CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN THU NHẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CỐ ĐỊNH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN
THU NHẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
ENZYME CỐ ĐỊNH

Ngành học :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa:

2004-2008

Sinh viên thực hiên :

TRANG HOÀNG NAM

Tháng 09/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN
THU NHẬN TỪ VỎ TÔM VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
ENZYME CỐ ĐỊNH

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

TRANG HOÀNG NAM

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 09/2008


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Các Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các Thầy Cô đã
trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua.
PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng và cô Đỗ Thị Tuyến đã tạo điều kiện cho tôi
được thực tập tại viện và đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập
tại đây.
Các anh chị phụ trách phòng các chất có hoạt tính sinh học thuộc viện Sinh
Học Nhiệt Đới Tp.HCM.
Toàn thể các bạn sinh viên cùng thực tập tại phòng các chất có hoạt tính

sinh học đã hết lòng giúp đỡ và cung cấp nhiều kiến thức quan trọng.
Cùng toàn thể lớp CNSH 30 thân thiện đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi
trong suốt thời gian làm đề tài.
Cuối cùng con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn luôn ở bên
con, lo lắng cho con và động viên con trong suốt quá trình học tập.

Tháng 09 năm 2008
Trang Hoàng Nam

iii


TÓM TẮT
TRANG HOÀNG NAM, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 09/2008.
CỐ ĐỊNH ENZYME PROTEASE BẰNG CHITOSAN THU NHẬN TỪ VỎ
TÔM VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME CỐ ĐỊNH
GVHD: PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG VÀ CN. ĐỖ THỊ TUYẾN
Phòng các chất có hoạt tính sinh học, viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM
Chitosan là một polymer sinh học được phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt có
nhiều trong vỏ của các loài động vật giáp xác như tôm, cua, tôm hùm,… Và được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y, dược và công nghệ. Với những đặc tính trên
của chitosan, chúng tôi đã tiến hành thu nhận chitosan từ vỏ tôm và sử dụng nó làm
chất mang để cố định enzyme protease. Kết quả thu nhận chitosan bằng phương pháp
hóa học cho hiệu suất thu nhận cao (20%) và các đặc tính tốt (độ hòa tan 98%, độ
deacetyl 80%, và độ nhớt 0,69 Pa.s). Thực hiện cố định enzyme protease trên chất
mang chitosan bằng hai phương pháp (liên kết đồng hóa trị - covalent binding và nhốt
trong gel – entrapment in gel) và khảo sát hoạt tính của enzyme cố định bằng phương
pháp Amano. Hiệu suất cố định hàm lượng protein và hoạt tính protease lần lượt là:
89,45% và 87,08% (phương pháp liên kết đồng hóa trị); 36,05% và 35,37% (phương
pháp nhốt trong gel). Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

cố định đã cho thấy khả năng ổn định với nhiệt độ của enzyme protease được cố định
bằng phương pháp liên kết đồng hóa trị rất cao (sau 100 phút ủ ở 600C, hoạt tính còn
giữ lại là 67,24%), tuy nhiên ở phương pháp nhốt trong gel thì enzyme protease cố
định không có khả năng ổn định với nhiệt độ (hoạt tính còn giữ lại là 28,38% sau 100
phút ủ ở 600C).
Từ khóa: chitosan, cố định, protease.

iv


SUMMARY
TRANG HOANG NAM, Agriculture and Forestry University of Ho Chi Minh
City. September, 2008.
PROTEASE IMMOBILIZATION ON CHITOSAN RECEIVED FROM
SHRIMP’S SHELL AND SURVEY IMMOBILIZED ENZYME’S ACTIVITY.
Supervisor: Ph.D. NGUYEN TIEN THANG and DO THI TUYEN
Chitosan is a biopolymer that is distributed widely in nature, especially in crustacean’s
shell such as shrimp, crab, lobster… Chitosan is applied wide in many domains such
as medicine, pharmacy and technology. We received chitosan from shrimp’s shell as
protease support. Results reported that output of chitosan reception by chemical
method (20%) and chitosan’s properties (solubility 98%, degree of deacetylation 80%,
viscosity 0,69 Pa.s). Protease was immobilized on chitosan by two methods (covalent
binding and entrapment in gel) and investigated activity of immobilized Enzyme by
Amano method.
Immobilization output by covalent binding method:
- Potein’s content: 89,45%.
- Protease’s activity: 87,08%.
Immobilization output by entrapment in gel method:
- Potein’s content: 36,05%.
- Protease’s activity: 35,37%.

Studied results of factors’s effect on immobilized protease’s activity showed
thermal stabile ability of protease immobilized by covalent binding method well (at
600C/100 minutes, activity retained by 67,24%). On the orther hand, entrapment in gel
method, thermal stabile ability lowly (600C/100 minutes , activity retained by
28,38%).
Keywords: chitosan, immobilization, protease.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iii
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
SUMMARY.....................................................................................................................v
MỤC LỤC ......................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................xii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... xiii
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU...................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề ..........................................................................................................1

1.2.

Mục tiêu của đề tài.............................................................................................2

1.3.

Mục đích ............................................................................................................2

1.4.

Giới hạn của đề tài .............................................................................................2

1.5.

Nội dung thực hiện.............................................................................................2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
2.1.

Đại cương về chitin-chitosan ............................................................................3

2.1.1.

Giới thiệu về chitin-chitosan .............................................................................3

2.1.2.

Cấu trúc và tính chất của chitin .........................................................................4

2.1.2.1.

Cấu trúc phân tử của chitin ............................................................................4

2.1.2.2.

Tính chất của chitin........................................................................................4

2.1.3.
2.1.3.1.
2.1.4.

Cấu trúc và tính chất của chitosan .....................................................................5
Cấu trúc phân tử của chitosan ........................................................................5
Ứng dụng của chitosan ......................................................................................6

2.1.4.1.

Trong công nghiệp thực phẩm .......................................................................6

2.1.4.2.

Trong mỹ phẩm..............................................................................................6

2.1.4.3.

Trong y tế .......................................................................................................6

2.1.4.4.

Trong nông nghiệp .........................................................................................7

2.1.4.5.

Trong công nghệ hóa học...............................................................................7

2.1.4.6.

Trong công nghệ sinh học..............................................................................7

vi


2.2.

Đại cương về Enzyme protease và Enzyme cố định..........................................7

2.2.1.

Đại cương về Enzyme protease ........................................................................7

2.2.1.1.

Định nghĩa......................................................................................................7

2.2.1.2.

Nguồn thu nhận..............................................................................................8

2.2.1.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân bằng Enzyme...........................9

2.2.1.4.

Ứng dụng......................................................................................................11

2.2.2.

Đại cương về Enzyme cố định.........................................................................12

2.2.2.1.

Định nghĩa Enzyme cố định (Enzyme không hòa tan) ...............................12

2.2.2.2.

Đặc điểm của Enzyme không hòa tan .........................................................12

2.2.2.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Enzyme không hòa tan ................13

2.2.2.4.

Phân loại chât mang dùng đê tạo Enzyme không hòa tan ...........................14

2.2.2.5.

Các phương pháp tạo Enzyme không hòa tan..............................................17

2.2.2.6.

Ứng dụng của Enzyme không hòa tan ........................................................20

2.2.3.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .....................................................22

2.2.3.1.

Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................22

2.2.3.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................23

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................24
3.1.

Thời gian và địa điểm tiến hành.......................................................................24

3.1.1.

Thời gian..........................................................................................................24

3.1.2.

Địa điểm...........................................................................................................24

3.2.

Vật liệu.............................................................................................................24

3.2.1.

Vỏ tôm ...........................................................................................................24

3.2.2.

Enzyme protease..............................................................................................24

3.2.3.

Hóa chất ...........................................................................................................24

3.2.4.

Dụng cụ, thiết bị ..............................................................................................24

3.3.

Các phương pháp nghiên cứu ..........................................................................25

3.3.1.

Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford ..............................25

3.3.1.1.

Nguyên tắc ...................................................................................................25

3.3.1.2.

Hóa chất .......................................................................................................25

3.3.1.3.

Tiến hành thí nghiệm ...................................................................................25

3.3.2.
3.3.2.1.

Phương pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phương pháp Amano) ....26
Nguyên tắc ...................................................................................................26
vii


3.3.2.2.

Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................26

3.3.2.3.

Hóa chất .......................................................................................................26

3.3.2.4.

Các bước tiến hành.......................................................................................26

3.3.2.5.

Tính toán ......................................................................................................27

3.3.3.

Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số - Kjeldahl ............................28

3.3.3.1.

Nguyên tắc ...................................................................................................28

3.3.3.2.

Dụng cụ và hóa chất.....................................................................................28

3.3.3.3.

Cách tiến hành..............................................................................................29

3.3.3.4.

Tính kết quả .................................................................................................29

3.3.4.

Xác định hoạt tính riêng của chế phẩm Enzyme .............................................30

3.3.5.

Xác định hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn Enzyme cố định .....30

3.3.6.

Xác định hiệu suất cố định protein .................................................................30

3.3.7.

Xác định hiệu suất hoạt tính Enzyme cố định ................................................31

3.3.8.

Thu nhận chitosan từ vỏ tôm ...........................................................................31

3.3.8.1.

Sơ đồ tổng quát ............................................................................................31

3.3.8.2.

Quy trình thu nhận chitosan từ vỏ tôm .......................................................32

3.3.8.3.

Định tính chitosan .......................................................................................33

3.3.8.4.

Phương pháp xác định độ hòa tan ...............................................................33

3.3.8.5.

Xác định độ deacetyl hóa bằng phương pháp dựa vào hàm lượng đạm

tổng số

.............................................................................................................33

3.3.8.6.

Phương pháp xác định độ nhớt của dung dịch chitosan...............................34

3.3.9.

Phương pháp cố định Enzyme protease lên chất mang chitosan.....................37

3.3.9.1.

Phương pháp gắn kết Enzyme protease với chitosan thông qua cầu nối

glutaraldehyde (GA) ......................................................................................................37
3.3.9.2.

Phương pháp nhốt Enzyme protease vào chất mang chitosan .....................38

3.3.10. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến hoạt tính Enzyme protease ban
đầu, và Enzyme protease cố định (EProtease cố định)...........................................................38
3.3.10.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.................................................................38
3.3.10.2. Khảo sát độ bền nhiệt...................................................................................39
3.3.10.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH .........................................................................39
3.3.11. Khảo sát số lần tái sử dụng của Enzyme protease được cố định bằng phương
pháp nhốt

...........................................................................................................39
viii


3.3.12. Xác định hàm lượng protein và hoạt tính protease trong chế phẩm Enzyme

protease ban đầu. ...........................................................................................................40
3.3.13. Xác định hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn Enzyme protease cố
định, hiệu suất cố định protein, và hiệu suất hoạt tính Enzyme protease cố định.........40
3.3.13.1. Cố định trên chất mang chitosan bằng phương pháp gắn kết thông qua cầu
nối glutaraldehyde (GA)................................................................................................40
3.3.13.2. Cố định trên chất mang chitosan bằng phương pháp nhốt...........................40
3.3.14. Xác định hoạt tính và hoạt tính riêng của Enzyme protease cố định ..............40
3.3.15. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................41
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................................................42
4.1.

Chitosan được thu nhận từ vỏ tôm...............................................................42

4.2.

Kết quả quá trình cố định Enzyme protease trên chất mang chitosan .............43

4.2.1.

Kết quả quá trình cố định Enzyme protease trên chất mang chitosan bằng

phương pháp gắn kết thông qua cầu nối GA (liên kết đồng hóa trị) .............................43
4.2.2.

Kết quả quá trình cố định Enzyme protease trên chất mang chitosan bằng

phương pháp nhốt ..........................................................................................................44
4.3.

Hàm lượng protein và hoạt tính của chế phẩm Enzyme protease ban đầu ......45

4.4.

Hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn Enzyme protease cố định

(EProtease cố định), hiệu suất cố định protein và hiệu suất hoạt tính Enzyme protease .......45
4.5.

Hoạt tính và hoạt tính riêng của Enzyme protease cố định (EProtease cố định) ......46

4.6.

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến chế phẩm Enzyme protease

ban đầu

......................................................................................................................47

4.6.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ...................................................................................47

4.6.2.

Độ bền nhiệt.....................................................................................................48

4.6.3.

Ảnh hưởng của pH...........................................................................................49

4.7.

Ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến Enzyme protease được cố định bằng

phương pháp gắn kết .....................................................................................................51
4.7.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ...................................................................................51

4.7.2.

Độ bền nhiệt.....................................................................................................52

4.7.3.

Ảnh hưởng của pH...........................................................................................54

4.8.

Ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý đến Enzyme protease cố định bằng phương

pháp nhốt ......................................................................................................................55
ix


4.8.1.

Ảnh hưởng của nhiệt độ...................................................................................55

4.8.2.

Độ bền nhiệt.....................................................................................................56

4.8.3.

Ảnh hưởng của pH...........................................................................................57

4.9.

Khảo sát số lần tái sử dụng của Enzyme protease cố định bằng phương

pháp nhốt ......................................................................................................................58
4.10.

So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm Enzyme protease ban đầu, Enzyme

protease được cố định bằng phương pháp nhốt và được cố định bằng phương pháp
gắn kết

......................................................................................................................60

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................62
5.1. Kết luận...................................................................................................................62
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................64
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 66

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 3.1 Dựng đường chuẩn albumine ....................................................................... 25
Bảng 3.2 Tính hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan theo lý thuyết .........34
Bảng 3.3 Tính hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan theo lý thuyết ........34
Bảng 4.1 Hiệu suất thu hồi chitosan ............................................................................42
Bảng 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease của enzyme protease ban đầu......45
Bảng 4.3 Hiệu suất cố định và hàm lượng protein có trong 1g chất mang trang ........45
Bảng 4.4 Hoạt tính riêng của enzyme protease cố định (EProtease cố định) .......................46
Bảng 4.5 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo nhiệt độ .......................................47
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease ban đầu ......................48
Bảng 4.7 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme protease ban đầu theo pH ..............50
Bảng 4.8 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme .........................51
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease cố định .......................52
Bảng 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cố định theo pH .................................53
Bảng 4.11 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ ................................55
Bảng 4.12 Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease cố định .....................56
Bảng 4.13 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH ...........................57
Bảng 4.14 Kết quả khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme protease cố định ............58
Bảng 4.15 Kết quả so sánh độ bền nhiệt của enzym protease ban đầu với enzyme
protease cố định bằng hai phương pháp ......................................................................60

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ
Hình

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của chitin ........................................................................... 4
Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của chitosan ...................................................................... 5
Hình 3.1 Cấu tạo nhớt kế mao quản Ostwald ............................................................ 37
Hình 3.2 Nguyên lý gắn kết của Enzyme với chtiosan thông qua cầu nối GA ......... 38
Hình 4.1 Chitosan được thu nhận từ vỏ tôm ............................................................. 42
Hình 4.2 Kết quả Enzyme protease cố định bằng phương pháp liên kết đồng
hóa trị ......................................................................................................................... 44
Hình 4.3 Enzyme protease được cố định trong gel chitosan ..................................... 44
Biểu đồ
Biểu đồ 4.1 Hoạt tính của enzyme protease ban đầu theo nhiệt độ ........................... 48
Biểu đồ 4.2 Hoạt tính enzyme protease ban đầu theo thời gian ủ ở 600C ................. 49
Biểu đồ 4.3 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme protease ban đầu theo pH ........ 50
Biểu đồ 4.4 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo nhiệt độ ....... 51
Biểu đồ 4.5 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease cố định theo thời gian ủ .. 53
Biểu đồ 4.6 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme cố định theo pH ....................... 54
Biểu đồ 4.7 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme theo nhiệt độ ........................... 55
Biểu đồ 4.8 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme cố định theo thời gian ủ .......... 56
Biểu đồ 4.9 Đường biểu diễn hoạt tính của enzyme protease cố định theo pH ........ 57
Biểu đồ 4.10 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số lần tái sử dụng .. 59
Biểu đồ 4.11 Đường biểu diễn độ bền nhiệt của ba loại enzyme protease ................ 60
Sơ đồ
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát để thu nhận chitosan từ vỏ tôm ................................. 32
Sơ đồ 3.2 Quy trình thu nhận chitosan từ vỏ tôm ...................................................... 33

xii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTPT:

Công thức phân tử

ELISA:

Enzyme link immunosorbent assay

HRP:

Horseradish Peroxidase

Ctv:

Cộng tác viên

PHEMA:

Polyhydroxy ethyl metrhcryla

TCA:

Tricloroacetic

GA:

Glutaraldehyde

TPP:

Tripolyphosphate

CBB:

Coomassie brilliant blue

OD:

Optical density

UV:

Ultraviolet

HTR:

Hoạt tính riêng

DD:

Degree of Deacetylation

EProtease cố định:

Enzyme protease được cố định

xiii

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Thế kỷ 21 được xem là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học trong đó công

nghệ enzyme là một lĩnh vực quan trọng của ngành công nghệ sinh học và có ứng
dụng rộng rãi trong những thập niên gần đây.
Trong khi thế kỷ 19 và 20 lãnh vực công nghệ enzyme được phát triển chủ yếu
là phát triển các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme từ nhiều nguồn khác
nhau (động vật, thực vật và vi sinh vật), thì thế kỷ 21 được xem là thế kỷ phát triển các
phương pháp cố định enzyme để tạo enzyme không hòa tan.
Tại sao lại cố định enzyme và cố định nó như thế nào?
Đối với những enzyme hòa tan, chúng ta không thể nào ngừng quá trình
phản ứng ở bất kỳ giai đoạn nào. Hơn nữa, sau khi sử dụng enzyme hòa tan
thường lẫn vào sản phẩm phản ứng khó có thể tách ra được. Nếu tách ra thì
enzyme cũng bị vô hoạt, hoặc chi phí rất tốn kém. Do đó với một lượng enzyme
nhất định chỉ có thể sử dụng trong một lần. Để khắc phục tình trạng trên thì việc
sử dụng enzyme cố định sẽ cải thiện phần nào những khuyết điểm của enzyme
hòa tan.
Có nhiều phương pháp để cố định enzyme, trong đó việc gắn enzyme với
một chất mang không tan để tạo enzyme không hòa tan là phương pháp được sử
dụng rộng rãi nhất. Hiện nay cũng có nhiều chất mang (có bản chất là polyme vô
cơ và hữu cơ) dùng để cố định enzyme và đã được thương mại hóa như agarose,
cellulose, polyacrylamide, polyester….
Trong các chất mang dùng để cố định enzyme thì chitosan là một dẫn xuất của
chitin (là một polyme có nhiều trong tự nhiên (vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế bào vi
sinh vật) chỉ đứng sau cellulose về số lượng) được xem là có nhiều triển vọng trong
việc cố định enzyme và tế bào.

1


Cũng có nhiều nghiên cứu trên thế giới sử dụng chitosan để làm vật liệu mang
cố định nhiều loại enzyme như: “Cố định catalase trong chitosan để tháo H2O2 trong
nước” của D.S. Yoon và các cộng sự; “Ổn định Penicillin G Acylase bằng việc cố định
trên chitosan được hoạt hóa bởi glutaraldehyde” của W.S. Adriano và các cộng sự.
Theo khuynh hướng đó chúng tôi thực hiện đề tài “Cố định enzyme protease bằng
chitosan thu nhận từ vỏ tôm và khảo sát hoạt tính của enzyme cố định”, dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng và CN. Đỗ Thị Tuyến.
Với đề tài này, chúng tôi hy vọng sẽ góp một phần nhỏ trong nghiên cứu sinh
hóa cơ bản và phát triển khả năng ứng dụng của chitosan trong việc cố định enzyme,
vẫn còn là điều mới mẽ với khoa học và sản xuất ở nước ta hiện nay.
1.2.

Mục tiêu của đề tài
Thực hiện việc cố định enzyme protease trên cơ chất chitosan thu nhận từ vỏ

tôm bằng hai phương pháp: liên kết đồng hóa trị và nhốt trong gel.
1.3.

Mục đích
Làm cơ sở để nghiên cứu ứng dụng chitosan làm chất mang để cố định nhiều

loại enzyme khác nhau và trên quy mô công nghiệp.
1.4.

Giới hạn của đề tài
Do thời gian và thiết bị còn hạn chế nên bước đầu chỉ nghiên cứu cố định

enzyme protease trên cơ chất chitosan ở quy mô nhỏ.
1.5.

Nội dung thực hiện
Thu nhận chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học.
Sử dụng chitosan được thu nhận để cố định enzyme protease bằng hai phương

pháp: liên kết đồng hóa trị và nhốt trong gel.
Khảo sát các yếu tố hóa lý ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố định.
Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme protease được cố định bằng phương
pháp nhốt.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Đại cương về chitin-chitosan [2,4]

2.1.1. Giới thiệu về chitin-chitosan
Lần đầu tiên chitin được Henri Braconnot tìm thấy ở nấm vào năm 1811.
Chitin là một polyme rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng thứ 2 sau cellulose.
Chitin có cấu tạo tương tự cellulose, là một polymer của 2-acetomido-deoxy-β-Dglucose.
Chitin tham gia vào thành phần cấu trúc của vỏ tôm, cua, côn trùng, thành tế
bào vi sinh vật. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng thể rắn, có cấu trúc gồm nhiều
phân tử được nối với nhau bằng các mối nối hydro và tạo thành một hệ thống sợi.
Trong tự nhiên chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do, mà gần như luôn luôn liên kết

ở dạng phức hợp chitin – protein, chitin – canxicacbonat. Điều này dẫn đến chitin khá
bền với các hóa chất và các men thủy phân gây nhiều khó khăn cho việc tách chiết,
tinh chế chúng.
Năm 1859 giáo sư C.Rouget đã phát hiện ra chitosan dạng deacetyl của chitin
khi xử lý bằng kiềm đặc. Từ đó đến nay nhiều nghiên cứu cơ bản và công nghệ về
những hợp chất này đã được tiến hành.
Động lực chính cho sự phát triển và ứng dụng chitin-chitosan là nó được điều
chế dễ dàng từ nguồn nguyên liệu phế thải phong phú trong tự nhiên, hạn chế được ô
nhiễm môi trường, không độc tính đối với con người và khả năng tự phân hủy sinh
học.
Nói chung chitin – chitosan tồn tại khá phong phú trong tự nhiên, chúng có cả
trong động vật và thực vật. Đặc biệt trong động vật thủy sản (vỏ cua, tôm, ghẹ,…) có
khoảng 25% là chitin và protein, phần còn lại 75% là các chất vô cơ mà chủ yếu là
carbonate calci. Vì vậy vỏ tôm, cua là nguồn nguyên liệu tốt để chúng ta sản xuất
chitin – chitosan và các dẫn xuất của chúng.

3


2.1.2. Cấu trúc và tính chất của chitin
2.1.2.1.

Cấu trúc phân tử của chitin
Từ những nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay bằng acid

chlohydic đậm đặc đều cho kết quả là chitin có cấu trúc đa phân tử (polymer) đồng
nhất từ các đơn vị N – axetyl – 2 – amino – 2 – deoxi – b – D – glucopyranozơ liên kết
với nhau bằng liên kết β - C – 1- 4 – glucozit.
CTPT: (C8H13O5N)n

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của chitin
2.1.2.2.

Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc – NHCOCH3 ở C2 (cacbon

số 2) làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch.
Chitin là một polysaccharide bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền
trong môi trường acid.
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid loãng, trong kiềm
loãng, các thuốc thử Schweitzer và các dung môi hữu cơ như rượu, este,…nhưng nó
hòa tan trong một số dung dịch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitric, formic,
acid khan). Đặc biệt nó còn hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối thioxianat liti
(LiSCN) và muối thixianat canxi [Ca(SCN)2] tạo thành dung dịch keo.
Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay
[Ca(ClO)2]… Lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin.
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử gốc acetyl tạo
thành chitosan.

4


2.1.3. Cấu trúc và tính chất của chitosan
2.1.3.1.

Cấu trúc phân tử của chitosan
Khi xử lý chitin với kiềm đậm đặc đun nóng ta thu được chitosan. Chitosan

là một polysaccharide gồm các phân tử β – D – glucozamin liên kết với nhau bằng
liên kết β – 1 – 4 – glucozid.

CTPT: (C6H11O4N)n

Hình 1.2: Cấu trúc phân tử của chitosan
2.1.3.2.

Tính chất của chitosan.
Trọng lượng phân tử chitosan tùy thuộc vào điều kiện sản xuất thường nằm

trong khoảng 10.000 - 1.000.000 dalton với mức độ deacetyl hóa thường 70-90%.
Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vị, không tan trong
nước, kiềm, acid đậm đặc, nhưng tan trong acid loãng, tan tốt trong dung dịch acid
acetic loãng (0,5÷1,5%) tạo thành dung dịch keo, trong suốt. Lợi dụng tính chất này
của chitosan để thực hiện cố định enzyme bằng phương pháp nhốt.
Chitosan là một poliamine, nó được xem như một polyme cationic có khả
năng cho các ion kim loại nặng bám dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức chất
với kim loại và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung dịch.
Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các khuẩn gây bệnh
như E.coli, Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất
là nấm Candida albicans.
Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309 ÷ 311 0C.

5


Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, tính
chất cơ lý bền vững, ổn định, thường được dùng cố định enzyme qua cầu nối
glutaraldehyde.
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng
với iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính
chitosan.

Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được xem là nguồn nguyên liệu
vô cùng quí giá để cho ra các dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lĩnh vực thực
phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường…
2.1.4. Ứng dụng của chitosan
2.1.4.1.

Trong công nghiệp thực phẩm
Chitosan dùng để bảo quản hoa quả và rau tươi, bảo quản thực phẩm

tươi sống.
Làm màng mỏng để bao gói bánh kẹo.
Chitosan và muối của nó được dùng như chất tinh luyện nước ép từ trái cây
như nước táo, cà rốt, chất này làm thay thế chất củ như Silicasol, gelatin…
2.1.4.2.

Trong mỹ phẩm
Chitosan dùng làm chất phụ gia, làm kem bôi mặt, thuốc làm mềm da, làm

tăng khả năng hòa hợp sinh học giữa kem thuốc và da, cấu tạo thuốc định hình tóc,
kem bôi lột da mặt…
2.1.4.3.

Trong y tế
Ngành dược:
Chitosan dùng làm chất phụ gia rất tốt cho kỹ nghệ bào chế dược phẩm

(keo kết dính viên, tá dược độn, chất tạo màng, tạo nang mềm…)
Chitosan là chất mang polime sinh học để gắn thuốc bằng liên kết cơ học
hay hóa học nhằm tạo ra thuốc polyme có nhiều tác dụng mới. Chitosan được coi
là một hệ thống vận tải thuốc khá lý tưởng.

Bản thân chitosan và các dẫn xuất của nó được dùng làm thuốc chữa
bệnh: Thuốc hạ cholesterol trong máu, thuốc chữa các vết thương, vết bỏng,
thuốc chữa đau dạ dày, thuốc chống đông tụ máu, thuốc dùng tăng cường miễn
dịch cơ thể và khả năng chống nhiễm HIV…
Ngành y:
6


Chitosan là vật liệu cho y khoa rất tốt như: Da nhân tạo, mô ghép, chỉ
khâu phẫu thuật tự tiêu, kem chữa bỏng, thuốc chữa lành nướu sau khi nhổ
răng….
2.1.4.4.

Trong nông nghiệp
Chitosan được dùng như là một thành phần chính trong thuốc phòng trừ nấm

(đạo ôn, khô vằn…) dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng cho lúa, cây công
nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh.
2.1.4.5.

Trong công nghệ hóa học
Chitosan được dùng để xử lý nước thải công nghiệp, có khả năng tạo phức

với các kim loại nặng độc hại, dùng để lọc nước sạch tiêu dùng.
2.1.4.6.

Trong công nghệ sinh học
Chitosan được sử dụng làm chất mang để cố định enzyme và các tế bào.
 Tóm lại, những polymer tự nhiên như chitosan ngày càng tỏ ra ưu việt,

nhất là trong thời điểm hiện nay khi vật liệu hóa học đã mất dần tính hấp dẫn và khả
năng phân hủy sinh học rất kém của nó. Chitosan là vật liệu sinh học có nhiều hứa hẹn
trong tương lai.
2.2.

Đại cương về enzyme protease và enzyme cố định

2.2.1. Đại cương về enzyme protease [7]
2.2.1.1.

Định nghĩa
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thuỷ phân

liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do,
một ít peptide ngắn, pepton.
Phản ứng thủy phân bởi enzyme có thể biểu diễn theo sơ đồ:
Enzyme
A–B

+

H2O

AH

+

BOH

Protease

(Cơ chất +

H 2O

Sản phẩm)

Như vậy, phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân. Nhưng
do trong phản ứng thủy phân lượng nước rất lớn và coi như không đổi trong suốt quá
7


trình, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân
bởi enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1. Trong quá trình phản ứng, các phân tử
cơ chất ban đầu sẽ phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc vào sự có mặt của các
phân tử khác.
Cần lưu ý: Trong quá trình thủy phân, phản ứng thủy phân cơ chất là phản
ứng chính nhưng không phải duy nhất mà còn có một số phản ứng phụ. Như: trong
phản ứng thủy phân protein thành axit amin, các phản ứng phụ có thể là phản ứng
phân huỷ axit amin thành các sản phẩm thứ cấp, phản ứng Melanoidin tạo thành các
hợp chất màu…
2.2.1.2.

Nguồn thu nhận
 Từ động vật
Protease động vật thường có ở tuỵ tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc

dạ dày,…
Gồm:


Pancreatin gồm: trypsin, chymotrypsin và một số enzyme khác có

ở tuỵ tạng, chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tuỵ.


Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với

dịch vị.


Renin chỉ có ở ngăn thứ tư trong dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi,

là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất phomat.
 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các phần khác nhau của cây như: thân,
lá và đặc biệt có nhiều ở quả.
Enzyme này chủ yếu có ở một số cây vùng nhiệt đới như: đu đủ, dứa,
cây sung, articho và đậu tương.
Ví dụ:


Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh.



Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh.



Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.

 Từ vi sinh vật

8


Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme
này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường
nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên
cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô
công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau
trong nông nghiệp và y dược.
Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,…Harley (1960) đã
phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau: Protease serine,
Protease kim loại, Protease acid, Protease tiol.
2.2.1.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân bằng enzyme
 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào

nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng
tăng chậm.
 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào
nồng độ cơ chất. Nhưng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục
tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng.
Với từng enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng như với từng cơ
chất, nồng độ tới hạn của enzyme phụ thuộc vào điều kiện của qúa trình phản
ứng. Vì vậy, với từng enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong

những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của enzyme.
 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa
Hoạt tính của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất
vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc
làm giảm (chất kìm hãm) hoạt tính enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc
hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất, tùy từng enzyme.
Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng
enzyme sẽ làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi
enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các
protein.

9


Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc
làm cho enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động. Các
chất này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim
lọai hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính
của enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp.
 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng
enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản
ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ
phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu.
Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính enzyme
sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme bị han chế rất mạnh, nhưng khi đưa
nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp.
Ở nhiệt độ thấp (0 - 410C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự
gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng.

Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại enzyme, ở khoảng 450C), vận
tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở
80 - 1000C.
Nhiệt độ thích hợp của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt
của cơ chất, pH, lực ion của môi trường.
 Ảnh hưởng của pH môi trường
pH của môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó
ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của
protein-enzyme. Đa số enzyme bền trong khoảng pH = 5-9, độ bền của enzyme
có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như: cơ chất, coEnzyme, Ca2+…
Mỗi enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc
vào nhiều yếu tố khác như: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ…
Với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhưng cũng
có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepxin, protease axit của vi sinh
vật,…) hoặc khá cao như subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10.
 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
10


Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của enzyme lên cơ chất dài
hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,…
Thời gian thủy phân cần đủ dài để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo
thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân
đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích
hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt.
Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và
kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể.
 Ảnh hưởng của lượng nước
Với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước vừa là môi trường để phân
tán enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nước có ảnh hưởng

đến tốc độ và chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Vì thế, nước là
một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme, nó có thể tăng cường
hoặc ức chế các phản ứng do enzyme xúc tác.
2.2.1.4.

Ứng dụng
 Trong công nghiệp thực phẩm
Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị

cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ,
nội tạng động vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu
tạo thành các dạng dịch thủy phân dễ hấp thu, dễ tiêu hoá.
Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm
protease sử dụng để làm trong dịch quả, dịch bia tạo điều kiện cho quá trình lọc.
Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm phomat.
Sản xuất nước chấm: nước mắm, tương, chao,…
Protease dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của các sản
phẩm có giá trị thấp, như: dùng protease để thủy phân protein trong phế liệu công
nghiệp thực phẩm (xương, collagen,…) thành các dạng hoà tan thu dịch đạm thủy
phân cho người hoặc thức ăn chăn nuôi.
Dùng protease để thuỷ phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá hoặc
để tinh chế guanin.
 Trong công nghiệp dệt

11


Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng,
không ảnh hưởng đến độ bền của tơ.
 Trong công nghiệp phim ảnh

Protease được dùng để sản xuất gellatin phủ trên bề mặt phim ảnh, dùng
để tái sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X-quang.
 Trong công nghiệp da
Protease được dùng để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng
lượng lông thu hồi và tỷ lệ thu hồi tăng 25-30% so với khi dùng phương pháp hoá
học, da có chất lượng cao.
 Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp
mỹ phẩm
Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, thuốc đánh răng, để tẩy
sạch các vết máu mủ hoặc bổ sung protease vào kem bôi mặt, có tác dụng loại
được các lớp biểu bì chết, làm mịn da.
 Trong công nghiệp dược phẩm
Protease được dùng để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu
hoá, thuốc tiêu mủ ở các vết thương và giảm đau cho người bệnh.
2.2.2. Đại cương về enzyme cố định
2.2.2.1.

Định nghĩa enzyme cố định (enzyme không hòa tan) [1]
Enzyme cố định hay enzyme không hòa tan là những enzyme được đưa vào

những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do. Pha
enzyme không hòa tan trong nước và được gắn với những polime ưa nước có
trọng lượng phân tử lớn (Michael Trevan). Các enzyme hòa tan được gắn với các
polimer (chất mang) bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, nhờ quá trình gắn này mà
enzyme chuyển từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan.
2.2.2.2.

Đặc điểm của Enzyme không hòa tan [1]
Khi gắn enzyme hòa tan vào một số chất mang, enzyme này có những đặc

điểm sau:
-

Hoạt tính riêng của enzyme không hòa tan thường nhỏ hơn hoạt

tính riêng của enzyme hòa tan cùng loại. Nguyên nhân là do:


Do ảnh hưởng điện tích của chất mang. Khi gắn enzyme vào chất

mang có điện tích khác với điện tích của enzyme, cấu trúc không gian của
12