Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 4

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

44

CHƯƠNG

4

KẾT QUẢ VÀ BÀN
LUẬN
4.1

KHẢO SÁT TINH SẠCH PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT
TỦA

4.1.1

Kết tủa pectinase bởi các loại dung môi hữu cơ

Trong thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện quá trình kết tủa pectinase từ dịch enzyme thô
sau 24 giờ nuôi cấy trong canh trường bề sâu (xem hình 4.1). Tại thời điểm này, hoạt tính
endo-PGase thu được là cao nhất và đạt giá trị 1.224 ± 0.003U/mL. Nồng độ protein của
dịch enzyme tương ứng là 0.489 ± 0.0006mg/mL. Sau quá trình ly tâm và lọc để tách tạp
chất thô và hệ sợi mốc, dịch enzyme thô sẽ được kết tủa lần lượt với các tác nhân ethanol,
isopropanol và acetone.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

45

Hoạt tính endo-polygalacturonase, U/mL

1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0

5

10

15

20

25

30

Thời gian ni cấy, h

Hình 4.1 Hoạt tính endo-polygalaturonase từ canh trường nuôi cấy Asp. Awamori theo thời
gian

4.1.1.1

Kết tủa endo-PGase bởi ethanol

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa enzyme thô bằng ethanol theo trình tự đã trình
bày trong phần 3.2.2.1 Kết quả được trình bày trong bảng 4.1 và hình 4.2:
Bảng 4.1 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng ethanol
Tỷ lệ

Hoạt tính
endo-Pgase*

(mg/mL)

Venzyme/ Vdung môi

Nồng độ
protein*

Hoạt tính riêng

(U/mL)

(U/mg protein)

Hiệu suất
thu hồi
(%)

Độ tinh

sạch
(lần)

10:90

0.078

1.144

14.609

92.21b

5.77b

20:80

0.074

1.204

16.294

97.02a

6.43a

30:70

0.068

1.005

14.678

80.96c

5.79b

40:60

0.052

0.287

5.493

23.15d

2.17e

50:50

0.009

0.123

13.673

7.95e

4.32c

60:40

0.004

0.036

9.321

2.90f

3.69d

Enzyme thô

0.489

1.244

2.544

100.00

1.00

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

46

97.0%

100%

100

92.2%

Độ tinh sạch

81.0%

Hiệu suất thu hồi, %

80%

90
80

70%

70

60%

60

50%

50

40%

40

30%

30

23.2%

20%
10%

Độ tinh sạch, lần

Hiệu suất thu hồi (%)

90%

20
5.77

6.43

8.0%

5.79
2.17

2.9%

4.32

3.69

10

0%

0
10:90

20:80

30:70

40:60

Venzyme:Vdung môi

50:50

60:40

Hình 4.2 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa bằng ethanol

Nhận xét: Từ kết quả thu được, chúng tôi có những nhận xét như sau:

– Nhìn chung, khi tăng thể tích ethanol sử dụng (tỷ lệ thể tích Venzyme:Vdung môi thay đổi từ
60:40 đến 20:80) thì hàm lượng protein kết tủa cũng tăng dần (từ 0.004mg/mL đến
0.078mg/mL) và hiệu suất thu hồi enzyme cũng tăng dần (từ 2.9% đến 92.2%). Điều
này cho thấy rằng, khi nồng độ dung môi càng cao thì khả năng gây biến tính protein
càng rõ rệt. Nhờø đó, lượng protein bị kết tủa càng nhiều và tổng số đơn vị hoạt độ
thu hồi được cũng tăng lên. Tuy nhiên, nếu tăng tỷ lệ thể tích ethanol sử dụng lên
quá cao (tỷ lệ Venzyme:Vdung

môi

là 10:90) thì lượng protein kết tủa có tăng theo

(0.078mg/mL) nhưng hiệu suất thu hồi endo-PGase lại giảm xuống (92.21%). Kết
quả này khẳng định là hàm lượng cồn cao làm cho protein kết tủa triệt để hơn nhưng
có thể làm vô hoạt một số phân tử enzyme.

– Chúng tôi thấy rằng, tỷ lệ thích hợp để kết tủa enzyme: Venzyme:Vdung

môi

nằm trong

khoảng từ 30:70 đến 10:90. Khi đó, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm

dao động trong khoảng 81-97% và 5.77-6.43 lần.

– Từ kết quả trên, chúng tôi chọn tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 20:80 là tỷ lệ thích hợp để kết
tủa enzyme với tác nhân ethanol là 20:80 (v/v). Khi đó hiệu suất thu hồi hoạt tính và
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

47

độ tinh sạch của chế phẩm cùng đạt giá trị cực đại (97.0% và 6.43 lần). Hoạt tính
riêng của chế phẩm đạt 16.924 U/mg protein.
Theo nghiên cứu của Manachini P.L. và cộng sự (1988), khi tinh sạch endo-PGase từ
Rhizopus stolonifer, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau khi kết tủa với
ethanol theo tỷ lệ 1:2 đạt được lần lượt là 77% và 9.2 lần. Khi so sánh với kết quả của chúng
tôi, nhận thấy rằng, thể tích ethanol dùng để tinh sạch endo-PGase từ Asp. awamori trong
nghiên cứu này cao hơn. Dù hiệu suất thu hồi enzyme của chúng tôi đạt giá trị cao hơn
(97.0% và 77%) nhưng độ tinh sạch của chế phẩm thu được thấp hơn 1.43 lần. Vì thế,
chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thêm một vài tác nhân kết tủa khác để lựa chọn tác nhân
kết tủa enzyme tốt nhất.
4.1.1.2

Kết tủa endo-PGase bởi iso-propanol

Kết quả thí nghiệm : Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô bằng isopropanol theo trình tự
đã trình bày trong phần 3.2.2.1. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 và hình 4.3.

Bảng 4.2
Tỷ lệ

Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng iso-propanol

Venzyme/ Vdung môi

Nồng độ
protein*

Hoạt tính
endo-Pgase*

(mg/mL)

(U/mL)

10:90

0.118

20:80

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu suất
thu hồi
(%)

Độ tinh
sạch

1.232

10.41

a

98.87

4.09e

0.100

1.241

12.46

99.60a

4.90d

30:70

0.073

1.198

16.44

96.12b

6.53c

40:60

0.052

1.108

21.44

88.95c

8.43a

50:50

0.022

0.419

19.42

33.63d

7.65b

60:40

0.015

0.066

4.47

5.30e

1.78f

Enzyme thô

0.489

1.244

2.544

100.00

(lần)

1.00

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

100%

98.9%

99.6%

48

100

96.1%
89.0%

90%

Hiệu suất thu hồi (%)
90

Độ tinh sạch

80

70%

70

60%

60

50%

50

40%

Độ tinh sạch, lần

Hiệu suất thu hồi, %

80%

40

33.6%

30%

30

20%

20

10%

4.09

4.90

10:90

20:80

6.53

8.43

7.65

5.3%

10

1.78

0%

0
30:70

40:60

Venzyme:Vdung môi

50:50

60:40

Hình 4.3 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa bằng isopropanol
Nhận xét:

– So với ethanol, isopropanol có phân tử lượng và chiều dài mạch carbon lớn hơn. Nhờ
đó, tính kỵ nước của isopropanol cũng cao hơn. Điều này làm cho nó có khả năng
làm kết tủa một lượng protein nhiều hơn so với ethanol khi sử dụng với cùng một
hàm lượng như nhau. Thật vậy, hàm lượng protein thu được tăng dần từ 0.015 đến
0.118mg/mL khi thay đổi tỷ lệ Venzyme:Vdung môi từ 40:60 đến 10:90. Hiệu suất thu hồi
của chế phẩm pectinase bởi isopropanol cũng cao hơn khi so sánh với tác nhân kết
tủa là ethanol.

– Khi tỷ lệ Venzyme:Vdung môi là 20:80, hoạt tính endo-PGase gần như được thu hồi hoàn
toàn (99.6%). Tuy nhiên, độ tinh sạch của chế phẩm thu được không cao (4.9 lần).
Có lẽ do ở nồng độ dung môi này, ngoài protein-enzyme, các protein tạp khác trong
dung dịch cũng có khuynh hướng bị kết tủa theo làm giảm hoạt tính riêng của chế
phẩm. Ngoài ra, tương tự như ethanol, khi nồng độ isopropanol quá cao, khả năng
gây biến tính bất thuận nghịch protein của isopropanol cũng xảy ra và làm giảm hiệu
suất thu hồi enzyme và hoạt tính riêng của chế phẩm.

– Dựa trên khả năng tinh sạch chế phẩm và chi phí dung môi, chúng tôi quyết định
chọn tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 40:60 để tinh sạch endo-PGase. Ở tỷ lệ này, độ tinh sạch

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

49

của chế phẩm là cao nhất (8.43 lần) và hiệu suất thu hồi hoạt tính chế phẩm là
88.95%.
4.1.1.3

Kết tủa endo-PGase bởi acetone

Kết quả thí nghiệm : Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là acetone theo
trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.1. Kết quả được trình bày trong bảng 4.3 và hình 4.4:
Bảng 4.3 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng acetone
Tỷ lệ

Nồng độ
protein*

Hoạt tính
endo-Pgase*

Hiệu suất
thu hồi
(%)

Độ tinh
sạch

(mg/mL)

(U/mL)

10:90

0.137

1.067

7.77

85.70b

3.06b

20:80

0.126

1.205

9.57

96.81a

3.77a

30:70

0.097

1.023

10.52

82.20c

4.14a

40:60

0.068

0.440

6.46

35.37d

2.54c

50:50

0.022

0.111

4.92

8.89e

1.95d

60:40

0.018

0.085

4.81

6.80f

1.95d

Enzyme thô

0.489

1.244

2.544

100.00

1.00

Venzyme/ Vdung môi

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

(lần)

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không

có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.

96.8%

100%
90%

100

Hiệ u suấ t thu hồi (%)

82.2%

80

70%

70

60%

60

50%

50

40%

Độ tinh sạ ch, lầ n

Hiệ u suất thu hồi, %

80%

90

Độ tinh sạ ch

85.7%

40

35.4%

30%

30

20%

20
8.9%

10%
3.06

3.77

4.14

10:90

20:80

30:70

6.8%

2.54

1.95

1.95

40:60

50:50

60:40

10

0%

0

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Venzyme:Vdung môi


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

50

Hình 4.4 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa bằng acetone
Nhận xét:

– Acetone là một trong những tác nhân kết tủa enzyme được quan tâm nhiều do giá
thành rẻ, khả năng gây biến tinh bất thuận nghịch thấp và có độ an toàn cao khi sử
dụng [8, 10]. Tuy nhiên, trong lónh vực tinh sạch pectinase, có rất ít nghiên cứu tinh
sạch pectinase bằng kết tủa với acetone. Vì thế, trong luận văn này, chúng tôi tiến
hành khảo sát khả năng tinh sạch endo-PGase của acetone.

– Kết quả trình bày trong bảng 4.3 cho thấy, endo-PGase kết tủa rấtù tốt với acetone.
Hàm lượng protein và hiệu suất thu hồi được cũng tương đối cao. Theo quy luật, hiệu
suất thu hồi hoạt tính endo-PGase tăng lên khi tăng lượng acetone sử dụng (tỷ lệ
Venzyme:Vdung môi thay đổi từ 40:60 đến 20:80. Ở tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 10:90, hàm lượng
protein kết tủa tăng cao nhất nhưng hiệu suất thu hồi giảm do acetone gây biến tính
bất thuận nghịch một số phân tử enzyme. Tác động này cũng xảy ra tương tự với
trường hợp kết tủa bằng ethanol và isopropanol.

– Tỷ lệ Venzyme:Vdung môi thích hợp để hiệu suất thu hồi endo-PGase cao nhất là 20:80.
Trong khi đó, độ tinh sạch của chế phẩm đạt được cao nhất khi Venzyme:Vdung

môi

là

30:70.

– Từ những nhận xét trên, chúng tôi có kết luận sơ bộ như sau: So với 2 tác nhân
ethanol và isopropanol, acetone tỏ ra kém hiệu quả hơn trong quá trình tinh sạch
endo-PGase. Độ tinh sạch cao nhất đạt được trong trường hợp kết tủa với tác nhân
này (tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 30:70) chỉ bằng 0.64 và 0.55 lần so với trường hợp kết tủa
bằng ethanol và isopropanol và hiệu suất thu hồi tương ứng cũng thấp hơn 1.18 và
1.08 lần.

Kết tủa pectinase bởi polymer hữu cơ

4.1.2
4.1.2.1

Kết tủa endo-PGase bởi PEG-6000

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là polyethylene
glycol (PEG 6000) theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.2. Kết quả thí nghiệm được
trình bày trong bảng 4.4 và hình 4.5:
Bảng 4.4 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng PEG-6000
Nồng độ
tác nhân

Nồng độ
protein
(mg/mL)

Hoạt tính
endo-PGase

(U/mL)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu suất
thu hồi
(%)

Độ tinh
sạch
(lần)

25%

0.028

0.106

3.76

8.67a

1.57a

20%

0.018

0.063

3.43

5.13c

1.44b

15%

0.021

0.058

2.82

4.77c

1.18c

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

51

10%

0.028

0.083

2.97

6.77b

1.24bc

5%

0.031

0.084

2.72

6.85b

1.16c

Enzyme thô

0.511

1.222

2.39

100.00

1.00

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.
100%

100

Hiệu suất thu hồi (%)

90%

Độ tinh sạch

Hiệ u suấ t thu hồ i, %

80%

90
80
70

60%

60

50%

50

40%

40

30%

30

20%

20

10%

Độ tinh sạ ch, lầ n

70%

8.7%

6.8%

6.9%

1.18

1.24

1.16

15%

10%

5%

4.8%

1.57

1.44

25%

0%

5.1%

20%

10
0

Nồ ng độ tá c nhâ n, %

Hình 4.5 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa bằng PEG-6000
Nhận xét:

– PEG là dung môi có tính háo nước lớn. Khi bổ sung vào dung dịch chứa protein,

chúng có thể tương tác với lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein và làm giảm
khả năng hòa tan của protein. Nhờ đó, các phân tử protein và enzyme sẽ kết tủa và
tách ra khỏi hỗn hợp.

– Tuy nhiên, nhược điểm PEG là làm tăng độ nhớt dịch enzyme, gây khó khăn cho
việc tách kết tủa ra khỏi dung dịch. Nếu sử dụng phương pháp lọc để phân riêng,
thời gian lọc sẽ kéo dài, còn nếu sử dụng phương pháp ly tâm thì phải tác động lên
dung dịch một lực ly tâm rất lớn. Điều này rất khó thực hiện khi triển khai ở quy mô
sản xuất lớn. Nếu lực ly tâm nhỏ thì có thể không thu hồi hết được lượng kết tủa.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị ly tâm có bán kính quay là 0.3m và
tốc độ quay là 5500vòng/phút , tương đương với gia tốc ly tâm làø 10000g (m/s2) nhưng
hiệu suất thu hồi pectinase chỉ dao động trong khoảng từ 4.8% đến 8.7%.

– Nhận xét về khả năng tinh sạch của chế phẩm, chúng tôi thấy rằng, độ tinh sạch
của chế phẩm tăng chỉ dao động từ 1.16 đến 1.57 lần.
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

52

– Như vậy, theo đánh giá chung, hiệu quả sử dụng PEG để tinh sạch endo-PGase là
không cao.
4.1.2.2

Kết tủa endo-PGase bởi PG-4000

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là polyethylene
glycol (PEG 4000) theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.2. Kết quả thu được trình bày

trong bảng 4.5 và hình 4.6:
Bảng 4.5 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng PEG-4000
Nồng độ
tác nhân

Nồng độ
protein*
(mg/mL)

Hoạt tính
endo-PGase*
(U/mL)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu suất
thu hồi
(%)

Độ tinh
sạch
(lần)

25%

0.046

0.152

3.34

12.18a

1.30a

20%

0.041

0.138

3.39

11.03b

1.33a

15%

0.034

0.089

2.60

7.16d

1.02b

10%

0.032

0.117

3.63

9.40c

1.42a

Enzyme thô

0.487

1.2480

2.56

100.00

1.00

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.
100%

100

90%

Hiệu suất thu hồi (%)

90

80%

Độ tinh sạch

80

60%

60

50%

50

40%

40
30

20%

Độ tinh sạ ch, lầ n

70

30%

Hiệu suấ t thu hồ i, %

70%

12%

20
11%

10%

7%

9%

10

1.30

1.33

1.02

1.42

25%

0%

20%

15%

10%

Nồ ng độ tá c nhâ n, %

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

0


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

53

Hình 4.6 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa bằng PEG-4000
Nhận xét:

– Tương tự như PEG 6000, kết quả kết tủa endo-PGase với tác nhân PEG-4000 cũng
không đạt hiệu quả cao khi so với trường hợp sử dụng các dung môi hữu cơ. Hiệu
suất thu hồi enzyme dao động từ 9.40% đến 12.18%, độ tinh sạch tương ứng từ 1.02
đến 1.42 lần.
–

Từ các kết quả thu được, chúng tôi đánh giá phương án tinh sạch endo-PGase bởi 2

loại polymer trên là không khả thi.

4.1.3

Kết tủa pectinase bởi các loại muối
4.1.3.1

Kết tủa endo-PGase bởi Sodium chloride (NaCl)

Kết quả thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân là muối sodium
chloride theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.2.1. Chúng tôi thu được kết quả như sau
(xem bảng 4.6 và hình 4.7):

Bảng 4.6 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng sodium chloride
Nồng độ
NaCl, % (w/v)

Nồng độ
protein*
(mg/mL)

Hoạt tính
endo-PGase*
(U/mL)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu suất
thu hồi

(%)

Độ tinh
sạch
(lần)

35%

0.049

0.607

12.29

48.87a

5.30a

30%

0.057

0.417

7.27

33.55b

3.14c

25%

0.098

0.347

3.55

27.94c

1.53e

20%

0.040

0.280

6.98

22.52d

3.01d

15%

0.036

0.232

6.37

18.65e

3.46b

Enzyme thô

0.535

1.242

2.32

100.00

1.00

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

54

100%

100

Hiệu suất thu hồi (%)

90

80%

Độ tinh sạch

80

70%

70

60%

60

50%

Độ tinh sạch, lần

Hiệu suất thu hồi, %

90%

48.87%

40%

50
40

33.55%
27.94%

30%

18.65%

20%
10%

30

22.52%

5.30

10
3.14

0%
35%

20

30%

1.53
25%

Nồng độ muối NaCl, % (w/w)

3.01

3.46

20%

15%

0

Hình 4.7 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch chế phẩm sau kết tủa bằng sodium chloride
Nhận xét:

– Sodium chloride có ưu điểm nổi bật là giá thành rẻ và khả năng gây biến tính bất
thuận nghịch protein thấp. Khi sử dụng tác nhân này để kết tủa endo-PGase, hiệu
suất thu hồi enzyme tăng dần từ 18.65% đến 48.87% khi hàm lượng NaCl tăng từ
10% đến giá trị nồng độ bão hòa (35%). Độ tinh sạch của chế phẩm cũng đạt giá trị
cao nhất là 5.30 lần tại nồng độ NaCl bão hòa.

– Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi chọn ra nồng độ sodium chloride thích hợp để kết
tủa endo-PGase là 35%.

– Tuy nhiên, nếu so sánh với kết quả thu được với phương pháp kết tủa bằng tác nhân

dung môi hữu cơ thì hiệu suất thu hồi hoạt tính pectinase đạt được trong thí nghiệm
này vẫn thấp hơn nhiều.
4.1.3.2

Kết tủa endo-PGase bởi ammonium sulphate
(NH4)2SO4

Kết quả thí nghiệm: Tiếp theo, chúng tôi tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác
nhân là muối ammonium sulphate. Ammonium sulphate được bổ sung vào dung dịch
enzyme ở dạng tinh thể và hòa tan đến độ bão hòa cần thiết (xem bảng 4.7). Kết quả thí
nghiệm thu được như sau:

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

55

Bảng 4.7 Kết quả tinh sạch endo-PGase bằng ammonium sulphate
Độ bão hòa của
(NH4)2SO4, %

Nồng độ
protein
(mg/mL)

Hoạt tính
endo-PGase
(U/mL)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu suất
thu hồi
(%)

100%

0.088

90%

Độ tinh
sạch
(lần)

1.059

12.03

85.68a

4.87d

0.085

1.041

12.24

84.22b

4.95c

80%

0.078

0.998

12.75

80.78c

5.16b

70%

0.074

0.966

12.94

78.17d

5.26a

60%

0.078

0.829

10.63

67.07e

4.30e

50%

0.046

0.336

7.34

27.21f

2.97f

40%

0.042

0.206

4.96

16.67g

2.01g

Enzyme thô

0.500

1.236

2.47

100.00

1.00

Chú thích: Các giá trị có cùng ký tự (được ký hiệu phía trên) thì sự khác nhau giữa chúng là không
có ý nghóa (α = 0,05).
(*) Nồng độ protein và hoạt tính enzyme trong dung dịch sau khi tái hòa tan kết tủa.

Nhận xét:

– Kết quả thí nghiệm cho thấy, hiệu suất thu hồi hoạt tính endo-PGase tăng dần từ
16.67% ở độ bão hòa 40% đến 85.68% ở độ bão hòa tuyệt đối. Điều này cho thấy
được ưu điểm của ammonium sulphate so với các tác nhân kết tủa khác.

– Lượng protein trong dung dịch enzyme kết tủa càng nhiều khi tăng nồng độ
ammonium sulphate sử dụng cũng có nghóa là hàm lượng các loại protein tạp trong

kết tủa cũng tăng theo. Từ đó, độ tinh sạch của chế phẩm cũng giảm. Thật vậy, độ
tinh sạch của chế phẩm tăng dần từ 2.01 đến 5.26 lần khi độ bão hòa tăng từ 40%
đến 80%. Sau đó, độ tinh sạch giảm nhẹ xuống còn 4.87 khi ammonium sulphate đạt
đến độ bão hòa 100%.

– Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy, ở độ bão hòa của ammonium sulphate
thích hợp để tinh sạch endo-PGase là 70%. Khi đó, hiệu suất thu hồi pectinase là
78.17% và độ tinh sạch của chế phẩm đạt giá trị cao nhất là 5.26 lần.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

56

100%

100

90%

85.68%

Hiệu suấ t thu hồ i (%)
84.22%

80.78%

78.17%

80
67.07%

70%

90

70

Độ tinh sạ ch, lần

Hiệu suấ t thu hồi, %

80%

Độ tinh sạ ch

60%

60

50%

50

40%

40
27.21%

30%

30
16.67%

20%
10%

4.87

4.95

5.26

5.16

20
10

4.3

2.97

2.01

0%

0
100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

Độ bão hoà , %

Hình 4.8 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch chế phẩm sau kết tủa bằng ammonium sulphate

– Theo các kết quả nghiên cứu của một số tác giả đi trước như Afifi A.F. và cộng sự
(1988); Miyazaki Y. (1990); Jaffar M. B. và cộng sự (1993), Guo Chung-Teng và cộng
sự (2001), độ bão hòa tối ưu để tinh sạch polygalaturonase thường dao động trong
khoảng từ 60-80% tuỳ thuộc vào nguồn gốc thu nhận chế phẩm và đặc tính của
enzyme. Do đó, kết quả thu được của chúng tôi khi tinh sạch pectinase từ canh
trường bề sâu A. awamori cũng tương tự như kết quả thực nghiệm của các tác giả đi
trước khi khảo sát trên các đối tượng vi sinh vật khác. [14, 35, 42, 62]

Kết luận chung

4.1.4

Để thuận tiện cho đánh giá hiệu quả tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, các kết quả

thí nghiệm với các loại tác nhân khác nhau được chúng tôi tóm tắt trong bảng 4.8:

Bảng 4.8 Tổng kết quá trình tinh sạch endo-PGase bằng phương pháp kết tủa
Tác nhân
kết tủa

Hàm lượng sử dụng
(% so với thể tích dịch
enzyme)

Dung môi hữu cơ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu suất thu
hồi (%)

Độ tinh sạch
(lần)


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

57

- Ethanol

80.0% (v/v)

16.29

97.02

6.43

- Isopropanol

60.0% (v/v)

19.24

88.95

8.43

- Acetone

60.0% (v/v)

6.46

70.74

5.08

- PEG 4000

20.0% (w/v)

3.63

9.40

1.42

- PEG 6000

25.0% (w/v)

3.76

8.67

1.57

Polymer hữu cơ

Muối
- (NH4)2SO4

47.2% (w/v)*

14.03

78.17

5.26

- NaCl

35.0% (w/v)

12.29

48.87

5.30

* Nồng độ của (NH4)2SO4 ứng với độ bão hòa 70%.
100%

97.02%

100

Hiệ u suấ t thu hồ i (%)

88.95%

90%

90

Độ tinh sạ ch
78.17%

80%

80

70%

70

60%

60
48.87%

50%

50

40%

40

30%

30

20%

Độ tinh sạ ch, lầ n

Hiệ u suấ t thu hồ i, %

70.74%

20

10%

6.43

9.40%

8.43

8.67%
5.26

5.08
1.42

0%

5.3

1.57

10
0

Ethanol

Isopropanol

Acetone

PEG-4000 PEG-6000 (NH4)2SO4 NaCl 35%

80% (v/v)

60% (v/v)

60% (v/v)

20% (w/w)

25% w/w

Tá c nhâ n kế t tủ a

70% độ bão

(w/v)

hoà

Hình 4.9 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase sau tinh sạch
bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân khác nhau.
Từ kết quả khảo sát hiệu quả tinh sạch của các tác nhân kết tủa khác nhau, chúng tôi đi
đến những kết luận như sau:

– Nhìn chung, các dung môi hữu cơ cho hiệu suất thu hồi enzyme tốt hơn so với muối
và polymer hữu cơ. Trong tất cả các tác nhân kết tủa, ethanol là tác nhân cho hiệu

suất thu hồi cao nhất (97.02%). Các tác nhân khác như isopropanol, acetone và
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

58

(NH4)2SO4 cho hiệu suất thu hồi khá cao (từ 70.74 đến 88.95%). PEG 4000 và 6000
cho hiệu suất thu hồi rất thấp.

– Xét về khả năng tinh sạch, isopropanol là tác nhân cho độ tinh sạch cao nhất (8.43
lần). Ethanol và ammonium sulphate cũng cho độ sạch khá cao (6.43 và 5.26 lần).
Thấp nhất là PEG với độ tinh sạch xấp xỉ 1.5 lần so với enzyme thô.

– Dựa trên cơ sở hiệu suất thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm, chúng tôi
quyết định chọn 3 loại tác nhân là isopropanol, ethanol và ammonium sulphate để
kết tủa enzyme, sau đó tách kết tủa và tái hòa tan để thực hiện bước tinh sạch tiếp
theo bằng phương pháp sắc ký lọc gel.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.2

59

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENDO-PGase BẰNG SẮC KÝ

LỌC GEL

4.2.1

Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa với isopropanol

Theo kết quả nghiên cứu ở phần 4.1, hiệu suất thu hồi enzyme khi kết tủa với
isopropanol theo tỉ lệ 4:6 (v/v) là 88.95% và độ tinh sạch tăng lên tương ứng là 8.43 lần.
Trên cơ sở đó, ở bước thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát tiếp quá trình tinh sạch endoPGase bằng sắc ký lọc gel (sử dụng Sephadex G-75) với mẫu enzyme kết tủa đã trình bày
ở trên.
Dịch enzyme thô (dịch nuôi cấy nấm sợi đã qua ly tâm và lọc để tách bỏ sinh khối và tạp
chất) có hàm lượng protein là 0.532mg/mL và hoạt tính endo-PGase tương ứng là
1.275U/mL được kết tủa với isopropanol theo tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 4:6. Phần kết tủa sau ly
tâm ở 5500 vòng/phút được hòa tan trở lại với một thể tích xác định dung dịch đệm acetate
0.05N sao cho hàm lượng protein nằm trong khoảng 1-10mg/mL. Trong thí nghiệm này,
chúng tôi sử dụng thể tích dung dịch đệm bằng 1/20 so với thể tích dịch enzyme ban đầu.
Enzyme sau kết tủa với isopropanol có độ tinh sạch là 8.6 lần và hiệu suất thu hồi đạt được
là 88.5%.

I

2.5

3.0
OD280nm

2.0

2.5

III

OD280nm

2.0
1.5
1.5
1.0
1.0
0.5

0.5

II

0.0

Hoạ t tínhendo-PGase, U.mL

Hoạ t tính endo-PGase

0.0
1

5

8

10

15

20

Phân đoạn

Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) và hoạt tính endo-PGase của các phân
đoạn trong quá trình lọc gel (Mẫu enzyme đã qua kết tủa với isopropanol theo tỉ
lệ Venzyme:Visopropanol là 4:6).

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

60

Quá trình triển khai sắc ký được tiến hành theo trình tự đã trình bày trong phần 3.2.3.3.
Kết quả đo độ hấp thu OD280 và hoạt tính enzyme của các phân đoạn được biểu diễn trên
hình 4.10.
Từ đồ thị biễu diễn tương quan giữa giá trị OD280nm và thứ tự các phân đoạn, chúng tôi
ghi nhận được 2 peak lớn (I và III) có chỉ số OD cao và 1 peak nhỏ (II). Như vậy, theo dự
đoán sơ bộ, hỗn hợp enzyme qua lọc gel gồm 3 loại protein có khối lượng phân tử khác
nhau. Sau khi quá trình lọc gel kết thúc, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính và hàm lượng
protein của các phân đoạn và thu được kết quả như sau (xem bảng 4.9 và hình 4.10).
Bảng 4.9 Hoạt độ và hoạt tính riêng của một số phân đoạn đo được sau khi lọc gel (Mẫu
dịch enzyme đã qua kết tủa bằng isopropanol theo tỷ lệ Venzyme:Visppropanol = 4:6)

Mẫu trước khi lọc gel

Hoạt độ tổng
(U)
67.61

1+2

0.000

0.000

0.0

3

4.162

0.323

12.9

4

5.885

0.411

14.3

5

11.258

0.108

104.7

6

11.152

0.083

133.9

7

3.826

0.042

90.9

8

2.426

0.040

49.4

9

1.961

0.132

40.4

10+11+12

5.318

0.403

13.2

13+14+15

1.506

0.101

14.9

16+17+18

0.190

0.014

13.8

19+20

0.055

0.048

1.2

Tổng

47.739

1.705

28.0

Phân đoạn

Lượng protein
(mg)
3.295

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)
20.51

Nhận xét: Kết quả đo hàm lượng protein và hoạt tính endo-PGase cho thấy:

– So với trước khi tiến hành sắc ký, tổng số đơn vị hoạt độ cũng như lượng protein
trong chế phẩm thu được giảm đi từ 67.61U và 3.295mg xuống còn 47.739U và
1.705mg tương ứng. Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất và biến tính bất
thuận nghịch của một số phân tử protein chế phẩm trong suốt quá trình sắc ký (dù
quá trình tinh sạch luôn được thực hiện ở nhiệt độ 18oC). Như vậy, từ 60mL dịch
enzyme thô ban đầu, tổng hiệu suất thu hồi enzyme sau lọc gel đạt được là 62.55%
và độ tinh sạch chung tăng lên 11.74 lần.

LUẬN VĂN TỐT NGHIEÄP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

61

– Dựa trên kết quả thu được từ sắc ký đồ, chúng tôi thấy rằng, lượng protein mẫu chủ
yếu tập trung vào 2 peak I (phân đoạn 4) và III (phân đoạn 10). Tuy nhiên, hoạt tính
endo-PGase thu được ở 2 vị trí peak này không cao. Điều này cho phép chúng tôi kết
luận 2 peak này có chứa những protein tạp, chúng bị lẫn vào trong chế phẩm khi kết
tủa. So với protein enzyme, các protein tạp tồn tại với hàm lượng khá cao. Do đó,
nếu tách được các protein này ra khỏi hỗn hợp thì độ tinh sạch của chế phẩm cuối
cùng sẽ được nâng lên đáng kể.

– Ở các phân đoạn 5, 6 và 7, mặc dù giá trị OD280nm đo được rất thấp và hàm lượng
protein xác định được cũng khá thấp nhưng hoạt tính enzyme thu được ở các phân
đoạn 5, 6 và 7 (đặc biệt là ở 2 phân đoạn 5 và 6) cao hơn nhiều lần so với ở các
phân đoạn khác. Từ đó, có thể dự đoán rằng enzyme cần tinh sạch được phân bố
chủ yếu trong các phân đoạn 5, 6 và 7. Khi đó, hoạt tính riêng của chế phẩm thu
được ở 3 phân đoạn rất cao và đạt đến giá trị tương ứng là 104.7, 133.9 và 90.9U/mg
protein. Vì vậy, nếu chỉ thu hồi 3 phân đoạn này thì chế phẩm thu được sẽ có hoạt

tính riêng rất cao và độ tinh sạch đạt được đến 47.2 lần (so với dịch enzyme thô).

– Vì hoạt tính enzyme chỉ tập trung chủ yếu vào các phân đoạn 5, 6 và 7 nên chúng tôi
tiến hành thu hồi các phân đoạn này và bảo quản trong điều kiện lạnh đông để
chuẩn bị cho bước khảo sát tiếp theo.
Bảng 4.10 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của pectinase qua các giai đoạn tinh sạch
bằng phương pháp kết tủa với isopropanol kết hợp với sắc ký lọc gel
Thể tích
(mL)
Enzyme thô
Sau kết tủa với
isopropanol
Sau lọc gel*

Protein tổng
(mg)

Hoạt độ
Tổng (U)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu
suất (%)

Độ tinh
sạch

60.0

31.980

76.32

2.386

100%

1.0

60.0

3.295

67.61

20.51

88.6%

8.6

3.0

0.349

39.36

112.63

51.6%

47.2

* Kết quả thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm bằng
phương pháp lọc gel tính trên các phân đoạn 5, 6 và 7.

4.2.2

Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa với ethanol 2:8

Sau giai đoạn kết tủa với ethanol theo tỷ lệ Venzyme:Vethanol = 2:8 (v/v), từ 60 mL dung dịch
enzyme thô với tổng số đơn vị hoạt độ là 76.32U, chúng tôi thu được một lượng kết tủa
tương ứng với tổng hoạt độ là 73.57U. Độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tăng lên tương
ứng là 6.6 lần.
Tiến hành phân tích chế phẩm sau kết tủa bằng sắc ký lọc gel chúng tôi thu được các
kết quả như sau (xem bảng 4.11 và hình 4.11):

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

62

Bảng 4.11 Hoạt độ và hoạt tính riêng của một số phân đoạn đo được sau khi lọc gel (mẫu
dịch enzyme đã qua kết tủa bằng ethanol theo tỷ lệ Venzyme:Vethanol = 2:8)
Lượng protein
(mg)

4.680

1+2

0.009

0.001

9.4

3

1.036

0.278

3.7

4

2.576

0.433

5.9

5

16.351

0.294

55.7

6+7

25.244

0.385

65.5

8

2.885

0.111

25.9

9

1.089

0.301

3.6

10+11+12

1.824

1.270

1.4

Tổng

51.014

3.073

16.6

3.5

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)
15.72

Hoạ t tính endo-PGase
OD280nm

3.0

4.5
4.0
3.5

OD280nm

2.5

3.0

2.0

2.5

1.5

2.0
1.5

1.0

1.0
0.5

Hoạ t tính endo-PGase, U/mL

Mẫu trước khi lọc gel

Hoạt độ tổng
(U)
73.57

Phân đoạn

0.5

0.0

0.0
1

5

8

10

15

20

Phân đoạn
Số thứ tự phân đoạn

Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) và hoạt tính endo-PGase của các phân
đoạn trong quá trình lọc gel với mẫu enzyme đã qua kết tủa với ethanol (tỷ lệ
2:8 theo thể tích)
Nhận xét:

– Hình ảnh trên sắc ký đồ cho thấy, đường cong OD280nm trong trường hợp mẫu enzyme
được kết tủa bởi ethanol cũng có dạng tương tự như trường hợp sử dụng isopropanol
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

63

để kết tủa enzyme. Đường cong hoạt tính endo-PGase cũng có 1 peak tập trung ở vị
trí các phân đoạn 5, 6, 7. Điều này một lần nữa khẳng định protein-enzyme có trong
chế phẩm mà chúng tôi cần tinh sạch được phân bố chủ yếu trong các peak 5, 6, 7.

– Kết quả đo hàm lượng protein và hoạt tính endo-PGase cho thấy, tổng số đơn vị hoạt
độ chế phẩm sau lọc gel thu hồi được là 51.014U và lượng protein tương ứng là
3.073mg. Do đó, hiệu suất thu hồi của toàn bộ chế phẩm sau lọc gel đạt được là
66.84% và độ tinh sạch tăng lên 7.15 lần so với dịch enzyme thô.

– Lý luận tương tự như ở thí nghiệm trong phần 4.2.1, do hoạt tính endo-PGase chủ
yếu tập trung ở các peak 5,6 và 7 nên chúng tôi chỉ thu lấy 3 phân đoạn này làm chế
phẩm tinh sạch cuối cùng. Khi đó, hoạt tính riêng của chế phẩm thu được từ 3 phân
đoạn này cao gấp 25.6 lần so với dịch enzyme thô và hiệu suất thu hồi đạt được là
81.7%.
Tương tự, chế phẩm sau khi thu hồi được bảo quản ngay trong điều kiện lạnh đông để
chuẩn bị cho bước khảo sát tiếp theo.
Bảng 4.12 Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của pectinase qua các giai đoạn tinh sạch
bằng phương pháp kết tủa với ethanol kết hợp với sắc ký lọc gel
Thể tích
(mL)
Enzyme thô
Sau kết tủa
với ethanol
Sau lọc gel

Protein tổng
(mg)

Hoạt độ
tổng (U)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu
suất (%)

Độ tinh
sạch

60

31.920

76.32

2.391

100%

1.0

60

4.680

73.57

15.72

96.4%

6.6

3.0

1.018

62.39

61.26

81.7%

25.6

* Kết quả thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm bằng
phương pháp sắc ký lọc gel được tính trên các phân đoạn 5, 6 và 7.

4.2.3

Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa với ammonium
sulphate 70%

Sau khi kết tủa với ammonium sulphate 70% (độ bão hòa), từ 60mL dịch enzyme thô
ban đầu, hiệu suất thu hồi hoạt tính chế phẩm đạt được là 79.7% và độ tinh sạch của chế
phẩm tăng lên 5.18 lần. Kết tủa sau ly tâm được hòa tan với thể tích đệm thích hợp rồi được

phân tích bằng sắc ký lọc gel. Kết quả sắc ký được trình bày trong bảng 4.13 và hình 4.12.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

64

Bảng 4.13 Hoạt độ và hoạt tính riêng của một số phân đoạn đo được sau khi lọc gel đối với
mẫu dịch enzyme đã qua kết tủa bằng ammonium sulphate 70% độ bão hòa
Phân đoạn
Mẫu trước khi lọc gel

Hoạt độ tổng
(U)
60.83

Lượng protein
(mg)
4.901

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)
12.4

1+2

0.004

0.010

0.4

3

0.034

0.257

0.1

4

2.152

0.295

7.3

5

14.269

0.208

68.5

6

14.777

0.185

79.9

7

5.869

0.088

66.7

8

1.264

0.038

33.7

10+11+12

1.042

0.718

1.5

Tổng

39.416

1.790

22.0

1.2

4.0
3.5

OD280nm

1.0

3.0
OD280nm

0.8

2.5

0.6

2.0
1.5

0.4

1.0
0.2

Hoạ t tínhendo-PGase, U/mL

Hoạ t tính endo-PGase

0.5

0.0

0.0
1

5

8

10

15

20

Phân đoạn

Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) và hoạt tính endo-PGase của các phân
đoạn trong quá trình lọc gel với mẫu enzyme đã qua kết tủa với ammonium
sulphate (độ bão hòa 70%).

Nhận xét:
Hình dạng sắc ký đồ thu được từ thí nghiệm này cũng tương tự như 2 thí nghiệm trước
(phần 4.2.1 và 4.2.2). Từ kết quả đo hàm lượng protein và hoạt tính endo-PGase của chế

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

65

phẩm sau khi lọc gel, tổng hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme trong chế phẩm đạt được khi
trộn ba phân đoạn 5, 6 và 7 là 68.6% và độ tinh sạch tăng lên 30.4 lần.
Bảng 4.14 Hoạt độ và hoạt tính riêng của một số phân đoạn đo được sau khi lọc gel (Mẫu
dịch enzyme đã qua kết tủa bằng ammonium sulphate 70% độ bão hòa)
Thể tích
(mL)
Enzyme thô
Sau kết tủa
(NH4)2SO4
Sau lọc gel

Protein tổng
(mg)

Hoạt độ tổng
(U)

Hoạt tính riêng
(U/mg protein)

Hiệu
suất (%)

Độ tinh
sạch

60

31.980

76.32

2.386

100.0%

1.0

60

4.901

60.83

12.41

79.7%

5.2

3.0

0.722

52.37

72.59

68.6%

30.4

* Kết quả thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm bằng
phương pháp lọc gel tính trên các phân đoạn 5, 6 và 7.

4.2.4

Kết luận chung

Qua các thí nghiệm trên, chúng tôi có một số kết luận như sau:

– Trong tất cả các trường hợp, độ tinh sạch của chế phẩm sau khi qua lọc gel đều tăng
lên đáng kể so với enzyme thô và enzyme đã qua kết tủa.

– Hiệu suất thu hồi enzyme sau lọc gel đạt được cao nhất là 81.7% khi sử dụng mẫu
đã qua kết tủa bởi ethanol (Venzyme:Vdung môi = 20:80). Khi đó, hiệu suất thu hồi enzyme
sau lọc gel chỉ giảm 14.7% so với hiệu suất thu hồi sau kết tủa. Tuy nhiên, độ tinh
sạch của chế phẩm thu được lại thấp nhất trong 3 trường hợp khảo sát (25.6).

– Ngược lại, isopropanol là tác nhân thích hợp hơn trong việc nâng cao độ tinh sạch
của chế phẩm. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 40:60 đã thu
hồi được 88.6% tổng hoạt tính pectinase và độ tinh sạch đạt 8.6 lần. Sau khi lọc gel,
độ tinh sạch của chế phẩm cũng đạt được giá trị cao nhất là 47.2 lần, tức là tăng
thêm được 5.49 lần so với sau khi kết tủa enzyme. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi hoạt
tính enzyme sau quá trình lọc gel giảm xuống còn 51.60% (giảm 37% so với hiệu
suất kết tủa enzyme). Như vậy, phương án sử dụng enzyme đã qua kết tủa bởi
isopropanol thích hợp trong vấn đề tinh sạch chế phẩm hơn là thu hồi hoạt tính chế
phẩm.

– Kết quả lọc gel với mẫu đã qua kết tủa với ammonium sulphate cho thấy: hiệu suất
thu hồi enzyme chỉ giảm rất ít, từ 79.7% xuống 68.6% (giảm 11.1% so với hiệu suất
kết tủa enzyme) nhưng độ tinh sạch tăng lên từ 5.2 lần đến 30.4 lần (tăng thêm 5.85
lần). Như vậy, nếu quy trình tinh sạch gồm có 2 giai đoạn cơ bản là kết tủa enzyme
và sắc ký lọc gel thì khi sử dụng tác nhân là ammonium sulphate sẽ cho:
o

Hiệu suất thu hồi enzyme cao hơn so với trường hợp dùng tác nhân
ispropanol nhưng lại thấp hơn so với trường hợp dùng tác nhân ethanol.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

o

66

Độ tinh sạch của chế phẩm cao hơn so với trường hợp dùng tác nhân ethanol

nhưng lại thấp hơn so với trường hợp dùng tác nhân isopropanol.

100%
88.60%

90
81.70%

80%

79.70%

68.60%

70%

Hiệu suấ t thu hồi, %

80

60%

70
60

51.60%

50%

50

47.2

40%

40
30.4

30%

25.6

20%
10%

Độ tinh sạch, lần

90%

100

96.40%

30
20

8.6

6.6

5.2

0%

10
0

Isopropanol

Ethanol

Ammonium sulphate

Tác nhân kết tủa
Hiệ u suấ t thu hồ i sau kế t tủ a
Độ tinh sạ ch sau kế t tủ a

Hiệ u suấ t thu hồ i sau lọ c gel
Độ tinh sạ ch sau lọ c gel

Hình 4.13 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch qua các phương án khác nhau
Như đã giới thiệu ở chương 1, mục tiêu nghiên cứu chủ yếu của chúng tôi là chọn quy
trình tinh sạch nhằm phục vụ cho việc sản xuất enzyme pectinase ở quy mô công nghiệp
nên ngoài yếu tố độ tinh sạch chế phẩm, thì hiệu quả kinh tế của quy trình cũng cần được
quan tâm. Để thuận tiện cho việc so sánh, chúng tôi lập bảng 4.15 để đánh giá hiệu quả
kinh tế cho từng phương án tinh sạch.
Kết quả đánh giá sơ bộ cho thấy, chi phí để thu hồi 1 đơn vị hoạt độ (đvhđ) chế phẩm
bằng phương án sử dụng kết tủa isopropanol, ammonium sulphate và ethanol lần lượt là
101.07, 25.96, 96.17 đồng/U chế phẩm. Theo đó, nếu không tính đến độ tinh sạch của chế
phẩm thì phương án có sử dụng ammonium sulphate là phương án mang tính khả thi cao và

dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp.
Bảng 4.15 Đánh giá hiệu quả kinh tế cho các phương án tinh sạch chế phẩm pectinase
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Loại tác nhân

Giá công
nghiệp

Đơn vị
tính

67

Thành
tiền

Tổng đvhđ
thu hồi**

Chi phí thu hồi
1 đvhđ***

(đơn vị)

(đồng)

Lượng
dùng*

(đồng)

(U)

(đồng/U)

Isopropanol

44200

1 kg

1.5 kg

66300

656.00

101.07

(NH4)2SO4

48000

1 kg

472 g

22656

872.83

25.96

Ethanol

25000

1L

4L

100000

1039.80

96.17

* Lượng tác nhân cần dùng để tinh sạch 1L chế phẩm enzyme thô.
** Tổng số đơn vị hoạt độ thu hồi sau quá trình lọc gel.
***Chi phí thu hồi cho 1 đơn vị hoạt độ chế phẩm sau quá trình lọc
gel: chưa tính đến chi phí cho quá trình lọc gel.

Như vậy, từ những kết quả thu được, chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp kết tủa
enzyme bằng ammonium sulphate 70% kết hợp với sắc ký lọc gel để tinh sạch pectinase.
Chế phẩm thu được từ 2 giai đoạn tinh sạch nói trên được sử dụng để nghiên cứu các tính
chất động học trong phần tiếp theo.

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.3

68

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng chế phẩm đã qua tinh sạch theo phương án

4.2.3. Để tạo chế phẩm, chúng tôi tiến hành kết tủa 160mL dịch enzyme thô bởi ammonium
sulphate 70%. Toàn bộ kết tủa sau ly tâm được tái hòa tan trong 4mL dung dịch đệm
acetate 0.05N rồi thực hiện quá trình lọc gel.
Chế phẩm sau tinh sạch được sử dụng làm đối tượng cho các nghiên cứu sau đây:
–

Xác định nhiệt độ và pH hoạt động tối thích của chế phẩm;

– Khảo sát độ bền (độ ổn định) hoạt tính chế phẩm ở các pH và nhiệt độ khác nhau;
– Xác định các thông số động học (Km và Vmax) của chế phẩm thu được.
4.3.1

Xác định nhiệt độ tối thích của chế phẩm

Tiến hành xác định hoạt tính chế phẩm các nhiệt độ khác nhau theo trình tự đã nêu
trong phần 3.2.2.3. Kết quả được trình bày trong bảng 4.16 và hình 4.17:
Bảng 4.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endo-PGase

Nhiệt độ

Hoạt tính

Hoạt tính tương đối

C

(U/mL)

(% so với hoạt tính cực đại)

30

5.054

86%

35

5.353

91%

40

5.554

95%

45

5.678

97%

50

5.808

99%

55

5.858

100%

60

5.280

90%

65

4.888

83%

70

4.360

74%

o

Nhận xét:
Kết quả thí nghiệm hoàn toàn phù hợp với quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt
tính enzyme [10, 11]. Từ đồ thị biễu diễn mối tương quan giữa nhiệt độ phản ứng và hoạt
tính chế phẩm (Hình 4.14), chúng tôi nhận thấy, nhiệt độ mà tại đó hoạt tính endo-PGase
đạt giá trị cao nhất là 55oC. Do đó, chúng tôi chọn giá trị nhiệt độ này là nhiệt độ hoạt động
tối thích của chế phẩm.
Trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 50oC, hoạt tính tương đối của chế phẩm tăng từ 86%
đến 99%. Khi nhiệt độ vượt quá 55oC và tăng đến 70oC, hoạt tính xúc tác giảm từ 100%
xuống còn 70%. Kết quả trên hình 4.14 cho thấy, vùng giá trị nhiệt độ mà tại đó hoạt tính
của endo-PGase thể hiện trên 90% so với hoạt tính tối đa nằm trong khoảng từ 35 đến
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP