Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 3

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35
CHƯƠNG 3
Nguyên liệu và phương pháp
Nguyên liệu và phương pháp
3.1
3.1
NGUYÊN LIỆU
NGUYÊN LIỆU
3.1.1 Vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Aspergillus awamori L1 được cung cấp
từ Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.
Chủng nấm sợi được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng, theo phương pháp cấy
chuyền đònh kỳ. Môi trường giữ giống được được sử dụng là môi trường Czapek (Xem phụ
lục A) [16]. Điều kiện bảo quản là 30
o
C. Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền liên tiếp là 3 tháng.
3.1.2 Môi trường nuôi cấy
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bột vỏ bưởi khô như nguồn carbon cho nấm
sợi sinh trưởng và tổng hợp pectinase. Bột vỏ bưởi khô được thu nhận bằng cách sấy khô vỏ
quả bưởi (Năm Roi, Tiền Giang) và nghiền thành bột có độ ẩm 7%.
Môi trường cơ bản nuôi cấy nấm mốc Aspergillus awamori L1 sinh tổng hợp pectinase
như sau (g/lít môi trường): hàm lượng pectin trong bột vỏ bưởi khô: 0.788; NH
4
NO
3
: 0.402;
KH
2
PO
4
: 4.0; Na

2
HPO
4
, FeSO
4
.7H
2
O: 0.2; CaCl
2
, H
3
BO
3
: 0.01; MnSO
4
.7H
2
O: 0.07. Sau quá
trình tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút, pH môi trường được điều chỉnh đến 5.0. [4, 8,12, 52]
3.1.3 Hóa chất
– Pectin chuẩn (Sigma, St Louis, US): dùng để xác đònh hoạt tính endo-
polygalacturonase.
– Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala, Sweden): dùng để tinh sạch enzyme.
– Chế phẩm Pectinex Ultra SPL (Novodisk, Denmark).
LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36
– Hóa chất phân tích các loại.
3.2

3.2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
Giai đoạn 1
Khảo sát quá trình tinh sạch pectinase bằng phương pháp kết tủa với các
tác nhân sau:
- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, acetone
- Polymer hữu cơ: PEG 4000, PEG 6000
- Muối vô cơ: (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl
Chọn loại tác nhân cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch pectinase cao
để tiếp tục tinh sạch bằng lọc gel
Giai đoạn 2
Khảo sát tiếp hiệu quả tinh sạch pectinase bằng phương pháp sắc ký lọc
gel trên cột Sephadex G-75
Giai đoạn 3
Xác đònh một số tính chất đặc trưng của chế phẩm thu được:
- Hệ số K
m
và V
max
- Nhiệt độ và pH tối thích
- Độ bền nhiệt và pH của chế phẩm
So sánh tính chất của chế phẩm thu được với chế phẩm thương mại

Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu
3.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
3.2.2.1 Giai đoạn 1: Tinh sạch enzyme bằng phương pháp
kết tủa
Trong giai đoạn đầu, chúng tôi tiến hành thu nhận enzyme pectinase từ nấm sợi
Aspergillus theo phương pháp nuôi cấy bề sâu. Quá trình nuôi cấy nấm sợi để thu nhận
enzyme được thực hiện trong bình lên men (Bio-stat) chứa 2,5 lít môi trường. Điều kiện nuôi
cấy được tóm tắt như sau: [4, 6]
– Tỉ lệ cấy giống : 34 mg chất khô bào tử/L môi trường
– pH (điều chỉnh) : 5.0
– Nhiệt độ (điều chỉnh) : 36
o
C
– Thời gian nuôi : 24 giờ
LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37
Khi quá trình nuôi cấy kết thúc, canh trường được đem ly tâm và lọc để tách bỏ pha rắn
và thu nhận dòch enzyme thô. Chúng tôi tiếp tục tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng
phương pháp kết tủa với các tác nhân sau đây:
1- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, aceton
Nội dung:
– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với các
dung môi kể trên theo tỷ lệ thể tích V
enzyme
:V
dung môi
lần lượt là 10:90; 20:80; 30:70;
40:60; 50:50; 60:40.
– Chọn dung môi và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của
chế phẩm pectinase là cao nhất.

Thực hiện:
– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone.
– Hút dung dòch enzyme (4
o
C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung dung môi
(-18
o
C) với tỉ lệ như đã dự kiến. Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên
dung dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4
o
C.
– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4
o
C) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15
phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch
đệm sodium acetate pH 4.5.
– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.
– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.
2- Các polymer hữu cơ: PEG 6000 và PEG 4000
Nội dung:
– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với
polyethylene glycol (PEG-4000 và PEG-6000) ở các nồng độ khác nhau: 5%, 10%,
15%, 20%, 25%.
– Chọn loại PEG và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của
chế phẩm pectinase là cao nhất.
Thực hiện:
– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và các polymer hữu cơ (PEG-4000 và PEG-6000).
– Hút 10 mL dung dòch enzyme (4
o
C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung tác

nhân kết tủa ở dạng rắn theo tỉ lệ như đã dự kiến. Để quá trình kết tủa enzyme xảy
ra hoàn toàn, cần để yên dung dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4
o
C.
LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38
– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4
o
C) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15
phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch
đệm sodium acetate pH 4.5.
– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.
– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.
3- Muối vô cơ: ammonium sulphate và sodium chloride
Nội dung:
– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với các
muối vô cơ sau:
o Ammonium sulphate: ở các nồng độ 76.1%, 65.7%, 56.1%, 47.2%, 39%,
31.4% và 25.1% w/v (độ bão hòa tương ứng là 100%, 90%, 80%, 70%, 60%,
50%, 40%).
o Sodium Chloride: ở những nồng độ 35%, 30%, 25%, 20%, 15% (w/v).
– Chọn loại tác nhân thích hợp sao cho hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của
chế phẩm pectinase là cao nhất.
Thực hiện:
– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và muối.
– Hút 10 mL dung dòch enzyme (4
o
C) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung
muối ở dạng tinh thể với hàm lượng như đã dự kiến. Khuấy nhẹ để muối hòa tan
hoàn toàn trong dung dòch. Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên dung

dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4
o
C.
– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4
o
C) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15
phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch
đệm sodium acetate pH 4.5.
– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.
– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.
3.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh sạch endo-PGase bằng phương
pháp lọc gel
Nội dung:
Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc
gel (Sephadex G-75), sử dụng chế phẩm pectinase thu được sau giai đoạn tinh sạch bằng
LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39
phương pháp kết tủa. Từ đó, đề xuất quy trình tinh sạch chế phẩm pectinase, sử dụng kết
hợp 2 phương pháp: kết tủa enzyme và sắc ký lọc gel.
Thực hiện:
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột sắc ký có
φ
=2 cm và l=50 cm. Cột được
nhồi bằng gel sephadex G-75. Phương pháp chuẩn bò cột và phân tích được trình bày trong
phần phụ lục C. Khi cột gel đã sẵn sàng, chúng tôi triển khai quá trình lọc gel theo từng
bước sau đây:
– Bước 1: Kết tủa dòch enzyme thô bằng các tác nhân như ethanol, isopropanol,
ammonium sulphate. Điều kiện thí nghiệm tương tự như đã trình bày trong phần
3.2.2.1. Sau khi kết tủa enzyme xong, hòa tan kết tủa vào một lượng thể tích nhất
đònh dung dòch đệm acetate 0.05N sao cho nồng độ enzyme dao động trong khoảng

1-10mg/mL.
– Bước 2: Hút một lượng thể tích enzyme nhất đònh sau tinh sạch ở bước 1, cho vào cột
và triển khai quá trình sắc ký qua cột gel. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần ứng
với mỗi loại tác nhân kết tủa để so sánh hiệu quả tinh sạch.
Trình tự thực hiện phương pháp sắc ký lọc gel được trình bày trong phụ lục C.
3.2.2.3 Giai đoạn 3: Xác đònh một số tính chất của chế
phẩm sau tinh sạch
3.2.2.3.1 Xác đònh pH tối thích và nhiệt độ tối thích của chế phẩm
Nhiệt độ tối thích của chế phẩm
Tiến hành xác đònh hoạt tính của chế phẩm ở nhiều giá trò nhiệt độ khác nhau (30, 35,
40, 45, 50, 55, 60, 65, 70
o
C) tại pH 4.5. Nhiệt độ tối thích của chế phẩm được đònh nghóa là
nhiệt độ mà tại đó hoạt tính chế phẩm là cao nhất.
pH tối thích của chế phẩm
Tiến hành xác đònh hoạt tính của chế phẩm ở những giá trò pH của dung dòch phản ứng
khác nhau: 3.0; 3.5; 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0. Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ tối
thích của chế phẩm.
3.2.2.3.2 Khảo sát độ bền nhiệt và pH của chế phẩm
Độ bền nhiệt của chế phẩm
Giữ chế phẩm ở nhiều giá trò nhiệt độ khác nhau từ 40 đến 70
o
C tại pH 4.5. Sau những
khoảng thời gian xác đònh, tiến hành đo hoạt tính hoạt tính enzyme thu được. Khảo sát độ
bền nhiệt của chế phẩm trong 4 giờ.
LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä