Ứng dụng nhựa macroporous trong tinh chế naringin từ cùi bưởi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
TRONG TINH CHẾ NARINGIN TỪ
CÙI BƯỞI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH TÂM
MÃ SINH VIÊN: 1301365

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
TRONG TINH CHẾ NARINGIN TỪ
CÙI BƯỞI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. TS. Bùi Thị Thúy Luyện
2. DS.NCS. Nguyễn Thanh Tùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Bùi Thị Thúy Luyện và
DS.NCS. Nguyễn Thanh Tùng - người thầy đã định hướng, trực tiếp hướng dẫn và chỉ
bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Hân và PGS.TS.
Nguyễn Thu Hằng đã luôn truyền động lực và tạo điều kiện cho tôi trên con đường
nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn DS. Trần Trọng Biên - người thầy, người anh đã luôn
quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi, giúp tôi tháo gỡ những khó khăn trong quá trình
thực hiện khóa luận.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Công Nghiệp Dược,
bộ môn Dược liệu và bộ môn Hóa Phân Tích- Độc Chất đã luôn tạo điều kiện để tôi
hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các bộ môn và phòng ban, các thầy
cô cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và chỉ
bảo tận tình cho tôi trong suốt năm năm học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên
tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Do thời gian tôi thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những
thiếu sót. Tôi rất mong có được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Tâm


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................................

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về chi Citrus L. .......................................................................3
1.1.1. Vị trí phân loại ...................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố ...............................................................3
1.1.3. Một số loài ở Việt Nam.......................................................................3
1.2. Tổng quan về cây Bưởi.............................................................................4
1.1.1. Tên gọi ................................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm thực vật...............................................................................4
1.1.3. Phân bố, trồng trọt và thu hái ............................................................5
1.1.4. Thành phần hóa học ...........................................................................5
1.1.5. Công dụng ..........................................................................................6
1.2. Hoạt chất naringin ....................................................................................6
1.2.1. Công thức, tên khoa học .....................................................................6
1.2.2. Tính chất vật lí....................................................................................7
1.2.3. Tính chất hóa học ...............................................................................7
1.2.4. Tác dụng dược lí.................................................................................7
1.2.5. Một số nghiên cứu tinh chế naringin từ cùi bưởi ...............................7
1.3. Hạt nhựa Macroporous .............................................................................9
1.3.1. Giới thiệu chung .................................................................................9
1.3.2. Ứng dụng trong phân lập và tinh chế các hoạt chất flavonoid...... 10
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..............................................................................................................................14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................... 14
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................ 14
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 15


2.1.3. Dụng cụ .............................................................................................. 15

2.1.4. Thiết bị ............................................................................................... 16
2.2. Nội dung nghiên cứu. ............................................................................... 16
2.2.1. Lựa chọn nhựa macroporous trong tinh chế naringin từ cùi bưởi.... 16
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hướng đến quá trình hấp phụ và phản hấp
phụ naringin trên nhựa macroporous đã chọn ............................................ 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp định lượng naringin .................................................... 16
2.3.2. Phương pháp chiết xuất naringin từ cùi bưởi ................................... 19
2.3.3. Phương pháp phân lập naringin từ dịch chiết cùi bưởi .................... 19
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................23
3.1. Kết quả thẩm định phương pháp định lượng bằng HPTLC ..................... 23
3.1.1. Độ đặc hiệu ........................................................................................ 23
3.1.2. Độ tuyến tính ...................................................................................... 23
3.1.3. Độ thích hợp hệ thống........................................................................ 24
3.1.4. Độ lặp lại ........................................................................................... 25
3.2. Kết quả quá trình phân lập naringin từ cùi bưởi bằng nhựa macroporous25
3.2.1. Lựa chọn loại nhựa macroporous để tinh chế naringin từ cùi bưởi . 25
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng hấp phụ của hạt D101 ................. 26
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đến khả năng hấp phụ của hạt
D101 ............................................................................................................. 27
3.2.4. Khảo sát tốc độ nạp dịch ................................................................... 27
3.2.5. Khảo sát thể tích dịch nạp ................................................................. 28
3.2.6. Khảo sát dung môi rửa giải ............................................................... 29
3.2.7. Khảo sát thể tích dịch rửa tạp ........................................................... 30
3.2.8. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải .................................................. 31
3.3. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế naringin từ dịch chiết cùi bưởi
sử dụng nhựa macroporous D101 ................................................................... 32
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………..

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Kí hiệu

1

BV

Tên đầy đủ
Thể tích khối hạt (Bed Volume)
Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin

2

HPTLC

Layer Chromatography)
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

3

HPLC

4

HSCCC

5

LDL

Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein)

6

MS

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry)

7

TLC

Sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

8

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

9

tt/tt

thể tích/thể tích

10

kl/tt

khối lượng/thể tích

Chromatography)
Sắc ký ngược dòng tốc độ cao (High Speed Counter
Current Chromatography)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Đặc điểm của nhựa macroporous D101 và HPD826(*)

14

Bảng 2.2

Danh mục hóa chất sử dụng

15

Bảng 3.1

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tinh

24

Bảng 3.2

Kết quả chấm lặp lại 6 lần vết chuẩn

24

Bảng 3.3

Kết quả chấm lặp lại 6 lần vết thử

25

Bảng 3.4

Kết quả lựa chọn nhựa macroporous

25

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ naringin

27

Bảng 3.6

Kết quả khảo sát tốc độ nạp dịch

28

Bảng 3.7

Nồng độ naringin trong dịch chảy qua cột nhựa

28

Bảng 3.8

Kết quả khảo sát dung môi rửa giải

29

Bảng 3.9

Kết quả khảo sát dịch rửa cột bằng nước cất

31

Bảng 3.10 Nồng độ naringin trong các phân đoạn dịch rửa giải

31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình
Hình 2.1
Hình 2.2

Nhựa macroporous D101 (A) và HPD826 (B)
Quy trình chiết xuất naringin từ cùi bưởi bằng nước vôi
trong

Trang
15
19

Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, và mẫu thử quan sát
Hình 3.1

ở bước sóng λ = 254nm và đồ thị của mẫu chuẩn (A) và

23

mẫu thử (B) phân tích bằng phần mềm TLC Scanner
Hình 3.2

Hình 3.3

Đường biểu diễn tương quan giữa diện tích peak và nồng
độ naringin
Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến tỷ lệ naringin tên hạt
nhựa macroporous D101

24

27

Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ naringin
Hình 3.4

trong dịch chảy qua cột và thể tích dịch hấp phụ

29

Nồng độ naringin trong dịch rửa giải và tỷ lệ naringin trong
Hình 3.5

Hình 3.6

Hình 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9

cắn khô khi sử dụng các dung môi khác nhau
Đường cong mối tương quan giữa thể tích dịch rửa cột và
khối lượng cắn khô trong từng phân đoạn
Mối tương quan giữa thể tích dịch rửa giải và nồng độ
narigin trong từng phân đoạn
Sắc kí cột sử dụng nhựa macroporous D101
Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế naringin từ cùi Bưởi
bằng nhựa macroporous D101

30

31

32

33
34

Hình ảnh sản phẩm kết tinh và sắc kí đồ mẫu chuẩn (C),
Hình 3.10 dịch chiết ban đầu (BĐ) và sản phẩm (T) quan sát ở bước
sóng λ = 254nm

35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bưởi là cây ăn quả được trồng phổ biến ở khu vực Đông Nam Á, Trung
Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và các nước vùng Địa Trung Hải. Tại Việt Nam, bưởi
được trồng ở hầu hết các tỉnh thành với nhiều giống bưởi ngon nổi tiếng như Đoan
Hùng (Phú Thọ), Diễn (Hà Nội) [2]. Ngoài múi bưởi có công dụng làm thực phẩm,
vỏ quả bưởi chứa tinh dầu và nhiều hoạt chất còn có tác dụng trị đờm, đau bụng
do lách to, đau dạ dày... [3]. Tuy nhiên, phần vỏ quả thường bỏ đi gây lãng phí.
Ngày nay, với sự phát triển của khoa học công nghệ, cây bưởi được nghiên
cứu để tiến tới đa dạng hóa sản phẩm, cải thiện giá trị bổ sung mang lại lợi ích
cho người trồng và môi trường. Trong đó có cùi bưởi - với sự có mặt của hơn 60
loại flavonoid có hoạt tính sinh học hữu ích [8].
Naringin là một hoạt chất nhóm flavonoid có trong cùi bưởi đã được nghiên
cứu và công bố một số tác dụng như chống lão hóa, làm giảm cholesterol, ngăn
ngừa cao huyết áp, giảm tai biến tim mạch, chống nấm, làm lành vết loét dạ dày,
phòng chống ung thư và có tác dụng làm đẹp da [14],[19],[20],[23].
Đã có một số nghiên cứu phân lập và tinh chế naringin bằng các phương
pháp khác nhau như: phương pháp tách sắc kí, sử dụng chất hấp phụ, chiết lỏnglỏng. Tuy nhiên các phương pháp này hoặc phải sử dụng dung môi độc hại, gây ô
nhiễm môi trường, không an toàn cho sức khỏe hoặc thiết bị phức tạp, đắt tiền,
khó thực hiện ở quy mô lớn.
Hiện nay, nhựa macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chiết

xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên với nhiều ưu
điểm nổi trội: khả năng làm giàu hoạt chất, loại bỏ tạp chất, không cần sử dụng
dung môi hữu cơ độc hại, khả năng lập lại và ổn định tốt, chi phí thấp, phù hợp
cho sản xuất công nghiệp.
Nhằm xây dựng một quy trình tinh chế naringin từ cùi bưởi hiệu quả, kinh
tế, không gây ô nhiễm môi trường và dễ ứng dụng vào thực tế, đề tài “Ứng dụng
nhựa macroporous trong tinh chế naringin từ cùi Bưởi” được thực hiện với
mục tiêu:

1


1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và phản hấp phụ
naringin trên nhựa macroporous thích hợp
2. Xây dựng quy trình tinh chế naringin từ dịch chiết cùi Bưởi sử dụng nhựa
macroporous.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về chi Citrus L.

1.1.1. Vị trí phân loại
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae)
Liên bộ: Cam (Runtanae)

Bộ: Cam (Rutales)
Họ: Cam (Rutaceae)
Chi: Citrus L. [25].
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố
Cây bụi hoặc cây nhỏ, thường xanh, hiếm khi rụng lá. Cành non thường trơn
nhẵn, gắn với gai đơn độc. Lá đơn, lá kép 1 lần, hiếm khi thấy lá kép 3 lần, cuống
lá thường được khớp nối với đế lưỡi lá, thường có cánh dễ thấy.
Hoa lưỡng tính hoặc hoa đực, đơn độc hoặc mọc thành chùm nhỏ, thơm.
Cánh hoa (3 hoặc) 4 hoặc 5 (-8) màu trắng hoặc đỏ hồng bên ngoài.
Quả mọng, áo hạt mịn hoặc nhô ra, phôi 1 đến nhiều.
Có 20-25 loài phân bố ở Đông, Nam và Đông Nam Á, Australia và các đảo
Thái Bình Dương, 11 loài và các loài lai có nguồn gốc tự nhiên hoặc được trồng
rộng rãi ở Trung Quốc [26].
1.1.3. Một số loài ở Việt Nam
1.1.3.1. Citrus grandis (L.) Osbeck
Tên đồng nghĩa: Citrus maxiama (Burm.) Merr., Citrus decumana Merr.
Tên Việt Nam: bưởi, bòng
Cây gỗ, cành có gai nhỏ, cuống là có cánh dài. Hoa mọc thành chùm. Quả
hình cầu hoặc cầu phẳng.
Phân bố: Phú Thọ, Hà Tĩnh, Huế, Đồng Nai, Nam Định [3].
1.1.3.2. Citrus paradisi Macfad.
Tên Việt Nam: bưởi chùm, bưởi đắng

3


Đặc điểm thực vật: Cây có dạng như Bưởi, được xem như 1 loài lai giữa
Bưởi và Cam chanh, nhánh non nhẵn, cành lá nhỏ hơn, quả nhỏ hơn Bưởi (913cm) và nhóm thành từng chùm, vỏ quả mỏng hơn (5-7mm), múi không lóc,
nhưng chua và đắng, hạt nhẵn, trắng, có 8-11 phôi.
Phân bố: Lâm Đồng (Đà Lạt) [3].

1.1.3.3. Citrus limonia Osb.
Tên Việt Nam: chanh, chanh kiên
Đặc điểm thưc vật: Cây nhỏ cao 2-5m, không có gai, lá có phiến bầu dục,
đầu tù, vàng lúc khô. Hoa trắng, cánh hóa dài 1,5cm, tiểu nhụy 20-40. Trái hơi
cao, to 2×1,7cm hay tròn to 2,5cm, vỏ hơi dễ tróc, nạc chua.
Phân bố: Hà Nội, Quảng Trị, Lâm Đồng [5].
1.1.3.4. Citrus medica var. sarcodactylis (Sieb.)
Tên Việt Nam: Phật thủ
Đặc điểm thực vật: Cây nhỏ cao 2-3,5m, có gai ngắn. Lá tròn, dài, thon, dài
10-20cm. Chùm ít hoa ở nách lá, dài 5 thùy, cánh hoa 4-5, trắng hoặc ửng tím, dài
2cm, tiểu nhụy 20-40. Trái vàng, chót như bàn tay chụm [5].
1.2.

Tổng quan về cây Bưởi

1.1.1. Tên gọi
Tên khoa học: Citrus maxima (Burm) Merrill; Citrus grandis (L.) Osbeck.
Tên khác: bòng, co phúc (Mường), kanbao tchiou (Thái), kroth thlong
(Campuchia), makkamtel, makphuc, maksomo (Lào).
Họ Cam - Rutaceae
1.1.2. Đặc điểm thực vật
Cây gỗ cao 5-10m hay hơn. Vỏ đôi khi để toát ra một chất gôm. Cành có gai
nhỏ mọc đứng ở kẽ lá, có lông rồi nhẵn. Lá hình trái xoan tù 2 đầu, nguyên, dai;
gân bên 8 đôi, gân nhỏ chỉ nổi rõ ở mặt dưới; cuống lá có cánh dài, có lông ở mặt
dưới, nhất là trên sống giữa.
Hoa mọc thành chùm 6-10 hoa; cuống hoa có lông; lá bắc hình vạch, có lông.
Hoa trắng, to, rất thơm; lá đài 4-5, tròn, có lông; cánh hoa 5; nhị khoảng 24, rời,

4

ngắn bằng nửa các cánh hoa; đĩa mật dày; bầu hình cầu, có lông, vòi dài, đầu nhụy
hình đầu, to.
Quả gần hình cầu và cầu phẳng, đường kính 15-30cm, có cùi dày và màu sắc
thay đổi tùy loại bưởi, thường có 12 múi, cơm quả chua hay ngọt cũng khác nhau
tùy loài [3].
1.1.3. Phân bố, trồng trọt và thu hái
Bưởi được trồng ở khu vực Đông Nam Á, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,
các nước vùng Địa Trung Hải.
Ở Việt Nam, bưởi được trồng ở hầu hết các tỉnh. Những nơi có bưởi ngon
nổi tiếng: Đoan Hùng (Phú Thọ), Mê Linh (Vĩnh Phúc), Phúc Trạch, Hương Khê
(Hà Tĩnh), Thanh Trà (Huế), Biên Hòa (Đồng Nai), Diễn (Hà Nội) [2].
Mùa hoa: Tháng 3-5, mùa quả: tháng 8-11. Bưởi được trồng chủ yếu để lấy
quả ăn, lấy hoa ướp thơm thức ăn, bánh trái hoặc cất nước hoa bưởi. Ngoài ra, lá
tươi còn được hái làm thuốc [6].
1.1.4. Thành phần hóa học
Trong dịch ép múi bưởi có chứa: nước (89%), protein (0,5%), lipid (0,4%),
đường (9,3%), vitamin: B1 (0,07 mg%), vitamin B2 (0,01 mg%) và vitamin C (44
mg%).
Hạt có chứa pectin.
Vỏ quả chứa tinh dầu 15%, pectin và các hợp chất flavonoid. Tinh dầu vỏ
bưởi Việt Nam có thành phần chính là limonen (41,45-84,62%), myrcen (8,2850,66%). Các thành phần terpenalcol và aldehyd tồn tại ở hàm lượng rất thấp
(<1%) [2].
Bộ phận chứa nhiều flavonoid thuộc chi Citrus chủ yếu là vỏ quả ngoài, vỏ
quả giữa và dịch quả. Các flavonoid của chi Citrus phần lớn thuộc nhóm flavanon
như: hesperidin, neohesperidin, naringin và một số dẫn chất flavon như diosmin,
rutin [1]. Với hàm lượng 17,0 mg trong 100g dịch ép múi bưởi, naringin chiếm
hàm lượng cao nhất trong các hợp chất flavonoid [18].

5

1.1.5. Công dụng
Lá bưởi tươi thường được dùng nấu với nhiều lá thơm khác để xông chữa
cảm cúm, nhức đầu. Còn dùng để cất tinh dầu, nhưng nếu hái lá thì hại quả và hoa
cho nên ít làm.
Vỏ hạt bưởi có thể dùng lấy pectin làm thuốc cầm máu và dùng chải tóc giữ
cho tóc im giống như dùng gôm adragant.
Dịch ép múi bưởi dùng làm thuốc chữa tiêu khát (đái tháo), thiếu vitamin C,
làm nguyên liệu chế acid citric thiên nhiên.
Nước hoa bưởi thường bán ở các hiệu làm bánh được cất từ hoa bưởi phối
hợp với các vị thuốc có vị thơm khác như hồi, quế… dùng làm thơm các thức ăn,
bánh trái [6].
Vỏ quả bưởi dùng trị đờm kết đọng ở cổ họng và cuống phổi, đau bụng do
lách to; còn dùng trị đau dạ dày, đầy bụng, ăn uống không tiêu, ho nhiều, hen, đau
thoát vị. Vỏ quả và lá được dùng uống trong, dưới dạng thuốc sắc, mỗi ngày dùng
10-15g [3].
1.2.

Hoạt chất naringin

1.2.1. Công thức, tên khoa học
OH

OH

HO
O

O

O

HO
O
H3C

O
OH
HO

OH

O

OH

Danh pháp IUPAC: 7 - ((2 - O - (6 – Deoxy – α – L - mannopyranosyl) – β
– D -

glucopyranosyl) oxy) - 2,3 – dihydro – 5 – hydroxy – 2 - (4 -

hydroxyphenyl) - 4H – 1 – benzopyran – 4 - one.
Công thức phân tử: C27H32O14
Phân tử lượng: 580,54 g/mol

6


1.2.2. Tính chất vật lí

Bột kết tinh không màu hoặc hơi vàng, không mùi, vị rất đắng.
Nhiệt độ nóng chảy: khi kết tinh từ dung môi hữu cơ và sấy khô ở 1100C,
nhiệt độ nóng chảy của naringin là 1710C, khi kết tinh từ nước, naringin có thêm
6 phân tử nước và nóng chảy ở 830C [29].
Độ tan: Naringin tan tốt trong ethanol, aceton và nước nóng, không tan trong
ether, benzen và cloroform.
Có khả năng hấp thụ tử ngoại.
1.2.3. Tính chất hóa học
Naringin có những tính chất hóa học đặc trưng của flavonoid:
Phản ứng với kiềm: do các nhóm OH phenol có tính acid nên dễ phản ứng
với hydroxid kiềm tạo muối tan trong nước, vì naringin có thêm nhóm CO
(carbonyl) trong phân tử nên tính acid của naringin mạnh hơn.
Phản ứng Cyanidin: phản ứng khử nhóm carbonyl mở vòng pyron.
Phản ứng tạo màu với AlCl3: tạo phức kim loại có màu vàng đặc trưng.
1.2.4. Tác dụng dược lí
Naringin có tác dụng làm giảm cholesterol, làm giảm LDL oxidation và có
thể giúp ngăn ngừa tăng cholesterol máu, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch
[14], chống oxy hóa, chống ung thư ác tính [13]. Với vai trò ức chế enzym ty thể
trong isoproterenol, naringin đã được chứng minh có tác dụng ngăn ngừa nhồi
máu cơ tim. Ngoài ra, naringin còn làm giảm những thay đổi lipoprotein huyết
thanh và enzym chuyển hóa lipid nên có tác dụng hạ lipid máu [19],[20].
1.2.5. Một số nghiên cứu tinh chế naringin từ cùi bưởi
Kết tinh là phương pháp phổ biến được sử dụng để tinh chế các hợp chất
thiên nhiên nói chung và naringin từ dịch chiết cùi bưởi nói riêng.
Năm 2014, Nguyễn Hoài Thương đã nghiên cứu quy trình chiết xuất và phân
lập naringin từ cùi bưởi. Cụ thể: 1kg bột cùi bưởi được chiết với 14 lít dung môi
ethanol- nước (8:2, tt/tt) ở nhiệt độ 700C trong 1 giờ. Lọc thu dịch chiết, loại bỏ
bã nguyên liệu và cô quay loại bớt dung môi còn khoảng 1/10 thể tích ban đầu.
Dùng Ca(OH)2 điều chỉnh pH về khoảng 9-10 để loại pectin và đường trong dịch
7

chiết. Sau khi lọc, điều chỉnh dung dịch về pH khoảng 5 bằng HCl. Để yên trong
48h cho naringin kết tinh, lọc thu tinh thể. Thực hiện quá trình kết tinh lại với hệ
dung môi ethanol- nước (8:2, tt/tt) vài lần. Sau mỗi lần, tiến hành lọc, rửa tinh thể
với nước lạnh và sấy khô thu tinh thể naringin. Hiệu suất thu được là 2,5% so với
tổng lượng mẫu khô ban đầu, độ tinh sạch sản phẩm là 95,08% [7].
Năm 2010, Phạm Thị Hảo đã nghiên cứu chiết xuất và tinh chế naringin sử
dụng than hoạt. Bột cùi bưởi được chiết với cồn, sau khi cô thu hồi dung môi, cao
lỏng được lắc với n-hexan. Tủa flavonoid thô thu được sau khi để lạnh cao lỏng ở
50C trong 48 giờ. Sau đó, hòa tan 5,0g flavonoid thô trong 350ml hỗn hợp ethanol
96%- nước (1:3, tt/tt), thêm 0,5g than hoạt và đun nóng trong 5 phút để loại màu.
Lọc bỏ than hoạt, dịch lọc được để kết tinh trong 48 giờ, lọc rửa tinh thể naringin
bằng nước cất và kết tinh lại 3 lần nữa. Cuối cùng, để các tinh thể khô ở nhiệt độ
phòng rồi sấy ở 600C đến khi khối lượng không đổi thu được 4,01g, hiệu suất tinh
chế là 80,2%. Phương pháp sử dụng than hoạt để tinh chế naringin tuy đơn giản,
nguyên liệu rẻ tiền nhưng phải kết tinh lại nhiều lần [4].
Phương pháp kết tinh trực tiếp từ dịch chiết có ưu điểm là đơn giản, dễ làm
nhưng phải kết tinh lại nhiều lần và hiệu suất chưa cao. Để cải thiện hiệu suất
chiết tách, phương pháp chiết phân bố với dung môi hữu cơ đã được nghiên cứu.
Năm 2009, Kanokorn Sudto và cộng sự đã phân lập naringin từ dịch chiết
trong methanol gồm các bước: ngâm 1kg bột cùi bưởi khô với 1500ml methanol
trong 3 ngày, lọc cắn, dịch chiết trong methanol được cô dưới áp suất giảm ở nhiệt
độ 450C. Thêm 1500ml nước cất vào cao khô methanol và khuấy ở 700C trong 24
giờ. Sau đó thêm vào hỗn hợp 350ml dicloromethan, khuấy mạnh trong 4 ngày ở
250C. Lọc lấy tinh thể naringin hình thành trong lớp nước, rửa, sấy khô ở 500C và
cân. Kết quả hiệu suất cao hơn 4 lần so với phương pháp tương tự mà không thêm
dicloromethan [24].
Phương pháp trên tuy cho hiệu suất cao hơn nhưng sử dụng lượng lớn
methanol và dicloromethan- dung môi hữu cơ độc hại, đắt tiền. Để hạn chế việc

sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, những năm gần đây phương pháp sử dụng
các chất hấp phụ đã được nghiên cứu và dần thay thế.
8


Năm 2016, Fang Liu, Shuai Han và Yuanying Ni đã phân lập và tinh chế 4
flavonoid trong cùi Bưởi bằng sắc kí cột sử dụng nhựa macroporous AB-8 kết hợp
sắc kí phân bố ngược dòng (HSCCC). Cùi bưởi được chiết 2 lần bằng ethanol
80% (tỉ lệ dược liệu: dung môi là 1:3 (kl/tt)), dịch chiết được ly tâm loại cắn, bốc
hơi và hòa tan trong 100ml ethanol 80% thu được dịch chiết thô. Sau đó, cho
250ml dịch chiết thô chảy qua sắc kí cột nhựa macroporous AB-8 (16*250mm)
với tốc độ 2,0ml/phút. Sau khi rửa cột bằng 300ml nước, rửa giải bằng 180ml
ethanol 70% với tốc độ 2,5ml/phút. Các phân đoạn có hàm lượng flavon cao được
gộp lại, bốc hơi (500C, 0,1 MPa) và đông khô. Tiếp theo, sử dụng hệ thống
HSCCC với hệ dung môi ethylacetat: n-buthanol: nước (3:2:5, tt/tt/tt) đã tách được
naringin trong hỗn hợp với neohesperidin có độ tinh khiết là 99,21% [16].
Phương pháp này cho naringin có độ tinh khiết cao, tuy nhiên phải sử dụng
nhiều công đoạn, máy móc thiết bị phức tạp và quy mô mỗi mẻ tinh chế chỉ là
30mg cắn chiết. Hơn nữa, điều kiện kinh tế và cơ sở vật chất tại Việt Nam hiện
tại chưa đủ để trang bị cho việc sử dụng phương pháp trên trong công nghiệp.
Năm 2006, Jiang Xinyu và cộng sự đã khảo sát trên 5 loại nhựa để tinh chế
naringin từ dịch chiết cùi bưởi: Polyamide, S-8, AB-8, X-5 và D4020. Sau khi
đánh giá khả năng hấp phụ và phản hấp phụ, nhựa X-5 đã được lựa chọn để tối ưu
hóa quy trình tinh chế. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp phụ và phản hấp phụ
naringin của nhựa X-5 được khảo sát: nồng độ, giá trị pH, tốc độ dòng. Sau đó,
rửa giải naringin bằng ethanol 60% có pH=10, tỷ lệ phản hấp phụ lên đến hơn
85% [12].
Phương pháp sử dụng nhựa macroprous X-5 trong tinh chế naringin của
Jiang Xinyu có nhiều ưu điểm như: đơn giản hơn so với sắc kí, không sử dụng
dung môi hữu cơ độc hại, hiệu suất quy trình cao.

1.3.

Hạt nhựa Macroporous

1.3.1. Giới thiệu chung
Nhựa macroporous là một nhóm các hạt polyme hình cầu rất nhỏ, có liên kết
chéo ở mức độ cao, đặc trưng bởi số lượng lớn các lỗ xốp (đường kính >50A),
dùng làm chất trao đổi ion, còn được gọi là nhựa macroreticular.
9


Dựa vào tính phân cực, nhựa macroporous có thể được chia làm 2 loại chính:
không phân cực và phân cực. Theo độ phân cực được chia thành phân cực yếu,
phân cực trung bình và phân cực mạnh. Hiện nay các nhựa macroporous thường
được sử dụng gồm: D101, H103,... (không phân cực); AB-8, HPD722,...(phân cực
yếu); ADS-17, LSA-10,... (phân cực trung bình); NKA-9, NKA-2,... (phân cực
mạnh) [9].
Diện tích bề mặt, đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt là ba thông số
quan trọng mô tả một loại nhựa macroporous hấp phụ. Diện tích bề mặt bên trong
của nhựa khô thường từ 100 đến 1000 m2/g, với đường kính lỗ xốp dao động từ
100 đến 300A. Sự phân cực của nhựa có thể khác nhau với sự lựa chọn của
monomer được sử dụng trong quá trình tổng hợp hoặc bằng cách xử lý hóa học
bổ sung sau trùng hợp.
Độ hấp phụ của nhựa macroporous phụ thuộc vào cấu trúc hình học của nó
và có thể được kiểm soát bằng cách thay đổi thành phần hóa học của hỗn hợp
polyme hóa trong quá trình tổng hợp, dẫn đến các hóa chất bề mặt khác nhau trên
chất hấp phụ.
Nhựa macroporous được tạo thành từ quá trình trùng hợp polyme. Trong quá
trình trùng hợp, ngoài các monome (thường sử dụng styren divinylbenzen), còn
có chất độn không polyme hóa (porogens) như toluen, n-heptan, iso-octan và

isobutanol. Các chất độn có khả năng trộn lẫn với hỗn hợp monome, không hoà
tan polyme và bay hơi ở những điều kiện nhất định sau khi kết thúc quá trình
polyme hoá để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polyme [17].
1.3.2. Ứng dụng nhựa macropoorus trong phân lập và tinh chế các hoạt chất
nhóm flavonoid
Những năm gần đây, nhựa macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh
vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên. Trong
đó, dược liệu chứa flavonoid cũng là đối tượng của nhiều nghiên cứu.
Năm 2016, Yang Xie, Qiu-Shi Guo và Guang-Shu Wang đã sử dụng nhựa
macroporous để phân lập flavonoid trong loài Scorzonera austriaca. Các loại
nhựa macroporous được khảo sát là: D101, D4020, NKA-9, X-5 và AB-8. Sau
10


khi đánh giá dung lượng hấp phụ, tỷ lệ hấp phụ và tỷ lệ phản hấp phụ, nhựa D4020
được chọn để khảo sát các yếu tố khác. Sau khi tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng,
quá trình tinh chế được thực hiện như sau: Cột nhựa macroporous D4020 được
bão hòa bằng dịch chiết có nồng độ 20mg/ml, sau khi rửa cột băng 5BV nước,
5BV dung dịch ethanol 5% và 5BV dung dịch ethanol 30% với tốc độ 2BV/h, thu
được flavonoid trong dung dịch ethanol 30% bằng cách cô thu hồi dung môi. Sản
phẩm thu được có hàm lượng flavonoid là 93,5% [28].
Năm 2015, Yi Dong và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính hấp phụ và phản hấp
phụ flavonoid trong lá cây Cam thảo (Glycyrrhiza glabra L.) của nhựa
macroporous. Trong đó, 5 loại hạt nhựa macroporous đã được đưa vào nghiên
cứu: XAD-4, XAD-16, HP-2MGL, SP207, SP825 đều cho thấy đặc tính hấp phụ
và phản hấp phụ tương tự nhau. Sau đó, quá trình hấp phụ và giải hấp phụ trên
sắc kí cột được thực hiện với 2 loại hạt nhựa đại diện là XAD-16 và SP825. Kết
quả thu được hàm lượng các flavonoid tăng lên từ 16,8% đến 55,6% bởi nhựa
XAD-16 và 53,9% bởi nhựa SP825 [10].
Cùng năm đó, trong một nghiên cứu khác của Ming-Zhi Zhu và cộng sự, sắc

kí cột nhựa macroporous D101 kết hợp với HPLC-MS/MS đã được sử dụng để
làm giàu và xác định flavonoid trong lá Sen (Nelumbo nucifera). Kết quả, xác
định được 14 loại flavonoid, 4 trong số đó lần đầu tiên được xác định có trong lá
sen [30].
Năm 2013, Ruan Xiao và cộng sự đã sử dụng nhựa polystyren AB-8 và
polyamid để phân lập và tinh chế flavonoid trong phần còn lại của dịch chiết
không chứa taxoid của cây Taxus. Nhóm tác giả đã khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình hấp phụ và phản hấp phụ như: nồng độ dịch chiết, thể tích hấp phụ,
tốc độ dòng, thể tích dịch rửa giải. Kết quả thu được sản phẩm có hàm lượng cao
gấp 16,09 lần so với dịch chiết ban đầu. Năng suất thu hồi của nhựa macropoorus
AB-8 là 68,8%, nhựa polyamid là 85,3% [27].
Năm 2009, Jing Li và Howard A. Chase đã nghiên cứu quá trình hấp phụ của
nhựa macroporous XAD7HP trong tinh chế rutin từ dịch chiết lá cây Bạch quả
(Ginkgo biloba L.). Sau khi xác định thời gian tiếp xúc và sự ảnh hưởng của bột
11


lá lên hiệu suất hấp phụ của hạt, nhóm tác giả đã nghiên cứu động học hấp phụ và
đặc điểm mở rộng trên cột nhựa XAD7HP có chiều cao 42cm. Kết quả, xác định
được tốc độ dòng 183cm/h, tỷ lệ mở rộng cột là 1,25 và giá trị trung bình thời gian
lưu là 28 phút [15].
Năm 2007, Silva và cộng sự đã ứng dụng nhựa macropopous trong tinh chế
polyphenol ở loài Inga edulis. Nhóm tác giả đánh giá khả năng hấp phụ của các
polyphenol trên 4 loại nhựa XAD-7, XAD-16, EXA-90, EXA-118 và khảo sát các
yếu tố ảnh hưởng như: hàm lượng nước trong dịch chiết cồn, loại nhựa sử dụng
và pH. Kết quả cho thấy XAD-7 là nhựa thích hợp cho quá trình hấp phụ
polyphenol trong dịch chiết lá cây Inga edulis [21].
Trong một nghiên cứu khác ở Trung Quốc năm 2006, các tác giả đã tách và
tinh chế các thành phần flavonoid (luteolin, vitexin và isovitexin) có trong loài
Cajanus cajan. Để làm giàu luteolin trong dịch chiết của lá cây, Fu và cộng sự đã

đánh giá khả năng hấp phụ và phản hấp phụ lên 8 loại nhựa AB-8, NKA-9, NKA2, D3520, D101, H1020, H103 và AL-2. Kết quả, AL-2 là nhựa macropopous cho
khả năng hấp phụ luteonin tốt nhất tại pH =5. Nhiều nghiên cứu và báo cáo đã chỉ
ra khả năng hấp phụ của 1 chất lên nhựa còn phụ thuộc vào pH của dịch hấp phụ.
Ứng dụng điều này để phân lập vitexin và isovitexin trong lá cây Cajanus cajan,
nhóm nghiên cứu của Fu đã thử khả năng hấp phụ trên 8 nhựa macropopous khác
(ADS-5, ADS-7, ADS-8, ADS-11, ADS-17, ADS-21, ADS-31 và ADS-F8) ở
những pH khác nhau. Kết quả cho thấy, tại pH=3,5-4, nhựa ADS-5 là
macropopous thích hợp cho việc phân lập và tinh chế vitexin và isovitexin [11].
Tóm lại, do có khả năng làm giàu các hoạt chất lên đến hơn 10 lần, độ bền
cơ học cao và có thể tái sử dụng, hạt nhựa macropopus có nhiều ưu điểm hơn so
với các chất hấp phụ truyền thống. Bên cạnh đó, có thể thấy rằng dung dịch
ethanol- nước hầu hết được sử dụng để rửa giải các chất mục tiêu từ nhựa. Như
vậy việc sử dụng nhựa macropopus được coi là một kỹ thuật “xanh” trong tinh
chế các hợp chất từ thiên nhiên không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Tuy
nhiên, quy trình tinh chế các hoạt chất thiên nhiên bằng nhựa macroporous phụ

12


thuộc vào rất nhiều yếu tố. Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để lựa chọn các điều
kiện thích hợp nhất nhằm xây dựng một quy trình đạt hiệu quả cao nhất.

13


CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu bưởi: vỏ bưởi Diễn được thu mua ở Thanh Trì- Hà Nội vào tháng

8 năm 2017. Loại bỏ lớp vỏ ngoài chứa tinh dầu, phần cùi trắng được thái mỏng,
sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60-700C trong 24 giờ. Xay thành bột, rây qua rây 1mm.
Bảo quản ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Nhựa macroporous:
Hạt nhựa macroporous D101 mua tại công ty Anhui Sanxing Resin
Technology Co.,LTD và hạt nhựa macroporous HPD826 mua tại công ty
BonChem CO., LTD.
Xử lí hạt nhựa: Ngâm hạt nhựa trong ethanol 96% trong 24-48 giờ. Gạt bỏ
lớp váng bẩn trên lớp dung môi. Sau đó, lọc hút hạt nhựa trên phễu lọc Buchner
và rửa hạt nhựa bằng nước cất nhiều lần ngay trên phễu lọc. Xác định hàm ẩm của
hạt và bảo quản trong lọ kín dùng cho các thí nghiệm sau.
Bảng 2.1: Đặc tính của nhựa Macroporous D101 và HPD826(*)
Thông số kỹ thuật

Đặc điểm

D101

HPD826

Styren

Liên kết hydro

Không phân cực

Phân cực

0,315 – 1,25

0,3-1,2

65-75

60-70

Diện tích bề mặt (m2/g)

500-550

500-600

Đường kính lỗ xốp trung bình (A)

100-110

90-100

Cấu trúc
Tính phân cực
Kích thước hạt (mm)
Độ ẩm (%)

*: Số liệu do nhà sản xuất cung cấp.

14


Hình 2.1: Nhựa macroporous D101 (A) và HPD826 (B)
2.1.2. Hóa chất

Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn chất
lượng

Chất chuẩn
Viện dược liệu: Số lô 77162,
1

Naringin chuẩn

số kiểm soát

Hàm lượng 92%

VDL-CC-Naringin-11
Hóa chất
2

Calci oxid

Trung Quốc

Tinh khiết phân tích

Dung môi
3

Acid acetic

Trung Quốc

Tinh khiết phân tích

4

n-Buthanol

Trung Quốc

Tinh khiết phân tích

5

Ethanol 96%

Việt Nam

DĐVN IV

6

Nước cất

Việt Nam

DĐVN IV

2.1.3. Dụng cụ
- Cột thủy tinh , bình cầu , cốc thủy tinh, ống đong, ống nghiệm, lọ penicillin.
- Bình định mức, pipet định mức
- Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius).
- Bản mỏng Silica gel 60 GF254 (MERCK)
- Phễu lọc Buchner
15


2.1.4. Thiết bị
- Máy cất quay Buchi B490 và R220 (Thụy Sĩ)
- Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức)
- Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BO 2015 (Đức)
- Hệ thống sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao gồm: Camag TLC Scanner 4,
Camag Linomat 5, Camag ADC 2 Automatic developing chamber (Thụy Sĩ)
- Tủ sấy MEMMERT (Đức).
- Hệ thống lọc hút Buchner.
- Máy li tâm Rotofix 32 Hettich (Đức)
- Máy lắc ngang IKA KS-125 (Đức)
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Lựa chọn nhựa macroporous trong tinh chế naringin từ cùi bưởi
Lựa chọn nhựa macroporous thích hợp để tinh chế naringin từ dịch chiết cùi
bưởi được đánh giá bằng dung lượng hấp phụ, tỷ lệ hấp phụ và tỷ lệ phản hấp phụ.
2.2.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hướng đến quá trình hấp phụ và phản hấp phụ
naringin trên nhựa macroporous đã chọn
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ naringin và pH dịch chiết đến khả năng hấp
phụ của nhựa macroporous đã chọn.
Khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng và thể tích dịch nạp đến khả năng

hấp phụ naringin trên cột nhựa macroporous đã chọn
Đánh giá khả năng giải hấp phụ naringin từ nhựa macroporous đã chọn của
các dung môi: nước, ethanol 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96% và xác định thể
tích dung môi rửa giải tối ưu cho quá trình giải hấp phụ.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp định lượng naringin
Xác định hàm lượng naringin trong nguyên liệu, trong dịch chiết và sản phẩm
bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng kết hợp đo mật độ vết (TLC-scanning). Tiến
hành như sau:

16


Điều kiện sắc kí:
Pha tĩnh: bản mỏng Silica gel 60 GF254 (MERCK) hoạt hóa trong tủ sấy ở
100-1100C trong 30 phút.
Pha động: n-buthanol - acid acetic - nước (4:1:5), lấy lớp phía trên.
Phát hiện vết: Mẫu cần định lượng được đưa lên bản mỏng có kích thước
5×10cm, 10×10cm hoặc 20×10cm bằng máy chấm Camag Linomat 5 với thể
tích 10μl trên dải 6mm. Vị trí chấm cách mép dưới bản mỏng và hai mép bên là
1cm. Khoảng cách giữa các vết phụ thuộc vào số vết.
Sau khi khai triển bằng hệ thống Camag ADC 2 Automatic developing
chamber, phân tích vết bằng máy Camag TLC Scanner 4 ở bước sóng 254nm.
Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu đối chiếu:
Cân chính xác khoảng 100mg chất đối chiếu naringin chuẩn cho vào bình
định mức 10ml. Hòa tan bằng ethanol 96% và thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch.
Thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ khoảng 10mg/ml.
Pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc đề được dung dịch có nồng độ thấp hơn.
Chuẩn bị mẫu thử:

Mẫu thử là dược liệu: Cân chính xác khoảng 5,0g bột dược liệu, cho vào bình
định mức 50ml, thêm ethanol 96% đến vạch, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm.
Sau đó để lắng 15 phút ở điều kiện phòng, gạn lấy dịch trong, lọc qua màng
cellulose 0,45 μm.
Mẫu thử là dịch chiết dược liệu: Dịch chiết dược liệu đã chuẩn bị như mục
2.2.3 được lọc qua màng cellulose 0,45μm.
Mẫu thử là sản phẩm: Cân chính xác khoảng 0,01g sản phẩm cho vào bình
định mức 5ml. Hòa tan bằng ethanol 96% và thêm ethanol 96% đến vạch, lọc qua
màng cellulose 0,45μm.
Thẩm định phương pháp định lượng naringin bằng HPTLC
Độ đặc hiệu
Để kiểm tra tính đặc hiệu của phương pháp với naringin, chuẩn bị 3 mẫu:
Mẫu 1: Mẫu trắng: Dung dịch ethanol 96%
17