Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tương chó bằng HPLC

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
ACID FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT
TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ BẰNG
HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ

HÀ NỘI 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGỌC
MSV : 1301293

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG
AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT
TRONG HUYẾT TƢƠNG CHÓ BẰNG
HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ
Người hướng dẫn :
1. TS. Nguyễn Thị Thuận
2. HVCH. Phạm Thị Huyền Chang
Nơi thực viện :

1. Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia
2. Bộ môn hóa dƣợc

Hà Nội-2018


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân
thành gửi lời cảm ơn đến những ngƣời trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động
viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình.
Trƣớc tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với ngƣời cô đáng kính của tôi: TS.
Nguyễn Thị Thuận - Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội và ngƣời chị
Phạm Thị Huyền Chang – Cao học 21 - trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Cô và chị
không chỉ hƣớng dẫn chỉ bảo tôi tận tình mà còn luôn tạo những điều kiện thuận lợi
nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận .
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật
viên của Viện Công Nghệ Dƣợc Phẩm Quốc Gia, Bộ môn Hóa Dƣợc - trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội, đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm
kiểm nghiệm bộ môn Hóa đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 4 tháng 1 năm 2018
Sinh viên
Nguyễn Thị Ngọc.


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN ................................................................................... 2

1.1.Tổng quan về acid fenofibric (FA) và fenofibrate (FB) ............................... 2
1.2. Tổng quan về kỹ thuật HPLC ....................................................................... 5
1.3.Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng ......... 9
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 12
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 13
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................. 13
2.4. Ứng dụng thực tế .......................................................................................... 18
2.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả ......................................................................... 18
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................. 20
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................ 20
3.2. Thẩm định phƣơng pháp ............................................................................. 22
3.2.1. Sự phù hợp hệ thống sắc ký ..................................................................... 22
3.2.2. Độ chọn lọc, độ đặc hiệu ......................................................................... 23
3.2.3. Tỷ lệ thu hồi ............................................................................................. 23
3.2.4. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ......................................................... 25
3.2.5. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ............... 27
3.2.6. Độ đúng, độ lặp lại .................................................................................. 29
3.2.7. Độ ổn định ............................................................................................... 33
3.3. Ứng dụng thực tế .......................................................................................... 37
BÀN LUẬN .......................................................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 42
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 44


DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú thích

µg

Microgram

µl

Microlit

Autosampler

Hệ thống tiêm mẫu tự động

C18

Cột Octadecylsilan

CE

Điện di mao quản

CV

Hệ số biến thiên

DĐVN IV

Dƣợc điển Việt Nam IV

EtOAc

Ethyl acetat

FA

Acid fenofibric

FB

Fenofibrate

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Mỹ

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

UPHLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

HQC

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

HT

Huyết tƣơng

IS

Chuẩn nội

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ 2 lần

LLOQ

Giới hạn định lƣợng dƣới

LOD

Giới hạn phát hiện

LQC

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

MeCN

Acetonitril


MeOH

Methanol

MQC

Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

PĐ

Pha động

r

Hệ số tƣơng quan

R%

Độ thu hồi (%)

RSD

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SD

Độ lệch chuẩn

SKD

Sinh khả dụng

Spic

Diện tích pic

TB

Trung bình

TĐSH

Tƣơng đƣơng sinh học

Tltk

Tài liệu tham khảo

tR

Thời gian lƣu giữ

V

Thể tích

ULOQ

Giới hạn định lƣợng trên


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1 : Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng ............ 9
Bảng 2. 1 : Danh mục chất chuẩn .................................................................................. 12

Bảng 2. 2 : Danh mục dung môi và hoá chất ................................................................ 12
Bảng 2. 3: Bảng nồng độ các mẫu QC .......................................................................... 14
Bảng 3. 1: Chƣơng trình gradient .................................................................................. 22
Bảng 3. 2 : Kết quả sự phù hợp hệ thống ...................................................................... 23
Bảng 3. 3: Kết quả tỷ lệ thu hồi FA sau khi chiết ......................................................... 24
Bảng 3. 4: Kết quả tỷ lệ thu hồi FB sau khi chiết.......................................................... 24
Bảng 3. 5: Kết quả tỷ lệ thu hồi IS sau khi chiết ........................................................... 25
Bảng 3. 6 : Các giá trị sử dụng trọng số ........................................................................ 25
Bảng 3. 7 : Kết quả khảo sát đƣờng chuẩn FA .............................................................. 26
Bảng 3. 8 : Kết quả khảo sát đƣờng chuẩn FB .............................................................. 26
Bảng 3. 9 : Kết quả xác định giới hạn định lƣợng dƣới FA .......................................... 27
Bảng 3. 10 : Kết quả xác định giới hạn định lƣợng dƣới FB ........................................ 28
Bảng 3. 11 : Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FA .......................... 29
Bảng 3. 12 : Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày của FB .......................... 30
Bảng 3. 13 : Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FA .......................... 31
Bảng 3. 14 : Kết quả xác định độ đúng, độ lặp lại khác ngày của FB .......................... 32
Bảng 3. 15: Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng .................................... 33
Bảng 3. 16: Độ ổn định của mẫu sau xử lý ................................................................... 34
Bảng 3. 17: Độ ổn định của mẫu huyết tƣơng sau 3 chu kì đông – rã .......................... 35
Bảng 3. 18: Độ ổn định trong 30 ngày của mẫu huyết tƣơng ....................................... 36
Bảng 3. 19 : Nồng độ FA, FB trong huyết tƣơng chó theo đƣờng chuẩn ..................... 37


DANH MỤC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ
Hình 1. 1 : Công thức cấu tạo của FA ............................................................................. 2
Hình 1. 2 : Công thức cấu tạo của FB ............................................................................. 2
Hình 1. 3 : Sơ đồ máy HPLC........................................................................................... 6
Hình 3. 1: Phổ xác định bƣớc sóng hấp thụ của FA và FB ........................................... 20
Hình 3. 2 : Sắc ký đồ chạy MeCN: đệm phosphat pH3 ................................................ 20
Hình 3. 3 : Sắc ký đồ chạy MeOH: đệm phosphat pH3 ................................................ 21

Hình 3. 4: Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 80: 20 ....................................... 21
Hình 3. 5 : Sắc ký đồ hệ MeOH: đệm phosphat pH3= 90: 10 ...................................... 21
Hình 3. 6 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient ................................................................. 22
Hình 3. 7 : Sắc ký đồ của FA, FB, IS kiểm tra sự phù hợp hệ thống. ........................... 22
Hình 3. 8 : Sắc ký đồ mẫu LLOQ……………………………………………………..23
Hình 3. 9 : Sắc ký đồ mẫu trắng……………………………………...……………….23
Hình 3. 10: Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FA .......................................... 28
Hình 3. 11: Sắc ký đồ phát hiện giới hạn phát hiện của FB .......................................... 29
Hình 3. 12: Đồ thị nồng độ FA trong HT chó theo thời gian ........................................ 38
Hình 3. 13: Đồ thị nồng độ FB trong HT chó theo thời gian ........................................ 38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn lipid máu hay còn gọi là bệnh mỡ máu, hiện đang là căn bệnh phổ biến
trong thế giới hiện đại. Trong những năm gần đây số ngƣời tử vong vì các bệnh tim
mạch, đột quỵ tăng lên nhanh chóng, mà nguyên sâu xa lại bắt nguồn từ mỡ máu. Bệnh
mỡ máu nếu đƣợc phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể duy trì ổn định các chỉ số
mỡ máu, phòng tránh các biến chứng nguy hiểm.
Hiện nay có nhiều nhóm thuốc để điều trị rối loạn lipid, trong đó nhóm thuốc
statin và nhóm thuốc fibric đƣợc sử dụng rộng rãi. Fenofibrat là một dẫn chất của acid
fibric đƣợc dùng trong điều trị rối loạn mỡ máu. Chất này có tác dụng ức chế sinh tổng
hợp cholesterol ở gan làm giảm các thành phần gây xơ vữa, giảm triglycerid và làm
tăng lipoprotein tỉ trọng cao, do đó có tác dụng tốt trong điều trị mỡ máu.
Sau khi uống, fenofibrat bị thủy phân trong huyết tƣơng thành chất chuyển hoá
có hoạt tính là acid fenofibric.
Hiện nay, fenofibrat có nhiều dạng bảo chế mới nên có thể khi uống vào cơ thể
fenofibrat chƣa bị thủy phân ngay thành aicd fenofibric. Tuy nhiên ở Việt Nam chƣa
có phƣơng pháp nào đƣợc xây dựng để định lƣợng đồng thời aicd fenofibric và
fenofibrat trong huyết tƣơng.
Do đó chúng tôi thực hiện đề tài : “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG

PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AICD FENOFIBRIC VÀ FENOFIBRAT TRONG HUYẾT
TƢƠNG BẰNG HPLC” nhằm mục đích :
1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng FA và FB trong huyết tƣơng
chó.

2. Ứng dụng đánh giá nồng độ FA và FB trong một số mẫu HT chó.

1


CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về acid fenofibric (FA) và fenofibrate (FB)
1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của FA và FB
Acid fenofibric :
O
H3C CH3
Cl

OH

O
O

Hình 1. 1 : Công thức cấu tạo của FA
- Tên khoa học : 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoic acid
- Công thức phân tử : C17H15ClO4
- Khối lƣợng phân tử: 318,75
- Tính chất hóa lý:
+ Là dạng chuyển hóa có hoạt tính trong huyết tƣơng của FB bằng cách cắt liên kết
ester trong phân tử FB nhờ enzyme esterase.

+ Dạng bột tinh thể màu trắng hoặc hơi trắng, không tan trong nƣớc, độ tan tăng trong
các hệ đệm, tan tốt trong MeOH, nóng chảy ở 179-1830C.
+ Có khả năng hấp thụ UV cực đại ở 288nm, nên có thể định lƣợng bằng HPLC
detector UV-VIS tại bƣớc sóng này.
Fenofibrat:
O

O

O

Cl

O

Hình 1. 2 : Công thức cấu tạo của FB
-

Tên khoa học: 1-methylethyl 2-[4-(4-clorobenzoyl) phenoxy]-2-methylpropanoat.
2


-

Công thức phân tử : C20H21ClO4

-

Khối lƣợng phân tử: 360,8 [2]

-

Tính chất vật lý: Bột kết tinh màu trắng. Thực tế không tan trong nƣớc, rất dễ tan
trong methylen clorid, khó tan trong ethanol 96%. Fenofibrat thân dầu, trung tính,
hệ số phân bố D/N logP = 5,24. Nóng chảy ở 79-820C.

-

Tính chất hóa học: có cấu trúc ester nên dễ bị thủy phân cho acid fenofibric (FA)
và isopropanol. Hấp thụ tia UV ở bƣớc sóng 286nm nên có thể định lƣợng bằng
HPLC detector UV-VIS tại bƣớc sóng này [2].

1.1.2 Đặc điểm dược động học của FA và FB
Fenofibrat đƣợc hấp thu ngay ở đƣờng tiêu hóa cùng với thức ăn. Hấp thu thuốc
bị giảm nhiều nếu uống sau khi nhịn ăn qua đêm. Thuốc nhanh chóng bị thủy phân
thành acid fenofibric có hoạt tính; chất này gắn nhiều vào albumin huyết tƣơng và có
thể đẩy các thuốc kháng vitamin K ra khỏi vị trí gắn. Nồng độ đỉnh trong huyết tƣơng
xuất hiện khoảng 5 giờ sau khi uống thuốc. Acid fenofibric đào thải chủ yếu theo nƣớc
tiểu (70% trong vòng 24 giờ, 88% trong vòng 6 ngày), chủ yếu dƣới dạng liên hợp
glucuronic.
Không thấy xảy ra điều gì nghiêm trọng khi ngừng dùng fibrat, thậm chí sau khi
đã điều trị lâu ngày và cắt thuốc đột ngột [3].
1.1.3 Dược lý dược lâm sàng
1.1.3.1 Tác dụng dược lý [3], [6] :
Fenofibrat, dẫn chất của acid fibric, là thuốc hạ lipid máu. Thuốc ức chế sinh
tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây vữa xơ (lipoprotein tỷ trọng
rất thấp VLDL và lipoprotein tỷ trọng thấp LDL), làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ
trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu, do đó giúp cải thiện đáng kể sự
phân bố cholesterol trong huyết tƣơng [6].
Fenofibrat đƣợc dùng để điều trị tăng lipoprotein- huyết typ IIa, typ IIb, typ III,

typ IV và typ V cùng với một chế độ ăn rất hạn chế về lipid. Fenofibtrat có thể làm
giảm 20- 25% cholesterol toàn phần và 40- 50% triglycerid trong máu. Ðiều trị bằng
fenofibrat cần phải liên tục.

3


1.1.3.2 Chỉ định và liều dùng
Fenofibrat đƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn lipoprotein huyết các tip IIa, IIb,
III, IV và V, phối hợp với chế độ ăn.
Ðiều trị fenofibrat nhất thiết phải phối hợp với chế độ ăn hạn chế lipid. Phải uống
thuốc cùng với bữa ăn vì thuốc giảm hấp thu khi nhịn đói.
Ngƣời lớn: 300mg/ngày (1 viên 300mg, uống vào một bữa ăn chính hoặc uống 3
lần, mỗi lần 1 viên 100mg cùng với các bữa ăn). Liều ban đầu thƣờng là 200mg một
ngày (uống một lần hoặc chia làm 2 lần). Nếu cholesterol toàn phần trong máu vẫn còn
cao hơn 4g/l thì có thể tăng liều lên 300mg/ngày. Cần duy trì liều ban đầu cho đến khi
cholesterol máu trở lại bình thƣờng, sau đó có thể giảm nhẹ liều hàng ngày xuống.
Phải kiểm tra cholesterol máu 3 tháng một lần. Nếu các thông số lipid máu lại tăng lên
thì phải tăng liều lên 300mg/ngày.
Trẻ > 10 tuổi: Cần nghiên cứu kỹ để xác định nguyên nhân chính xác của tăng
lipid máu ở trẻ. Có thể điều trị kết hợp với một chế độ ăn đƣợc kiểm soát chặt chẽ
trong vòng 3 tháng. Liều tối đa khuyên dùng là 5mg/kg/ngày.
Nếu nồng độ lipid trong máu không giảm nhiều sau 3 đến 6 tháng điều trị bằng
fenofibrat thì cần thay đổi trị liệu (trị liệu bổ sung hoặc trị liệu khác). [3]
1.1.3.3 Chống chỉ định [3], [6] :
Suy thận nặng. Rối loạn chức năng gan nặng. Trẻ dƣới 10 tuổi.
1.1.3.4 Tác dụng không mong muốn
Tác dụng không mong muốn thƣờng nhẹ và ít gặp.
- Thƣờng gặp, ADR >1/100
+ Tiêu hóa: Rối loạn tiêu hóa, trƣớng vùng thƣợng vị, buồn nôn, ỉa chảy nhẹ.

+ Da: Nổi ban, nổi mày đay, ban không đặc hiệu.
+ Gan: Tăng transaminase huyết thanh.
+ Cơ: Ðau nhức cơ.
- Hiếm gặp, ADR < 1/1000
Sỏi đƣờng mật, mất dục tính và liệt dƣơng, giảm tinh trùng, giảm bạch cầu.

4


1.1.3.4 Tương tác thuốc [3], [6] :
Dùng kết hợp các thuốc ức chế HMG CoA reductase (ví dụ: pravastatin,
simvastatin…) và fibrat sẽ làm tăng đáng kể nguy cơ tổn thƣơng cơ và viêm tụy cấp.
Kết hợp fibrat với ciclosporin làm tăng nguy cơ tổn thƣơng cơ. Không đƣợc dùng
kết hợp các thuốc độc với gan (thuốc ức chế MAO, perhexilin maleat...) với fenofibrat.
Fenofibrat làm tăng tác dụng của các thuốc uống chống đông và do đó làm tăng
nguy cơ xuất huyết do đẩy các thuốc này ra khỏi vị trí gắn với protein huyết tƣơng.
Cần theo dõi lƣợng prothrombin thƣờng xuyên hơn và điều chỉnh liều thuốc uống
chống đông trong suốt thời gian điều trị bằng fenofibrat và sau khi ngừng thuốc 8
ngày.
1.2. Tổng quan về kỹ thuật HPLC
1.2.1 Khái Niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động
lỏng dƣới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố hay trao đổi ion
tùy thuộc vào pha tĩnh đƣợc sử dụng.
1.2.2 Nguyên tắc
Để tiến hành sắc ký, pha tĩnh đƣợc nhồi vào cột tách theo 1 kỹ thuật nhất định
phù hợp. Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại
sắc ký. Nếu pha tĩnh :
+ Là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thƣờng hay pha ngƣợc (hệ NP-HPLC

hay RP-HPLC).
+ Là chất trao đổi ion, ta có sắc ký trao đổi ion ( Iex-HPLC)
+ Là chất lỏng thì ta có sắc ký chiết hay sắc ký phân bố (LLC)
Cùng với pha tĩnh, để thực hiện sắc ký, rửa giải chất phân tích ra khỏi cột tách,
chúng ta phải cần một dung môi rửa giải, đó là pha động. Quyết định hiệu quả của sự
tách sắc ký ở đây là tổng các mối tƣơng tác :

5


Trong đó : X là chất phân tích
SP là pha tĩnh
MP là pha động

Lực F1 giữ chất phân tích ở lại trên cột, trong khi đó lực F2 kéo chất phân tích ra
khỏi pha tĩnh, F3 là lực tƣơng tác giữa pha động và pha tĩnh. Nếu trong 1 hệ sắc ký với
các chất khác nhau thì F1 và F2 thay đổi, F3 không thay đổi. Nhƣ vậy F1 và F2 là hai
yếu tố quyết định sự lƣu giữ của chất tan trong một hệ pha.
1.2.3 Cấu tạo hệ thống HPLC [1], [4].
Về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, sự tách các chất xảy ra liên tục trong cột
sắc ký từ lúc mẫu đƣợc nạp vào cột cho đến khi nó đƣợc rủa giải ra khỏi cột cùng với
pha động. Vì thế hệ thống HPLC cần có sự phù hợp giữa các bộ phận trong hệ thống
để thu đƣợc kết quả tốt nhất. Về nguyên tắc hệ thống HPLC gồm các bộ phận sau :

Hình 1. 3 : Sơ đồ máy HPLC
* Bơm cao áp :
Bơm cao áp để bơm pha động qua cột sắc ký. Bơm phải điều chỉnh đƣợc áp suất
(áp suất bơm có thể từ 0- 400 bar) để tạo tốc độ dòng phù hợp với quá trình sắc ký và
phải nhanh chóng đạt cân bằng tốc độ bơm đã chọn (thông thƣờng từ 0,2- 10ml/phút)
và lặp lại tốt cũng nhƣ ổn định trong suốt quá trình bơm.

6


* Bộ phận tiêm mẫu :
Để bơm mẫu vào cột sắc ký theo những lƣợng mẫu nhất định không đổi trong
quá trình sắc ký.
* Cột phân tích :
Cột chính là trái tim của hệ thống sắc ký. Mọi diễn biến của sự tách hỗn hợp chất
đều xảy ra ở đây và kết quả tốt hay không thì cột luôn là một yếu tố quyết định.
Cột thƣờng có chiều dài 10-25cm và có đƣờng kính trong từ 2-4,5mm. Trong cột
chứa pha tĩnh (chất nhồi cột). Pha tĩnh đƣợc chế tạo trên nền silica đƣợc sử dụng rộng
rãi nhất với nhiều tính chất ƣu việt nhƣ khả năng chịu áp suất cao, bền với nhiệt, trơ
với các dung môi chạy sắc ký và có độ thay đổi dung môi rất nhỏ khi thay đổi thành
phần pha động.
* Detecter : [4]
Là bộ phận phát hiện chất khi ra khỏi cột. Hiện nay có nhiều loại detector khác nhau :
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV- VIS): 190- 900 nm để phát hiện các chất
hấp thụ quang. Đây là loại thông dụng nhất.
+ Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng
nhƣ các dẫn chất có huỳnh quang. Là loại detector có độ chọn lọc cao hơn hẳn detecter
UV- VIS.
+ Detector mảng diod phát quang: Loại detecter này có độ nhạy, độ chọn lọc rất cao và
có thể chọn bƣớc sóng hấp thụ cho từng chất dễ dàng.
* Bộ phận ghi tín hiệu :
Thông thƣờng ngƣời ta dùng các thiết bị để ghi lại sắc đồ của sự tách và máy tính
để xử lý kết quả.
Ngoài những bộ phận tối thiểu của hệ thống HPLC nhƣ đã nếu trên thì hệ thống
HPLC ngày càng đƣợc hoàn thiện theo sự phát triển của khoa học kỹ thuật. Các hệ
thống HPLC hiện đại còn có thêm bộ chƣơng trình dung môi để thay đổi thành phần

pha động trong quá trình sắc ký , bộ phận nạp mẫu tự động, bộ điều nhiệt cho cột vv…

7


1.2.4 Các đại lượng đặc trưng [1], [4].
* Thời gian lưu giữ (tR) :
Các chất phân tích khi nạp vào cột sắc ký sẽ bị lƣu giữ ở trong cột theo một thời
gian nhất định, tR. Thời gian lƣu giữ này đƣợc tính từ lúc nạp mẫu vào cột sắc ký cho
đến lúc chất tan đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có nồng độ cực đại.
tR = t0 + t’R
Trong đó: t0 là thời gian không lƣu giữ (thời gian chất tan nằm trong pha động).
t’R là thời gian lƣu giữ thực của chất trong cột.
*Hệ số tách của 2 chất (α):
Với 2 chất A và B kế tiếp nhau trong sắc ký đồ chúng ta có :
α = t’R(B) - t’R(A)
Giá trị α càng lớn thì sự tách của chất A và B càng rõ. Khi đại lƣợng này bằng 1 thì
không có sự tách của 2 chất, lúc này 2 chất nằm trong cùng 1 pic. Còn nếu α gần bằng
1, thì pic sắc ký của hai chất A và B có chung một vùng đè lên nhau, nghĩa là chúng
chập vào nhau không thể tách thành hai pic riêng biệt đặc trƣng cho hai chất đó.
*Hệ số phân bố (K) :
Quá trình tách sắc ký của các chất tan là dựa trên sự phân bố của chất tan giữa
pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong cột. Sự phân bố này đƣợc đặc trƣng bởi một
đại lƣợng gọi là hệ số phân bố K.
K = C S / CM
Với CM , CS lần lƣợt là nồng độ chất tan trong pha động và pha tĩnh.
Hệ số phân bố này cho biết khả năng phân bố của chất tan nhƣ thế nào trong mỗi pha
(pha động và pha tĩnh).
*Hệ số dung lượng (k) :
Hệ số dung lƣợng cho ta biết tỷ số khối lƣợng của chất tan phân bố trong mỗi pha

là bao nhiêu.
k’ = ( CS.VS)/(CM.VM)
k’ = K.VS/VM
Với VM là thể tích pha động trong cột tách, VS là thể tích thực của pha tĩnh trong cột.

8


*Độ phân giải (RS) :
Độ phân giải nói lên mức độ tách các chất khỏi nhau trong một chƣơng trình sắc ký.
Độ phân giải đƣợc tính theo công thức sau:
RAB = 2.(tR(A) – tR(B))/(WA – WB)
Ở đây : tR(A), tR(B) lần lƣợt là thời gian lƣu của chất A và B.
WA, WB là bề rộng đáy pic sắc ký của hai chất A và B.
Hai chất A và B đƣợc tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. R
càng lớn thì pic 2 chất A và B càng tách xa nhau. Song nếu R lớn quá cũng không cần
thiết vì nhƣ thế sẽ làm tốn dung môi pha động để rửa giải các chất hơn. Trong thực tế
nếu R quá lớn thì chúng ta phải ứng dụng quá trình rửa giải gradient thành phần pha
động để cho chất sau đƣợc rửa giải nhanh hơn.
1.3.Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng
Bảng 1. 1 : Một số phƣơng pháp định lƣợng acid fenofibric trong huyết tƣơng
Tltk Phƣơng pháp Điều kiện sắc ký
phân tích
[5]

HPLC-UV

Xử lý mẫu

-Cột: Germini C18 (250 × 4,6mm;

Tủa protein

5µm)
-Pha động: MeOH – đệm phosphat
pH3 (75: 25)
-Thể tích tiêm mẫu: 50µl
-Bƣớc sóng phân tích 288nm
-Chất nội chuẩn: atorvastatin
[10]

HPLC-UV

-Cột: Symmetry Shield TMRP 18 (150
× 4,60mm; 5µm)

Chiết lỏng- lỏng
bằng EtOAc

-Pha động: MeCN– acid phosphoric
0,02M (50: 50)
-Bƣớc sóng phân tích: 287nm
-Chất chuẩn nội: CFHB

9


[12]

HPLC-UV

-Cột: C18 (4,6x 250mmx 5µm)
-Pha động: MeCN: đệm acetat 20mM

Chiết lỏng- lỏng
bằng EtOAc

= 40:60
-Bƣớc sóng phân tích: 295nm
-Chất chuẩn nội: Nevidipin
[16]

HPLC-UV

-Cột: Lithosphere 60 RP-Select B
(250x 4mm; 5µm)

Chiết lỏng- lỏng
bằng EtOAc

-Pha động: MeCN: đệm phosphate pH
6,0 = 30: 70
-Chất chuẩn nội: Diazepam
[15]

LC-MS/MS

-Cột: C18 pha đảo (2,1 × 50mm, 5µm) Chiết lỏng- lỏng
-Pha động: methanol: water: formic =

với hỗn hợp Nhexane:

75: 25: 0,25

dichloromethan:
- Chất chuẩn nội: acid diclofenac

isopropanol

-Thời gian phân tích 1 mẫu là 2,5 phút
[8]

UHPLC-

-Cột: UPLCTM BEH C18 column (50

Chiết lỏng -lỏng

MS/MS

× 2,1 mm, 1,7 μm; Waters Corp.,

bằng hỗn hợp

Milford, MA, USA)

diethylether-

-Pha động: acetonitril: water: formic =

ethylacetat

70: 30: 0,2
-Chất chuẩn nội : acid mefenamic
-Tổng thời gian phân tích mẫu là 2
phút
[14]

CE

-Mao quản 25cm x 50µm ( ID)

Tủa protein

-Dòng điện 5,5kV

bằng MeCN

10


-Áp suất tiêm mẫu 3447Pa
-Bƣớc sóng phát hiện 280nm
-Hệ đệm là acid boric, sodium
carbonat, polyethylen glycol 6000.
-Thời gian phân tích: 7 phút

Hầu hết các nghiên cứu trên đều sử dụng HPLC và xử lý mẫu bằng phƣơng pháp
chiết lỏng- lỏng. Do đó chúng tôi cũng lựa chọn định lƣợng fenofibrat và acid
fenofibric trong huyết tƣơng bằng HPLC với detector UV, sử dụng hệ sắc ký pha đảo

với cột C18 và xử lý mẫu bằng phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng với ethylacetat.

11


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu là acid fenofibric và fenofibrat trong huyết tƣơng chó.
2.1.2. Nguyên vật liệu, dung môi và hóa chất
Bảng 2. 1 : Danh mục chất chuẩn
Tên chuẩn

Nơi cung cấp

Số lô

Hàm lƣợng

Fenofibrat

Viện kiểm nghiệm TW

0113295.01

99,82%

Acid fenofibric

Cayman chemical

19262

98%

Natri diclofenac

Viện kiểm nghiệm TW

0216130.02

99,83%

Bảng 2. 2 : Danh mục dung môi và hoá chất
STT

Tên

Độ tinh khiết

Hãng sản xuất

1

Methanol

HPLC

Fisher- Hàn Quốc

2

Acetonitril

HPLC

Merck- Đức

3

Ethyl acetat

P.A

Merck- Đức

4

Kali dihydrophosphat

P.A

Merck- Đức

5

Natri hydroclorit

P.A

Merck- Đức

Huyết tƣơng thử là huyết tƣơng chó lấy tại các thời điểm nhất định sau khi cho
uống 1 liều fenofibrat (do nhóm dƣợc lý cung cấp).
Huyết tƣơng trắng là huyết tƣơng đƣợc tách từ máu chó nuôi bình thƣờng, sử
dụng heparin chống đông trong quá trình bảo quản máu.
2.1.3. Thiết bị dụng cụ:
Thiết bị:
 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao của shimadu, cột Shim-pack GIST C18 (150 x
4,6mm; 5µm)
 Bộ lọc dung môi (màng lọc 0,45µm).
12


 Cân phân tích Mettler Toledo XPE 105.
 Máy lắc xoáy Vortex ZX3.
 Máy lắc ngang GFL 3006.
 Máy ly tâm Herme Z306.
 Máy cô nitơ Hanon HN200.
 Tủ lạnh âm sâu Sanyon MDF U333.
 Tủ sấy Memmert ULM 500.
Dụng cụ:
Ống ly tâm thủy tinh, vial, đầu típ micropipet, micropipet, quả bóp cao su, bình
định mức chính xác, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác.
2.2. Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định lƣợng FA và FB trong huyết
tƣơng trên thiết bị HPLC.
 Thẩm định phƣơng pháp định lƣợng (sự phù hợp hệ thống, độ chọn lọc/ đặc
hiệu, tỷ lệ thu hồi, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn phát hiện,

giới hạn định lƣợng, độ ổn định).
 Ứng dụng đánh giá nồng độ FA và FB trong một số mẫu huyết tƣơng chó.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
 Chuẩn bị các dung dịch gốc trong MeOH :
+ Dung dịch chuẩn gốc FA (FB): cân chính xác một lƣợng FA (FB) pha vào
MeOH để đƣợc dung dịch chuẩn gốc FA (FB) có nồng độ khoảng 500µg/ml.
+ Dung dịch chuẩn nội gốc natri diclofenac (IS): cân chính xác một lƣợng IS, pha
vào MeOH để đƣợc dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ khoảng 1mg/ml.
+ Dung dịch QC gốc FA (FB): cân chính xác một lƣợng FA (FB) pha vào MeOH
để đƣợc dung dịch chuẩn gốc FA (FB) có nồng độ khoảng 500µg/ml.
 Các dung dịch làm việc :
+ Chuẩn làm việc 1 có nồng độ 50µg/ml: pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn gốc
FA (FB) bằng MeOH để thu đƣợc chuẩn làm việc 1.

13


+ Chuẩn làm việc 2 nồng độ 5µg/ml: pha loãng 10 lần dung dịch chuẩn làm việc 1
của FA (FB) bằng MeOH để thu đƣợc chuẩn làm việc 2.
+ Chuẩn nội làm việc: Pha loãng IS gốc 10 lần bằng MeOH thu đƣợc IS làm việc
có nồng độ 100µg/ml.
+ Pha tƣơng tự nhƣ các chuẩn làm việc 1 và 2 để thu đƣợc các QC làm việc của
FA (FB) có nồng độ 5µg/ml và 50µg/ml.
 Chuẩn bị các dung dịch trong huyết tƣơng:
+ Dãy đƣờng chuẩn FA: Từ các dung dịch chuẩn làm việc FA có nồng độ 5µg/ml
và 50µg/ml, pha thành dãy chuẩn FA có nồng độ trong huyết tƣơng bằng: 0,2; 0,5; 1;
5; 10; 50 (µg/ml).
+ Dãy đƣờng chuẩn FB: Từ các dung dịch chuẩn làm việc FB có nồng độ 5µg/ml

và 50 µg/ml, pha thành dãy chuẩn FB có nồng độ trong huyết tƣơng bằng: 0,2; 0,5; 1;
5; 10; 50 (µg/ml).
+ Mẫu QC kiểm tra: Từ các dung dịch QC làm việc pha thành 3 dung dịch hỗn
hợp QC có nồng độ trong huyết tƣơng lần lƣợt là LQC, MQC, HQC.
Bảng 2. 3: Bảng nồng độ các mẫu QC
Mẫu QC

Mã

Khoảng nồng độ

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

LQC

≤ 3 x LLOQ

Mẫu kiểm tra nồng độ
trung bình
Mẫu kiểm tra nồng độ cao

MQC
HQC

Gần điểm giữa của
đƣờng chuẩn
70% - 80% ULOQ

Giá trị (µg/ml)
0,5

25
40

Các dung dịch trong huyết tƣơng tiếp tục đƣợc đƣa vào xử lý để thu đƣợc các
dung dịch tiêm sắc ký theo quy trình xử lý mẫu dƣới đây.
*Quy trình xử lý mẫu :

Hút 1 ml mẫu, thêm tiếp 100µl dung dịch chuẩn IS (100µg/ml) lắc đều 5 giây.
Sau đó thêm 0,5ml dung dịch NaCl bão hòa vào lắc đều 5 giây. Thêm tiếp 5ml dung
môi EtOAc lắc ngang 20 phút tốc độ 300 lần/phút, ly tâm 20 phút tốc độ 5500
vòng/phút. Hút 3ml lớp dung môi hữu cơ cô nitơ ở nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn
trong 1ml MeOH: đệm phosphat pH3 (0,01M) = 70: 30 sau đó tiến hành chạy sắc ký.

14


2.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
Tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích FB, FA và
IS bao gồm:
+ Chọn bƣớc sóng phát hiện: chọn bƣớc sóng sao cho tại đó đáp ứng phân tích của
chất phân tích là tối ƣu.
+ Pha động: lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng sao cho đảm bảo các yêu
cầu phân tích.
2.3.3. Thẩm định phương pháp
Tiến hành thẩm định phƣơng pháp theo hƣớng dẫn của Cục quản lý Thực phẩm
và Dƣợc phẩm Mỹ (FDA–Mỹ) [9] với các chỉ tiêu:
 Sự phù hợp của hệ thống .
 Độ chọn lọc/đặc hiệu của phƣơng pháp.
 Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính.
 Độ đúng, độ lặp lại.

 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng dƣới (LLOQ).
 Tỷ lệ thu hồi chuẩn nội và hoạt chất.
 Độ ổn định của mẫu phân tích bao gồm:
 Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông.
 Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn.
 Độ ổn định dài ngày.
 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler).
- Sự phù hợp của hệ thống
Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu dung dịch hỗn hợp FA, FB, IS trong MeOH.
Ghi lại sắc ký đồ. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống về thời gian lƣu và diện tích
pic của các chất phân tích và chuẩn nội.
Yêu cầu: Giá trị RSD của thời gian lƣu ≤ 2,0% và diện tích pic phải ≤ 5,0%.
Trƣờng hợp giá trị RSD > 5%, phải có sự giải thích phù hợp.
- Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành phân tích các lô mẫu QC trên nền mẫu huyết tƣơng, mỗi lô gồm 06
mẫu độc lập, song song chuẩn bị các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha động có nồng

15


độ tƣơng ứng mẫu QC. Phân tích các mẫu QC theo phƣơng pháp đã xây dựng. Định
lƣợng trực tiếp các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua giai đoạn chiết tách.
Yêu cầu: Phƣơng pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi hoạt
chất không quá 110% và không thấp hơn 30%. Tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng
độ không quá 15%. Độ lệch giữa các tỷ số FA/IS (FB/IS) trong các mẫu QC có qua
chiết tách ở mỗi nồng độ phải không quá 15% và không qua chiết tách không quá 5%.
- Độ chọn lọc/đặc hiệu của phƣơng pháp
Tiến hành phân tích các mẫu: Huyết tƣơng trắng với ít nhất 6 mẫu khác nhau.
Huyết tƣơng trắng có thêm chuẩn (ở nồng độ LLOQ) và IS. Tiến hành phân tích các
mẫu trên theo phƣơng pháp đã xây dựng và ghi lại pic sắc ký.

Yêu cầu: Ở điều kiện phân tích, pic của chất cần phân tích phải đảm bảo đƣợc
nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu. Đáp ứng của mẫu
trắng tại thời điểm trùng với thời gian lƣu của FA và FB không đƣợc vƣợt quá 20%
đáp ứng của FA và FB ở nồng độ LLOQ. Đáp ứng của mẫu trắng ở điều kiện xác định
IS tại thời điểm trùng với thời gian lƣu của IS không đƣợc vƣợt quá 5% đáp ứng của
IS ở nồng độ LLOQ.
- Đƣờng chuẩn và khoảng hồi quy
Mối quan hệ tỷ số diện tích pic FA/IS (FB/IS) với nồng độ của FA (FB) đƣợc
đánh giá bằng phƣơng trình hồi quy. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp
nhất đến cao nhất trên đƣờng chuẩn có đáp ứng tuyến tính.
Để thiết lập mối tƣơng quan giữa nồng độ của chất chuẩn với đáp ứng của thiết bị
phân tích, số lƣợng điểm chuẩn phải đủ lớn (gồm 1 mẫu trắng, một mẫu trắng có chuẩn
nội và ít nhất 6 điểm chuẩn) và khoảng nồng độ khảo sát phải bao hàm đƣợc khoảng
nồng độ có thể đạt đƣợc trong quá trình phân tích mẫu.
Phân tích các dung dịch chuẩn đã chuẩn bị theo phƣơng pháp đã xây dựng.
Theo FDA [9] đƣờng chuẩn nên là đƣờng đơn giản nhất mô tả chính xác mỗi quan
hệ giữa nồng độ và đáp ứng đo đƣợc. Khi phân tích dịch sinh học, khoảng nồng độ chất
phân tích thƣờng rộng và trải dài trên nhiều khoảng tuyến tính khác nhau. Một đƣờng
hồi quy tuyến tính không sử dụng trọng số sẽ tạo ra sai số lớn vì mô hình này giả định
SD2 tƣơng đƣơng nhau trên toàn bộ phạm vi của các mẫu. Trong một đƣờng cong hiệu
chuẩn điển hình, phƣơng sai (SD2) tăng khi tăng nồng độ. Giải pháp để nâng cao độ
chính xác cho các dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất là sử dụng trọng số [7], [13].
16


Từ kết quả phân tích, dùng T-test để xác định mức độ đồng nhất của tập hợp kết
quả thu đƣợc trên hai mức nồng độ LLOQ và ULOQ, nếu kết quả F test cho thấy
không có sự khác biệt giữa giá trị SD2 ở hai nồng độ thì không cần sử dụng trọng số và
ngƣợc lại [11],[13]. Hệ số trọng số phù hợp (1, 1/x, 1/x2 , 1/x1/2 ) là hệ số mô tả tốt
nhất tƣơng quan giữa đáp ứng pic và nồng độ của chất chuẩn (tổng phần dƣ của độ

đúng là nhỏ nhất) [7]. Theo hƣớng dẫn của tài liệu tham khảo [13], tiến hành tính tổng
phần dƣ độ đúng để chọn hệ số weighting phù hợp nếu F-test cho thấy có sự khác biệt
giữa giá trị SD2 ở hai nồng độ LLOQ và ULOQ
Yêu cầu: Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại
điểm LLOQ đƣợc chấp nhận 80% - 120%. Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt
đƣợc tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất đạt tiêu chuẩn. Khoảng
tuyến tính có hệ số r ≥ 0,95 [9].
-Độ đúng, độ lặp lại
Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của
mẫu đã biết. Độ lặp lại là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình
phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, đƣợc biểu thị bằng giá trị
RSD%. Độ lặp lại bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày.
Cách tiến hành:
Ở mỗi ngày chuẩn bị một đƣờng chuẩn và 3 lô QC, mỗi lô gồm 6 mẫu độc lập
nhƣ quy trình đã nêu.
Dựa theo đƣờng chuẩn pha trong huyết tƣơng trắng tiến hành cùng điều kiện, tính
lại nồng độ hoạt chất có trong các mẫu QC. Xác định độ đúng của phƣơng pháp bằng
cách so sánh giá trị định lƣợng đƣợc so với giá trị thực có trong mẫu. Xác định độ lặp
lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch RSD% giữa giá trị các lần định lƣợng của
mỗi nồng độ phân tích trong cùng một ngày. Xác định độ lặp lại khác ngày bằng cách
tính toán độ lệch RSD% giữa giá trị các lần định lƣợng của mỗi nồng độ đƣợc phân
tích trong ít nhất 3 ngày khác nhau.
Yêu cầu: Với mỗi nồng độ độ đúng phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%,
riêng với mẫu LLOQ đƣợc chấp nhận từ 80% đến 120%. Độ lặp lại trong ngày giá trị
RSD% phải ≤ 15%. Riêng với mẫu LLOQ đƣợc chấp nhận ≤ 20%. Độ lặp lại khác ngày
giá trị RSD% phải ≤ 15%, riêng với mẫu LLOQ đƣợc chấp nhận ≤ 20%.

17