hệ tự nhũ hóa và hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa
Hệ tự nhũ hóa là một hỗn hợp chứa các thành phần: dược chất, dầu, chất diện hoạt,
đồng diện hoạt. Hệ tự nhũ hóa là hệ lỏng, thường được đóng vào nang mềm hay nang

8

cứng để phân liều. Hệ có đặc điểm khi được pha loãng với nước dưới sự khuấy trộn nhẹ
nhàng sẽ tự nhũ hóa tạo thành nhũ tương [30], [52].
Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa là hệ mang thuốc có công thức được thay đổi từ hệ tự
nhũ hóa thông thường, chứa lượng chất diện hoạt giảm đi và thêm polyme ức chế tái kết
tinh nhằm mục đích tạo ra và duy trì trạng thái siêu bão hòa của dược chất khi nhũ hóa
với nước [24].
Ở trạng thái siêu bão hòa, nồng độ dược chất trong nhũ tương cao hơn đáng kể giới
hạn độ tan bão hòa, cho phép tăng tốc độ và mức độ hấp thu dược chất [22].
1.2.2. Thành phần của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa
Công thức bào chế của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa bao gồm: dược chất, pha dầu,
chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt và polyme.
Các dược chất sử dụng hệ tự nhũ hóa siêu bão để khắc phục sinh khả dụng là các
chất có độ tan trong nước thấp.
Trong công thức, dầu là một thành phần tá dược quan trọng, đóng vai trò hòa tan
dược chất khó tan trong nước và làm tăng hấp thu thuốc qua đường uống [51]. Hệ tự
nhũ hóa siêu bão hòa thường sử dụng pha dầu là các triglycerid. Các triglycerid được
lựa chọn dựa trên khả năng làm tăng độ tan cũng như vận chuyển dược chất qua hệ bạch
huyết. Trong các loại triglycerid, triglycerid mạch trung bình có khả năng hòa tan dược

chất tốt hơn [30]. Mặt khác, sử dụng các triglycerid mạch dài làm tăng khả năng vận
chuyển thuốc qua hệ bạch huyết rồi đi vào vòng tuần hoàn chung mà không qua gan,
tránh bị chuyển hóa bước một qua gan, giúp cải thiện sinh khả dụng [51].
Chất diện hoạt được sử dụng với mục đích tạo lớp màng bao quanh pha dầu làm
giảm sức căng bề mặt, giúp cho quá trình tự nhũ hóa diễn ra dễ dàng hơn [52], [24]. Hệ
tự nhũ hóa siêu bão hòa dùng lượng chất diện hoạt ít hơn so với hệ tự nhũ hóa, qua đó
hạn chế tác dụng phụ trên đường tiêu hóa [24]. Các chất diện hoạt thường được sử dụng
là chất diện hoạt không ion hóa do chúng có độc tính thấp. Ngoài ra, hệ còn sử dụng
thêm chất đồng diện hoạt làm tăng tính linh hoạt của bề mặt phân cách tăng hiệu suất
của quá trình nhũ hóa.
Polyme là thành phần quan trọng nhất trong công thức, được sử dụng để ức chế tái
kết tinh dược chất nhằm tạo ra và duy trì trạng thái siêu bão hòa mà không cần dùng
nồng độ cao các chất diện hoạt, thông qua cơ chế ức chế quá trình tạo mầm và lớn lên
9

của tinh thể bằng cách hấp phụ lên trên bề mặt, từ đó làm tăng tốc độ và mức độ hấp thu
dược chất so với hệ tự nhũ hóa thông thường, đồng thời, hạn chế tác dụng phụ của chất
diện hoạt trên đường tiêu hóa [22].
1.2.3. Cơ chế hấp thu và cải thiện sinh khả dụng đường uống của hệ tự nhũ hóa siêu
bão hòa
Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa làm tăng sinh khả dụng của các chất khó tan, nhờ làm
tăng độ tan cũng như khả năng vận chuyển dược chất qua hệ bạch huyết [39].


Cơ chế làm tăng độ tan của hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa
Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa giúp tăng tốc độ và mức độ hấp thu so với hệ tự nhũ

hóa thông qua 3 con đường: nhũ hóa tạo nhũ tương, khuếch tán thụ động trong pha nước
và phân bố vào micell với acid mật [15], [23], [24].

 Con đường nhũ hóa tạo nhũ tương: hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa được pha loãng
với nước tạo thành các giọt nhũ tương và hấp thu trực tiếp vào tế bào hấp thu ruột.
 Con đường khuếch tán thụ động: dược chất ở dạng tự do được khuếch tán thu
động vào biểu mô ruột nhờ sự chênh lệch nồng độ giữa hai bên màng.
 Con đường phân bố vào micell với acid mật: dược chất tự do được phân bố vào
trong micell của acid mật và nhờ micell vận chuyển tới tế bào hấp thu ruột.
So với hệ tự nhũ hóa, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa không những làm tăng sự hấp
thu dược chất tới tế bào ruột, mà còn làm tăng nồng độ thuốc dạng tự do sau khi pha
loãng so với hệ tự nhũ hóa nhờ sự có mặt của polyme ức chế tái kết tinh. Nồng độ ở
dạng tự do cao hơn đem lại nhiều lợi ích như: tăng khuếch tán thụ động tới tế bào hấp
thu ruột nhiều hơn (do chênh lệch gradient nồng độ lớn hơn) và phân bố vào micell của
acid mật cao hơn, từ đó vận chuyển nhiều dược chất tới tế bào hấp thu ruột [24]. Như
vậy, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa đã khắc phục nhược điểm về độ tan trong nước của
silymarin.


Cơ chế làm tăng vận chuyển dược chất qua hệ bạch huyết
Tuy nhiên, ngoài đặc điểm về độ tan, hiệu ứng qua gan bước một mạnh cũng là

nguyên nhân dẫn tới sinh khả dụng đường uống của silymarin thấp và dao động. Một
trong các biện pháp khắc phục nhược điểm này của silymarin là tăng vận chuyển qua hệ
bạch huyết không cần qua gan, dẫn tới làm tăng sinh khả dụng đường uống [40]. Hấp
thu thuốc qua đường bạch huyết cũng là yếu tố quan trọng làm tăng sinh khả dụng của
10

một số thuốc có hiệu ứng qua gan bước một mạnh như ontazolast…[29]. Hiện tại, cơ
chế vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết chưa được sáng tỏ, tuy nhiên một số tác giả
cho rằng dược chất vận chuyển qua hệ bạch huyết nhờ liên kết với triglycerid [54], [63].
Hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa sử dụng triglycerid có mạch carbon dài làm tăng khả

năng vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết không qua gan, giúp cải thiện sinh khả dụng
[51]. Cơ chế vận chuyển thuốc qua hệ bach huyết nhờ liên kết với triglycerid diễn ra
như sau: Sau khi được hấp thu qua tế bào biểu mô ruột, dược chất có thể đi qua tĩnh
mạch cửa về gan hoặc được vận chuyển nhờ hệ bạch huyết. Phần lớn các chất sẽ được
hấp thu vào tĩnh mạch cửa vì lưu lượng máu qua tĩnh mạch cửa cao gấp 500 lần so với
hệ bạch huyết. Tuy nhiên, lipoprotein (LP) được tạo thành từ triglycerid (TG) và dược
chất (D) sẽ được hấp thu chọn lọc vào hệ bạch huyết, do kích thước của chúng ngăn cản
sự khuếch tán thụ động qua tĩnh mạch cửa [38] (hình 1.3).

Hình 1.3. Vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết và tĩnh mạch cửa [63]
Liên kết với triglycerid giúp tăng cường vận chuyển thuốc qua hệ bạch huyết
nhưng chỉ có các triglycerid ngoại sinh mới tham gia vào quá trình này, trong đó các
triglycerid có mạch carbon dài cho hiệu suất cao hơn [63]. Khi được vận chuyển qua hệ
bạch huyết rồi đi vào tuần hoàn chung, dược chất sẽ tránh bị chuyển hóa bước một qua
gan qua đó cải thiện sinh khả dụng [51].

11

Như vậy, hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa đã khắc phục hai nhược điểm dẫn tới sinh
khả dụng đường uống của silymarin thấp là độ tan trong nước kém và có hiệu ứng qua
gan bước một mạnh.
1.3. Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4
1.3.1. Cơ chế gây độc gan cấp bằng CCl4
Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 vẫn là một trong những mô hình được sử dụng
phổ biến nhất để đánh giá tác dụng bảo vệ gan của nhiều tác nhân khác nhau trong đó
có silymarin [31], [49], [65].
Trong cơ thể, CCl4 được chuyển hóa phần lớn qua CYP2E1 và một phần nhỏ qua
CYP2B1, CYP2B2, CYP3A4 thành gốc tự do tricloromethyl (CCl3*) [9], [49], [65]. Gốc
tự do CCl3* gây tổn thương gan thông qua hai con đường chính là haloalkyl hóa và

peroxy hóa lipid, tương ứng với hai con đường này là hai cơ chế: liên kết cộng hóa trị
trực tiếp vào các phân tử quan trọng và peroxy hóa lipid. Cả hai cơ chế này đều gây tổn
thương tế bào gan và cuối cùng dẫn đến chết tế bào.
Cơ chế peroxy hóa lipid: Với sự có mặt của oxy, gốc tự do CCl3* phản ứng với oxy
tạo ra gốc tự do tricloromethylperoxy (CCl3OO*) [49], [67]. CCl3OO* khơi mào phản
ứng dây chuyền của peroxy hóa lipid dẫn đến tấn công và phá hủy các acid béo chưa
bão hòa, đặc biệt là những acid béo liên quan đến phospholipid màng tế bào. Quá trình
này làm thay đổi tính thấm của ty thể, lưới nội chất và màng tế bào, hậu quả là gây mất
cân bằng Ca++ nội môi và tổn thương tế bào. Sản phẩm thoái hóa của các acid béo là các
aldehyd hoạt động, đặc biệt là 4-hydroxynonenal, có thể liên kết với các nhóm chức
năng của protein dẫn đến ức chế hoạt động của các enzym quan trọng như Ca2+-ATPase,
Na+,K+-ATPase, phosphatase, protein kinase [45], [67].
Cơ chế liên kết cộng hóa trị: Gốc tự do CCl3* có thể liên kết cộng hóa trị với các
phân tử (như acid nucleic, protein, lipid) làm rối loạn chuyển hóa lipid và dẫn đến thoái
hóa mỡ. Sản phẩm hình thành giữa CCl3* và ADN (acid deoxyribonucleic) được xem
như tác nhân khơi mào ung thư gan [45].
Dựa trên các cơ chế gây tổn thương gan, có thể sử dụng mô hình gây độc gan cấp
bằng CCl4 để đánh giá khả năng cải thiện tổn thương gan gây ra bởi tác nhân này của
các chất chống oxy hóa, chất dọn gốc tự do và các chất ức chế enzym hoạt hóa.

12

1.3.2. Lựa chọn điều kiện thí nghiệm để triển khai mô hình gây độc gan cấp bằng
CCl4


Động vật thí nghiệm
Mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4 đã được tiến hành trên nhiều động vật thí

nghiệm trong đó sử dụng nhiều nhất là chuột nhắt [16], [65] và chuột cống [32], [49]


Đường dùng và liều gây độc của CCl4
Có nhiều đường dùng để gây tổn thương gan như đường tiêm màng bụng, đường

tiêm dưới da hoặc đường uống với nhiều mức liều rất khác nhau 0,02 ml/kg - 2 ml/kg
và có thể dùng đơn liều hoặc đa liều [14], [21], [32], [49]. Trong đó, đường tiêm màng
bụng là đường dùng phổ biến nhất. Đường dùng này có ưu điểm là gây tổn thương gan
ổn định hơn đường tiêm dưới da và có độ lặp lại cao [32].
Có những nghiên cứu gây tổn thương gan bằng cách tiêm màng bụng CCl4 đa liều
tuy nhiên cách gây độc này có nhược điểm tốn thời gian và tổng liều CCl4 rất cao [3],
[6], [34]. Trong khi đó, có nhiều nghiên cứu khác gây độc bằng cách tiêm màng bụng
CCl4 một liều duy nhất và với liều dùng thấp hơn (0,02 -2 ml/kg) làm giảm thời gian
gây độc cũng như mức độ phơi nhiễm CCl4 với môi trường [2], [50], [56].


Thời điểm lấy mẫu
Đa số các nghiên cứu tiến hành lấy mẫu để định lượng các thông số tại thời điểm

24 giờ sau gây độc tuy nhiên một số tác giả tiến hành lấy mẫu định lượng các thông số
sau 12 giờ, 36 giờ, 72 giờ … [21], [50].
Để phù hợp với điều kiện nghiên cứu trong nước, một nghiên cứu tối ưu hóa mô
hình gây độc gan cấp bằng CCl4 đã được thực hiện và đề xuất điều kiện triển khai mô
hình như sau: chuột nhắt trắng được tiêm màng bụng CCl4/dầu olive với thể tích 0,05
ml/kg (tương ứng với liều của CCl4 là 0,5ml/kg) tiến hành định lượng các thông số đánh
giá 24 giờ sau khi gây độc [4].
1.3.3. Các thông số đánh giá
Để đánh giá mức độ tổn thương gan do CCl4, các tác giả chủ yếu sử dụng hai nhóm
thông số: cách thông số trong huyết thanh và các thông số trong gan

Các thông số trong huyết thanh thường được sử dụng bao gồm: AST (aspartat
aminotransferase), ALT (alanin aminotransferase), LDH (lactat dehydrogenase), ALP
(phosphatase kiềm), bilirubin toàn phần, albumin, globulin, protein toàn phần [14], [47].
13

Trong đó, AST và ALT là hai thông số thường được sử dụng để đánh giá mức độ hoại
tử của tế bào gan. Khi tế bào gan bị tổn thương, AST và ALT được giải phóng vào máu
làm cho hoạt độ của chúng trong huyết thanh tăng lên. ALT được coi là đặc hiệu hơn
cho tổn thương gan so với AST do ALT phân bố nhiều ở gan, trong khi AST phân bố ở
tim nhiều hơn ở gan. Hoạt độ ALT và AST huyết thanh tăng rất cao phản ánh tổn thương
gan nghiêm trọng.
Các cơ chất, enzym trong gan thường được sử dụng để phản ảnh chức năng gan
bao gồm: MDA (malondialdehyd), SOD (superoxid dismutase), CAT (catalase), GSH
(glutathion), GST (glutathion- S- transferase), NO (Nitric oxyd), GPx (Glutathion
peroxidase),

succinat

dehydrogenase;

glucose-6-phosphatase;

cytocrom

P450;

phosphatase acid…. [14], [16], [49], [65].
Như đã trình bày ở trên, tổn thương gan do CCl4 chủ yếu liên quan đến hoạt động
của các gốc tự do (CCl3* và CCl3OO*). Các gốc tự do này gây phá hủy lipid màng tế

bào, làm thay đổi tính thấm của màng dẫn đến giải phóng các enzym AST, ALT trong
gan vào máu. Gốc tự do CCl3OO* được coi là tác nhân khơi mào phản ứng dây chuyền
của quá trình peroxy hóa lipid. Do đó, tăng hàm lượng MDA trong gan phản ánh quá
trình peroxy hóa lipid đang diễn ra mạnh mẽ. Sự hình thành của các gốc tự do là một
trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến độc tính của CCl4 trên gan. Các chất chống
oxy hóa nội sinh tế bào gan như SOD và GSH, có vai trò quan trọng cơ chế chống lại
các gốc tự do. Vì vậy, các thông số thường được dùng trong các nghiên cứu là hoạt độ
AST, ALT trong huyết thanh, hoạt độ SOD trong gan, hàm lượng MDA và GSH trong
gan [65], [26], [28].

14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Chế phẩm thử
- Chế phẩm thử là hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin (S-SMEDDS) với
thành phần công thức như sau:
Bảng 2.1. Công thức bào chế hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa chứa silymarin [5]
Thành phần

Khối lượng (mg)

Silymarin

70

Poloxame 407

50

Labrafil M

152

Cremophor RH40

76

Transcutol P

152

- Chế phẩm thử được bào chế như sau: Cân các thành phần gồm dược chất
(silymarin), pha dầu (Labrafil M), chất diện hoạt (Cremophor RH40), đồng diện hoạt
(Transcutol P) và trộn đều, sau đó đặt trên bể cách thủy ở 70oC và khuấy trộn liên tục
bằng thiết bị cánh khuấy trong khoảng 30 phút đến khi thu được một hệ trong suốt. Phân
tán tiếp poloxame 407 ức chế tái kết tinh vào hệ trên và khuấy liên tục đến khi tạo hỗn
hợp đồng nhất.
- Chế phẩm đối chiếu là viên nén bao đường Legalon® do công ty Meda Pharma
(Bỉ) sản xuất, số lô B1602454, hạn dùng 05/2019.
- Quy trình chuẩn bị hỗn dịch cho động vật uống như sau:
 S-SMEDDS được pha loãng với nước tạo thành nhũ tương dầu/nước có hàm
lượng thích hợp và sử dụng đường uống.
 Viên bao đường Legalon® được nghiền mịn, phân tán trong dung dịch
NaCMC (Natri carboxy methylcellulose) 0,5% tạo thành các hỗn dịch có
hàm lượng thích hợp và sử dụng theo đường uống.
 Liều của S-SMEDDS và Legalon® được tính dựa trên kết quả định lượng
hàm lượng silibinin thực tế trong mỗi chế phẩm.
2.1.2. Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống cái, trưởng thành, khỏe mạnh, khối lượng 25
– 30 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
15

Động vật thí nghiệm được nuôi ổn định 5 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu để
thích nghi với môi trường và điều kiện chăn nuôi phòng thí nghiệm. Trước và trong suốt
quá trình nghiên cứu, động vật thí nghiệm được cho ăn bằng thức ăn chuẩn do Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp, uống nước tự do, chu kì sáng tối được duy trì 12 giờ.
2.1.3. Hóa chất thuốc thử
- Carbon tetraclorid (tiêu chuẩn phân tích - Trung Quốc).
- Kit định lượng AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin aminotransferase)
(Biosystems, Tây Ban Nha).
- Tetramethoxypropan, acid thiobarbituric, 5,5′-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid,
xanh nitrotetrazolium clorid, xanthin oxidase (Sigma-Aldrich, Mỹ).
- Kali clorid, acid hydroclorid, acid acetic, n- butanol, acid sulfosalicylic, dinatri
hydrophotsphat, kali dihydrophotsphat (tiêu chuẩn phân tích - Trung Quốc).
2.1.4. Thiết bị nghiên cứu
- Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động TC – 3300 Plus (Teco diagnostics, Mỹ)
- Máy nghiền dịch đồng thể (Wisestir HS-30E, Mỹ)
- Máy ly tâm (Gilson GmClab, Mỹ)
- Máy ly tâm lạnh (Centrifuge 5702R, Mỹ)
- Máy ELISA (Biotek, Mỹ)
- Cân phân tích (Shimadzu AY 220, Nhật)
- Cân kĩ thuật (Precisa-BJ610C, TE 412, Sartorius)
- Đĩa Costar 3596 (Corning, Mỹ)
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để đánh giá tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS nghiên cứu được chia thành 2
nội dung chính bao gồm:
- Nghiên cứu khảo sát mức liều có tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS trên

mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4: Tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS trong khoảng
liều tương đương 5-50 mg/kg silibinin sẽ được đánh giá qua các thông số phản ánh mức
độ toàn vẹn của tế bào gan (AST và ALT) và mức độ stress oxy hóa tế bào gan (MDA).
Từ đó, lựa chọn mức liều phù hợp để so sánh tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và
chế phẩm đối chiếu Legalon®.

16

- Nghiên cứu so sánh tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và Legalon® trên
mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4: Dựa trên nghiên cứu thăm dò, tác dụng bảo vệ gan
của S-SMEDDS và Legalon® được đánh giá song song ở những mức liều tương đương.
Thông số đánh giá bao gồm mức độ hoại tử tế bào gan (đánh giá thông qua hoạt độ
AST, ALT huyết thanh) và tình trạng stress oxy hóa (đánh giá thông qua hàm lượng
MDA, GSH và hoạt độ SOD trong dịch nghiền đồng thể gan).
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu được thể hiện trong hình 2.1

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan
của S-SMEDDS

Xác định mức liều có tác dụng

So sánh tác dụng bảo vệ gan của

bảo vệ gan của S-SMEDDS

S-SMEDDS và Legalon®

Hoại tử tế bào
gan (AST và

ALT)

Stress oxy hóa
(MDA)

Hoại tử tế bào

Stress oxy hóa

gan (AST và

(MDA, GSH

ALT)

và SOD)

Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS và so sánh tác dụng bảo vệ
gan của S-SMEDDS và Legalon được thực hiện trên mô hình gây độc gan cấp, các điều
kiện thí nghiệm được thực hiện dựa trên nghiên cứu tối ưu hóa mô hình gây độc gan cấp
bằng CCl4 [4].
2.3.1. Khảo sát mức liều có tác dụng bảo vệ gan của S-SMEDDS trên mô hình gây
độc gan cấp bằng CCl4
Thiết kế thí nghiệm
Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên vào các lô

17

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của silymarin hệ tự nhũ hóa siêu bão hòa trên mô hình gây độc gan cấp bằng CCl4

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về