Xây dựng quy trình định lượng bacoside a3 trong dược liệu rau đắng biển

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG HÙNG MẠNH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
BACOSIDE A3 TRONG DƯỢC LIỆU
RAU ĐẮNG BIỂN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VƯƠNG HÙNG MẠNH
Mã sinh viên: 1301272

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
BACOSID A3 TRONG DƯỢC LIỆU
RAU ĐẮNG BIỂN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Tuấn Hiệp
2. TS. Trần Nguyên Hà
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
2. Khoa CNCX – Viện Dược Liệu

HÀ NỘI – 2018

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành khóa luận này, ngoài sự cố gắng và nỗ lực của bản
thân, em còn may mắn nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ của mọi người xung
quanh. Em xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã dạy
dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy TS. Nguyễn Tuấn
Hiệp, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, dạy bảo em trong
suốt quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn cô TS. Trần Nguyên Hà,
người đã tạo điều kiện, và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị khoa Công Nghệ Chiết Xuất, Viện
Dược Liệu, đặc biệt là chị Đỗ Thị Thùy Linh, người đã luôn theo sát giúp đỡ em.
Chân thành cảm ơn ban giám đốc Viện Dược Liệu đã cho em cơ hội thực tập tại
viện.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội,
các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện cho
em trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị những người luôn động viên
khích lệ, trợ giúp cho em về mọi mặt để em có được kết quả ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Sinh viên
Vương Hùng Mạnh


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .............................................................................

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2
1.1. Tổng quan về loài Bacopa monnieri ........................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri ................................... 2
1.1.2. Bộ phận sử dụng ........................................................................................................ 2
1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................................. 2
1.1.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................................... 5
1.2. Tổng quan về phương pháp HPLC ............................................................................ 7
1.2.1. Nguyên tắc hoạt động ................................................................................................ 7
1.2.2. Cấu tạo HPLC ........................................................................................................... 8
1.3. Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3 ........... 10
1.3.1. Phương pháp chiết xuất .......................................................................................... 10
1.3.2. Phương pháp phân tích định lượng ....................................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 15
2.1. Đối tượng và hóa chất, thiết bị ................................................................................. 15
2.1.1. Đối tượng ................................................................................................................. 15
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất .............................................................................................. 15
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 16
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích .......................................................................... 16
2.2.2. Thẩm định phương pháp......................................................................................... 16
2.2.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................ 16
2.2.2.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................ 16
2.2.2.3. Đường chuẩn ........................................................................................................ 17
2.2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................. 17


2.2.2.5. Độ lặp lại ............................................................................................................... 18
2.2.2.6. Độ đúng ................................................................................................................. 18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 20

3.1. Xây dựng phương pháp định lượng ......................................................................... 20
3.1.1. Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển ........................................... 20
3.1.2. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký ............................................................................. 23
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ......................................................................... 27
3.2.1. Tính thích hợp của hệ thống ................................................................................... 27
3.2.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................... 28
3.2.3. Đường chuẩn ........................................................................................................... 29
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................................... 30
3.2.5. Độ lặp lại .................................................................................................................. 31
3.2.6. Độ đúng .................................................................................................................... 31
3.3. Ứng dụng phương pháp trong định lượng Bacosid A3 trong một số mẫu rau
đắng biển ........................................................................................................................... 32
3.4. Bàn luận ...................................................................................................................... 33
3.4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu rau đắng biển ở Việt Nam ...... 33
3.4.2. Quy trình chiết xuất Bacosid A3 trong rau đắng biển ........................................... 34
3.4.3. Phương pháp định lượng và thẩm định phương pháp .......................................... 34
3.4.4. Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu thực..................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 39
PHỤ LỤC 1 ...........................................................................................................................
PHỤ LỤC 2 ...........................................................................................................................
PHỤ LỤC 3 ...........................................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
AOAC

Nội dung đầy đủ
Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of official

analytical chemists)

ACN

Acetonitrile

BA3

Bacosid A3

EtOH

Ethanol

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

MeOH

Methanol

PDA

Detector mảng diod

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Realtive Standard Deviation)

SKĐ

Sắc ký đồ

TFA

Acid Trifluoroacetic

TLC

Sắc ký lớp mỏng

UV

Tử ngoại (Ultraviolet)

kl/kl

Khối lượng/ khối lượng

kl/tt

Khối lượng/ thể tích

tt/tt

Thể tích/ thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
1.1

Nội dung
Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

Trang
4

jujubogenin trong rau đắng biển
1.2

Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là

4

pseudojujubogenin trong rau đắng biển
1.3

Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển

5

1.4

Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo

10

3.1

Kết quả định lượng Bacosid A3 khi chiết bột rau đắng biển với

20

MeOH và EtOH
3.2

Chương trình Gradient của pha động

24

3.3

Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống

27

3.4

Thời gian lưu mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn

28

3.5

Mối tương quan giữa diện tích peak và nồng độ Bacosid A3

29

3.6

Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp

31

3.7

Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp

32

3.8

Hàm lượng Bacosid A3 trong một số mẫu dược liệu rau đắng biển

33


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Nội dung

Hình

Trang

1.1

Rau đắng biển – Bacopa monnieri

2

1.2

Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

8

3.1

Kết quả khảo sát nồng độ cồn

21

3.2

Kết quả khảo sát thời gian chiết

21

3.3

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử dịch chiết bã dược

22

liệu sau 3 giờ chiết Soxhlet với hệ pha động ACN và TFA 0,05%
(pH = 2,3) (32:68)
3.4

Quy trình chiết Bacosid A3 trong rau đắng biển

23

3.5

Sắc ký đồ (a) Bacopasid I; (b) Bacosid A3 chuẩn và (c) mẫu thử với

24

hệ pha động ACN và đệm phosphat (pH = 2,3) theo chương trình
dung môi 1
3.6

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử với hệ pha động

25

ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (35:65)
3.7

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn và (b) mẫu thử với hệ pha động

26

ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68)
3.8

Sắc ký đồ (a) Bacosid A3 chuẩn; (b) mẫu thử và (c) mẫu thử thêm

28

chuẩn với hệ pha động ACN và TFA 0,05% (pH = 2,3) (32:68)
3.9

Sắc ký đồ của dãy dung dịch chuẩn Bacosid A3 nồng độ 25-500

29

(µg/ml)
3.10

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ
Bacosid A3

30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Rau đắng biển (Bacopa monnieri) là một loại thảo dược vị đắng, tính mát, có tác
dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng.
Ngày nay, ngoài việc sử dung rau đắng biển như một loại thức ăn, rau đắng biển được sử
dụng như một vị thuốc trong các thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khô.
Ngoài ra, trên thị trường Việt Nam hiện nay đã có một số chế phẩm đông dược được sản
xuất từ vị thuốc này như: hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm
phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg và Brahmi 3000 mg, … Các nghiên cứu trong và ngoài
nước đã cho thấy tác dụng nổi bật của rau đắng biển trên hệ thần kinh giúp cải thiện trí
nhớ, tăng cường khả năng nhận thức, học hỏi là nhờ vào hoạt chất Bacosid với 5 loại
chính có trong rau đắng biển gồm: Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid II, Bacopasid X

và Bacopasaponin C. Trong đó, Bacosid A3 là một hoạt chất chiếm hàm lượng tương đối
lớn (chiếm 0,14-0,85% (kl/kl) ở loài B.monnieri tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ, đồng
thời chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A.
Hiện nay, ở nước ta việc đánh giá hàm lượng Bacosid trong rau đắng biển còn
chưa được tiêu chuẩn hóa. Hơn nữa, trong dược điển Việt Nam IV chưa đề cập đến dược
liệu rau đắng biển cũng như các thành phần hóa học trong dược liệu này. Do đó, việc xây
dựng phương pháp xác định hàm lượng các Bacosid trong rau đắng biển là rất cần thiết.
Theo Dược điển Mỹ (USP 38) và Dược điển Ấn Độ (IP 2010), chất chuẩn Bacosid
A3 được sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng tổng các loại Bacosid
chính chiếm hàm lượng chủ yếu trong rau đắng biển. Trong khuôn khổ khóa luận này, do
bị giới hạn về thời gian, kinh tế nên chúng tôi chỉ có thể định lượng hàm lượng một thành
phần Bacosid A3, bước đầu làm cơ sở để định lượng 4 Bacosid còn lại. Vì vậy, đề tài:
“Xây dựng quy trình định lượng Bacosid A3 trong dược liệu rau đắng biển (Bacopa
monnieri)” được thực hiện với mục tiêu:


Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển

bằng phương pháp HPLC.


Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng Bacosid A3 trong một

số mẫu rau đắng biển thu hái ở Việt Nam.
1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về loài Bacopa monnieri

1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật loài Bacopa monnieri
Vị trí phân loại của loài Bacopa monnieri trong hệ thống phân loại thực vật học [33]:
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta);
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida);
Bộ: Hoa Môi (Lamiales);
Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae);
Chi: Bacopa;
Loài: monnieri (L.);
Cây thảo, sống dai có thân nhẵn, mọc bò

Hình 1.1: Rau đắng biển - Bacopa
monnieri [33]
mọc đứng, không lông. Lá mọc đối, không cuống, thuôn hình muỗm, dài 8 – 12 mm, rộng
mang rễ dài 10 - 40 cm, vị rất đắng. Cành mềm

3 – 5 mm, gân chính giữa hơi khó thấy. Hoa lưỡng tính, mọc riêng lẻ ở nách lá, có cuống
dài 1 cm. Năm lá đài không đều, cao 5 – 6 mm, 5 cánh hoa có màu tím nhạt, dính nhau ở
thành ống. Bốn nhị, bầu không lông. Quả nang, hình trứng, nằm trong đài, có mũi, nhắn,
có vòi tồn tại. Hạt nhiều, rất nhỏ, mùa hoa tháng 4 – 6 [3], [4], [6]. Rau đắng biển là loài
cây ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm, ven bờ ruộng, bãi cỏ, bờ mương, cây ra hoa quả
hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt (Hình 1.1).
Phân bố: Cây được trồng nhiều ở khắp các vùng đồng bằng và trung du miền Bắc
và miền Nam [3].
1.1.2. Bộ phận sử dụng
Thu hái phần trên mặt đất, dùng tươi hay phơi khô [3].
1.1.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chính có tác dụng dược lý của Bacopa monnieri gồm các
triterpen tự do, saponin, alkaloid, flavonoid và các phenylethanoid glycosid.

2


a. Saponin triterpenoid
Thành phần hóa học chính có hoạt tính trong B. monnieri chính là các saponin có
cấu trúc nhân dammaran với aglycon là jujubogenin và pseudojujubogenin (Bảng 1.1 và
1.2).
Nghiên cứu về thành phần hóa học đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt đồng thời của
2 saponin là Bacosid A và Bacosid B [9], [12]. Sau đó, các thành phần hóa học chính có
tác dụng cải thiện trí nhớ của B.monnieri đã được phân lập và xác định công thức. Các
thành phần đó là Bacosid A và Bacosid B được phân lập đồng thời cùng nhau, chỉ khác
nhau ở độ quay cực [11].
Tuy nhiên, các nghiên cứu tiếp theo đã chỉ ra rằng Bacosid A và Bacosid B không
hoàn toàn là đơn chất mà là hỗn hợp của các saponin [21]. Trong đó, Bacosid A cũng là
thành phần hóa học trong rau đắng biển được nghiên cứu nhiểu nhất. Hàm lượng Bacosid
A trong các bộ phận của rau đắng biển là khác nhau với hàm lượng cao nhất ở thân (9,54
mg/g) và thấp nhất ở hoa (1,91 mg/g) [27]. Tuy nhiên, các thông tin cụ thể về hoạt tính
sinh học của từng Bacosid vẫn chưa được làm rõ [22]. Bacosid A là hỗn hợp của 4
triglycosidic saponin: Bacosid A3, Bacopasid X (jujubogenin), Bacopasid II và
Bacosaponin C (pseudojujubogenin) với khoảng hàm lượng lần lượt là 0,14-0,85%; 0,050,72%; 0,12-0,69% và 0,05-0,44% (kl/kl) khi thu hái tại các vùng khác nhau ở Ấn Độ [8],
[13]. Trong đó, Bacosid A3 có công thức phân tử là: C47H76O18, khối lượng mol: 929,11
g/mol, là một chất bột trắng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy từ 244-250oC, có tính
phân cực mạnh và hòa tan tốt trong các dung môi phân cực như: MeOH, EtOH [39].
Bacosid B là một hỗn hợp các aglycon là các jujubogenin hoặc pseudojujubogenin như:
bacopasid

N1,

bacopasid

IV

(jujubogenin),

bacopasid

N2,

bacopasid

V

(pseudojujubogenin) [16]. Quy trình chiết xuất Bacosid trong rau đắng biển của một số tài
liệu tham khảo được trình bày ở bảng 1.4. Ngoài ra, D-manitol và một saponin là
hersaponin cũng đã được Sastri và cộng sự phân lập năm 1959 [37].

3


Bảng 1.1: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là jujubogenin
trong rau đắng biển [46]

Jujubogenin
STT

Tên chất

1

Bacosid A3

R
β-D-glucopyranosyl-(1→3)-O-{α-L-arabinofuranosyl(1→2)}-O-(β-D- glucopyranosyl)

2

Bacopasid N1

β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl

3

Bacopasid IV

β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl

4

Bacopasid X

α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-D-glucopyranosyl-

(Bacopasaponin C

(1→3)}- α-L-arabinofuranosyl

isomer)
Bảng 1.2: Cấu trúc một số hợp chất saponin glycosid có aglycon là
pseudojujubogenin trong rau đắng biển [46]

Pseudojujubogenin
STT

Tên chất

5

Bacopasaponin C

R
β-D-glucopyranosyl-(1→3)-{ α-L-arabinofuranosyl(1→2)}- α-L-arabinofuranosyl

6

Bacopasid N2

β-D-glucopyranosyl-(1→3)- β-D-glucopyranosyl

7

Bacopasid II

α-L-arabinofuranosyl-(1→2)-{ β-D-glucopyranosyl(1→3)}- β-D-glucopyranosyl

8

Bacopasid V

β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinofuranosyl

4


b. Flavonoid
Ngoài các saponin đã được phân lập và xác định cấu trúc, Flavonoid được tìm thấy
trong rau đắng biển là Luteonin và Apigenin (Bảng 1.3). Một số nhà khoa học đã tiến
hành định lượng Luteolin trong các bộ phận khác nhau của rau đắng biển được thu hái tại
các vùng khác nhau tại Ấn Độ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và thu
được kết quả hàm lượng Luteolin trong lá B.monnieri thu hái tại vùng Bhayander,
Maharashtra là 0,1691 ± 0,0024 mg/ 500 g; trong khi hàm lượng Luteolin định lượng
trong thân B.monnieri thu hái tại vùng Chembur, Mumbai là 0,0940 ± 0,0047 mg/ 500 g
[45]. Ngoài ra, hàm lượng Luteolin và Apigenin được định lượng trong dịch chiết MeOH
của B.monnieri lần lượt là 0,22% và 0,45% [31].

Luteolin

Apigenin

Bảng 1.3: Cấu trúc các flavonoid trong rau đắng biển
c. Các thành phần khác:
Ngoài ra, rau đắng biển còn chứa các alkaloid như Hydrocotylin, Brahmin,
Herpestin và các glycosid như Asiaticosid, Thanakunicid [32], [37].
1.1.4. Tác dụng dược lý
a. Theo y học cổ truyền:
Rau đắng biển có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, thanh
nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng. Toàn cây rau đắng biển được dùng chữa
suy nhược thần kinh, mất trương lực cơ, động kinh, thao cuồng, mất tiếng, khản tiếng,
viêm phế quản cấp, ho, hen, chữa bí đái, viêm gan, thấp khớp, rắn cắn và bệnh ngoài da
như da sưng dày lên như da voi, lở, nhọt độc, ghẻ. Ngày 6-12 g dạng thuốc sắc, dùng
ngoài không kể liều lượng. Ngoài ra, rau đắng biển có thể được dùng như rau sống hoặc

nấu chín ăn [3].
5


Dịch chiết Brahmin từ cây rau đắng biển và một số dược liệu khác được sử dụng
trong nền y học cổ truyền Ayurvedic (Ấn Độ) hàng thế kỷ nay như một thuốc bổ não để
tăng cường trí nhớ, khả năng học tập và sự tập trung, giảm lo âu, trầm cảm và động kinh,
suy giảm nhận thức [34].
b. Theo y học hiện đại:
Theo các nghiên cứu trên thế giới, rau đắng biển có một số tác dụng dược lý chính
như sau:


Tác dụng chống vi khuẩn: Tác dụng chống vi khuẩn của dịch chiết B.monnieri

trong các dung môi khác nhau đã được đánh giá bởi Sampathkumar và cộng sự năm 2008.
Kết quả cho thấy dịch chiết trong Diethyl ether có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram (+)
(Staphylococcus aureus, trong khi dịch chiết bằng Ethyl acetat chống được vi khuẩn
Gram (-) (Proteus vulgaris) [36]. Ngoài ra, dịch chiết cồn có tác dụng diệt các loại nấm
như Aspergillus niger, Candida albicans [20].


Tác dụng chống ung thư: Dịch chiết cồn của cây rau đắng biển có tác dụng ức chế

sự phát triển của tế bào nuôi cấy sarcoma-180 bằng cách tác động lên quá trình sao chép
DNA [15].


Tác dụng trên hệ tim mạch: Alkaloid Bahmin được chiết từ rau đắng biển với liều

0,5 mg/ kg có tác dụng hạ huyết áp ở mèo, với liều nhỏ hơn gây tăng huyết áp nhẹ do co
mạch và kích thích cơ tim. Tổng các thành phần chiết xuất từ B.monnieri có tác dụng trợ
tim, co mạch, ức chế hệ thần kinh – cơ [23].


Tác dụng trên hệ thần kinh:
+ Tác dụng chống lo âu, trầm cảm: Các thành phần bacosid A và B, bacosid I,

bacosid II, và bacopasaponin C đã được chứng minh là có hoạt tính chống trầm cảm trên
mô hình chuột bơi cưỡng bức và mô hình treo đuôi chuột trong nghiên cứu của Zhon và
cộng sự năm 2007 [46]. Ngoài ra, Hersaponin - một loại glycosid được phân lập từ
B.monnieri, đã được chứng minh là có tác dụng an thần, chống lo âu [23].
+ Tác dụng chống động kinh: Nghiên cứu lâm sàng được thực hiện bởi
Dhanasekaran và cộng sự năm 2007 cho kết quả về hiệu quả của dịch chiết B.monnieri
trong việc làm giảm các triệu chứng của động kinh [14]. Một thí nghiệm khác nghiên cứu
6


về động kinh thùy thái dương (một hội chứng động kinh thường gặp) cho thấy hiệu quả
điều trị của B.monnieri và Bacosid A trên chuột bị động kinh [24].
+ Tác dụng cải thiện trí nhớ, khả năng nhận thức và học hỏi: B.monnieri có tác
dụng cải thiện trí nhớ có thể là do khả năng làm tăng tuần hoàn não bằng cách ức chế quá
trình oxy hóa ở não, đồng thời tăng nồng độ serotonin ở não [44]. Nghiên cứu việc sử
dụng sản phẩm từ B.monnieri trong điều trị rối loạn khả năng tập trung ở trẻ em (ADHD –
Attention-deficit hyperactivity disorder) được tiến hành kiểm soát ở đại học Y dược BRD
tại Gorakhpur, kết quả thu được cho thấy sự gia tăng đáng kể trong việc nhắc lại câu văn,
tư duy logic và học tập theo cặp trong cả 19 trẻ được sử dụng Bacopa [38].


Tác dụng trên hệ nội tiết: Dịch chiết cồn của lá B.monnieri tăng nồng độ hormone

tuyến giáp T4 (tới 41%) ở chuột đực thông qua tác dụng cường giáp theo kết quả nghiên
cứu của Kar và cộng sự năm 2002 [19].


Tác dụng trên hệ hô hấp: Dịch chiết của B.monnieri đã được chứng minh có tác

dụng giãn phế quản trên chuột bị gây mê [10].


Tác dụng trên hệ tiêu hóa: Dịch chiết của cây B.monnieri sạch có tác dụng bảo vệ

và chữa lành vết loét đường tiêu hóa trên nhiều mẫu động vật khác nhau. Cơ chế tác dụng
được cho là gia tăng các yếu tố bảo vệ niêm mạc (bài tiết chất nhày, tăng tuổi thọ của tế
bào niêm mạc, chống oxy hóa,…), giảm các yếu tố tấn công (sự bài tiết acid, pepsin) [35].
Dịch chiết B.monnieri có khả năng chống loét đại tràng bằng cách ức chế sự phát triển
của Helicobacter pylori, tăng nồng độ prostaglandin E và Prostaglandin I2 ở đại tràng
[17]. Ngoài ra, khi uống dịch chiết cồn của B.monnieri sẽ tạo ra tác dụng bảo vệ gan bằng
cách chống lại sự suy giảm các emzyme chống oxy hóa ở gan (superoxide dismutase,
catalase, glutathione peroxidase, glutathione reductase) theo nghiên cứu của Sumathy và
cộng sự năm 2001 [40].
1.2.

Tổng quan về phương pháp HPLC

1.2.1. Nguyên tắc hoạt động
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách trong đó, mẫu lỏng hoặc
rắn được hòa tan thành dung dịch thích hợp rồi đưa đi qua cột sắc ký bởi pha động (chất
lỏng). Tốc độ di chuyển khác nhau phụ thuộc vào các tương tác: chất tan – pha tĩnh, chất
tan – pha động và pha động – pha tĩnh, do đó các thành phần khác nhau trong dung dịch

7


chất phân tích sẽ có tốc độ di chuyển khác nhau dẫn đến sự phân tách. Thành phần pha
động đưa các chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất
phân tích với thời gian hợp lý. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được detector phát hiện và
chuyển qua bộ phận xử lí số liệu [1], [5], [18].
1.2.2. Cấu tạo HPLC
Nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận
kết nối với nhau [1], [2], [5], [18]:


Hệ thống cấp pha động;



Bơm sắc ký lỏng;



Bộ phận tiêm mẫu;



Cột;



Detector;



Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu.

1.2.2.1.

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo của máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao [25]

Hệ thống cấp pha động

Pha động trước khi đưa vào bình chứa pha động cần được lọc qua màng lọc
0,45µm và loại bỏ khí hòa tan trong pha động (ví dụ: N2, O2) bằng cách: rung siêu âm, sục
khí trơ Heli có khả năng hòa tan thấp trong pha động.
1.2.2.2.

Bơm sắc ký lỏng

Hệ thống bơm sắc ký phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưu lượng không
đổi. Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suất sinh ra do hệ thống bơm. Máy
sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar (407 atm), tốc độ dòng từ 0,1 –
9,999 ml/phút. Hệ thống được điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp 2 chế độ
vận hành của pha động bao gồm:


Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký.



Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, thường là 2-4 loại dung môi

được đặt trong các bình khác nhau. Tỷ lệ các thành phần thay đổi trong quá trình chạy sắc
ký theo chương trình đã định trước (chương trình dung môi).

8


1.2.2.3.

Bộ phận tiêm mẫu

Mẫu được tiêm thẳng vào pha động ở ngay đầu cột với áp suất cao nhờ sự điều
chỉnh dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu cho phép thể tích tiêm từ 5 µL – 100
µL. Có 2 cách tiêm mẫu vào cột là tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫu tự động. Khi tiêm
bằng tay có thể gây sai số do thể tích tiêm vào vòng chứa mẫu không đủ.
1.2.2.4.

Cột

Một máy HPLC bình thường có hai cột: cột phân tích và cột bảo vệ.


Cột phân tích:
-

Loại cột phân tích phổ biến nhất hiện nay được làm bằng thép không gỉ;

ngoài ra còn có cột bằng thủy tinh hoặc chất dẻo.
-

Chiều dài cột: 10 – 30 cm.

-

Đường kính trong cột: 4 – 10 mm.

-

Hạt nhồi cột: đường kính 3-10 µm; có thể được chế tạo từ silica, nhôm oxit,

polymer xốp, nhựa trao đổi ion. Các hạt silica gel hình thành thường được bao một lớp
mỏng hữu cơ liên kết với bề mặt.


Lò cột: đảm bảo nhiệt độ ổn định cho cột.

Cột bảo vệ:
-

Cột được nhồi các hạt nhồi cột và pha tĩnh tương tự như cột phân tích,

nhưng ngắn hơn và rẻ hơn, dài 7,5 mm và giá chỉ bằng 1/10 cột phân tích thông thường;
đặt trước cột sắc kí để loại bớt tạp và gia tăng tuổi thọ của cột phân tích.
1.2.2.5.

Detector

Là một bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất phân tích mà
sử dụng detector phù hợp. Một số loại detector hiện đang được sử dụng:


Detector quang phổ: Detector được sử dụng phổ biến nhất, hoạt động dựa trên sự

đo lường quang phổ, bao gồm sự hấp thụ UV-VIS và sự phát huỳnh quang. Cấu tạo của
Detector loại này gồm: nguồn sáng, bộ lọc ánh sáng, cách tử, buồng đo, mảng Diod.
-

Detector hấp thụ UV-VIS: áp dụng cho những chất có khả năng hấp thụ ánh

sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến. Khi dùng detector này quang phổ thu được là đồ
thị của độ hấp thụ biến thiên theo thời gian rửa giải. Giới hạn phát hiện từ 100pg – 1ng
chất phân tích. Thiết bị có sử dụng thêm mảng diod trong quá trình đo phổ có thể ghi lại
9


toàn bộ phổ, sắc ký đồ 3 chiều biểu thị độ hấp thụ là một hàm theo bước sóng và thời gian
rửa giải.
Detector huỳnh quang (RF): sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát

-

huỳnh quang (tính chọn lọc). Đối với những chất có bản chất không phát huỳnh quang,
cần tạo dẫn xuất của chất phân tích có khả năng bắt huỳnh quang.


Detector chỉ số khúc xạ (RI): thường dùng để định lượng các hợp chất đường.



Detector điện hóa: Detector hoạt động dựa trên nguyên tắc đo điện thế, độ dẫn,

điện phân,…
1.3.

Phương pháp chiết xuất và phân tích định lượng bacosid và bacosid A3

1.3.1. Phương pháp chiết xuất
Quy trình chiết xuất Bacosid trong dược liệu rau đắng biển của một số tài liệu tham khảo
được trình bày ở bảng sau:
Bảng 1.4: Quy trình chiết xuất Bacosid trong các tài liệu tham khảo
Tài liệu
Quy trình chiết xuất

tham
khảo
[24]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được phơi khô, nghiền thánh bột.
+ Dung môi sử dụng: EtOH 90%, Aceton.
+ Số lần chiết: 3 lần.

[26]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được rửa với nước, phơi khô và nghiền thành
bột thô.
+ Dung môi sử dụng: Hexan, Aceton, MeOH, n-Butanol, nước.

[28]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được rửa với nước và sấy khô ở 50oC/ 12 giờ.

+ Dung môi sử dụng: MeOH.

[29]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và phơi khô.
+ Dung môi sử dụng: EtOH 95%.

[30]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được ngâm với nước trong 24 giờ và ép loại bỏ
nước, phơi khô.
+ Dung môi sử dụng: EtOH 95%, MeOH.
10


[41]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột, rây qua rây 355.
+ Dung môi sử dụng: MeOH 70%.

[43]

+ Xử lý mẫu: Rau đắng biển được nghiền thành bột mịn.
+ Dung môi sử dụng: MeOH.

Nhận xét: Các phương pháp chiết được sử dụng để chiết Bacosid trong rau đắng biển là
chiết ngâm, chiết hồi lưu, chiết Soxhlet hay chiết bằng sóng siêu âm. Các dung môi sử
dụng chiết Bacosid trong các tài liệu tham khảo chủ yếu là MeOH và EtOH. Ngoài ra, các
nghiên cứu [24], [26] trong quá trình chiết có sử dụng thêm n-Butanol, Aceton hoặc
Hexan để loại bỏ chất béo và tạp.

1.3.2. Phương pháp phân tích định lượng
Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao để định lượng bacosid trong rau đắng biển. Một số chương trình chạy sắc ký
trong các tài liệu tham khảo được tổng kết như sau:
 Theo tác giả Navneet Kumar M. [28]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm
+ Pha động: ACN : TFA 0,1% (35:65, tt/tt)
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL
+ Detector: PDA 205 nm

-

Kết quả: Thời gian lưu của Bacosid A3: 14,805 phút

 Theo Phrompittayarat W. và cộng sự [30]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Luna RP-18 (150 mm x 4,6 mm), kích thước hạt: 5µm
+ Cột bảo vệ: Phenomenex RP-18
+ Pha động: ACN : H3PO4 0.2% (35:65, tt/tt), điều chỉnh pH đến 3,0 bằng NaOH 5M
+ Thể tích tiêm: 20µL
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Detector: PDA 205 nm
11

-

Kết quả:
+ Hai thành phần có hàm lượng lớn nhất trong rau đắng biển là Bacopasid II (0,27 –
0,59%, kl/kl) và Bacopasid I (0,35 – 0,71%, kl/kl).
+ Hàm lượng Bacosid A3 trong rau đắng biển là 0,07-0,34% (kl/kl).

 Theo Sivaramakrishna C. và cộng sự [39]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
+ Pha động: ACN : Na2SO4 0,05M (pH= 2,3) (31,5 : 68,5, tt/tt)
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: 30oC
+ Thể tích tiêm: 20µL
+ Bước sóng phát hiện: 205 nm

-

Kết quả: Bacosid A3 chiếm 29,45% (kl/kl) trong 4 thành phần của Bacosid A.

 Dược điển Anh (BP 2016) đưa ra điều kiện [41]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
+ Pha động đẳng dòng (isocratic): ACN : Na2SO4 (từ Na2SO4 khan 0,71%, kl/tt) (315 :
685, tt/tt), điều chỉnh về pH = 2,3 bằng acid sulfuric

+ Dung môi pha mẫu: MeOH 70%
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: 30oC
+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL
+ Bước sóng phát hiện: 205 nm

-

Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển:
Bacopasid I, Bacosid A3, Bacopasid X và Bacopasaponin C so với Bacopasid II lần
lượt là: 1,4; 0,9; 1,2; 1,3.

 Dược điển Ấn Độ (IP 2010) đưa ra điều kiện [42]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột thép không gỉ C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
+ Pha động (Gradient): ACN : đệm H3PO4 (pH = 2,8) theo chương trình:
12


Thời gian (phút)

Đệm H3PO4 (%, tt/tt)

ACN (%, tt/tt)

0

70

30

25

60

40

35

40

60

36

70

30

45

70

30

+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL
+ Bước sóng phát hiện: 205 nm

-

Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học trong rau đắng biển:
Bacopasid II, Bacopasid X và Bacopasaponin C so với Bacosid A3 lần lượt là: 1,04;
1,13; 1,19.

 Dược điển Mỹ (USP 38) đưa ra điều kiện [43]:
-

Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Phenomenex Luna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)
+ Pha động (Gradient): ACN : đệm phosphat (từ KH2PO4 khan và H3PO4, pH = 2,3)
+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: 27oC
+ Thể tích tiêm mẫu: 20µL
+ Detector: UV 205 nm

-

Kết quả: Tỷ lệ thời gian lưu của các thành phần hóa học chính trong rau đắng biển:
Bacopasid I, Bacopasid II, Bacopasid X và Bacopasaponin so với Bacosid A3 lần lượt
là: 0,73; 1,04; 1,15; 1,22.

Nhận xét:
+ Đối tượng rau đắng biển được rửa sạch, sấy khô và nghiền thành bột.
+ Các chương trình sắc ký đều sử dụng thành phần pha động chính là ACN cùng
một dung dịch đệm có pH vùng acid, và chủ yếu chạy với chế đồ đẳng dòng pha động.
+ Các điều kiện sắc ký trong các tài liệu tham khảo hầu hết đều sử dụng cột sắc ký
pha đảo C18, thể tích tiêm mẫu 20µl, tốc độ dòng 1,0 – 1,5 ml/phút và bước sóng phát
hiện là 205 nm.

13


+ Bacosid A3 chiếm hàm lượng tương đối lớn (29,45%, kl/kl) trong 4 thành phần
của Bacosid A.
+ Các tài liệu tham khảo chỉ công bố thời gian lưu của các Bacosid khác so với
BA3 cho thấy có thể sử dụng BA3 làm căn cứ để xác định các thành phần khác trong
dược liệu rau đắng biển.

14


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.

Đối tượng và hóa chất, thiết bị

2.1.1. Đối tượng
Các mẫu dược liệu rau đắng biển (Bacopa monnieri) sử dụng trong nghiên cứu
được thu hái và phơi khô tại “Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Bắc Trung bộ - Viện dược
liệu”. Các mẫu này đều được giám định tên khoa học tại khoa tài nguyên của Viện Dược
Liệu lưu giữ tại khoa Công Nghệ Chiết Xuất – Viện Dược Liệu
2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất


Chất chuẩn:
+ Bacosid A3 Trung Quốc (98%).
+ Bacopasid I Trung Quốc.



Dung môi, hóa chất:
+ Acetonitril (≥ 99,9 %), loại HPLC, Fisher, Mỹ;
+ Methanol (≥ 99,8 %), loại HPLC, Merck, Đức;
+ Acid trifluouroacetic (≥ 99,9 %), loại HPLC, Fisher, Mỹ;
+ Ethanol, methanol, đạt tiêu chuẩn phân tích (P.A), Trung Quốc;
+ Nước cất 2 lần.

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị


Máy siêu âm Daihan, Hàn Quốc.



Cân hàm ẩm OHAUS, Switzerland.



Tủ sấy Memmert, Đức.



Cân phân tích 4 số AND, Nhật Bản



Máy chiết béo Soxhlet 148 Velp, Italy.



Máy HPLC UFLC Shimadzu, Nhật Bản.



Các dụng cụ khác: Bình định mức, Micropipet 100-1000 µl, ống đong, cồn kế, …

15


2.2.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích
Dựa trên các tài liệu tham khảo về điều kiện chiết Bacosid trong rau đắng biển
(Bảng 1.4), chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện chiết mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký
để xây dựng phương pháp phân tích.
Khảo sát điều kiện chiết mẫu:


Dung môi chiết: Khảo sát các dung môi: MeOH, EtOH 96o, EtOH 50o, nước. Lựa

chọn dung môi và nồng độ tại đó cho hiệu suất chiết cao nhất.


Thời gian chiết: Chiết mẫu với các thời gian khác nhau. Lựa chọn thời gian chiết

tại đó Bacosid A3 được chiết kiệt và tiết kiệm thời gian nhất.
Lựa chọn điều kiện sắc ký:



Cột sắc ký: Sử dụng cột sắc ký pha đảo có sẵn tại phòng thí nghiệm: Shim-pack

GIST C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).


Bước sóng phát hiện: Khảo sát bước sóng tối ưu với điều kiện phân tích.



Thể tích tiêm, tốc độ dòng, nhiệt độ cột: Khảo sát thể tích tiêm và tốc độ dòng tối

ưu cho peak sắc ký rõ nét, thời gian lưu hợp lý.


Pha động: Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động.

2.2.2. Thẩm định phương pháp [7]
2.2.2.1.

Tính thích hợp của hệ thống

Xác định bằng cách lặp lại 6 lần một mẫu chuẩn có nồng độ chất phân tích nằm
trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích peak của các lần sắc ký.
Yêu cầu: Chênh lệch diện tích peak, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một
mẫu biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD không lớn hơn 2%.
2.2.2.2.

Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các chất tương
tự, tạp chất,… Trong phép phân tích định lượng, đó là khả năng xác định chính xác chất
phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả
chính xác. Sau khi chuẩn bị mẫu thử, phân tích mẫu trên thiết bị sắc ký thu được peak sắc

16


ký, ta thêm chuẩn vào mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. Đánh giá tính đặc hiệu
bằng cách tiến hành so sánh sắc ký đồ của hai mẫu: Mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn.
Yêu cầu: Sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn phải tương đồng nhau,
trong đó peak của Bacosid A3 phải tương tự nhau về thời gian lưu và chỉ khác nhau về
diện tích peak. Đồng thời, phổ tại các điểm trên peak của Bacosid A3 thuộc hai sắc ký đồ
phải giống nhau về hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại.
2.2.2.3.

Đường chuẩn

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch chuẩn Bacosid A3 pha trong MeOH: 25, 50, 100, 200,
250, 500 µg/ml, từ chuẩn Bacosid A3 1 mg/ml. Tiến hành đo các mẫu dung dịch chuẩn đã
chuẩn bị. Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ
(trục hoành x). Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính (y = ax + b) bằng Microsoft
office Excel.
Yêu cầu: Hệ số tương quan R: 0,995 ≤ R ≤ 1.
Độ chệch giữa các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn ∆ i =

Ct−Cc
Cc

x 100

không vượt quá ± 15%. Riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%.
2.2.2.4.

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ
không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong
mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
Xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Tiến hành phân tích dãy
mẫu chuẩn có nồng độ thấp dần cho đến khi còn có thể xuất hiện tín hiệu của Bacosid A3.
Sau đó xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N: signal to noise ratio). Trong đó, S là
chiều cao tín hiệu Bacosid A3, N là nhiễu đường nền. Nhiễu đường nền được tính về hai
phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của peak, chiều rộng mỗi bên
tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao.
Lấy giá trị LOD là nồng độ Bacosid A3 tại đó cho S/N = 3.
Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà
ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn.
Tương tự như LOD, xác định LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N).
17