ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC HỆ ENZYME THỦY PHÂN TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LỎNG CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC HỆ
ENZYME THỦY PHÂN TRONG MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY LỎNG CỦA CÁC CHỦNG
XẠ KHUẨN Streptomyces sp.

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Lớp: DH04SH
Sinh viên thực hiện: DƯƠNG QUỐC LÂM

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC HỆ
ENZYME THỦY PHÂN TRONG MÔI TRƯỜNG

NUÔI CẤY LỎNG CỦA CÁC CHỦNG
XẠ KHUẨN Streptomyces sp.

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

DƯƠNG QUỐC LÂM

Tháng 9/2008
ii


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
 Ban giám hiệu Trường ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ
môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt thời gian học tạp tại trường.
 ThS. Trương Phước Thiên Hoàng đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt
thời gian học và thực tập tại trường.
 Ban giám đốc Trung Tâm Môi Trường, Trường ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh.
 Kỹ sư Tăng Thị Ánh Thơ đã tận tình giúp đỡ, tạo điền kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các anh chị tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh, Khu Cẩm Tú, Trường
Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K30 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn

trong suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2008
Dương Quốc Lâm

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Đánh giá khả năng sinh tổng hợp các hệ enzyme thủy phân trong môi
trường nuôi cấy lỏng của các chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.” được tiến hành tại
Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh
học và Công nghệ môi trường, Khu Cẩm Tú, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh, thời gian từ tháng 7 đến tháng 10 năm 2008. 10 chủng Streptomyces sp. được sử
dụng trong nghiên cứu là SĐR10, SĐT2, SPC1, SPC9, SPC12, SPC33, SPC89,
SPC100, SVCP17, SVCP18 do Viện Khoa học – Kĩ thuật Nông Lâm Nghiệp Tây
Nguyên cung cấp.
Đề tài khảo sát khả năng sinh trưởng và chịu nhiệt của 10 chủng Streptomyces sp.
trên các môi trường nuôi cấy. Đồng thời, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng
tổng hợp các hệ enzyme thủy phân cellulase, amylase, protease, pectinase và khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase từ môi trường nuôi cấy
Streptomyces sp.
Kết quả thu được như sau:
 Môi trường Nutrient là môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của các
chủng Streptomyces sp., 8/10 chủng này vẫn có thể phát triển ở 500C và cả
10 chủng Streptomyces sp. trên đều có khả năng sinh cellulase, amylase,
protease và pectinase.
 Chủng SPC9 có hoạt tính cellulase cao nhất trong 10 chủng khi canh
trường nuôi cấy được nhiễm khoảng 105 bào tử/ml, lắc ở 320C và 130

vòng/phút trong 96 giờ. Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng SPC9 là: pH
môi trường 6,0, thời gian nuôi cấy 96 giờ, nguồn carbon thích hợp là CMC
1,5%, nguồn nitrogen thích hợp là pepton 0,5%.

iv


SUMMARY
The thesis “Study on the ability to synthezise the hydrolysis enzyme systems
in submerged cultivation for Streptomyces sp.” was executed at The Laboratory for
Biotechnology in Enviroment, Reseach Institute for Biotechnology and Enviromental
Technology, Department of Cam Tu, Agriculture and Forestry University, in July to
October 2008. Ten Streptomyces sp. strains were used in experiment: SĐR10, SĐT2,
SPC1, SPC9, SPC12, SPC33, SPC89, SPC100, SVCP17 and SVCP18, were provided
by Institute for Science – Technique Agriculture and Forestry Tay Nguyen.
The thesis included: studying the growth, the thermostable ability of 10
Streptomyces sp. strains at different medias and the ability to produce cellulase,
amylase, protease and pectinase enzyme systems of 10 Streptomyces sp. strains;
quantitative analysis for cellulase enzyme, chose the Streptomyces sp. strain with the
highest cellulase activity to study on the factors influe cellulase synthesis
continuously.
Results:
 Nutrient medium was consonant with the growth of ten Streptomyces sp.
strains, 8/10 Streptomyces sp. strains can growth at 500C at Nutrient medium and
all of them have the ability to produce cellulase, amylase, protease and pectinase
enzyme systems at different medias.
 SPC9 strain have cellulase activity higher others when the broth was
inoculated with 1.0 x 105 spores per ml and shaken at 320C and 130 rev min-1 for
96 hours. Cellulase reached maximum activity (284.54 UI/ml) at 96 to 108 hours,
optimal pH 6.0, and the optimal carbon sourse was CMC 1.5% (w/v), optimal

nitrogen sourse was pepton 0.5% (w/v).

v


MỤC LỤC
ĐỀ MỤC

TRANG

Trang tựa .................................................................................................................i
Lời cảm tạ .............................................................................................................iii
Tóm tắt ..................................................................................................................iv
Summary ................................................................................................................ v
Mục lục .................................................................................................................vi
Danh mục các chữ viết tắt ...................................................................................xii
Danh mục các biểu đồ, đồ thị .............................................................................xiii
Danh mục các hình, sơ đồ ..................................................................................xiv
Danh mục các bảng ............................................................................................. xv
Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu ...................................................................................... 1
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Xạ khuẩn Streptomyces .................................................................................. 2
2.1.1. Phân loại ...................................................................................................... 2
2.1.2. Phân bố và vai trò của Streptomyces trong tự nhiên ................................... 3
2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh sản ........................................................................ 4
2.1.3.1. Khuẩn ty ................................................................................................... 4
2.1.3.2. Bào tử và sự hình thành bào tử ................................................................. 5
2.1.3.3. Khuẩn lạc .................................................................................................. 6

2.1.3.4. Cấu tạo tế bào ........................................................................................... 7
2.1.3.5. Sự sinh sản của xạ khuẩn Streptomyces ................................................... 8
2.2. Hệ enzyme cellulase ....................................................................................... 9
2.2.1. Định nghĩa – cấu tạo .................................................................................... 9
2.2.2. Tính chất ...................................................................................................... 9
2.2.3. Cơ chế thủy phân cellulose .......................................................................... 9
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase ................................... 10
vi


2.2.4.1.Ảnh hưởng của nguồn carbon ................................................................. 10
2.2.4.2. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen .............................................................. 10
2.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy và pH môi trường nuôi cấy .............. 11
2.2.4.3.Ảnh hưởng của yếu tố khác ..................................................................... 11
2.2.5. Ứng dụng của cellulase ............................................................................. 12
2.2.5.1. Trong công nghiệp giấy .......................................................................... 12
2.2.5.2. Trong công nghiệp dệt ............................................................................ 12
2.2.5.3. Trong xử lý môi trường .......................................................................... 12
2.2.5.4.Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ........................................... 12
2.2.5.5. Trong kỹ thuật di truyền ......................................................................... 13
2.2.5.6. Trong công nghệ chế biến thực phẩm .................................................... 13
2.2.5.7. Trong sản xuất cồn ................................................................................. 13
2.2.5.8. Trong sản xuất bột giặt và các chất tẩy rửa ............................................ 13
2.3. Hệ enzyme amylase ...................................................................................... 13
2.3.1. Định nghĩa – cấu tạo .................................................................................. 13
2.3.2. Cơ chế thủy phân tinh bột .......................................................................... 14
2.3.3. Ứng dụng của enzyme amylase ................................................................. 14
2.3.3.1. Ứng dụng amylase để sản xuất sirô
và những sản phẩm có vị ngọt cao ...................................................................... 14
2.3.3.2. Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn từ nguồn tinh bột ....................... 15

2.3.3.3. Ứng dụng amylase trong sản xuất bia .................................................... 15
2.3.3.4. Ứng dụng amylase trong sản xuất bánh mì ............................................ 15
2.3.3.5. Ứng dụng amylase trong sản xuất tương và nước chấm ........................ 15
2.3.3.6. Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc ............................ 16
2.3.3.7. Ứng dụng amylase trong công nghiệp dệt .............................................. 16
2.4. Hệ enzyme protease ...................................................................................... 16
2.4.1. Định nghĩa, cấu tạo .................................................................................... 16
2.4.2. Ứng dụng của enzyme protease ................................................................. 17
2.4.2.1. Ứng dụng protease trong sản xuất các chất tẩy rửa ................................ 17
2.4.2.2. Ứng dụng protease trong công nghiệp da ............................................... 17
vii


2.4.2.3. Ứng dụng tổng hợp Aspartam ................................................................ 17
2.4.2.4. Sản xuất insulin cho người từ insulin heo .............................................. 17
2.4.2.5. Ứng dụng protease trong chế biến thịt ................................................... 18
2.4.2.6. Ứng dụng protease trong chế biến sữa ................................................... 18
2.5. Hệ enzyme pectinase .................................................................................... 18
2.5.1. Định nghĩa – cấu tạo .................................................................................. 18
2.5.2. Cơ chế thủy phân pectin ............................................................................ 18
2.5.3. Ứng dụng ................................................................................................... 19
2.6. Một số nghiên cứu về enzyme
trên xạ khuẩn Streptomyces đã được công bố ..................................................... 20
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm ................................................................ 22
3.2. Vật liệu ......................................................................................................... 22
3.2.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu .................................................................... 22
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................... 22
3.2.3. Các môi trường dùng trong thí nghiệm ..................................................... 23
3.2.3.1. Môi trường giữ giống ............................................................................. 23

3.2.3.2. Môi trường tăng sinh cho xạ khuẩn ........................................................ 23
3.2.3.3. Môi trường SM ....................................................................................... 23
3.2.3.4. Môi trường CSM .................................................................................... 23
3.2.3.5. Môi trường Nutrient ............................................................................... 24
3.2.3.6. Môi trường cảm ứng tổng hợp cellulase ................................................. 24
3.2.3.7. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme amylase .................................... 24
3.2.3.8. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease .................................... 25
3.2.3.9. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme pectinase .................................. 25
3.2.3.10. Môi trường sinh tổng hợp cellulase ...................................................... 25
3.3. Phương pháp ................................................................................................. 25
3.3.1. Phương pháp cấy chuyền giữ giống .......................................................... 25
3.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng sinh trưởng các
chủng Streptomyces sp. trên những môi trường khác nhau ................................. 26
3.3.3. Phương pháp khảo sát khả năng

viii


chịu nhiệt của các chủng Streptomyces sp............................................................ 26
3.3.4. Phương pháp định tính khả năng
phân giải cellulose của các chủng Streptomyces sp. ........................................... 26
3.3.5. Phương pháp định tính khả năng
phân giải tinh bột của các chủng Streptomyces sp. ............................................. 27
3.3.6. Phương pháp định tính khả năng
phân giải protein của các chủng Streptomyces sp. .............................................. 27
3.3.7. Phương pháp định tính khả năng
phân giải pectin của các chủng Streptomyces sp. ................................................ 27
3.3.8. Phương pháp tăng sinh xạ khuẩn ............................................................... 28
3.3.9. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ....................... 28
3.3.9.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 28

3.3.9.2. Hóa chất và môi trường .......................................................................... 28
3.3.9.3. Cách tiến hành ........................................................................................ 28
3.3.10. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường
thu nhận enzyme cellulase ................................................................................... 29
3.3.11. Phương pháp thu dịch chiết enzyme ........................................................ 29
3.3.12. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử
(phương pháp định lượng đường khử theo Miller) ............................................. 29
3.3.12.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 29
3.3.12.2. Hóa chất ................................................................................................ 29
3.3.12.3. Cách tiến hành ...................................................................................... 29
3.3.13. Phương pháp xác định hoạt độ hệ enzyme cellulase ............................... 30
3.3.13.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 30
3.3.13.2. Hóa chất ................................................................................................ 30
3.3.13.3. Cách tiến hành ...................................................................................... 31
3.3.13.4. Cách tính ............................................................................................... 31
3.3.14. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
lên quá trình sinh tổng hợp cellulase ................................................................... 32
3.3.14.1. Chọn giống xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao nhất .......................... 32
3.3.14.2. Ảnh hưởng của thời gian lên sinh tổng hợp cellulase .......................... 32
3.3.14.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh tổng hợp cellulase ...................... 32
ix


3.3.14.4. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất CMC
lên sinh tổng hợp cellulase .................................................................................. 32
3.3.14.5. Ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác
lên sinh tổng hợp cellulase .................................................................................. 33
3.3.14.6. Ảnh hưởng nguồn nitrogen lên sinh tổng hợp cellulase ....................... 33
3.3.15. Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................ 33
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng Streptomyces sp.
trên các môi trường Gauze, SM, CSM và Nutrient ............................................. 34
4.2. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng Streptomyces sp. .................... 38
4.3. Định tính các hệ enzyme cellulase, amylase, protease
và pectinase của các chủng Streptomyces sp. ...................................................... 39
4.3.1. Định tính khả năng phân giải cellulose của
các chủng Streptomyces sp. ................................................................................. 39
4.3.2. Định tính khả năng phân giải tinh bột
của các chủng Streptomyces sp. ........................................................................... 41
4.3.3. Định tính khả năng phân giải protein
của các chủng Streptomyces sp. ........................................................................... 43
4.3.4. Định tính khả năng phân giải pectin
của các chủng Streptomyces sp. ........................................................................... 44
4.4. Khảo sát chọn giống và chọn điều kiện môi trường tối ưu
cho sinh tổng hợp cellulase của các chủng Streptomyces sp. .............................. 46
4.4.1. Chọn lọc chủng Streptomyces sp. cho sinh tổng hợp cellulase ................. 46
4.4.2. Xác định thời gian nuôi cấy tối ưu cho
sinh tổng hợp cellulase của các chủng Streptomyces sp. ..................................... 48
4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy
lên sự sinh tổng hợp cellulase của chủng SPC9 .................................................. 50
4.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ CMC lên
khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng SPC9 ............................................. 51
4.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên
sinh tổng hợp cellulase của chủng SPC9 ............................................................. 53
4.3.6. Ảnh hưởng của các cơ chất khác lên khả năng
x


sinh tổng hợp cellulase của chủng SPC9 ............................................................. 54
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận ......................................................................................................... 56
5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

xi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CMC

Carboxymethylcellulose

DNS

Acid dinotrosalisylic

G

Môi trường Gauze

SM

Môi trường SM

CSM

Môi trường CSM

N

Môi trường tổng hợp Nutrient

ES

Phức chất enzyme-cơ chất

S

Cơ chất

xii


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ
TRANG

BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
các chủng Streptomyces sp. sau 5 ngày ............................................................... 35
Biểu đồ 4.2. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
các chủng Streptomyces sp. sau 10 ngày ............................................................. 36
Biểu đồ 4.3. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
các chủng Streptomyces sp. sau 14 ngày ............................................................. 37
Biểu đồ 4.4. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm) của các chủng
Streptomyces sp. sau 7 ngày khi nuôi cấy
ở các nhiệt độ 40, 45, 50 và 550C ........................................................................ 39
Biểu đồ 4.5. Hoạt tính cellulase (UI/ml) của dịch enzyme thu được khi
nuôi cấy 10 chủng Streptomyces sp. sau 96 giờ .................................................. 47
Biểu đồ 4.6. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên khả năng

sinh tổng hợp cellulase của chủng SPC9 ............................................................. 53

ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Sự biến thiên hoạt tính cellulase (UI/ml) theo thời gian của
các chủng SĐT2, SPC1 và SPC9 ......................................................................... 49
Đồ thị 4.2. Sự biến thiên hoạt tính cellulase của chủng SPC9
theo pH ban đầu của môi trường nuôi cấy ........................................................... 50
Đồ thị 4.3. Sự biến thiên hoạt tính cellulase của chủng SPC9
theo nồng độ CMC .............................................................................................. 52
Đồ thị 4.4. Sự biến thiên hoạt tính cellulase (UI/ml) chủng SPC9
khi nuôi cấy trên các nguồn cơ chất khác nhau ................................................... 55

xiii


DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ
TRANG
HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc khuẩn ty ................................................................................... 4
Hình 2.2. Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn ................................................................ 5
Hình 2.3. Bào tử của xạ khuẩn .............................................................................. 5
Hình 2.4. Sự hình thành cuốn bào tử của Streptomyces sp. .................................. 6
Hình 2.5. Một số hình dạng khuẩn lạc của Streptomyces sp. ................................ 7
Hình 2.6. Chu trình sinh sản và phát triển từ bào tử của Streptomyces sp. ........... 8
Hình 2.7. Cơ chế hoạt động của cellulase (theo Resses, 1950) ........................... 10
Hình 2.8. Cơ chế phân giải pectin ....................................................................... 19
Hình 4.1. Khuẩn lạc chủng SPC1 sau 10 ngày nuối cấy
trên các môi trường Gauze, SM, CSM và Nutrient ............................................. 37
Hình 4.2. Vòng phân giải CMC của các chủng Streptomyces sp. ....................... 41
Hình 4.3. Vòng phân giải tinh bột của một số chủng Streptomyces sp. .............. 43

Hình 4.4. Vòng phân giải casein của một số chủng Streptomyces sp. ................ 44
Hình 4.5. Vòng phân giải pectin của các chủng Streptomyces sp. ...................... 45

SƠ ĐỒ
Sơ đồ. Cơ chế chuyển hóa tinh bột bởi nhóm enzyme amylase .......................... 14

xiv


DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 3.1. Danh sách các chủng Streptomyces sp.
sử dụng trong nghiên cứu .................................................................................... 22
Bảng 3.2. Xây dựng đường chuẩn Glucose ......................................................... 30
Bảng 3.3. Bảng xác định hoạt độ enzyme cellulase ............................................ 31
Bảng 4.1. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm) các chủngStreptomyces sp.
sau 5 ngày trên các môi trường Gauze, SM, CSM và Nutrient ........................... 34
Bảng 4.2. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
các chủng Streptomyces sp. sau 10 ngày ............................................................. 35
Bảng 4.3. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm)
các chủng Streptomyces sp. sau 14 ngày ............................................................. 36
Bảng 4.4. Đường kính khuẩn lạc trung bình (mm) của các chủng Streptomyces sp.
sau 7 ngày khi nuôi cấy ở các nhiệt độ 40, 45, 50 và 550C ................................. 38
Bảng 4.5. Đường kính vòng phân giải CMC của
các chủng Streptomyces sp. sau 6 ngày ............................................................... 40
Bảng 4.6. Đường kính vòng phân giải tinh bột của
các chủng Streptomyces sp. sau 15 ngày ............................................................. 42
Bảng 4.7. Đường kính vòng phân giải casein của
các chủng Streptomyces sp. sau 15 ngày ............................................................. 43
Bảng 4.8. Đường kính vòng phân giải pectin của

các chủng Streptomyces sp. sau 12 ngày ............................................................. 46
Bảng 4.9. Hoạt tính cellulase (đvhđ/ml) của dịch enzyme thu được
khi nuôi cấy 10 chủng Streptomyces sp. sau 96 giờ ............................................ 47
Bảng 4.10. Hoạt tính cellulase (UI/ml) của các chủng
SĐT2, SPC1 và SPC9 theo thời gian .................................................................. 48
Bảng 4.11. Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên
sinh tổng hợp cellulase của chủng SPC9 ............................................................. 50
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của nồng độ CMC lên
hoạt tính cellulase (UI/ml) của chủng SPC9 ....................................................... 51
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên

xv


hoạt tính cellulase (UI/ml) của chủng SPC9 ....................................................... 53
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của các cơ chất tự nhiên lên
hoạt tính cellulase (UI/ml) của chủng SPC9 ....................................................... 54

xvi


10

Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Streptomyces sp. nổi tiếng trên thế giới với khả năng sản sinh ra các hợp chất
kháng khuẩn, kháng nấm, các alkaloid, và các chất chống ung thư. Hiện đã có rất
nhiều nghiên cứu tập trung vào các lĩnh vực này. Vào năm 2002, David Hopwood,

trung tâm John Innes ở Norwich, Anh và cộng sự đã ráp nối 8,5 triệu ký tự trong bộ
gene của Streptomyces coelicolor. Với thành tựu này, các công ty dược phẩm có thể
chế tạo ra những loại thuốc kháng sinh hiệu quả hơn, khắc phục tình trạng kháng thuốc
hiện nay của nhiều loài vi sinh vật.
Bên cạnh đó, với khả năng sử dụng nhiều nguồn cơ chất khác nhau để tổng hợp
như glucose, tinh bột, cellulose, các loại phụ phẩm nông nghiệp…các chủng
Streptomyces sp. cũng tạo ra được số loại enzyme thủy phân ngoại bào rất phong phú.
Tính ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học và
nghiên cứu khoa học đã biến việc sản xuất enzyme trở thành một ngành công nghiệp
phát triển mạnh mẽ trên toàn thế giới. Xạ khuẩn Streptomyces sp. với nhiều tiềm năng
về sinh tổng hợp các hệ enzyme khác nhau đã và đang thu hút nhiều nhà nghiên cứu
khoa học trên thế giới.
1.2. Mục đích và yêu cầu của nghiên cứu
Để góp thêm những thông tin về đặc điểm sinh trưởng và khả năng sinh enzyme
của loài xạ khuẩn này, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các
hệ enzyme thủy phân trong môi trường nuôi cấy lỏng của các chủng xạ khuẩn
Streptomyces sp.” với những nội dung nghiên cứu như sau:
 Đánh giá khả năng sinh trưởng của 10 chủng Streptomyces sp. trên các môi
trường khác nhau.
 Khảo sát khả năng chịu nhiệt của 10 chủng Streptomyces sp. được phân lập từ
các nguồn khác nhau.
 Khảo sát sơ bộ khả năng tổng hợp các hệ enzyme cellulase, amylase, protease
và pectinase.
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp cellulase của 10 chủng
Streptomyces sp.


20

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Xạ khuẩn Streptomyces
2.1.1. Phân loại
<URL: />Theo bảng phân loại của Bergey (1974), Streptomyces có vị trí phân loại như sau:
Giới

:

Bacteria

Ngành

:

Actinobacteria

Lớp

:

Actinobacteria

Dưới lớp :

Actinobacteridae

Bộ

:

Actinomycetales

Dưới bộ :

Streptomycineae

Họ

:

Streptomycetaceae

Chi

:

Streptomyces

Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và Henrici đặt tên
năm 1943. Chúng có vị trí tiến hóa cao trong số các giống thuộc vi khuẩn Gram
dương, có trị số % mol Guanine và Xytozin rất cao (69 - 77% (G + X) trong DNA).
Streptomyces là giống có số lượng nhiều nhất trong lớp Actinobacteria. Màu sắc
của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc
này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau, chính vì vậy mà Ủy
ban quốc tế về phân loại xạ khuẩn (ISP) đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương
pháp chung để phân loại nhóm vi sinh vật này. Hiện nay khoa học đã mô tả được hơn
500 loài xạ khuẩn bậc cao này.
Trước đây, vị trí phân loại của Streptomyces nói riêng và xạ khuẩn nói chung
luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà Vi sinh vật học, do nó có những đặc

điểm vừa giống vi khuẩn vừa giống nấm. Tuy nhiên, đến nay, xạ khuẩn đã được
chứng minh là vi khuẩn. Chúng có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn như:
-

Kích thước của sợi xạ khuẩn và bào tử tương đương với vi khuẩn, đồng thời sợi
xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn.


30

-

Nhân tế bào chưa phân hoá hình thái, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố
dọc theo các sợi hoặc các tế bào.

-

Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn và gọi là
Actinophage, trong khi đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể.

-

Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các kháng sinh có tác dụng lên vi khuẩn, nhưng
lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen.

-

Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà
không có ở vi khuẩn. Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không
chứa cellulose.

-

Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trường,
đặc điểm này không có ở nấm.

-

Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực và tế bào cái).

-

Sự phân chia tế bào của xạ khuẩn theo kiểu phân bào vô ty (amytoza)- một tính
chất đặc trưng của vi khuẩn.
Vì những đặc điểm trên nên không xếp xạ khuẩn vào ngành nấm mà xếp vào

ngành vi khuẩn.
2.1.2. Phân bố và vai trò của Streptomyces trong tự nhiên
<URL: />Streptomyces phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, phế phẩm nông
nghiệp, phân chuồng, gỗ mục, rác… Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colonyforming unit) thường khoảng 105 - 107 trong 1g đất.
Streptomyces tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất
trong tự nhiên, giúp cải tạo sinh thái đất mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của
cây trồng, nhưng đặc điểm quan trọng nhất làm cho Streptomyces trở nên nổi tiếng là
khả năng hình thành chất kháng sinh như Streptomycin, tetracyline, erythromycine,
neomycine, chloramphenicol, vancomycin, gentamicin, nystatin, amphotericin,
cephamycin... có tác dụng chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm Fusarium,
Pythium, Colletotrichum và Rhizoctonia, tuyến trùng Meloidogyne arenaria... Thực tế,
2/3 số thuốc kháng sinh hiện có trên thế giới được lấy từ họ xạ khuẩn Streptomyces.
Họ xạ khuẩn này cũng tạo ra các loại thuốc dùng để chữa bệnh ung thư hay ngăn chặn
quá trình đào thải khi cấy ghép nội tạng. Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất chúng

còn sinh ra 1 số chất hữu cơ có giá trị như vitamin nhóm B và enzyme (protease,


40

amylase, cellulase, pectinase, lipase), các acid hữu cơ (acid clavulanic, acid lactic, acid
indolacetic), các acid amin có giá trị như Alanin, Valin, Methionin. Tuy nhiên, cũng
có một số loài Streptomyces gây bệnh cho động vật và cây trồng.
2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh sản
(Giáo trình vi sinh vật học đại cương, Tủ sách ĐH Nông Lâm Tp. HCM)
2.1.3.1. Khuẩn ty
Khuẩn ty phân nhánh, không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Đường kính
mỗi khuẩn ty khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm. Các loại xạ khuẩn khác nhau đều có
cùng một loại cấu tạo khuẩn ty nhưng sự phân nhánh của khuẩn ty nhiều hay ít, khuẩn
ty dài hay ngắn, thẳng hay xoắn, mọc đơn hay mọc vòng có sự khác nhau giữa các
giống loài. Đặc điểm nổi bật của khuẩn ty xạ khuẩn là khả năng phân nhánh. Khả năng
này có mặt ở tất cả các loài xạ khuẩn. Các đặc điểm hình thái này rất quan trọng khi
tiến hành định tên xạ khuẩn.

Hình 2.1. Cấu trúc khuẩn ty
cp - tế bào chất; pm - màng tế bào; cw - thành tế bào;
me - mezoxom; se - vách ngăn; ri - riboxom; re - chất dự trữ
Khi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng đặc, khuẩn ty xạ khuẩn phát triển
thành hai loại khuẩn ty cơ chất (hay còn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng) và khuẩn ty khí
sinh:
-

Khuẩn ty cơ chất cắm sâu vào môi trường dinh dưỡng để hút chất dinh dưỡng.
Khuẩn ty cơ chất hầu như giống nhau giữa các loài.

-

Khuẩn ty khí sinh phát triển bên trên môi trường.


50

Hình 2.2. Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn
<URL: />khuanlacxakhuan005.jpg>
2.1.3.2. Bào tử và sự hình thành bào tử
Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh của Streptomyces hình
thành cuống bào tử và chuỗi bào tử. Trên cuống sinh bào tử mang nhiều bào tử. Cuống
sinh bào tử có nhiều dạng khác nhau tuỳ theo loài như thẳng-lượn sóng (Retiflexibilis),
xoắn (Spirales) hoặc có móc, vòng (Retinaculiaperti)…

Hình 2.3. Bào tử của xạ khuẩn
<URL: />Sự hình thành bào tử xạ khuẩn có hai kiểu:
-

Kiểu kết đoạn (fragmentation): lúc đầu các hạt cromatin trong tế bào chất được
phân bố đều khắp cuốn sinh bào tử, cái nọ cách cái kia theo một khoảng cách
nhất định. Sau đó, tế bào chất co lại bao bọc các hạt cromatin ấy để tạo thành
tiền bào tử. Như vậy, mỗi bào tử có chứa ít nhất một hạt cromatin. Hạt này có
kích thước bằng 1/3 kích thước bào tử và nằm ở trung tâm hoặc sát màng bào
tử. Bào tử hình thành theo kiểu này có dạng hình cầu. Bào tử được giải phóng
ra ngoài sau khi màng cuốn sinh bào tử bị tan rã.


60

-

Kiểu cắt khúc (segmentation): theo kiểu này, cuống sinh bào tử hình các vách
ngăn ngang. Sự hình thành vách ngăn ngang làm cho bào tử hình thành thường
có dạng hình trụ hay hình que. Trên mỗi cuống sinh bào tử thường có từ 30 –
100 bào tử, đôi khi có đến 200 bào tử.
Kích thước bào tử biến động trong khoảng 0,7 – 1,9 x 0,7 – 0,9 µm. Bào tử được

bao bọc bởi lớp màng mucopolysaccharide giàu protein, có độ dày khoảng 300 – 400
Ao, có cấu tạo 3 lớp. Bào tử xạ khuẩn hình bầu dục, hình lăng trụ hoặc hình cầu với
đường kính khoảng 1,5m. Màng bào tử xạ khuẩn có thể nhẵn (smooth), gai (spiny),
tóc (hairy), khối u (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn. Những
tiểu tiết này có thể thay đổi theo quy luật trên môi trường nuôi cấy, thường thì xạ
khuẩn có tiểu tiết có thể có màng nhẵn trên môi trường có nguồn nitơ hữu cơ, trên môi
trường có đạm vô cơ và glucose các bào tử dễ biểu hiện các tiểu tiết rõ nhất. Sự hình
thành bào tử là một hình thức sinh sản của xạ khuẩn khác với vi khuẩn.

Hình 2.4. Sự hình thành cuốn bào tử của Streptomyces sp.
<URL: />khuan_baotu002.jpg>
2.1.3.3. Khuẩn lạc
Trên môi trường dinh dưỡng đặc, khuẩn ty xạ khuẩn phát triển dày đặt, bện vào
nhau tạo thành khuẩn lạc. Nếu sự phân nhánh ít sẽ tạo thành các khuẩn lạc trần, khô
sát môi trường, có dạng vôi. Nếu khuẩn ty phân nhánh nhiều sẽ tạo ra những khuẩn lạc
dạng nhung hay lông tơ mịn. khuẩn lạc xạ khuẩn thường có các màu sắc như đỏ, lam,
vàng, tím, nâu, đen. Khuẩn lạc thường có dạng tròn, đường kính khoảng 0,5 – 2mm
hoặc có khi 1cm. Bề mặt khuẩn lạc có thể nhẵn bóng hay xù xì, thường có 3 lớp: lớp
ngoài cùng gồm các sợi bện chặt vào nhau, lớp trong xốp hơn, lớp ở giữa (lớp thứ 3
trong cùng) có cấu trúc dạng tổ ong (theo Bongopskaia).

70

Hình 2.5. Một số hình dạng khuẩn lạc của Streptomyces sp.
2.1.3.4. Cấu tạo tế bào
Tế bào xạ khuẩn gồm các thành phần :
- Màng nhầy: một số xạ khuẩn có lớp màng nhầy mỏng có cấu tạo từ polysaccharit.
- Thành tế bào: tương đối dày và chắc hơn thành tế bào vi khuẩn, gồm 3 lớp: lớp
ngoài cùng dày khoảng 120Ao chứa nhiều thành phần lipid ( đây là đặc điểm đặc trưng
của xạ khuẩn), lớp giữa chủ yếu là protein dày khoảng 50Ao và lớp trong cùng có
glycopeptid và acid teichoic (đặc điểm của vi khuẩn gram dương) dày khoảng 50Ao.
Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ và có cấu tạo dạng sợi, có kích thước lớn hơn của vi
khuẩn nên một số chất có phân tử lớn như peptid, dextran, enzyme đi qua được thành
vào bên trong tế bào.
- Màng nguyên sinh chất: gồm hai lớp, dày khoảng 50nm, có cấu tạo giống màng
nguyên sinh chất của vi khuẩn gram dương. Màng nguyên sinh chất tham gia hình
thành vách ngăn ngang. Những chức năng chủ yếu của màng nguyên sinh chất là điều
hòa sự hấp thu các chất dinh dưỡng và tham gia vào sự hình thành bào tử. Nguyên sinh
chất gồm có chất nhân, những nucleic, các hạt volutin, không bào và các hạt ẩn nhập
khác.
Khi bào tử mới nảy mầm, trong tế bào chỉ thấy có một hạt nucleoit gọi là hạt
cromatin. Khi tế bào càng già càng chứa nhiều hạt cromatin và tạo thành metacromatin


80

(chất nhân). Ngoài chất nhân và các hạt dị nhiễm, trong nguyên sinh tế bào xạ khuẩn
còn chứa các hạt ribosom, lipid, polysaccharit. Đặc biệt, trong tế bào chất, hàm lượng
nucleoprotein khá cao chứa nhiều ADN. Hàm lượng này thay đổi trong quá trình phát
triển của xạ khuẩn và quá trình nuôi cấy.
2.1.3.5. Sự sinh sản của xạ khuẩn Streptomyces

Xạ khuẩn sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi, bằng sự nảy chồi phân nhánh, phân
bào và bằng bào tử.
-

Đoạn sợi: mỗi đoạn sợi xạ khuẩn khi đứt ra đều có khả năng nảy chồi tạo ra hệ
sợi xạ khuẩn.

-

Sự nảy chồi phân nhánh: trên bề mặt sợi xạ khuẩn xuất hiện những mấu lồi,
mấu lồi lớn dần lên thành chồi, chồi được kéo dài ra thành nhánh mới. Từ các
nhánh này lại mọc lên các nhánh chồi mới, cứ như vậy chẳng bao lâu từ một
nhánh phát triển thành một đám sợi dày đặc.

-

Phân bào theo kiểu amitose (phân bào không tơ).

-

Sự hình thành bào tử.

Hình 2.6. Chu trình sinh sản và phát triển từ bào tử của Streptomyces sp.
<URL: />9R_GFfwRbTg/s400/Streptomyces+life+cycle.jpg>


90

2.2. Hệ enzyme cellulase
(Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.2.1. Định nghĩa – cấu tạo
Hệ cellulase là một hệ bao gồm các enzyme hoạt động xúc tác cùng nhau, xúc tác
cho quá trình thủy phân cellulose thành các sản phẩm hòa tan (chủ yếu là cellobiose
hay glucose), hệ gồm 3 loại enzyme chủ yếu:
 Endo 1,4 - β - glucanase ( EC 3.2.1.4) hay 1,4  - D - glucan - 4 glucanohydrolase. Enzyme này cắt liên kết  1,4- glucoside ở bất kỳ vị trí
nào trong vùng chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin có độ trùng hợp cao.
 Exo 1,4 - β - glucanase ( EC 3.2.1.91) phân cách chuỗi cellulose từ đầu
không khử và giải phóng cellobiose.
 β - glucosidase ( EC 3.2.1.21) còn gọi là cellobiase hay  - D - glucosideglucohydrolase. Enzym này thủy phân cellobiose và các cellodextrin hòa tan
thành glucose. Enzyme này không tác động đến cellulose hay cellodextrin
có độ trùng hợp cao.
2.2.2. Tính chất
Các chế phẩm cellulase có thể thủy phân cellulose tự nhiên như giấy lọc và một
số dẫn xuất của cellulose như carbonxymethyl cellulose (CMC), hydroxyethyl
cellulose (HEC) bằng cách bẽ gãy các liên kết  - 1,4 - glucoside và  -1,4- glucan.
Các cellulase được nghiên cứu để tìm ra các thông số về độ bền nhiệt, pH tối ưu,
tính đặc hiệu cơ chất, về thành phần các acid amin trong phân tử, tính hòa tan. Các chế
phẩm cellulase thường hoạt động mạnh ở pH tối ưu từ 4 - 5, nhiệt độ tối ưu từ 400500C.
Hoạt động của enzyme bị phá hủy sau 10- 15 phút 800C. Độ hòa tan của cellulase
ở p 5 - 7 thì bền, ổn định trong 24 giờ ở 40C. Vì vậy chế phẩm cellulase cần được
bảo quản ở 40C nơi khô thoáng.
2.2.3. Cơ chế thủy phân cellulose
Theo Reese (1950), Exoglucanase hay enzym C1 không đặc hiệu chỉ có tác dụng
làm trương cellulose tự nhiên và các cellulose này sẽ chuyển thành các chuỗi cellulose