NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁI SINH CÂY THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁI SINH CÂY THÔNG NHỰA
(Pinus merkusii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HOÀNG VÂN

Tháng 9 /2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁI SINH CÂY THÔNG NHỰA
(Pinus merkusii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

NGUYỄN THỊ HOÀNG VÂN

Tháng 9/2008


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
 TS. Vương Đình Tuấn đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
thực tập tốt nghiệp.
 KS. Nguyễn Xuân Cường, KS. Nguyễn Lê Huyền Thanh, chị Hương, anh Nam
cùng các cô chú tại Phân viện khoa học Lâm nghiệp Nam bộ đã giúp đỡ tôi rất nhiều
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các bạn bè thân yêu CNSH K30 và lớp 12A1 niên khóa 2001 – 2004 trường
Bùi Thị Xuân, Đà Lạt, Lâm Đồng đã chia sẻ, động viên cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều
kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hoàng Vân

iii

TÓM TẮT
Nguyễn Thị Hoàng Vân, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2008.
“Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây thông nhựa (Pinus merkusii) trong điều kiện in
vitro”.
Thông nhựa là loài cây có nhiều giá trị kinh tế. Tuy nhiên, trong những năm vừa
qua, thông nhựa đang bị sâu róm tấn công rất nhiều. Tái sinh là một bước quan trọng
và không thể thiếu trong kỹ thuật chuyển gen tạo ra giống thông mới kháng sâu.
Đề tài được tiến hành từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2008 tại Phân viện nghiên cứu
khoa học Lâm nghiệp Nam bộ trên đối tượng là phôi trưởng thành của thông nhựa
(Pinus merkusii). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu
nhiên, lập lại 3 lần. Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 14.0 với mức ý nghĩa P ≤ 0,05.
Kết quả thu được:
 Thí nghiệm tạo chồi:
 Môi trường thích hợp cho việc tạo chồi là môi trường DCR.
 Trong 3 loại cytokinin sử dụng, BA kích thích tạo chồi nhiều nhất.
 Kết hợp các cytokinin cho hiệu quả tạo chồi và hiệu quả kinh tế không cao
 Kết hợp auxin và cytokinin nâng cao hiệu quả tạo chồi
 Bổ sung chất hữu cơ, đặc biệt là Casein Hydrosylate cho hiệu quả tạo
chồi cao nhất.
Từ các kết quả trên, công thức cho hiệu quả tạo chồi cao nhất là môi trường
DCR có bổ sung BA (5 mg/l), NAA (0,01 mg/l) và Casein Hydrolysate (500 mg/l).
 Thí nghiệm kéo dài chồi:
Môi trường DCR có bổ sung GA3 (1 mg/l) cho hiệu quả kéo dài chồi tốt nhất.

iv


SUMMARY
Nguyen Thi Hoang Van, Nong Lam University, HCM city, September, 2008.
“Study on regeneration technology for Pinus merkusii in vitro”.

Pinus merkusii is an important tree species in Vietnam. Protocols for genetic
transformation in P. merkusii pine require improved tissue culture procedures. The
present study was undertaken to establish a protocol for direct organogenesis and
plantlet regeneration from mature zygotic embryos of P.merkusii.
The study was carried out from 3/2008 to 9/2009 at the Forest Science Sub –
Institute of South Vietnam. All the experiments were repeated at least 3 – 4 times and
based on a complete randomized experimental design.

. Results:
 Shoot induction:
 DCR basal medium was observed to be most suitable for the shoot induction.
 Among the different cytokinins used during our studies, the effect of BA
for shoot induction was observed to be very high when used singly, as compared to
that of kinetin, TDZ.
 Most cytokinin combinations failed to induce adventitious shoots.
 A combination of BA and NAA was effective in inducing shoots.
 Supplementing with Casein Hydrosylate was also effective in inducing shoots.
From results above, DCR medium supplemented with BA (5 mg/l), NAA (0,01
mg/l) and Casein Hydrolysate (500 mg/l) was found to be most effective in inducing
shoots.
 Shoot elongation:
DCR medium supplemented with GA3 (1 mg/l) and activated charcoal (2 mg/l) is
the best medium for shoot elongation.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ .........................................................................................................iii

Tóm tắt.............................................................................................................. ix
Summary ............................................................................................................ v
Mục lục ............................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt ..............................................................................viii
Danh sách các hình ............................................................................................ ix
Danh sách các biểu đồ ....................................................................................... ix
Danh sách các bảng ........................................................................................... x
Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu ....................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
1.4 Giới hạn ........................................................................................................ 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
2.1. Sơ lược về thông nhựa ................................................................................. 3
2.1.1. Vị trí phân loại. ......................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học................................................................. 3
2.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái của thông nhựa ........................................ 5
2.1.4. Giá trị kinh tế của thông nhựa................................................................... 7
2.2. Tái sinh cây thông in vitro .......................................................................... 8
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô thực vật ............................................................... 8
2.2.2. Các phương pháp ...................................................................................... 9
2.2.3. Các giai đoạn nhân giống in vitro ............................................................. 9
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ....................................... 10
2.2.5. Những thành tựu về nuôi cấy mô một số loài thông............................... 12
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 15

vi


3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm .............................................................. 15

3.2. Vật liệu....................................................................................................... 15
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 15
3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 15
3.2.3. Môi trường nuôi cấy................................................................................ 15
3.2.4. Điều kiện nuôi cấy. ................................................................................. 16
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16
3.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu................................................................... 16
3.3.2. Các thí nghiệm ....................................................................................... 17
3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 21
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 22
4.1. Kết quả ....................................................................................................... 22
4.2. Thảo luận.................................................................................................... 38
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................... 41
5.1. Kết luận. ..................................................................................................... 41
5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 42
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
IBA

Indolebutyric acid

NAA

Nanaphthaleneacetic acid

2,4 D

2,4 – dichlorophenoxy acetic acid

BA

N6-benzyladenine

TDZ

(thidiazuron)1 – Phenyl – 3 – (1,2,3 – thiadiazol – 5 – yl) urea

GA3

Gibberellic acid

Glu

L-glutamine

Casa

Casein Hydrolysate

ĐHST

Điều hòa sinh trưởng

GD

Gresshoff và Doy, 1972

MS

Murashige và Skoog, 1962

DCR

Gupta và Durzan, 1985

TE

Tang và ctv, 1998

MCM

Harry và Torpe 1994; Murithii và ctv, 1991

LP

Von Arnold và Eriksson, 1979

SH

Schenk và Hildebrandt, 1972

Ctv

Cộng tác viên

NT

Nghiệm thức

Đc

Đối chứng

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Cành và lá thông nhựa....................................................................................4
Hình 2.2. Quả và hạt thông nhựa....................................................................................5
Hình 2.3. Phân bố thông nhựa trên thế giới....................................................................6
Hình 4.1. Phôi thông sau trong môi trường có và không có chất điều hòa
sinh trưởng ..............................................................................................................24
Hình 4.2. Chồi có rễ trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng ..............24
Hình 4.3. Phôi thông qua các giai đoạn khác nhau ......................................................33
Hình 4.4. Phôi thông dưới kính lúp ..............................................................................34
Hình 4.5. Chồi ở các môi trường kéo dài .....................................................................35
Hình 4.6. Rễ hình thành sau 6 tuần ..............................................................................36
Hình 4.7. Chồi trong các môi trường ra rễ ...................................................................37

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng môi trường khoáng cơ bản đến tỷ lệ tạo chồi .......................23
Biểu đồ 4.2.Ảnh hưởng môi trường khoáng cơ bản đến số chồi..................................23
Biểu đồ 4.3. Hiệu quả các cytokinin đến tỷ lệ tạo chồi................................................26

Biểu đồ 4.4. Hiệu quả các cytokinin đến số chồi .........................................................26
Biểu đồ 4.5. Hiệu quả sự kết hợp các cytokinin đến tỷ lệ tạo chồi ..............................28
Biểu đồ 4.6. Hiệu quả sự kết hợp các cytokinin đến số chồi .......................................28
Biểu đồ 4.7. Hiệu quả sự kết hợp BA / NAA đến tỷ lệ tạo chồi ..................................30
Biểu đồ 4.8. Hiệu quả sự kết hợp BA / NAA đến số chồi............................................30
Biểu đồ 4.9. Hiệu quả chất hữu cơ đến tỷ lệ tạo chồi ..................................................32
Biểu đồ 4.10. Hiệu quả chất hữu cơ đến số chồi .........................................................32
Biểu đồ 4.11. Hiệu quả của GA3 đến kéo dài chồi .......................................................35

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Một số loài thông được nuôi cấy mô ...........................................................13
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng môi trường khoáng cơ bản ............................17
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm hiệu quả của một số cytokinin ........................................18
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm hiệu quả của sự kết hợp các cytokinin ............................18
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm hiệu quả của sự kết hợp BA / NAA ................................19
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm hiệu quả của một số chất hữu cơ .....................................20
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm hiệu quả của GA3 lên sự kéo dài chồi..............................20
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm hiệu quả của auxin đến khả năng tạo rễ ..........................21
Bảng 4.1. Bảng so sánh ảnh hưởng môi trường khoáng cơ bản ..................................22
Bảng 4.2. Bảng so sánh hiệu quả của một số cytokinin ..............................................25
Bảng 4.3. Bảng so sánh hiệu quả của sự kết hợp các cytokinin ..................................27
Bảng 4.4. Bảng so sánh hiệu quả của sự kết hợp BA / NAA ......................................29
Bảng 4.5. Bảng so sánh hiệu quả của chất hữu cơ .......................................................31
Bảng 4.6. Bảng so sánh hiệu quả của GA3 lên sự kéo dài chồi....................................34
Bảng 4.7. Bảng so sánh hiệu quả của auxin đến khả năng tạo rễ ................................36

x


Chương 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Đặt vấn đề
“Thông là một nguồn tài nguyên thiên nhiên quí, nó có vai trò quan trọng trong
việc cung cấp nguyên liệu gỗ, nhựa cho công nghiệp và góp phần tăng nguồn hàng
xuất khẩu, bảo vệ môi trường, tạo công ăn việc làm...”, Trung tâm Tin học Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn (01 – 03 – 2007).
Tuy nhiên, trong những năm vừa qua tình hình sâu bệnh xảy ra rất nghiêm trọng
trên nhiều loài thông. Điển hình là thông nhựa đã bị sâu róm tấn công trên hàng ngàn
hecta ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Quảng Bình .... Điều này gây thiệt hại lớn về
kinh tế cho các vùng sản xuất thông nhựa.
Việc tạo giống thông có khả năng chống chịu sâu róm là nhu cầu bức xúc của sản
xuất. Trong những năm gần đây, việc tạo giống thông mới có năng suất, chất lượng tốt
đã được nghiên cứu tại trung tâm nghiên cứu giống Lâm nghiệp, viện Khoa học Lâm
nghiệp Việt Nam. Tuy nhiên những nghiên cứu này dựa trên kỹ thuật lai tạo, chọn lọc
truyền thống nên cần rất nhiều thời gian để đưa giống mới vào sản xuất.
Ứng dụng Công nghệ sinh học trong hơn một thập niên qua đã đạt được nhiều
thành tựu quan trọng trong việc cải tạo giống cây trồng. Trong đó những tính trạng
chất lượng như giảm hàm lượng lignin, cải thiện tính kháng sâu bệnh đã được công bố
(Tang, 2001). Để góp phần hỗ trợ công tác tạo chọn giống cây thông có khả năng
chống chịu cao với sâu róm, ứng dụng Công nghệ sinh học, đặc biệt là kỹ thuật chuyển
gen là một việc làm hết sức cần thiết nhằm rút ngắn quá trình tạo giống mới. Tuy
nhiên, để tiến hành chuyển gen thực vật thành công và tạo được cây thông mới mang
gen kháng sâu róm mong muốn thì một trong những bước rất quan trọng và không thể
thiếu được là xây dựng được hệ thống tái sinh. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu kỹ
thuật tái sinh cây thông nhựa (Pinus merkusii) trong điều kiện in vitro”

được thực hiện.

1


1.2. Mục tiêu
Tìm được điều kiện nuôi cấy phù hợp để tái sinh thông nhựa in vitro
hiệu quả nhất.
1.3. Yêu cầu
Tạo được nhiều chồi, chồi khoẻ mạnh và có thể tạo cây hoàn chỉnh.
Các chất điều hoà sinh trưởng phổ biến, dễ mua.
1.4. Giới hạn
Do thời gian có hạn nên nghiên cứu về khả năng tạo rễ của chồi in vitro thành cây
hoàn chỉnh và đưa ra môi trường trồng ngoài vườn ươm chưa thực hiện được.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về thông nhựa
2.1.1. Vị trí phân loại
Thông nhựa, còn gọi là thông hai lá, có tên khoa học là Pinus merkusiana Cool
và Gauss hoặc Pinus merkusii Jung et de Vriese.
Tên thông thường ở một số nước (www.worldagroforestrycentre.org):
 Philippines: mindoro pine, tapulau
 Indonesia: damar bunga
 Thái Lan: son – haang – maa
 Việt Nam: thông nhựa, thông hai lá
Theo hệ thống phân loại thực vật của Phạm Hoàng Hộ (1999) thì thông nhựa thuộc:

Giới

Plantae

Ngành

Gymnospermae

Phân ngành

Pinicae

Lớp

Pinopsida

Phân lớp

Pinida

Bộ

Pirales

Họ

Pinaceae

Chi

Pinus

Loài

P. merkusii

2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học
Thông nhựa là cây gỗ lớn, cao trung bình 20 – 25 m, đường kính 60 – 70 cm có
khi tới 1 m, thân thẳng và tròn, gốc không có bạnh vè, vỏ dày màu nâu đỏ nhạt, nứt
dọc sâu, tán lá rộng hình tháp góc phân cành từ 25 – 800, cành cứng và giòn, hai lá kim
mọc ra từ 1 bẹ, bẹ dài 1 – 1,5 cm, màu nâu nhạt. Lá có chiều dài 20 – 25 cm, có màu
xanh đậm (Lâm Công Định, 1977).

3


Cành

Lá
Hình 2.1. Cành và lá thông nhựa

Thông nhựa là loài cây lưỡng tính, nón đực mọc ra ở nách các bẹ lá. Có chiều dài
từ 2 – 3 cm, màu vàng nhạt khi chín có màu vàng đậm. Là cây tự thụ phấn nhờ gió nên
nón đực chủ yếu tập trung ở những cành nằm phía dưới tầng tán lá, còn nón cái ngược
lại chủ yếu ở phần trên của tán lá. Nón cái được mọc ra ở các đầu cành, thường có
2 – 4 nón, nón gồm nhiều vảy xếp hình xoắn ốc, bên trong có vảy chứa noãn. Nón cái
chưa được thụ phấn thì vảy quả đóng lại và quả chuyển qua màu xanh đậm. Khi quả
chín thì có màu vàng xậm, chiều dài quả 10 – 12 cm, đường kính quả 3 – 4 cm. Hạt
thông nhựa hình trái xoan dài 3 – 4 mm và có cánh, cánh hạt dài từ 1 – 1,5 cm. Khi hạt
chín vảy quả mở ra để hạt bay ra theo gió. Thời gian từ khi hạt chín đến khi bay ra

khỏi quả thường không quá 1 tháng. Chu kỳ sai quả của thông nhựa là 2 – 3 năm. Quả
sau khi chín thường rụng chứ không nằm lâu trên cây. Thời gian từ khi quả (nón cái)
tới khi quả chín mất 14 tháng.

4


Cành mang quả

Quả thông nhựa

Hạt có vảy

Hình 2.2. Quả và hạt thông nhựa
Thông nhựa là cây ưa sáng hoàn toàn. Cây dưới 5 tuổi có thể chịu bóng râm nhẹ.
Tùy điều kiện sống và loại thông, có giai đoạn cây sinh trưởng rất chậm, cây 5 – 6 tuổi
có chiều cao thường không quá 2 m, nhưng từ 10 – 25 tuổi cây sinh trưởng nhanh nhất,
sau đó lại giảm dần. Rễ cọc ăn sâu và rộng, có khả năng liền rễ trong cùng một cây và
khác cây, có nấm rễ cộng sinh chủ yếu là Boletus granulatu và Khizo pogoprosculus
giúp cho rễ cây hấp phụ được các chất khoáng tốt hơn và có khả năng cố định được lâu
trong đất (Lâm Công Định, 1977; Lê Đình Khả, 1995).
Trong tự nhiên, thông nhựa mọc thuần loại và cũng mọc hỗn loại với nhiều loại
cây khác thuộc họ Giẻ, họ Dầu hay loài thông ba lá…(Lâm Công Định, 1977).
2.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái của thông nhựa
 Phân bố và sinh thái của thông nhựa trên thế giới
Thông nhựa là cây đặc hữu của khu vực nhiệt đới Đông Nam Á. Chúng thích hợp
với điều kiện nóng ẩm, mưa nhiều của khí hậu vùng thấp. Thông nhựa có mặt ở Thái
Lan, Miến Điện, Hải Nam (Trung Quốc), Philippin, Indonesia, Campuchia, Lào
và Việt Nam.

5


Hình 2.3. Phân bố thông nhựa trên thế giới
Nói chung, thông nhựa phân bố ở độ cao từ 0 – 1000 m so với mặt nước biển, với
nhiệt độ bình quân 23 – 270C, lượng mưa trung bình năm 1500 – 2500 mm, có những
biến động lớn theo mùa, độ ẩm tương đối của không khí 80 – 84 %, thích hợp đất sâu,
thành phần cơ giới nhẹ đến trung bình, thoát nước, chua (pH 4 – 5,5), phát triển trên đá
mẹ sa thạch, phiến thạch, cuội kết, granit, bazan (Lâm Công Định, 1977).
Thông nhựa là loài cây dễ sống, có thể sống trên đất xấu, khô kiệt, chua, thoát
nước, tầng đất mặt mỏng có đá sỏi, nhiều loài cây khác không mọc được thì loài cây
này vẫn mọc thuần loại và sinh trưởng, phát triển bình thường. Tuy nhiên, nó không
thể sống trên đất trũng, kiềm, mặn, đất phèn và đất đá vôi.
 Phân bố và sinh thái thông nhựa ở Việt Nam
Thông nhựa là loài cây đặc hữu của nước ta, phát triển trên nền đất chua
(pH = 3,3 – 4,9) có nguồn gốc đá mẹ bazan, feralit, granit, phiến thạch sét, sa thạch,
sỏi sạn và cuội kết. Chúng có phạm vi phân bố rộng, nằm trong giới hạn 10 vĩ tuyến
với 5 kinh tuyến, ở độ cao dưới 100 – 200 m đến gần 1000 m so với mặt nước biển,
nhưng lại không liên tục. Về độ cao chủ yếu trên 3 vành đai: dưới 100 – 200 m,
500 – 700 m, 800 đến dưới 1000 m. Về chỗ cách biển cũng giới hạn từ chỗ sát biển
hoặc cách biển 5 – 10 km đến 100 – 120 km.
Thông nhựa phân bố trên nền nhiệt độ trung bình từ 20 – 250C, lượng mưa hàng
năm 1800 – 2100 mm. Tuy nhiên, xét về mối quan hệ nhiệt ẩm thì thông nhựa ở nước
ta tồn tại và phát triển trên hai vùng có chế độ mưa màu khác nhau. Vùng I có chế độ
6


mưa tập trung vào vụ hè thu trùng với mùa nắng nóng, còn mùa khô trùng với mùa
đông lạnh (như Tây Nguyên). Vùng II có chế độ mưa trùng với mùa đông lạnh, còn
mùa khô trùng với tháng hè nóng (như Bắc Trung Bộ). Do sự phân bố như vậy, giữa

hai vùng có những điều kiện sinh thái, địa lí khác nhau dẫn đến tạo nên hai loại thông
nhựa, đó là thông nhựa vùng cao và thông nhựa vùng thấp. Sự khác nhau không chỉ ở
đặc điểm hình thái mà cả về khả năng sinh trưởng (Nguyễn Xuân Quát, 1993).
2.1.4. Giá trị kinh tế của thông nhựa
Rừng thông có vai trò to lớn trong việc bảo vệ môi trường sống và duy trì ổn định
sinh thái. Ngoài tác dụng phủ xanh đất trống đồi trọc, rừng thông còn là chiếc máy lọc
không khí khổng lồ và tinh vi. Một hecta rừng thông trong 1 năm sản xuất được 5 - 7
tấn O2 làm trong sạch 18 triệu m3 không khí, giữ lại 30 - 70 tấn bụi và hấp thụ 3 - 7 tấn
CO2. Rừng thông còn có tác dụng bảo hộ, hạn chế lũ lụt, góp phần tạo nên khung cảnh
thiên nhiên tươi đẹp (www.dalatrose.com).
Thông là một trong những nguồn quan trọng cung cấp gỗ. Gỗ thông có vân đẹp,
mùi thơm, có nhiều đặc tính cơ lý tốt (nhẹ, mềm, dễ xẻ, dễ bào...), tỷ trọng 0,55 – 0,9,
gỗ bền, chống được mối mọt (đặc điểm này hơn hẳn thông ba lá). Cây có nhiều nhựa
thì gỗ càng nặng và bền. Gỗ thông được dùng rộng rãi trong xây dựng, đóng thùng,
đàn, bàn ghế, chế tạo diêm quẹt, ván ép, làm sàn nhà, nhiều mặt hàng thủ công mỹ
nghệ (hộp, tranh chạm bút lửa...). Các loại gỗ thông cũng được dùng để xây dựng cầu,
sườn nhà máy. Thân thông dài và thẳng được dùng để làm trụ điện, điện thoại, cột
buồm ... Thông là nguyên liệu dùng làm bột giấy rất tốt vì thông cho sợi dài, tỷ lệ
cellulose chiếm hơn 62 % (www.dalatrose.com).
Nhựa thông là loại sản phẩm quý giá cho nhiều ngành công nghiệp. Sản lượng
nhựa của cây thông nhựa nhiều hơn bất cứ loài thông nào khác hiện có ở Việt Nam,
đồng thời tế bào nhựa cũng lớn hơn và vách dài hơn so với các loài thông khác. Sau
khi chưng cất nhựa thông người ta thu được khoảng 20 % tinh dầu và 60 – 70 %
tùng hương.
Nhờ khả năng hòa tan tốt, tinh dầu thông được sử dụng phổ biến làm dung môi
trong công nghiệp sơn. Trong các xí nghiệp sản xuất chất dẻo và celluloid, tinh dầu
thông được dùng để hòa tan cao su và các chất nhựa khác, tinh dầu thông còn được

7

dùng làm nguyên liệu để tổng hợp ra các chế phẩm như long não, thuốc trừ sâu, thuốc
ho tecpincol, tecpin hydrat v.v...
Tùng hương (rosin) thường được gọi là colophan. Colophan là một loại nguyên
liệu được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau:
* Công nghiệp chất béo: do khả năng thấm ướt tốt, nhiều bọt, hòa tan tốt các
chất béo, giá thành vừa phải. Colophan được sử dụng cùng với các chất béo khác để
nấu xà phòng.
* Công nghiệp giấy: colophan được dùng để chế keo phủ lên bề mặt giấy giữ
cho giấy không bị nhòe mực và làm xấu màu sắc của mực.
* Công nghiệp điện: chế tạo các vật liệu điện, phối hợp với các loại nhựa khác
để chế tạo sơn ngâm tẩm cách điện cho các dụng cụ điện.
* Công nghiệp sơn: chế tạo chất làm khô cho các loại sơn dầu …
* Công nghiệp dược: nấu cao dán nhọt.
* Công nghiệp cao su: chế vải sơn, phủ bóng cho các sản phẩm làm bằng cao
su, cho thêm vào cao su để tăng độ đàn hồi.
* Công nghiệp dầu mỏ: chế tạo chất bôi trơn đặc quánh.
* Công nghiệp dệt: chế tạo các chất cắn màu dùng cho quá trình nhuộm.
* Công nghiệp xây dựng: nâng cao tính chất cơ học của đá xây dựng và các
công trình bằng bê tông (www.dalatrose.com).
Trong những năm gần dây, mặc dù sản xuất nhựa tổng hợp trên cơ sở công
nghiệp hóa dầu đã tăng lên đáng kể, cũng như đã xuất hiện nhiều dung môi hữu cơ rẻ
tiền, song colophan và dầu terpentin vẫn không mất ý nghĩa của nó (Slaviannskii,
1970). Vì vậy, thông nhựa vẫn đang là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị.
2.2. Tái sinh cây thông in vitro
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp có khả năng nhân nhanh một số lượng lớn,
đảm bảo giữ các đặc điểm di truyền tốt và giữ được tính trẻ hóa, đây là phương pháp
tốt nhất để giải quyết nhu cầu cây con phục vụ trồng rừng sản xuất trên quy mô lớn với
độ đồng đều cao đáp ứng yêu cầu sản xuất công nghiệp, góp phần thực hiệu quả công

tác trồng rừng (Đoàn Thị Mai và ctv, 2004).

8


Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống
và nhân giống hiện đại, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi
thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng
và thực tiễn sản xuất nông, lâm nghiệp ở Việt Nam.
2.2.2. Các phương pháp
Theo Trần Thị Dung (2005), một số phương pháp chính trong nhân giống in vitro
bao gồm:
 Nhân giống bằng sự tăng sinh chồi nách.
 Nhân giống qua nuôi cấy chồi đỉnh.
 Nhân giống bằng chồi bất định hay phôi vô tính trực tiếp từ mẫu cấy.
 Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo (callus) để phát sinh chồi bất định hay
phôi vô tính.
 Nhân giống qua nuôi cấy tế bào lớp mỏng.
2.2.3. Các giai đoạn nhân giống in vitro
Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau (Nguyễn Đức
Lượng, 2002):
2.2.3.1. Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ
Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang trong giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi
nhân giống sẽ đạt hiệu quả cao.
2.2.3.2. Giai đoạn 2: Khử trùng mẫu cấy
Một phần thích hợp của thực vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi
cấy trong điều kiện vô trùng. Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được
chuyển sang giai đoạn 3.

9

2.2.3.3. Giai đoạn 3: Tăng sinh
Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự phát sinh phôi
soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định. Các chồi tăng trưởng mạnh, đạt chiều
cao thích hợp sẽ chuyển sang giai đoạn 4.
2.2.3.4. Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro
Những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường kích thích
ra rễ. Trong môi trường này cần bổ sung auxin để cảm ứng ra rễ và nồng độ khoáng
thường giảm so với môi trường tăng sinh.
2.2.3.5. Giai đoạn 5: Ra rễ in vivo
Với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ được chuyển ra vườn ươm để ra rễ và
phát triển thành cây con hoàn chỉnh. Phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ,
ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm
cũng như ruộng sản xuất.
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
2.2.4.1. Mẫu nuôi cấy
Murashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của chọn lựa mẫu cấy thích hợp và chỉ
cho thấy hầu hết những cơ quan có thể dùng để nuôi cấy mô. Điều quan trọng cho thấy
một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn lọc, tuổi sinh
lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khoẻ của mẫu và nguồn mẫu.
2.2.4.2. Điều kiện nuôi cấy
 Ánh sáng
Nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 5 – 25 w/m2
(100 – 5000 lux), nhưng người ta sử dụng thường xuyên nhất là từ 10 – 15 w/m2
.Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần gia
tăng cường độ ánh sáng.

10

 Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi cấy in
vitro. Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loài cây trồng trong khoảng 20 – 270C. Một số loài cây
cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình.
 Không khí
Thành phần chất khí trong bình nuôi cấy có ảnh hưởng đến sinh trưởng cây in
vitro: O2, CO2 và ethylen là những thành phần chất khí được khảo sát nhiều trong môi
trường nuôi cấy. Ẩm độ cũng được quan tâm đến, do ảnh hưởng đến quá trình làm khô
mẫu nuôi cấy.
2.2.4.3. Môi trường nuôi cấy
Mỗi loại cây trồng khác nhau đều yêu cầu một hàm lượng dinh dưỡng khác nhau.
Mặt khác, môi trường còn thay đổi tuỳ thuộc vào sự phân hoá của mô cấy, tuỳ theo
trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo mầm hay tái sinh cây
hoàn chỉnh.
Các thành phần môi trường chính gồm:
 Đường làm nguồn carbon.
 Các muối loại muối khoáng đa lượng và vi lượng.
 Các vitamin.
 Các chất điều hoà sinh trưởng.
Ngoài ra còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (amino
acid, EDTA…) hoặc không xác định (nước dừa, nước chiết nấm men…).
2.2.4.4. Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng trong nuôi cấy mô
Hiện nay 3 nhóm chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) thường được dùng: auxin,
cytokinin và gibberellin.
 Auxin
Auxin có vai trò kích thích tăng trưởng và kéo dài tế bào, có khả năng khởi đầu
sự phân chia tế bào. Điều chỉnh tính hướng động của cây: quang hướng động và địa hướng
động. Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn được giải thích bằng việc ức chế sinh trưởng của
chồi bên khi auxin được vận chuyển từ ngọn xuống dưới. Kích thích sự hình thành rễ.

11


Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm
hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù.
 Cytokinin
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào ở chồi và rễ. Tỷ lệ giữa cytokinin và
auxin thích hợp sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nếu tỷ lệ này
cao thì chồi sẽ hình thành. Ngược lại, tỷ lệ này thấp sẽ tạo rễ. Khi tỷ lệ này cân bằng
thì hình thành mô sẹo.
Cytokinin kìm hãm ưu thế ngọn, kích thích hình thành chồi bên, kìm hãm quá trình
hóa già của lá.
Cytokinin kích thích vận chuyển dinh dưỡng thông qua việc thiết lập mối quan hệ
giữa source – sink, phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng
sự nở hoa.
 Gibberellin
Gibberellin cảm ứng kéo dài thân ở các loài cây lùn và dạng hoa thị. Gibberellin
kích thích tăng trưởng thân thông qua kích thích cả kéo dài và phân chia, cảm ứng sự
phát triển của đỉnh sinh trưởng hay chồi in vitro, làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo
chồi, rễ bất định và sự phát sinh phôi soma.
Gibberellin kích thích sự nẩy mầm của hạt và củ, kích thích sự ra hoa. Ảnh hưởng
sự phân hoá giới tính: ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực.
Làm tăng kích thước của quả, tạo quả không hạt.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thì tùy vào mẫu cấy và yêu cầu của từng thí
nghiệm mà các chất điều hòa sinh trưởng được dùng một cách hợp lý.
2.2.5. Những thành tựu về nuôi cấy mô một số loài thông
2.2.5.1. Trên thế giới
Tái sinh cây con bằng phương pháp nuôi cấy mô của các cây lá kim được
Sommer và các đồng nghiệp báo cáo đầu tiên vào năm 1975. Một thời gian sau, nhiều

loài cây lá kim đã được tái sinh thành công thông qua hình thành cơ quan từ các mẫu
cấy khác nhau Riêng về các loài thông, cũng có nhiều công trình nghiên cứu. Nhiều
loài thông được tái sinh thông qua con đường phát sinh cơ quan trực tiếp từ các mẫu
cấy khác nhau (phôi trưởng thành, phôi chưa trưởng thành, lá mầm (cotyledon)...). Có
nhiều loại môi trường sử dụng trong nuôi cấy thông như: GD (Gresshoff and Doy,
12


1972), DCR (Gupta và Durzan, 1985), MS (Murashige và Skoog, 1962), MCM (Harry
và Thorpe 1994; Murithii và ctv, 1991), TE (Tang và ctv 1998)....
Trong đó, một số môi trường có hàm lượng khoáng đa lượng giảm đi ½ hay ¼,
tùy theo loại cây. Môi trường có thể bổ sung thêm L – glutamin, Casein hydrolysate
kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng. Để tạo chồi bất định, hầu hết các tác giả đều
sử dụng cytokinin là BA có hoặc không kết hợp với auxin (NAA, IBA...).
Bảng 2.1. Một số loài thông được nuôi cấy mô

Vật liệu

Môi
trường

Cotyledon

GD

Phôi trưởng thành

AE

Pinus monticola

Phôi trưởng thành

LV

Pinus pinaster

Cotyledon

GMD

Pinus ayacahuite

Phôi trưởng thành

MCM

Pinus pinea L.

Cotyledon

DCR

Pinus pinea L.

Cotyledon

½ LP

Pinus wallichiana

A.B. Jacks

Phôi trưởng thành

½ DCR

Tang W. (2001)

Pinus taeda L.

Phôi trưởng thành

Stojicic D. (2000, 2004 )

Pinus heldreichii

Phôi trưởng thành

TE
GD

Pinus pinaster

Phôi chưa trưởng
thành

DCR

Pinus pinea

Cotyledon

½ MS

Pinus massoniana
L.

Phôi trưởng thành

DCR

Tác giả

Loài

Carole H. Saravitz và ctv
(1991)
Maurizio Lambardi và
ctv (1993)
Martin S. Lapp và ctv
(1995)
Filomena Calixto, M.
Salome Pais (1996)
Francisco Saborio và ctv
(1997)
Maurizio Capuana
và ctv (1995)
Gonzalez và ctv (1998)
Mathur G., Nadgauda
(1999)

Pinus virginiana
Mill.
Pinus halepensis
Mill.

Célia Miguel và ctv
(2004)
Whan Sul, S. S. Korban
(2004),
Yu Zhang và ctv (2006)

13


2.2.5.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, việc nuôi cấy mô cây thông cũng như chỉ mới thực hiện trong
những năm gần đây. Đối tượng nghiên cứu chưa nhiều, mới chỉ có một số kết quả nuôi
cấy mô công bố cho một số loài thông như thông caribê (Pinus caribaea), thông ba lá
(Pinus khasya Royle)... với vật liệu ban đầu là chồi nách và chồi đỉnh. (Hà Thị Loan,
2003; Cao Quốc Liêm, 2004...)
Tuy nhiên, hiện nay chưa có tài liệu nào công bố về kết quả tái sinh thông nhựa
(Pinus merkusii) trong điều kiện in vitro kể cả ở Việt Nam và trên thế giới.

14


Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Thời gian: từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2008
Địa điểm: Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ, số 1 Phạm Văn
Hai, phường 1, quận Tân Bình, Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Hạt thông nhựa trưởng thành dòng 54 (do trung tâm nghiên cứu giống cây rừng,
viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp).
3.2.2. Trang thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: nồi hấp vô trùng, máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy vô trùng
Dụng cụ: kẹp, kéo, dao cấy, đèn cồn, ống nghiệm, erlen 250 ml, erlen 100 ml,
pipette ….
3.2.3. Môi trường nuôi cấy
Các môi trường được sử dụng gồm: MS (Murashige và Skoog, 1962), ½ MS,
DCR (Gupta và Durzan, 1985). Trong đó môi trường ½ MS là môi trường MS mà
thành phần đa lượng được giảm đi một nửa (phụ lục).
Các chất điều hòa sinh trưởng:
 Cytokinin: BA (N6 – benzyladenine), Kinetin, TDZ (thidiazuron)
1 – Phenyl – 3 - (1,2,3 – thiadiazol – 5 – yl) urea….
 Auxin: IBA (indolebutyric acid), NAA (naphthaleneacetic acid) ….
 Gibberellin: GA3 (gibberellic acid).
Các chất hữu cơ:
 L – glutamine (Glu)


500 mg/l (lọc khử trùng, cho vào ở nhiệt độ 600C)

Casein Hydrolysate (Casa) 500 mg/l

15