NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN PROTEIN TRÙN QUẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEASE TỪ
CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis
VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN
PROTEIN TRÙN QUẾ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: TIÊU THỊ NGỌC THẢO

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEASE TỪ
CANH TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis VÀ
ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN
PROTEIN TRÙN QUẾ

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

TIÊU THỊ NGỌC THẢO

ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT

Tháng 9/2008


LỜI CẢM ƠN


Xin được gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và các anh chị trong gia đình đã

luôn quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập xa nhà.


Xin cảm ơn ban chủ nghiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý

thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường


Xin được gởi lời cảm ơn chân thành nhất đến ThS. Trương Phước Thiên

Hoàng và ThS. Nguyễn Như Nhứt đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và

tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này.


Cảm ơn các anh chị làm việc tại công ty TNHH Gia Tường đặc biệt là các

anh chị trong phòng thí ngiệm đã luôn quan tâm, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong
thời gian thực tập tốt nghiệp tại công ty.


Cảm ơn những người bạn thân thiết đã luôn gắn bó, chia sẻ và giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Sinh viên thực hiện
Tiêu Thị Ngọc Thảo

iii


TÓM TẮT
Tiêu Thị Ngọc Thảo, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu thu nhận protease từ canh trường nuôi cấy
Bacillus subtilis và ứng dụng trong thủy phân protein trùn quế”. Đề tài được thực hiện
tại phòng thí nghiệm chi nhánh công ty TNHH Gia Tường từ 04/03/2008 đến
30/07/2008.
Giáo viên hướng dẫn:
ThS. Trương Phước Thiên Hoàng
ThS. Nguyễn Như Nhứt
Chúng tôi sử dụng tác nhân tủa là ethanol 96% để thu nhận protease từ canh
trường nuôi cấy B. subtilis. Sản phẩm protease thu được sau tủa được xác định điều
kiện nhiệt độ và pH tối ưu để ứng dụng vào thủy phân protein trùn quế. Ngoài ra,

chúng tôi đã khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình thủy phân nguồn protein
này.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
 Sử dụng tác nhân tủa là ethanol 96% với tỷ lệ thể tích dịch chiết enzyme và
ethanol là 1:2, thời gian tủa là 40 phút sẽ thu hồi được chế phẩm protease có
hoạt tính cao nhất.
 Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động thủy giải protein của chế phẩm
protease lần lượt là 50oC và 7,6.
 Hiệu suất thủy phân lên đến 97,84% khi sử dụng nồng độ cơ chất bột trùn
quế là 15%, hoạt độ protease bổ sung vào là 2UI/ml và thời gian thủy phân
là 18 giờ.

iv


ABSTRACT
TIEU THI NGOC THAO, Nong Lam University of Ho Chi Minh City.
Graduating thesis topic: “Study on collecting protease from Bacillus subtilis
solid state culture and applying for hydrolysing redworm protein”. This thesis was
carried out at the laboratory of the branch of Giatuong Co. Ltd from 03/2008 to
07/2008.
We used 96% ethanol as a precipitation factor to collect protease from the
Bacillus subtilis culture. Protease product was got after precipitating, was determined
optimal temperature anh pH in order to use for hydrolyze redworm protein. We also
surveyed some factors effected on this hydrolysis process.
Our result showed that:
 Suitable volume ratio of extracted enzyme and 96% ethanol is 1:2 and
optimal precipitation time is 40 minutes.
 Optimal temperature and pH in order to hydrolyze casein of the protease
product are 50oC and 7,6 respectively

 Hydrolysis efficiency of the protease product reaches to 97,84% when
substrate concentration was 15%, added protease activity is 2UI/ml and
hydrolysis time is 18 hours.

v


MỤC LỤC
TRANG
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................iii
TÓM TẮT ........................................................................................................................ iv
ABSTRACT ...................................................................................................................... v
MỤC LỤC ........................................................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................. xi
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ....................................................................................... xii
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ........................................................................................xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................xiii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
1.2. Mục đích ...................................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................................ 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis ..................................................................................... 3
2.1.1. Phân loại ................................................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm của loài B.subtilis ..................................................................................... 3
2.1.3. Cấu trúc bộ gene của B.subtilis ................................................................................ 6
2.1.4. Sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên ........................................................ 6
2.1.5. Các sản phẩm từ B.subtilis ....................................................................................... 7
2.1.6. Tác hại của B.subtilis ................................................................................................ 9

2.1.7. Ứng dụng của B.subtilis ........................................................................................... 9
2.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận protease ....................................................................... 10
2.3. Tổng quát về protease ................................................................................................ 11
2.3.1. Sơ lược lịch sử ........................................................................................................ 11
2.3.2. Giới thiệu chung ..................................................................................................... 14
2.3.3. Phân loại protease ................................................................................................... 14
2.3.4. Chức năng sinh học của protease vi khuẩn ............................................................ 16
vi


2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của protease ................................................ 17
2.3.5.1. Nhiệt độ ............................................................................................................... 17
2.3.5.2. pH ........................................................................................................................ 17
2.3.5.3. Thời gian hoạt động của enzyme ......................................................................... 18
2.3.5.4. Bản chất protease ................................................................................................. 18
2.3.5.5. Chất hóa học ........................................................................................................ 18
2.3.5.6. Độ bền hoạt tính protease .................................................................................... 18
2.4. Ứng dụng của protease vi sinh vật ............................................................................ 19
2.4.1. Trong xử lý rác ....................................................................................................... 19
2.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm ................................................................................ 20
2.4.3. Trong công nghiệp nước giải khát .......................................................................... 21
2.4.4. Trong công nghiệp thuộc da ................................................................................... 21
2.4.5. Trong mỹ phẩm ...................................................................................................... 21
2.4.6. Trong nông nghiệp ................................................................................................. 21
2.4.7. Trong công nghiệp dược phẩm và y học ................................................................ 21
2.5. Sự thủy phân protein .................................................................................................. 22
2.5.1. Các phương pháp thủy phân ................................................................................... 22
2.5.1.1. Thủy phân bằng acid ........................................................................................... 22
2.5.1.2. Thủy phân bằng kiềm .......................................................................................... 23
2.5.1.3. Thủy phân bằng enzyme ...................................................................................... 23

2.5.2. Những thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân ............................................... 23
2.6. Giới thiệu về trùn quế ................................................................................................ 23
2.6.1. Phân loại ................................................................................................................. 23
2.6.2. Đặc điểm cấu tạo .................................................................................................... 24
2.6.2.1. Đặc điểm hình thái ............................................................................................... 24
2.6.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái .................................................................................. 24
2.6.2.3. Đặc điểm sinh sản ................................................................................................ 24
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 26
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................ 26
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................... 26
3.2.1. Giống vi sinh vật .................................................................................................... 26
vii


3.2.2. Nguyên liệu ............................................................................................................ 26
3.2.3. Các môi trường dùng trong thí nghiệm .................................................................. 26
3.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất ......................................................................................... 26
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................................... 26
3.3.2. Hóa chất .................................................................................................................. 26
3.4. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu ............................................................. 26
3.5. Phương pháp thí nghiệm ............................................................................................ 27
3.5.1. Tinh sạch sơ bộ protease từ canh trường nuôi cấy ................................................. 27
3.5.1.1. Khảo sát tỷ lệ thích hợp để tủa protease bằng ethanol 96% ................................ 27
3.5.1.2. Khảo sát thời gian tủa .......................................................................................... 28
3.5.2. Xác định điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm protease .......................... 28
3.5.2.1. Xác định nhiệt độ tối ưu ...................................................................................... 28
3.5.2.2. Xác định pH tối ưu .............................................................................................. 29
3.5.3. Khảo sát điều kiện và thời gian bảo quản chế phẩm enzyme ................................. 29
3.5.4. Khảo sát và chọn lọc điều kiện thủy phân protein trùn Quế bằng chế phẩm
protease ............................................................................................................................. 29

3.5.4.1. Khảo sát nồng độ cơ chất .................................................................................... 29
3.5.4.2. Khảo sát nồng độ enzyme bổ sung ...................................................................... 30
3.5.4.3 Khảo sát thời gian thủy phân ................................................................................ 30
3.5.5. Ứng dụng thủy phân cơ chất với các điều kiện đã chọn được ............................... 30
3.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu ....................................................... 31
3.7. Tóm tắt quá trình thí nghiệm ..................................................................................... 31
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 32
4.1. Kết quả so sánh hoạt tính protease của chủng Ba01 khi nuôi trong điều kiện thí
nghiệm và nuôi trên khay ................................................................................................. 32
4.2. Kết quả tinh sạch sơ bộ protease với tác nhân tủa là cồn .......................................... 33
4.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ tủa ....................................................................................... 33
4.2.2. Kết quả khảo sát thời gian tủa ................................................................................ 35
4.3. Kết quả xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme .................................. 37
4.3.1. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của protease ................................ 38
4.3.2. Kết quả xác định pH tối ưu cho hoạt động của protease ........................................ 39
viii


4.4. Kết quả khảo sát điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản chế phẩm protease
thu được ............................................................................................................................ 40
4.5. Kết quả khảo sát thành phần của cơ chất dùng để thủy phân .................................... 42
4.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân ............... 43
4.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ enzyme lên quá trình thủy phân ............... 46
4.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình thủy phân .......................... 48
4.9. Ứng dụng chế phẩm protease trong thủy phân bột trùn quế với các
điều kiện tối ưu đã chọn được .......................................................................................... 51
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 54
5.1. Kết luận ...................................................................................................................... 54
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 56

PHỤ LỤC

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B. subtilis

Bacillus subtilis

CT

Canh trường

CPE

Chế phẩm enzyme

C/N

Carbon/Nitrogen

DAP

Diammonium phosphate

ddE

Dung dịch enzyme

HSTP

Hiệu suất thủy phân

HSTNđht

Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

NF

Nitrogen formol

NNH3

Nitrogen NH3

NTS

Nitrogen tổng số

NL

Nguyên liệu

NPG

Neopentyl glycol

PEG

Polyethylenglycol

PHA

Polyhydroxyalkanoate

UI

Unit International

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Một số loại enzyme do B.subtilis sinh tổng hợp ............................................. 7
Bảng 2.2: Một số nguồn protease động vật và thực vật ................................................ 11
Bảng 4.1: Hoạt độ protease khi nuôi trong điều kiện thí nghiệm và nuôi trên khay ..... 32
Bảng 4.2: Hiệu suất thu hồi hoạt tính và hiệu suất thu hồi hàm lượng protein với các
tỷ lệ tủa cồn khác nhau .................................................................................. 34
Bảng 4.3: Hiệu suất thu hồi hoạt tính và hiệu suất thu hồi hàm lượng protein ở
những thời gian tủa khác nhau ...................................................................... 36
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính protease do chủng Ba01
tổng hợp ......................................................................................................... 38
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính protease do chủng Ba01
tổng hợp ......................................................................................................... 39
Bảng 4.6: Hoạt độ protease của chế phẩm thu được ở các điều kiện bảo quản và

thời gian bảo quản khác nhau ........................................................................ 41
Bảng 4.7: Thành phần các loại đạm có trong bột trùn quế dùng để thủy phân ............. 42
Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân protein
trùn quế .......................................................................................................... 45
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của hoạt độ enzyme lên quá trình thủy phân protein
trùn quế ở nồng độ 15% (w/v) ...................................................................... 47
Bảng 4.10: Ảnh hưởng của thời gian (2 giờ - 10 giờ) lên quá trình thủy phân
protein trùn quế ............................................................................................. 49
Bảng 4.11: Ảnh hưởng của thời gian (12 giờ - 20 giờ) lên quá trình thủy phân
protein trùn quế ............................................................................................. 50
Bảng 4.12: Kết quả so sánh một số chỉ tiêu giữa hai sản phẩm bột đạm thủy phân
từ nguyên liệu trùn quế ................................................................................. 52
Bảng 4.13: Hàm lượng các amino acid hòa tan có trong hai sản phẩm thủy phân .......... 53

xi


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 4.1: Hoạt tính protease và hàm lượng protein của canh trường khi
nuôi cấy ở điều kiện thí nghiệm và nuôi trên khay .................................... 33
Biểu đồ 4.2: Hiệu suất thu hồi hoạt độ với các tỷ lệ tủa cồn khác nhau .......................... 34
Biểu đồ 4.3: Hiệu suất thu hồi protein với các tỷ lệ tủa cồn khác nhau .......................... 35
Biểu đồ 4.4: Hiệu suất thu hồi hoạt độ protease ở các thời gian tủa khác nhau .............. 36
Biểu đồ 4.5: Hiệu suất thu hồi protein ở các thời gian tủa khác nhau ............................. 37
Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản lên hoạt tính chế phẩm
protease ....................................................................................................... 41

Biểu đồ 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hiệu suất thủy phân
và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan ............................................................. 43
Biểu đồ 4.8: Ảnh hưởng của hoạt độ enzyme lên hiệu suất thủy phân
và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan ............................................................. 48

xii


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ

TRANG

Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính protease do
chủng Ba01 tổng hợp .................................................................................... 39
Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính protease do chủng
Ba01 tổng hợp ............................................................................................... 40
Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên hiệu suất thủy phân
và hiệu suất thu nhận đạm hòa tan ................................................................ 51

DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Bacillus subtilis ................................................................................................. 3
Hình 2.2: B.Subtilis ở giai đoạn tạo bào tử ........................................................................ 4
Hình 2.3: Một dạng khuẩn lạc của B.subtilis trên môi trường thạch đĩa ........................... 5
Hình 2.4: Cấu trúc bộ gene của B.subtilis ......................................................................... 6
Hình 2.5: Natto- một sản phẩm lên men từ B.subtilis chứa nhiều protein

và vitamin ....................................................................................................... 10
Hình 2.6: Sơ đồ quá trình phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật ..................................... 20

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
“Hoạt động của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống. Không có
hoạt động nào lại không có quá trình enzyme” – Pavlov. Enzyme giúp cho các quá
trình hóa học trong tế bào diễn ra với tốc độ nhanh chóng, chính xác, nhịp nhàng, cân
đối và hài hòa. Ngoài khả năng xúc tác đặc hiệu và năng lực xúc tác mạnh mẽ,
enzyme còn mang một tính chất hết sức quan trọng là vẫn bảo toàn khả năng xúc tác
ấy khi ở ngoài cơ thể sống. Chính nhờ đặc điểm quan trọng này mà enzyme ngày
càng được ứng dụng nhiều hơn trong cuộc sống.
Một nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nền công nghiệp
enzyme chính là các vi sinh vật - những nhà máy sản xuất enzyme. Với đặc điểm phát
triển cực kỳ nhanh và có khả năng tiết enzyme ngoại bào có hoạt lực cao nên ta có thể
thu được một lượng lớn enzyme trong một thời gian ngắn. Ngoài ra, ta còn có thể tận
dụng các phế thải của ngành công nghiệp khác để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật
do đó chi phí sản xuất được giảm xuống đáng kể.
Protease là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và được sử
dụng rộng rãi trong nhiều nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y
học, nghiên cứu khoa học… Trong công nghiệp, protease có thể được bổ sung trực
tiếp vào thức ăn nhằm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi hoặc sử
dụng để thủy phân các loại protein khác nhau tạo sản phẩm chứa hàm lượng amino
acid hòa tan cao để bổ sung vào khẩu phần dinh dưỡng cho người hoặc gia súc. So
với phương pháp thủy phân bằng acid thì việc sử dụng protease có nhiều ưu điểm hơn
hẳn như: không độc hại, không làm mất đi một số amino acid trong quá trình thủy

phân.
Trong phạm vi và thời gian cho phép chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu thu nhận protease từ Bacillus subtilis và ứng dụng trong thủy phân protein
trùn quế”

1


1.2. Mục đích
Thu nhận protease tinh sạch sơ bộ từ Bacillus subtilis, xác định các điều kiện tối
ưu cho quá trình thủy phân protein trùn quế để thu nhận bột đạm có hàm lượng amino
acid hòa tan cao.
1.3. Yêu cầu
 So sánh và đánh giá điều kiện nuôi cấy thí nghiệm và pilot lên hoạt độ protease
do Bacillus subtilis tổng hợp.
 Tinh sạch sơ bộ protease từ canh trường nuôi cấy Bacillus subtilis.
 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân protein trùn quế
của chế phẩm protease thu được.
 Ứng dụng thủy phân thử nghiệm để thu sản phẩm bột đạm có hàm lượng
amino acid hòa tan cao.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis
2.1.1. Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.1.2. Đặc điểm của loài Bacillus subtillis
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí
hay kỵ khí tùy ý. Thường được tìm thấy trong đất.
Có khả năng di động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que,
kích thước chiều rộng từ 0,7 đến 0,8 μm, chiều dài từ 2,0 đến 3,0 μm. Không kết thành
chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều, không tạo bao nang.

Hình 2.1: Bacillus subtilis
(URL: />Khi nhuộm sơ, thấy được nguyên sinh chất của những tế bào non. B. subtilis
không có không bào khi phát triển trên môi trường thạch có glucose. Sống trên môi

3


trường thạch chứa glucose cũng tốt như trên môi trường thạch không có chứa glucose
và phát triển tốt nhất trên môi trường chứa bột đậu nành.
Nang bào tử dẹp, trụ tròn, nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào.
Bào tử rộng 0,6 – 0,9 micron, dài 1,0 – 1,5 micron, có dạng hình elip hay hình cầu,
vách bào tử mỏng, phần nhiều được tạo thành trong vòng 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo
được một bào tử, bào tử này có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất
hút ẩm.
Những đặc điểm của loài trực khuẩn này cho phép chúng sống được trong
nhiều sinh cảnh, bao gồm những kiểu giới hạn như cát, sa mạc, những con suối có
nhiệt độ cao, môi trường đất ở Bắc Cực. Ngoài ra, trong nhóm này có thể có loài ưa
nóng, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa acid, ưa muối hay có thể phát triển ở những môi trường có

pH, nhiệt độ và nồng độ muối mà ít sinh vật nào có thể chịu được.
Đặc điểm biến dị: theo Smith và Gordon, sự tạo thành bào tử tốt hơn nếu trên
môi trường thạch thô hay thạch tinh bột có bổ sung chất chiết từ đất.

Hình 2.2: Bacillus subtilis ở giai đoạn tạo bào tử
(URL: />Khi cấy sâu dưới mặt gelatin, thường hóa lỏng gelatin thành dạng chén hay
phân tầng.
Khi cấy ria trên mặt thạch đĩa, thường tạo thành vùng thủy phân rộng. Khuẩn
lạc trên mặt thạch có dạng gồ ghề, sần sùi, đục, trải rộng. Các đặc điểm biến dị: trơn
nhẵn, có chất nhầy mỏng, trong, mờ, màu vàng hay cam (vài giống có màu xanh lục
đến vàng), sắc tố bị khuếch tán khi ủ ở 45oC.
Khi cấy trên mặt thạch nghiêng có glucose, khuẩn lạc mịn, phát triển đều hơn
ở môi trường thạch không có glucose, đôi khi có màu hồng nhạt hay nâu.
4


Trong môi trường thạch nghiêng có bột đậu nành, khuẩn lạc mọc tốt, đều, mịn
và mật độ nhiều hơn trong môi trường không có bột đậu nành.
Khi nuôi B. subtilis trong môi trường có sữa, xảy ra hiện tượng pepton hóa
một cách chậm chạp và làm pH môi trường chuyển sang kiềm. Khi cấy ria trên mặt
thạch sữa sẽ tạo vùng thủy phân casein rộng.

Hình 2.3: Một dạng khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường thạch đĩa
(URL: />jpg/200px-Bacillus_subtilis_colonies.jpg)
Trong môi trường lỏng có NaCl, B. subtilis phát triển tốt ở nồng độ NaCl 7%,
một vài trường hợp phát triển tốt ở môi trường có 10 – 12% NaCl.
Trong môi trường có khoai tây, khuẩn lạc mọc khá phong phú, uốn nếp hay
gấp thô, trải rộng, màu vàng hoặc hồng nâu. Đặc điểm biến dị: mỏng, mềm, mịn, có
vài nốt sần.
Sinh acid từ xylose, arabinose, glucose, sucrose và manitol nhưng không tạo

khí (sử dụng nguồn nitrogen là muối ammonium). Thường không sinh acid từ lactose.
Thủy phân tinh bột tạo acetylmethyl carbinol. Khi ủ ở 37oC cho kết quả tốt hơn
khi ủ ở 32oC. Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrite từ nitrate. Trong điều kiện kỵ
khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate.
Các yếu tố về nhiệt độ: nhiệt độ tối thích vào khoảng 28 – 40oC. Nhiệt độ cao
nhất mà B. subtilis có thể tồn tại là 50oC. Tuy nhiên nhiều giống chỉ chịu được nhiệt
độ 40oC. Không cần bổ sung các yếu tố phụ khác trong quá trình tăng trưởng.

5


2.1.3. Cấu trúc bộ gene của Bacillus subtilis
Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của B. subtilis
và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn.
Bộ gen của B. subtilis chứa 4,2 mega-base, xấp xỉ 4500 gen. Trong số đó, chỉ
có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết
yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào

Hình 2.4: Cấu trúc bộ gene của Bacillus subtilis
(URL: />964/png/1_1.png)
2.1.4. Sinh thái học tế bào và phân bố trong tự nhiên
Dựa vào sự đa dạng trong trao đổi chất của loài Bacillus mà chúng có thể tạo
ra những quần thể ở nhiều sinh cảnh khác nhau, từ môi trường đất, trên côn trùng và
trên cơ thể người.
Người ta đã chứng minh rằng các loài Bacillus có tập tính ăn lẫn nhau. Chúng
dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời
sống giới hạn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt,
chúng thường tạo bào tử. Nhưng cách này làm tiêu tan khá nhiều năng lượng. Một
6

cách đơn giản hơn là sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh và
thu lấy nội quan của chúng, giúp một số cá thể sống khỏe mạnh khác tiếp tục sống sót
để chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn.
B. subtilis có mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ (cho
gia súc ăn) nên có tên gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố rộng rãi trên bề
mặt các loại hạt và các sản phẩm chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B. subtilis
chiếm khoảng 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử.
Người ta nhận thấy rằng nhóm vi khuẩn B. subtilis có mặt khắp nơi: các
nguyên liệu dùng để sản xuất như bột mì, bột gạo, muối hột… tới các thực phẩm
truyền thống như các loại mắm, tương, mẻ (cơm lên men chua), chao… B. subtilis
đóng vai trò đáng kể về mặt lợi cũng như mặt hại trong quá trình biến đổi sinh học.
2.1.5. Các sản phẩm từ Bacillus subtilis
B. subtilis có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống
để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường như: amylase, hemicellulase,
glucanase…
Bảng 2.1: Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và ứng
dụng
Enzyme
α-amylase

Nhiệt độ

pH

tối thích (oC)

tối thích

60

5,0 – 6,0

Phản ứng

Thủy phân liên kết Trong ngành công
α-glucoside trong

nghiệp dệt, sản xuất

tinh bột và những

các chế phẩm sinh

polysaccharide

học bổ sung vào

khác tạo ra các

thức ăn gia súc…

dextrin và
oligosaccharide

7

Ứng dụng

β-glucanase

35 - 55

6,0 – 7,0

Thủy phân liên kết Được ứng dụng
β-1,6- glucoside

trong ngành công

của β-glucan tạo

nghiệp thức ăn gia

ra những chất có

súc, y dược, điều trị

phân tử lượng thấp các bệnh về tiêu hóa.
hơn.
Xylanase

25

5.0

Thủy phân Xylan - Tăng khả năng hòa
một thành phần

tan NPG,ứng dụng

của hemicellulose.

trong công nghiệp
sản xuất bia và thức
ăn gia súc.

Hemicellulase

45 - 55

5,0 – 6,0

Thủy phân liên kết Giảm độ nhớt trong
β-1,4- glucoside

tiêu hóa, tăng khả

của cellulose, β-

năng hòa tan NPG,

1,4- glucan, α-

tăng khả năng tiêu

arabinoside, 1,3-β- hóa hemicellulose và

Protease

40

6,2 – 7,4

D-Xylans và

giá trị năng lượng

những

trong thức ăn,được

polysaccharide

ứng dụng bổ sung

khác.

vào thức ăn gia súc.

Thủy phân liên kết Được ứng dụng
peptid của protein

trong nông nghiệp,

và các

tận dụng phế liệu

polypeptide, tạo

giàu protein, ứng

các peptide có

dụng trong y học,

phân tử lượng thấp công nghiệp chế
hơn, các amino

biến thực phẩm, bột

acid

dinh dưỡng cho trẻ
em…

8


Ngoài ra, người ta còn thu được một số kháng sinh từ B. subtilis:
 Subtilin (Jansen Hirschman, 1944)
 Bacillin (Foster và Wooddruff, 1954)
 Subtenolin (Hirschhorn, Bucca và Thayer, 1948)
 Bacillomycin (Landy, Warren, Rosenman và Colio, 1948).
B. subtilis còn được dùng để tổng hợp một số chất khác.
2.1.6. Tác hại của Bacillus subtilis
Do có bào tử chịu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hỏng một số thực phẩm
hộp, làm chúng có mùi thối chua rất khó chịu.

B. subtilis không tạo gas hoặc có thể tạo gas trong môi trường có đường.
B. subtilis là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa, bánh ngọt, chocolate, kẹo
có nhân, nhất là khi các sản phẩm nói trên được bảo quản ở khí hậu nóng. B. subtilis
gây bệnh “chảy nhớt khoai tây” và bệnh “chảy nhớt bánh mì” được Laurent phát hiện
đầu tiên năm 1885 nên từ đó chúng có tên là “trực khuẩn khoai tây”.
2.1.7. Ứng dụng của Bacillus subtilis
B. subtilis được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như bổ sung vào thức ăn cho
gia súc. B. subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm
lượng khá lớn (15 – 20%) từ tinh bột nên được ứng dụng trong sản xuất lysine.
Trong y dược, B. subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml trị bệnh
tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dường ruột do lị trực trùng,
đắp các vết thương lở loét ngoài da.
Sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật gây
bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae… Người ta thấy
rằng sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây làm tăng khả năng tổng hợp các
peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium). Khả năng này được ứng
dụng trong kiểm soát sinh học.
Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) bổ sung trong thức ăn
nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc;
bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi.
Hệ enzyme của B. subtilis được sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy rửa.
Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp chất vô hại.
9


Một chủng B. subtilis được biết trước đây là Bacillus natto được dùng trong
sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như Cheonggukjang của Hàn Quốc.

Hình 2.5: Natto - một sản phẩm lên men từ Bacillus subtilis
chứa nhiều protein và vitamin

(URL: />2.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận protease
Protease có ở tất cả động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, sự phân bố
của chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan. Một số loài, cơ quan và
mô của động thực vật có chứa một hoặc một số protease nhất định có thể dùng làm
nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng.
Sau khi được tổng hợp, protease có thể được tiết ra ngoài tế bào gọi là enzyme
ngoại bào hoặc tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường gọi là enzyme nội
bào và chỉ có thể nhận được các enzyme này sau khi đã phá vỡ tế bào.
Một số protease ngoại bào đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong nông nghiệp và y học. Một số vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc có thể được dùng để sản xuất protease.

10


Bảng 2.2: Một số nguồn protease động vật và thực vật
Nguyên liệu
- Tụy tạng

Enzyme
- Trypsin

- Các enzyme này được

- Chymotrypsin

tiết ra ngoài cùng với

- Carboxypeptidase A và B

dịch tụy.

- Màng nhày dạ dày.

- Pepsin A, B, C và D

- Dạ dày động vật có

- Gastricin

sừng, còn non.
- Gan, lá lách, thận, phổi,
cơ lá lách, tim, cơ thận,

Đặc điểm

- Các enzyme được tiết ra
ngoài cùng với dịch vị.

- Renin
- Cathepsin A, B, C và D

- Enzyme nội bào

- Leucinaminopeptidase

dạ non( mô cơ)
- Huyết tương (máu)

- Trompin

- Mủ cây đu đủ

- Plazmin

protease bromelin của

- Các cây Ficus, sung si,

- Papain

thân và quả không giống

- Fixin

nhau.

vả, dứa

- Gồm

nhiều

enzyme

- Bromelin

2.3. Tổng quát về protease
2.3.1. Sơ lược lịch sử
Các enzyme protease xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid –CO-NHtrong các peptid hoặc protein theo phản ứng sau:

- CH – C – N – CH – +

H2O 

- CH – C – OH

+

HN – CH –

O
H
R
R
R
O H R’
Protease có thể chia thành: proteinase và peptidase. Protease phân hủy phân tử
protein thành polypeptid, pepton. Chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng. Tiếp theo
chúng phân hủy các phân tử nhỏ này (pepton, polypeptid) thành các amino acid tự do
dưới tác dụng của peptidase. Các peptidase có tính đặc hiệu hẹp hơn, chúng chỉ tác
dụng lên các liên kết peptid ở những vị trí nhất định.
11


Trong các enzyme của hệ tiêu hóa, protease được nghiên cứu sớm hơn cả.
 Từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát
hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt.
 Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị.
Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzyme này.
 Năm 1857, Corvisart tách được trypsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận

được dưới dạng chế phẩm, nhưng chế phẩm này còn lẫn nhiều enzyme và protein
khác.
 Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp thụ trên colodion đã tách được
trypsin với amylase tụy tạng. Phương pháp hấp thụ chọn lọc của Danilevxki có ý
nghĩa lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme cũng như protein.
 Năm 1961, Brucke cũng tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối
tinh khiết.
 Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin).
Ngoài các enzyme tiêu hóa, người ta cũng đã có những nghiên cứu bước đầu về
các protease trong máu. Schmidt (1869 - 1872) đã nêu ra giả thuyết rằng trong máu
có enzyme fibrin (ngày nay gọi là frombin) tham gia trong quá trình làm đông máu.
Tác giả đã tách enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác dụng
làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn so với protease động vật
 Năm 1874, Group Besanez công bố đã thu nhận được protease từ một số loại
hạt đậu (hạt đại mạch, bông) đều có hoạt động phân giải protein.
 Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease thực vật.
Ông nêu rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa protease, khi dùng cồn để
kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain.
Đến nửa đầu thế kỷ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptide hydrolase khác
như:
 Bromeline protease có trong các phần khác nhau của cây dứa (Willstatter,
Grassmann, Ambros; 1926).
 Cathepsxin protease của mô cơ động vật (Willstatter Bamann, 1929).
12